WO2007136303A1 - Способ идентификации урогенитальной инфекции, олигонуклеотид, комбинация олигонуклеотидов, биочип и набор на его основе - Google Patents

Способ идентификации урогенитальной инфекции, олигонуклеотид, комбинация олигонуклеотидов, биочип и набор на его основе Download PDF

Info

Publication number
WO2007136303A1
WO2007136303A1 PCT/RU2007/000248 RU2007000248W WO2007136303A1 WO 2007136303 A1 WO2007136303 A1 WO 2007136303A1 RU 2007000248 W RU2007000248 W RU 2007000248W WO 2007136303 A1 WO2007136303 A1 WO 2007136303A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
oligonucleotides
microchip
sequences
identification
Prior art date
Application number
PCT/RU2007/000248
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2007136303A8 (ru
Inventor
Igor Eduardovich Granovsky
Igor Petrovich Beletsky
Elena Andreevna Shlyapnikova
Alexander Vladimirovich Gavryushkin
Sergey Vladimirovich Biryukov
Original Assignee
Closed Company "Molecular-Medicine Technologies"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Closed Company "Molecular-Medicine Technologies" filed Critical Closed Company "Molecular-Medicine Technologies"
Priority to EP07794002A priority Critical patent/EP2028273A4/de
Publication of WO2007136303A1 publication Critical patent/WO2007136303A1/ru
Publication of WO2007136303A8 publication Critical patent/WO2007136303A8/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Definitions

  • the invention relates to the field of microbiology, virology, biotechnology, molecular biology and genetic engineering, namely, to the specific identification of infectious pathogens (bacteria, viruses, fungi, etc.) in biological samples, including the steps of DNA amplification and subsequent hybridization of amplified DNA to biological microchip.
  • the invention also discloses the composition of highly specific DNA probes and oligonucleotides, a set of reagents, and a method for recording and interpreting results. State of the art
  • enzyme-linked immunosorbent assay methods are used - ELISA [1,2], microbiological analysis methods [3], virological analysis methods [4], methods based on PCR [5], including followed by length analysis an amplified fragment [6] or with subsequent determination of the nucleotide sequence (sequencing) [7].
  • An invention in which the diagnosis of urogenital diseases is carried out by examining complexes containing gram-positive bacteria and other microorganisms, such as yeast, simple microorganisms, mycoplasma and gram-negative bacteria, in one sample [8].
  • the invention is known in which a diagnostic method is considered, in which nucleic acid groups are used to form samples that hybridize with the 16S rRNA or 16S rDNA region of Urlasta andreututi [9].
  • a plurality of microorganisms selected from the group Ne ⁇ sseria goporrhoeae, Neisseria tepipgitidis, Naetorhil ⁇ s d ⁇ sreui, Vraphatella satarrhalis, Vordetella rertissis, Naetor
  • the nucleic acids of many microorganisms are brought into contact with a membrane containing regions in which nucleic acid samples taken from the transcription site of a gene between 16S and 23 S rRNA of a gene of a prokaryotic microorganism and containing from 15 to 100 nucleotides are applied [10].
  • primers are provided for amplification of 16S-23 S rRNA sites and subsequent hybridization to detect microorganisms belonging to the group of strains Musobasterite, Chlutudia, Isteria, Bricella and Yessipia epiterolitis.
  • the invention [12] provides a technical solution for the use of real-time PCR for the diagnosis of any eubacteria using the highly conserved region of the 16S rRNA gene.
  • Amplification is carried out using PCR and other systems: LCR, NASBA, 3SR, SDA, bDNA, (TMA), CPT, nested PCR and multiplex PCR.
  • Primers and PCR kits are known for identifying Nerres sixtlex viris tures 1 apd 2 [23, 24] and Nerres siitlex viris tures 4 Epstein-Barr viruses
  • This invention describes a method for determining the position of multiple samples with different genotypes on the surface of one microchip.
  • This method relates to the use of a multi-primer polymerase chain reaction (PCR) using fluorescently labeled primers to produce amplified single-stranded DNAs.
  • PCR polymerase chain reaction
  • this method is not applicable without significant modifications to create a relatively inexpensive microchip or multichip, consisting of several chips, to identify urogenital infections.
