RU2182328C2

RU2182328C2 - Флуоресцентный микроскоп

Info

Publication number: RU2182328C2
Application number: RU2000104231/28A
Authority: RU
Inventors: В.Е. Барский; Е.Е. Егоров; Ю.Ю. Венгеров; А.Д. Мирзабеков
Original assignee: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН
Priority date: 2000-02-17
Filing date: 2000-02-17
Publication date: 2002-05-10
Also published as: AU2001237056A1; WO2001061324A1

Abstract

Изобретение относится к оборудованию для научных исследований. Задачей изобретения является разработка эффективного устройства для флуоресцентной микроскопии. Источник возбуждения флуоресцентного излучения выполнен в виде одного или нескольких светоизлучающих диодов, установленных с возможностью предотвращения попадания возбуждающего излучения на детектор флуоресцентного излучения. Технический результат - повышение безопасности. 19 з.п. ф-лы, 14 ил., 1 табл.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к оборудованию для исследований, в частности, к флуоресцентным микроскопам, предназначенным для получения изображения люминесцирующих объектов, точнее, к люминесцентно-микроскопическому анализу объектов, обладающих флуоресценцией при освещении возбуждающим светом.

Уровень техники
Флуоресцентная микроскопия широко применяется для наблюдения флуоресцирующих веществ в различных объектах.

В настоящее время для флуоресцентной микроскопии используются, преимущественно, два типа источников света, а именно лазеры и лампы высокой мощности (например, ртутные, ксеноновые и лампы накаливания). Лазеры используются, в основном, в сканирующих устройствах для обеспечения высокой интенсивности освещения в узкой спектральной области и на малой площади образца. Лампы дают мощное освещение больших поверхностей, при этом одна и та же лампа позволяет работать в различных длинах волн. Обоим типам источников света присущи недостатки, которые будут описаны ниже.

Большинство существующих в настоящее время конструкций микроскопов для обнаружения флуоресцирующих молекул используют освещение объекта через объектив. При этом во флуоресцентной микроскопии для возбуждения флуоресценции образца наиболее часто применяются мощные вольфрамовые или дуговые лампы в комбинации со световыми фильтрами. В этом способе анализа один и тот же объектив используется как для освещения образца, так и для сбора флуоресцентного излучения и фокусировки. Однако, такие источники света являются малоэффективными, поскольку они производят большое количество избыточной тепловой и световой энергии, по сравнению с энергией, требуемой для освещения образца. Кроме того, высокий уровень потребляемой и выделяемой мощности и большие размеры этих ламп делают системы, в которых они применяются, громоздкими. Выполнение устройств портативными является проблематичным. Стоимость таких систем очень высока.

В флуоресцентных микроскопах также используются лазеры. Существуют сложные способы конфокальной микроскопии (т.е., использующие конфокальные лазерные сканеры) и устройства (например, американские патенты 5,631,734 и 5,578,832), в которых остросфокусированные световые лучи лазера сканируют образец точку за точкой. Лазеры испускают свет в узкой спектральной области и, таким образом, исключают необходимость применения возбуждающих светофильтров. Однако, при использовании флуорохромов, которые возбуждаются на других длинах волн, требуется использовать другие лазеры, что приводит к повышению затрат.

Работа конфокальных лазерных систем требует применения сложных и, следовательно, дорогостоящих сканирующих и электронных устройств и электронных детекторов излучения с соответствующими преобразованиями сигналов, которые необходимы для реконструкции всего изображения. В отличие от флуоресцентных микроскопов с ламповыми источниками света, устройства, использующие конфокальный принцип, не могут детектировать флуоресцентное изображение всего образца одновременно, изображение снимается последовательно точка за точкой.

Пример конфокальной конфигурации изображен на фиг. 1. Стационарный лазерный источник 1 создает луч 2 света, предназначенный для освещения образца 3. При этом необходимо, чтобы луч отразился от светоделительного зеркала 4 перед тем, как он попадет на объектив 5.