  • the general principles of conducting multi-primer PCR contain their own characteristics related to the choice of PCR temperatures, the length of the primers and the choice of primer sequences that do not affect each other during amplification.
  • the effectiveness of diagnosis is largely determined by the choice of a list of pathogenic organisms by which the mixed urogenital infection is identified.
  • the objective of the present invention is to increase the efficiency of diagnosis and create an inexpensive method for determining mixed urogenital infections by identifying up to 15 types of pathogens on biological microarrays.
  • Another objective of the invention is the development of a biological microchip and a multichip for diagnosing in the laboratory without the use of complex diagnostic equipment.
  • One of the objects of the invention is a method for identifying urogenital infection, which includes providing a sample of the studied DNA, direct and reverse primers specific for identifying infectious agents in the urogenital region, and a biological microchip containing differentiating oligonucleotides, PCR in the presence of a DNA sample and primers with probes specific to the identification of infectious agents, incubation of the PCR product with a biological microchip under hybridization conditions, determination of urogenital infection and detecting the formed hybridization complexes on a microchip, wherein the biological microchip contains differentiating oligonucleotides with the sequences shown in SEQ ID NOS: 59-87; as specific primers, primers are used whose sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1-58, As PCR, asymmetric PCR is used, and in a pair of forward and reverse primers, one primer contains a label that is detected after DNA hybridization, detection data is recorded, and registration data is used and to identify infectious agents in
  • Another object of the invention is a specific oligonucleotide as a PCR primer for species identification of an infectious agent in a method for identifying an urogenital infection with the sequences shown from SEQ ID NO: 1 by SEQ ID NO: 58.
  • Another object of the invention is a differentiating oligonucleotide as a probe for species identification of an infectious agent in a method for identifying an urogenital infection with the sequences presented from SEQ ID NO: 59 to SEQ ID NO: 87.
  • Another object of the invention is a combination of oligonucleotides for the species identification of the infectious agent Chlapidia trhothotis, which includes oligonucleotides with the sequences of either SEQ ID NO: 59 and SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • Another object of the invention is a combination of oligonucleotides for the species identification of an infectious agent Neisseria goporrhoeae, which includes oligonucleotides with sequences of either SEQ ID NO: 61 and SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 62 and SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 84, or SEQ ID NO: 63 and SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10.
  • Another object of the invention is a combination of oligonucleotides for the species identification of an infectious agent Trichotopes vagipalis, which includes oligonucleotides with sequences of either SEQ ID NO: 64 and SEQ
  • Another object of the invention is a combination of oligonucleotides for the species identification of the infectious agent Ueraplast andreulitis and / or Urela rastit, which includes oligonucleotides with sequences of either SEQ ID NO: 66 and SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 67 and
  • Another object of the invention is a combination of oligonucleotides for the species identification of the infectious agent Sapdida albicaps, which includes oligonucleotides with sequences of either SEQ ID NO: 68 and SEQ
  • Another object of the invention is a combination of oligonucleotides for the species identification of the infectious agent Muslasta hepatitis, which includes oligonucleotides with sequences of either SEQ ID NO: 70 and SEQ
  • Another object of the invention is a combination of oligonucleotides for species identification of an infectious agent of Muslotta hotpis, which includes oligonucleotides with sequences of either SEQ ID NO: 73 and SEQ
  • Another object of the invention is a combination of oligonucleotides for the species identification of the infectious agent Gardoplella vagipalis, which includes oligonucleotides with sequences of either SEQ ID NO: 76 and SEQ
  • Another object of the invention is a combination of oligonucleotides for the species identification of the infectious agent Stertosossis agalacliae, which It includes oligonucleotides with the sequences SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO:. 41 and SEQ ID NO: 42. -
  • Another object of the invention is a combination of oligonucleotides for the species identification of the infectious agent Stertosossis agalastae and / or Stertosossis rugepes, which includes oligonucleotides with the sequences SEQ ID NO: 80 and SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44.