Для облегчения обнаружения флуоресценции, исходящей от освещенного образца, излучение флуоресценции должно пройти через светоделительное зеркало 4, фильтр 6 для выделения люминесцентного излучения и попасть на детектор 7, например, фотоэлектронный умножитель. Для устранения возможности обнаружения детектором флуоресцентного излучения света (который является помехой при анализе флуоресцентного излучения образца) от участков, не находящихся в плоскости освещения, участков объекта, не находящихся в фокусе, а также от люминесцирующих поверхностей, находящихся на пути возбуждающего луча, между светоделительным устройством (зеркалом) и детектором помимо светофильтров располагается конфокальное отверстие 8 малого диаметра. Блок 9 обрабатывает и передает сигнал от детектора на компьютер 10.

В данной области техники существует потребность в эффективном устройстве флуоресцентного детектирования и в способе, в котором можно было бы использовать обычную конструкцию микроскопа без необходимости применения сложных блоков обработки сигнала и лазеров. Такое устройство должно устранить неэффективное использование энергии, связанное с использованием мощных источников энергии, таких, как вольфрамовые или дуговые лампы накаливания.

Ближайшим аналогом данного изобретения может служить флуоресцентный микроскоп, в котором образец освещается сфокусированным лазерным лучом, двигающимся по отношению к образцу. В каждый момент времени освещается небольшой участок препарата (обычно, освещаемая площадь имеет диаметр 0,1-1,0 мкм), флуоресценция которого возбуждается, и интенсивность объекта измеряется высокочувствительным фотодетектором (фотоумножителем или фотодиодом). С помощью специальных устройств лазерный луч сканирует объект (либо объект двигается по отношению к лазерному лучу). Основными недостатками этой системы являются: необходимость применения высокоточных и быстродействующих механических узлов, отвечающих за перемещение лазерного луча по отношению к объекту (или объекта - по отношению к лазерному лучу), невозможность визуального наблюдения объекта, необходимость использования компьютера и соответствующего программного обеспечения, как правило, более длительное время анализа (объект анализируется "точка за точкой"). Кроме того, этот метод требует обязательного знания оператором (исследователем) хотя бы основ компьютерных программ анализа изображения. ("Каталог микроскопов фирмы CARL ZEISS", Confocal Laser Scan Microscope (LSM), 1994).

Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание эффективного устройства для флуоресцентной микроскопии.

Флуоресцентный микроскоп для решения указанной задачи содержит оптическую систему для наблюдения и/или фиксирования изображения образца на носителе информации, фильтры для возбуждения и выделения флуоресцентного излучения, детектор флуоресцентного излучения, держатель образца, предназначенный для размещения образца напротив объектива оптической системы и его перемещения, источник возбуждения флуоресцентного излучения, при этом источник возбуждения флуоресцентного излучения выполнен в виде одного или нескольких светоизлучающих диодов, установленных с возможностью освещения образца и возбуждения его флуоресценции, а также предотвращения попадания возбуждающего излучения на детектор флуоресцентного излучения.

Возможны различные схемы установки светоизлучающих диодов в микроскопе, например, между фронтальной линзой объектива и детектором флуоресцентного излучения.

Различные компоновочные решения предполагают наличие световодов, при этом излучающий конец световода расположен между объективом и детектором флуоресцентного излучения.

Объектив оптической системы может быть снабжен кожухом с отражающей поверхностью, предназначенной для направления возбуждающего излучения на образец. Светоизлучающие диоды могут быть установлены между кожухом и объективом, или устройство снабжают кольцевым зеркалом, установленным между объективом и детектором флуоресцентного излучения и предназначенным для направления возбуждающего излучения на отражающую поверхность кожуха.

Еще одним решением является расположение светоизлучающего диода с противоположной, по отношению к образцу, стороны от детектора флуоресцентного излучения, при этом между образцом и светоизлучающим диодом установлен темнопольный конденсор.

Конструктивно задача может быть решена установкой светоизлучающих диодов в корпусе объектива со стороны образца; размещением излучающих концов световодов в непосредственной близости от образца или в корпусе объектива; закреплением светоизлучающих диодов по периферии корпуса объектива со стороны образца.