  • Another object of the invention is a combination of oligonucleotides for the species identification of the infectious agent Nitap hersviris 1 and / or Nitap hersviris 2, which includes oligonucleotides with sequences of either SEQ ID NO: 81 and SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 46 or SEQ ID NO: 82 and SEQ ID NO:
  • Another object of the invention is a combination of oligonucleotides for the species identification of an infectious agent Nitap hersviris 4, which includes oligonucleotides with the sequences of either SEQ ID NO: 83 and SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 50, or SEQ ID NO: 84 and SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO:
  • Another object of the invention is a combination of oligonucleotides for the species identification of the infectious agent Nitap hersviris 5, which includes oligonucleotides with the sequences of either SEQ ID NO: 86 and SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 56, or SEQ ID NO: 87 and SEQ ID NO: 57 and SEQ ID NO:
  • Another object of the invention is a biological microchip for species identification of infectious agents, which is a supporting element on which differentiating oligonucleotides with one or more sequences shown in
  • kits for the species identification of infectious agents including: a) at least one biological individual microchip for one-time diagnostics or a biological multichip for parallel or sequential screening, containing differentiating oligonucleotides with one or more sequences shown in SEQ ID NO: 59 according to SEQ ID NO: 87. b) reagents that are selected from reagents for sample preparation, reagents for PCR, reagents for hybridization, and combinations thereof. c) specific oligonucleotides as PCR primers for species identification of an infectious agent with sequences that are selected from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 58.
  • kits which, in addition to a biological microchip or multichip, reagents for sample preparation, reagents for PCR, reagents for hybridization and their combination and specific oligonucleotides as PCR primers for species identification of an infectious agent, further comprises a hybridization device and / or a device for scanning and interpreting the results of the analysis, and for scanning using a device that is included in the group consisting of: a hand scanner, an individual chip scanner, a flatbed multi-chip scanner, a disk multi-chip scanner, and a computer, as a means for interpreting and storing diagnostic results.
  • FIG. 2. The cross section of the multichip carrier element for different recesses: a) a triangular recess, b) a spherical recess, c) a rectangular recess, d) a polygonal recess, e) a recess option from both sides of the recess.
  • FIG. 3. The cross section of the multichip carrier element for different recesses: a) a triangular recess, b) a spherical recess, c) a rectangular recess, d) a polygonal recess, e) a recess option from both sides of the recess.
  • Placement of the main elements of the multichip on the surface of the bearing element with the formation of a common zone on the bearing element a) the distribution of zones on the bearing element of the multichip; b) a multi-chip variant with a combination of recesses and through holes between the chips with the placement of three identifiers; c) a multi-chip variant with a combination of recesses and through holes between the chips with the placement of two identifiers.
  • FIG. 4. A block diagram of a system for collecting, processing, and transmitting data read from multichips to individual user computers.
  • FIG. 5. Image of points during the detection of an experimental slide to verify the effectiveness of the choice of probes and primers, as well as positive and negative controls for the diagnosis of urogenital infection.
  • FIG. 6 The structural diagram of the medical chip.
  • Position 100 - relate to the structural elements of the multichip.
  • Position 200 - refers to a system for analyzing diagnostic results.
  • a method for the species identification of infectious agents includes the following stages: target selection, selection of primers and probes, synthesis of probes and primers, preparation of a biological microchip (for example, surface modification), application of probes, DNA isolation, DNA amplification at PCR, DNA hybridization on a microchip, detection and registration of the result, identification and interpretation of the results.
  • Target selection In the process of studying methods for diagnosing urogenital infections and known diagnostic microarrays, it was found that most of the known solutions related to the selection of the list of pathogenic organisms for diagnosis do not take into account the fact that recently there has been a rapid increase in diseases associated with mixed urogenital infection [38] .
  • a non-obvious solution within the framework of the present invention is the selection of a list of pathogenic organisms by which a mixed urogenital infection is identified.
  • the list presented in table N ° l is designed in such a way that it eliminates the disadvantages of known inventions.
  • viruses and viruses that are commonly found in urogenital diagnostics include viruses, namely, Nitap herresviris 1 and / or Nitap herresviris 2, Nitap herresviris 4 and Nitap herresviris 5.
  • viruses namely, Nitap herresviris 1 and / or Nitap herresviris 2, Nitap herresviris 4 and Nitap herresviris 5.
  • Such a combination of viruses, bacteria, yeast and technical fungi allows the invention to be realized with an increase in the efficiency of diagnostics, at the same time, quickly and at minimal cost, to diagnose from 1 to 15 pathogens in one analysis, based on the identification of up to 26 sections of DNA specific for these pathogenic organisms.
  • Table Ng List of pathogenic organisms and targets.
  • the primers were selected taking into account the requirements of high specificity for conserved regions of the genes of the studied pathogens, which allows one to selectively amplify the DNA fragment of the pathogenic organism 0 directly from the isolated biological sample. In this case, we proceeded from the requirements that are standardly applied to primers, which include: the absence of highly stable secondary structures, a small difference in melting temperatures not exceeding 2-3 ° C, and also the choice of the length of the primers in the range from 15 to 55 n.a.
  • sequences were selected that are characteristic of an identifiable pathogenic organism and are presented in the database of nucleotide sequences GepVapk (http://ncbi.nlm.nih.gov), in which the most conserved regions were selected that were not previously used and were not obvious for the preparation of specific and differentiating oligonucleotides to create biological chips.
  • Each pair of oligonucleotides for PCR specific to a target of pathogens consists of one unlabeled (not containing one or several labels necessary for subsequent analysis and interpretation of the results) specific oligonucleotide from the listed sequences with any odd number with SEQ ID NO: 1- by SEQ ID NO:
  • Differentiating oligonucleotides were selected taking into account the high specificity requirements for conserved regions of the genes of the studied pathogens, which allows selective hybridization of DNA fragments amplified with specific oligonucleotides by PCR directly from biological samples, as well as on the basis of the absence of highly stable secondary structures and having a length of 15 to 55 but.
  • Differentiating oligonucleotides are characterized by species specificity for pathogens, mainly the urogenital region.
  • oligonucleotides homologous to the oligonucleotides indicated in the sequence listing by not less than 80%, preferably not less than 90%, most preferably not less than 95%. It is permissible to use oligonucleotides having deletions or insertions of one or more nucleotides.
  • oligonucleotide as a probe and two specific oligonucleotides used as PCR primers.
  • One of the combinations includes differentiating SEQ ID NO: 59 and two specific SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 oligonucleotides, the other combination includes differentiating SEQ ID NO: 60 and two specific SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 oligonucleotides.
  • any of two combinations is used, which includes one differentiating oligonucleotide as a probe and two specific oligonucleotides used as PCR primers.
  • One of the combinations includes the differentiating SEQ ID NO: 61 and two specific SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 oligonucleotides, the other combination includes the differentiating SEQ ID NO: 62 and two specific SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 84 oligonucleotides and the third combination includes differentiating SEQ ID NO: 63 and two specific SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 oligonucleotides.
  • the species identification of infectious agents mainly the urogenital region, and the specific identification of bacteria of the Trichotope vagipalis species
  • use any of two combinations which include one differentiating oligonucleotide as a probe and two specific oligonucleotides used as PCR primers.
  • One of the combinations includes the differentiating SEQ ID NO: 64 and two specific SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 oligonucleotides
  • the other combination includes the differentiating SEQ ID NO: 65 and two specific SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 oligonucleotides.
  • any of two combinations which include one differentiating oligonucleotide as a probe and two specific oligonucleotides used as PCR primers.
  • One of the combinations includes the differentiating SEQ ID NO: 66 and two specific SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, the other combination includes differentiating SEQ ID NO: 67 and two specific SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 oligonucleotides.
  • any of two combinations is used, which includes one differentiating oligonucleotide as a probe and two specific oligonucleotides used as PCR primers.
  • One of the combinations includes the differentiating SEQ ID NO: 68 and two specific SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 oligonucleotides, the other combination includes the differentiating SEQ ID NO: 69 and two specific SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 oligonucleotides.
  • Muscle hepatitis uses either of the two combinations, which includes one differentiating oligonucleotide as a probe and two specific oligonucleotides used as PCR primers.
  • One of the combinations includes the differentiating, SEQ ID NO: 70 and two specific SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24, the other combination includes the differentiating SEQ ID NO: 71 and two specific SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO : 26 oligonucleotides and the third combination includes differentiating SEQ ID NO: 72 and two specific SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 oligonucleotides.