В флуоресцентном микроскопе, согласно изобретению, возможно использование объективов оптической системы, выполненных зеркальными или зеркально-линзовыми. При этом светоизлучающий диод устанавливают между объективом и образцом, либо располагают между ними излучающий конец световода.

Светоизлучающий диод может быть размещен на фронтальной линзе объектива со стороны образца на светонепроницаемой подложке.

Наличие в устройстве нескольких светоизлучающих диодов предусматривает использование диодов, имеющих как одинаковую длину волны излучения, так и различную.

С целью обеспечения более равномерного освещения образца, светоизлучающие диоды могут быть установлены с возможностью вращения вокруг своей оси и/или вокруг оптической оси объектива.

Особенностью настоящего изобретения является использование взаимозаменяемых светоизлучающих диодов (СИД). Преимущество настоящего изобретения состоит в том, что использование СИД, благодаря их эксплуатационным характеристикам (малые размеры, мощность и высокий КПД), позволяет создавать устройства, приспособленные для использования в обычном микроскопе, что ведет к уменьшению габаритов систем, их упрощению при том же соотношении параметров сигнал/фон, устранению помех при анализе флуоресцентного излучения образца.

Еще одним преимуществом изобретения является отсутствие тепла, выделяющегося при использовании источников света, применяемых в известных системах. Более того, имеется возможность заменять или использовать одновременно различные СИД, с тем, чтобы последовательно или одновременно освещать один и тот же образец в различных спектральных областях.

К важным достоинствам данного изобретения можно отнести:
а) уменьшение цены и габаритов осветительной системы флуоресцентного микроскопа, а также увеличение срока службы источника света;
б) резкое уменьшение потребляемой мощности системы, возможность создания портативных приборов с батарейным или аккумуляторным питанием;
в) создание осветителей флуоресцентных микроскопов более чистыми в экологическом смысле;
г) повышение безопасности флуоресцентного микроскопа.

Перечень чертежей
Далее изобретение поясняется чертежами, на которых представлены:
на фиг. 1 - схематическое изображение известного из уровня техники конфокального флуоресцентного микроскопа;
на фиг.2 - схема флуоресцентного микроскопа со светоизлучающим диодом в качестве источника возбуждения флуоресцентного излучения;
на фиг.3 - схема флуоресцентного микроскопа, обеспечивающего темнопольное эпи-освещение образца с использованием СИД в комбинации с кольцевым зеркалом;
на фиг.4 - схема флуоресцентного микроскопа с размещением СИД между объективом и кожухом с внутренней отражающей поверхностью;
на фиг.5 - схема флуоресцентного микроскопа с размещением СИД между объективом и детектором флуоресцентного излучения;
на фиг. 6 - схема флуоресцентного микроскопа с размещением излучающего конца световода между объективом и детектором флуоресцентного излучения;
на фиг.7 - схема темнопольного освещения образца в проходящем свете;
на фиг. 8 - объектив с расположенными по его периферии светоизлучающими диодами;
на фиг.9 - схема устройства с размещением СИД в корпусе объектива;
на фиг.10 - схема размещения СИД на фронтальной линзе объектива со стороны образца.

на фиг.11, 12 - схемы устройств с зеркальным или зеркально-линзовым объективом;
на фиг.13 - схема устройства с размещением излучающих концов световодов непосредственно у поверхности образца;
на фиг.14 - схема устройства с размещением излучающих концов световодов в корпусе объектива.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

В соответствии с настоящим изобретением предлагается недорогостоящая, в высокой степени оптимизированная конструкция флуоресцентного микроскопа.

Пример конструкции устройства в соответствии с настоящим изобретением изображен на фиг. 2. Устройство работает следующим образом. Свет от светоизлучающего диода 11 падает на линзу 12. Линза 12 преобразует свет в параллельный луч, который направляется на светоделительное зеркало 13, которое служит для отклонения луча вызывающего люминесценцию образца через объектив 14 на образец 15. Свет люминесценции образца собирается объективом 14 и направляется на детектор 16 флуоресцентного излучения. Эта схема является наиболее легко реализуемой, она не требует какой-либо переделки имеющегося оборудования, простая замена одного источника света на другой приводит к улучшению эксплуатационных характеристик флуоресцентного микроскопа.