  • any of two combinations is used, which includes one differentiating oligonucleotide as a probe and two specific oligonucleotides used as PCR primers.
  • One of the combinations includes the differentiating SEQ ID NO: 73 and two specific oligonucleotides of SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30, the other combination includes the differentiating SEQ ID NO: 74 and two specific SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 oligonucleotides and the third combination includes differentiating SEQ ID NO: 75 and two specific SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 3 4 oligonucleotides.
  • One of the combinations includes differentiating SEQ ID NO: 76 and two specific SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36, the other combination includes differentiating SEQ ID NO: 77 and two specific SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38 oligonucleotide and the third combination includes the differentiating SEQ ID NO: 78 and two specific SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO: 40 of the oligonucleotide.
  • any of two combinations is used, which includes one differentiating oligonucleotide as a probe and two specific oligonucleotides used as PCR primers.
  • One of the combinations includes differentiating SEQ ID NO: 79 and two specific SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42 oligonucleotides.
  • Stertosossis agalastiae and / or Stertosossis rughepes use any of two combinations, which include one differentiating oligonucleotide as a probe and two specific oligonucleotides used as PCR primers.
  • One combination includes the differentiating SEQ ID NO: 80 and two specific SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 oligonucleotides.
  • Nitap herresvir ⁇ s 1 and / or Nitap herresviris 2 use any of two combinations, which includes one differentiating oligonucleotide as a probe and two specific oligonucleotides used as PCR primers.
  • One of the combinations includes the differentiating SEQ ID NO: 81 and two specific SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 46 oligonucleotides, the other combination includes the differentiating SEQ ID NO: 82 and two specific SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 48 oligonucleotides.
  • One of the combinations includes the differentiating SEQ ID NO: 83 and two specific oligonucleotides SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 50, the other combination includes the differentiating SEQ ID NO: 84 and two specific SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 52 oligonucleotides and the third group includes the differentiating SEQ ID NO: 85 and two specific SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 oligonucleotides.
  • any of two combinations which include one differentiating oligonucleotide as a probe and two specific oligonucleotides used as PCR primers.
  • One of the combinations includes differentiating SEQ ID NO: 86 and two specific oligonucleotides SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 56, the other combination includes differentiating SEQ ID NO: 87 and two specific SEQ ID NO: 57 and SEQ ID NO: 58 oligonucleotides.
  • Table 1-1 Specific oligonucleotides (part 1).
  • Oligonucleotides are synthesized using an automatic synthesizer (for example, the Gepe Assembler model of Ppharmacia by the standard amidophosphite method.
  • an automatic synthesizer for example, the Gepe Assembler model of Ppharmacia by the standard amidophosphite method.
  • differentiating oligonucleotides are modified at the 5'- or 3'-end, for example, the 5'-terminal phosphate group is introduced during the synthesis.
  • One of a pair of specific oligonucleotides for PCR is modified at the 5'-end tag, which is selected from the group consisting of: catalytic, ligand, fluorescent and radioactive, which is introduced by chemical methods or enzymatically.
  • a matrix having surface amino groups is prepared using a solution of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) in various solvents depending on the type of substrate.
  • APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
  • glass substrates are incubated in a solution of 3-aminopropyltriethoxysilane in acetone or in ethanol.
  • APTES concentrations vary from 0.1 to 10% by volume. If the reaction is carried out in acetone, the glasses are washed three times with acetone for 5 minutes, then with ethanol 2 times for 3 minutes and calcined at a temperature of 120-130 0 C for 20 minutes.
  • the droplet volume of each probe is at least 0.005 ⁇ l.
  • Matrices coated with oligonucleotides are placed in a sealed container, kept at room temperature for 1 hour in a humid atmosphere and washed on a shaker with a 1 M NaCI solution for 10 minutes, then with distilled water.
  • the biochip is dried and stored at room temperature.
  • the concentration of oligonucleotide in the volume of droplets of each probe is from 0.5 to 100 ⁇ M.
  • DNA isolation and preparation of material for amplification DNA isolation and preparation of material for amplification.
  • DNA extraction from a biological sample blood, biopsy material, saliva, lacrimal secretions, urine, broncho-aveolar lavage, cerebrospinal fluid, cerebrospinal fluid, etc.
  • a biological sample blood, biopsy material, saliva, lacrimal secretions, urine, broncho-aveolar lavage, cerebrospinal fluid, cerebrospinal fluid, etc.
  • DNA isolation and preparation of material for amplification DNA extraction from a biological sample (blood, biopsy material, saliva, lacrimal secretions, urine, broncho-aveolar lavage, cerebrospinal fluid, cerebrospinal fluid, etc.) is carried out using generally accepted methods based, for example, on alkaline lysis, the use of detergents, proteinase K extraction with phenol, chloroform and / or a phenol / chloroform mixture, or purification on diatomaceous earth or silica.
  • positive control DNA is
  • Positive and negative controls are used in a diagnostic kit to confirm compliance with the optimal conditions for the procedures necessary to identify the claimed pathogenic organisms, namely, the isolation of DNA from biological material, PCR and hybridization.
  • DNA with a known nucleotide sequence is used as a positive control 1.
  • DNA can be either the natural DNA of an organism, or an artificial sequence, for example, recombinant DNA, or a fragment of such DNA obtained by PCR or another method.
  • Positive control DNA 1 is amplified by asymmetric PCR using specific oligonucleotides in the same way as the test samples.
  • Specific oligonucleotides for amplification of DNA positive control 1 are selected so that its amplification can be carried out by PCR under the same conditions as for the determined pathogenic organisms.
  • a differentiating oligonucleotide, complementary to the positive control DNA sequence generated in single-stranded form, is immobilized on a chip.
  • an oligonucleotide or several oligonucleotides complementary to specific PCR oligonucleotides that are modified at the 5 'end with the label from the group given in the section “Synthesis of probes and primers” are immobilized onto a chip.
  • Negative controls in the framework of this invention are used to confirm compliance with optimal hybridization conditions.
  • an oligonucleotide is partially immobilized on a chip, partially complementary to the DNA sequence of the positive control generated in single-stranded form, or oliguncleotides partially complementary to specific oligonucleotides for PCR, which are modified at the 5 'end with a label from the group given in p. “Synthesis of probes and primers”.
  • the number and position of nucleotides that do not match the DNA sequence of the positive control or specific oligonucleotides for PCR are selected so that this differentiating oligonucleotide is able to form and maintain an imperfect duplex with a single stranded DNA of a positive control or specific oligonucleotide for PCR if hybridization and washing conditions are not observed, namely, when testing enii hybridization and wash in conditions softer than optimal.
  • sequence listing shows specific oligonucleotides ID SEQ No: 88 and 89, which are used to amplify pUC18 plasmid DNA using asymmetric PCR, as well as differentiating oligonucleotides ID SEQ No: 90 and 91 which are immobilized on the surface of the chip and used as, respectively, positive and negative controls.
  • a large number of patents are known in which various types of tags are considered for constructing biological chips.
  • Known classification of labels into groups consisting of: catalytic, ligand, fluorescent or radioactive molecules [21,22]. These patents are incorporated by reference.
  • the catalytic molecule is selected from the group consisting of hemin, cyanocobalamin or flavin.
  • the ligand molecule is selected from the group consisting of biotin, dioxigenin or dinitrobenzene.
  • the fluorescent molecule is selected from the group consisting of FAM, TAMRA, Cy3, Cy5, Cy7, R6G, RI lO, ROX or JOE.
  • the PCR mixture contains a lx-fold reaction buffer, for example, from 10 to 80 mM Tris-Hcl pH8.8, up to 50 mM KCl and / or up to 25 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Triton X -IOO, or 0.1% Tween 20, or 0.8% Nopid P40, from 1 mm to 5 mm, optimally from 1.5 mm to 2.5 mm, MgCl 2 or MgSO 4 , from 10 ⁇ g to 300 ⁇ g , optimally from 50 ⁇ g to 200 ⁇ g, the DNA of the analyzed sample and at least one pair of specific oligonucleotide primers for each target.
  • a lx-fold reaction buffer for example, from 10 to 80 mM Tris-Hcl pH8.8, up to 50 mM KCl and / or up to 25 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Triton X -IOO, or 0.1% Tween
  • the total number of pairs of specific oligonucleotides can vary from 1 to 29 in combination to identify at least one infectious agent in the form of pathogenic microorganisms and / or fungi and / or viruses.