В другом варианте выполнения объектив 14 флуоресцентного микроскопа снабжен охватывающим его кожухом 17 цилиндрической формы (фиг.3, 4). Кожух 17 имеет отражающие внутренние поверхности 18, которые изготовлены из светоотражающего материала и предназначены для направления возбуждающего излучения на образец 15. При этом световой поток от светоизлучающего диода 11 может направляться на отражающую поверхность 18 посредством кольцевого зеркала 19 (фиг. 3). Эта схема широко использовалась много лет назад, но впоследствии была отброшена, как не эффективная в силу трудности использования излучения источника света. Схема давала хорошее контрастное изображение ярких образцов, но обладала малой чувствительностью. В настоящее время с появлением мощных СИД эта схема опять является конкурентно-способной по сравнению со стандартной схемой флуоресцентного микроскопа. Конструкция микроскопа предусматривает возможность размещения светоизлучающих диодов между кожухом и объективом (фиг.4). В этом случае световой поток от светоизлучающих диодов направляется непосредственно на отражающую поверхность 18. Ранее эта привлекательная схема была не осуществима в силу больших геометрических размеров имевшихся источников света. Наличие СИД позволит с помощью этой схемы революционизировать весь подход.

Использование кожуха 17 позволяет регистрировать только свет флуоресценции, излучаемый образцом 15. При этом реализуется схема освещения, минуя объектив 14. Таким образом, не возникает флуоресценция оптики, и поэтому достигается дополнительное уменьшение фона, повышается чувствительность обнаружения флуоресценции образца. Расположение светоизлучающих диодов между кожухом 17 и объективом 14 исключает из конструкции микроскопа кольцевое зеркало и дополнительные линзы.

Флуоресценция освещенного образца 15 наблюдается через окуляр и/или записывается с помощью детектора 16, такого как фотографическая пленка. Световой поток падает на образец 64 в течение времени, достаточного для регистрации изображения люминесцирующего объекта. В зависимости от конструкции доступных светоизлучающих диодов и для обеспечения равномерного освещения поверхности образца, светоизлучающий диод 11 может быть расположен между фронтальной линзой 14 и детектором 16 флуоресцентного излучения (фиг.5). В силу своих малых размеров установка СИД в этом месте не скажется на яркости получаемого изображения, однако, позволит существенно упростить конструкцию микроскопа. Как показано на фиг.6, свет, излучаемый СИД, может быть направлен по оптоволоконной системе (световоду 20). Оптические волокна передают свет, исходящий от СИД или от нескольких СИД, обеспечивая, таким образом, равномерное освещение образца. Излучающий конец световода может быть расположен между объективом 14 и детектором 16 флуоресцентного излучения. Эта схема является альтернативной к схеме по фиг.5, ее легче реализовать, особенно при работе с несколькими СИД, хотя она дороже.

На фиг.7 изображено использование СИД в схеме темнопольного освещения в проходящем свете (схема пригодна для работы с прозрачными образцами, расположенными на прозрачной подложке). При такой схеме прямой свет не попадает на детектор флуоресцентного излучения. Образец 15 освещается в темном поле в проходящем свете, лучи света падают на образец под углами, отличными от направления оси оптической системы и большими угла сбора излучения образца объективом.

Неперпендикулярный угол падения светового потока на образец 15 достигается благодаря использованию кардиоидного параболического конденсора или конденсора с затемненным центром, расположенным между СИД 11 и образцом 15. При такой схеме светоизлучающий диод 11 расположен с противоположной, по отношению к образцу 15, стороны от детектора 16 флуоресцентного излучения, при этом между образцом 15 и светоизлучающим диодом 11 установлен конденсор 21.

В настоящем изобретении в качестве образца был использован микрочип, состоящий из ячеек акриламида, часть из которых обладала флуоресценцией из-за наличия в них флуоресцирующего вещества. При этом в флуоресцирующей ячейке размером 100х100 мкм с толщиной 20 мкм обнаруживалось до 5•10⁵ молекул люминесцирующего красителя. Техасского Красного. Средняя интенсивность возбуждения составляла ≈ 1 мВт/мм², время экспозиции в диапазоне от 0,5 до 30 с. При этом использовалась черно-белая фотопленка чувствительностью 3000 ISO.