  • the composition of the PCR mixture includes from 1 unit. up to 20 units, optimally from 6 units. up to 14 units, most optimally from 8 units. up to 12 units Taq polymerase activity.
  • the PCR mixture may include reagents that increase the specificity and effectiveness of PCR, for example, such as betaine, ectain and its derivatives, as well as trehalose, dimethyl sulfoxide, glycerol.
  • the concentration of unlabeled specific oligonucleotide in PCR can be from 0.025 ⁇ M to 0.2 ⁇ M, optimally from 0.05 ⁇ M to 0.1 ⁇ M, and the concentration of labeled specific oligonucleotide in PCR is from 0.125 ⁇ M to 1 ⁇ M, optimally from 0.25 ⁇ M up to 0.5 ⁇ M.
  • the ratio of unlabeled oligonucleotide to labeled is from 1/2 to 1/50, optimally from 1/5 to 1/10.
  • the volume of the reaction mixture can be from 5 ⁇ l to 200 ⁇ l, optimally from 20 ⁇ l to 50 ⁇ l.
  • the reaction can be carried out with or without mineral oil, depending on the design of the DNA amplifier. PCR is performed using a DNA amplifier (for example, Terzik, DNA technology, Russia or Mastercusler, Herrepdorf, Germany), under the conditions shown in Table 2. Table 2. Conditions for PCR.
  • Labeled PCR products hybridize with DNA probes (differentiating oligonucleotides) immobilized on a biochip in a specially selected buffer.
  • Hybridization is carried out in a buffer containing 0.5 x 5 x SSC, 0.1% SDS, up to 25% formamide and / or up to 10 mM EDTA for 1 hour at 35-5O 0 C. Then the chip is washed at room temperature on an orbital shaker from 5 to 10 times with solutions of 0.5 x - 5 x SSC, 0.1% SDS. In the case of using enzymes for the manifestation of hybridization results, the last 3 washes are carried out with an SDS-free SSC solution.
  • PCR products are labeled with biotin, then for further identification a reaction is carried out with conjugate streptavidin peroxidase or streptavidin phosphatase.
  • a biological microchip for species identification of infectious agents can be either an individual chip or a multichip made on the surface of a common carrier element containing N individual chips.
  • differentiating oligonucleotide probes with one or more sequences are immobilized in the form of clusters, presented in SEQ ID NO: 59-87.
  • the supporting element of the microchip can be made in the form of flat platforms or films.
  • the preferred form of the multichip is a flat sheet of different thicknesses.
  • the shape of the multichip is selected based on preliminary information about the type of material for the multichip, about the proposed method of surface modification, information about the proposed method of processing the analysis data and the choice of equipment for the collection and processing of information.
  • the shape of a multichip can be a rectangle, square, disk, polygon.
  • the thickness of the supporting element may be from 0.5 to 5 mm.
  • Figure 1 shows the placement options of the main elements of the multichip on the surface of the supporting element without forming a common zone.
  • Fig.l (a) - (g) shows the distribution of zones on the carrier element of the multichip for different options.
  • the multichip contains a carrier element 100, on the surface of which N individual chips separated from the carrier element are placed in sectors 102, the number N of individual chips in the multichip is chosen at least 2.
  • a group of zones is formed: a) the working area of the chip for applying probes 103, b) the area for applying the first identifier 104 and optionally the second identifier 105.
  • the working area of an individual chip consists of a group of clusters 106, each of which formed by its probe.
  • the group of probe types that are selected for placement on the working surface of the chip includes a group of probes related to positive or negative controls, as well as a group of probes made in the form of labels, for example, labels identifying the position of the chip .
  • each sector is in contact with a zone 107 in contact with the boundaries of at least two individual chips adjacent to the outer contour of each sector. In the zone 107, recesses 108 and / or through holes between the chips 109 are made. Through holes can be made in the form of perforations, slots, gaps or intervals between the side boundaries of the chips. (Fig.
  • L (c) shows a variant of a multichip with a combination of recesses and through holes in between the chips with the placement of two identifiers.
  • Figure l (g) shows a variant of a multichip with a single identifier.