В устройстве в соответствии с настоящим изобретением используется множество различных типов светоизлучающих диодов. Подходящий диод должен испускать излучение, пригодное для возбуждения флуоресценции в типичных флуорохромах. Примерами являются: Техасский Красный (Texas Red), цианиновые красители (Сy dyes), нафтофлуоресцеин (Naphthofluorescein), флуоресцеин, красители BODIPY и другие. В таблице приведены различные типы флуорохромов, которые могут быть использованы с различными СИД, доступными в настоящее время (см. в конце описания).

Пример
Шестнадцать СИД 11 голубого цвета были установлены по периферии корпуса объектива 22 фирмы Цейс (Zeiss) (20х0,5) со стороны образца 15 (фиг.8). Дополнительные линзы не использовались, поскольку расстояние до образца было весьма мало (300 мкм). При такой схеме любой СИД, расположенный на таком расстоянии к образцу, способен обеспечить требуемую освещенность. На фиг.8, кроме того, изображен источник питания 23. СИД могут быть присоединены к объективу, с возможностью их замены, любым известным способом. При этом можно менять СИД, и тот же самый объектив может использоваться для экспериментов с различной длиной волны. Очень легко выполняемая схема, не требующая никакой дополнительной оптики. Ограничением применимости схемы является то, что она требует применения объективов с большим рабочим расстоянием.

В качестве альтернативы, СИД постоянно закрепляются на корпусе объектива с помощью клея, механического крепежа или они могут быть интегрально сформованы с элементом 24, формирующим указанный корпус (фиг.9). Эта схема обеспечивает изготовление специализированных объективов со встроенным освещением, которые можно использовать в любом стандартном флуоресцентном микроскопе, но избежать при этом освещения образца с помощью прилагаемых к микроскопу источников света.

При подаче на СИД энергии получается общая освещенная область диаметром приблизительно 10 мм. Интенсивность освещенности внутри поля зрения объектива 20х0,5 составляла приблизительно 3 мВт/мм. Такая интенсивность используется для возбуждения люминесценции применяемой окраски. В качестве объекта был выбран мазок туберкулезных бактерий, который после фиксации и дополнительной предобработки погружали в смесь красителей аурамина и родамина 6G на 30 с, после чего его промывали дистиллированной водой. При использовании объектива 40х0,65 и схемы освещения согласно фиг.8, время экспозиции составило менее 10 с.

На фиг. 10 показан светоизлучающий диод 11, размещенный на фронтальной линзе 14 объектива со стороны образца 15 на светонепроницаемой подложке 25. При такой схеме СИД располагается на расстоянии "D" в пределах 300 мкм от образца, устраняя при этом необходимость установки дополнительного фокусирующего средства. Для того чтобы облучение фона не достигало детектора, область линзы, на которой устанавливается СИД, может закрываться непрозрачным материалом. Эта схема требует специальной техники для ее осуществления, однако, при освоении этой техники будет выпускаться принципиально новый класс объективов со встроенным освещением.

Согласно изобретению объектив оптической системы флуоресцентного микроскопа может быть выполнен зеркальным или зеркально-линзовым. При этом, между объективом и образцом 15 может быть расположен излучающий конец световода 20 (фиг.11) или светоизлучающий диод 11 (фиг.12). Эта схема требует изготовления новых типов объективов, что приведет к "освоению" новых областей применения флуоресцентной микроскопии.

Требуемая освещенность образца может быть достигнута размещением излучающих концов световодов 20 в непосредственной близости от образца 15 (фиг. 13), что легко реализуется, позволяя получить яркую люминесценцию больших площадей образца при работе с малыми увеличениями микроскопа, или размещением их в элементе 24 корпуса объектива (фиг.14). Схема реализуется легче, чем ее аналог по фиг.9, но она дороже.

Выше приведены предпочтительные примеры осуществления изобретения, допускающие различные изменения и дополнения, не выходящие за пределы существа и объема изобретения. Соответственно, следует понимать, что данное описание настоящего изобретения имеет лишь иллюстративное, а не ограничивающее назначение.

Claims

1. Флуоресцентный микроскоп, содержащий оптическую систему для наблюдения и/или фиксирования изображения образца на носителе информации, фильтры для возбуждения и выделения флуоресцентного излучения, детектор флуоресцентного излучения, держатель образца, предназначенный для размещения образца напротив объектива оптической системы и его перемещения, источник возбуждения флуоресцентного излучения, отличающийся тем, что источник возбуждения флуоресцентного излучения выполнен в виде одного или нескольких светоизлучающих диодов, установленных с возможностью освещения образца и возбуждения его флуоресценции, а также предотвращения попадания возбуждающего излучения на детектор флуоресцентного излучения.

2. Флуоресцентный микроскоп по п. 1, отличающийся тем, что светоизлучающий диод установлен между фронтальной линзой объектива и детектором флуоресцентного излучения.

3. Флуоресцентный микроскоп по п. 1, отличающийся тем, что между фронтальной линзой объектива и детектором флуоресцентного излучения установлено несколько светоизлучающих диодов.

4. Флуоресцентный микроскоп по п. 1, отличающийся тем, что он снабжен, по крайней мере, одним световодом.

5. Флуоресцентный микроскоп по п. 4, отличающийся тем, что излучающий конец световода расположен между объективом и детектором флуоресцентного излучения.

6. Флуоресцентный микроскоп по п. 1, отличающийся тем, что объектив снабжен кожухом с отражающей поверхностью, предназначенной для направления возбуждающего излучения на образец.

7. Флуоресцентный микроскоп по п. 6, отличающийся тем, что светоизлучающие диоды размещены между кожухом и объективом.

8. Флуоресцентный микроскоп по п. 6, отличающийся тем, что он снабжен кольцевым зеркалом, установленным между объективом и детектором флуоресцентного излучения и предназначенным для направления возбуждающего излучения на отражающую поверхность кожуха.

9. Флуоресцентный микроскоп по п. 1, отличающийся тем, что светоизлучающий диод расположен с противоположной, по отношению к образцу, стороны от детектора флуоресцентного излучения, при этом между образцом и светоизлучающим диодом установлен конденсор.

10. Флуоресцентный микроскоп по п. 1, отличающийся тем, что светоизлучающие диоды установлены в корпусе объектива со стороны образца.

11. Флуоресцентный микроскоп по п. 4, отличающийся тем, что излучающие концы световодов размещены в непосредственной близости от образца.

12. Флуоресцентный микроскоп по п. 4, отличающийся тем, что излучающие концы световодов размещены в корпусе объектива.

13. Флуоресцентный микроскоп по п. 1, отличающийся тем, что светоизлучающие диоды установлены по периферии корпуса объектива со стороны образца.

14. Флуоресцентный микроскоп по п. 1, отличающийся тем, что объектив оптической системы выполнен зеркальным или зеркально-линзовым.

15. Флуоресцентный микроскоп по п. 14, отличающийся тем, что светоизлучающий диод установлен между объективом и образцом.

16. Флуоресцентный микроскоп по п. 14, отличающийся тем, что между объективом и образцом расположен излучающий конец световода.

17. Флуоресцентный микроскоп по п. 1, отличающийся тем, что светоизлучающий диод размещен на фронтальной линзе объектива со стороны образца на светонепроницаемой подложке.

18. Флуоресцентный микроскоп по любому из пп. 1, 3, 7, 10-13, отличающийся тем, что светоизлучающие диоды имеют одинаковую длину волны излучения.

19. Флуоресцентный микроскоп по любому из пп. 1, 3, 7, 10-13, отличающийся тем, что светоизлучающие диоды имеют различную длину волны излучения.

20. Флуоресцентный микроскоп по любому из пп. 1-19, отличающийся тем, что один или несколько светоизлучающих диодов установлены с возможностью вращения вокруг своей оси и/или вокруг оптической оси объектива.