  • the recesses and / or through holes between the chips make it easy to separate the individual chips 110 from or from the carrier 100.
  • the ability to easily separate individual chips from a multichip allows sequential screening using a single multichip, in which all individual chips are manufactured under the same conditions, which allows you to compare individual chips during sequential diagnostics, for example, in the treatment of a patient.
  • at least one individual chip is sequentially separated, which is used for hybridization with PCR products in an individual chamber.
  • Figure l (a) shows a variant of a multichip with the formation on the surface of the multichip of one notch without through holes between the chips and with the placement of two identifiers.
  • the problem of cross-contamination is eliminated by a combination of grooves and through holes made in the form of perforations, slots, gaps or intervals between the side boundaries of the chips.
  • excess hybridization mixture will drain into recesses or through holes.
  • Figure 2 shows examples of cross-sectional shapes of the multi-chip carrier element for different recesses: a) a triangular recess 120, b) a spherical recess 121, c) a rectangular recess 122, d) a polygonal recess 123, e) a recess option from both sides of the carrier 124 Moreover, the recesses, preferably during stamping or casting, they can be arranged on either one or both sides of the multichip.
  • the thickness of the supporting element is selected from 0.5 to 5 mm.
  • the ratio of the thickness of the layer of the bearing element to the depth of the notch of the multichip is selected based on the mechanical and physical parameters of the selected material (hardness, brittleness) for the multichip and can be a ratio from 2: 1 to 100: 1. If you use a combination of recesses and through holes in the zone 107, then the ratio between the lengths of the recesses and through holes between the chips is selected in the range from 1: 10 to 10: 1. The ratio of the width of the recess to the width of the through holes can be selected in the range from 1:10 to 10: 1. The width of the recess is selected in the range from 0.1 mm to 5 mm.
  • FIG. Figure 3 shows the placement options of the main elements of the multichip on the surface of the carrier element, on which the common zone 111 is formed.
  • the common zone 111 of the carrier element of the multichip 100 can be located on the side, top, bottom or in the center of the chip array. It may be in the shape of a rectangle or, for example, in a cruciform shape.
  • the common zone has two functions. The first is related to its use for forming mounting and fixing holes 112 on it, which facilitate the fastening of multi-chip blanks during surface modification, numerous washing and surface cleaning before applying probes.
  • the second function of the common zone is the placement on its surface of a third identifier 113, on which information useful for subsequent analysis of diagnostic data during parallel or sequential screening of biopolymers can be placed.
  • FIG. 3 (a) shows the distribution of zones on the carrier element of the multichip.
  • the multichip contains a carrier element 100, on the surface of which N chips are placed, located in sectors 102, a group of zones is formed on the surface of each sector: a) the working area of the chip for applying the probes 103, b) the zone for applying the first identifier 104 and optionally the second identifier 105.
  • the working area of an individual chip consists of a group of clusters 106, each of which is formed by its own probe.
  • the composition of the clusters located on the working area of the chip is selected from the group of clusters of probes, clusters of positive controls, clusters of negative controls.
  • the number of clusters located in the working area of each individual chip can be from 2 to 1000. For low-cost chips, the number of clusters, placed in the working area of each individual chip, can be 15.
  • the number of deposited probes of one type of differentiating oligonucleotide on the surface of each cluster is from 1 to 50. For cheap chips, it is preferable if the number of deposited probes of one type of differentiating oligonucleotide on the surface of each cluster is 4 or 9.
  • the group of probes placed on the surface of the working area includes a group of probes related to positive or negative controls; a group of probes made in the form of marks, for example, marks identifying the position of the chip, can be placed.
  • the ratio between the number of clusters in which the probes are placed and the clusters in which positive or negative controls are placed is selected in the range from 1: 1 to 500: 1.
  • Each sector 102 is in contact with a zone 107 in contact with the boundaries of at least two individual chips adjacent to the outer contour of each sector and the boundary of the common area of the multichip. In the zone 107, recesses 108 and / or through holes between the chips 109 are made.
  • Figure 3 (6) shows a multi-chip variant with a combination of recesses and through holes between the chips with three identifiers.
  • the recesses and / or through holes, the gaps between the chips provide separation of the chips 110 from the carrier element 100 or relative to each other.
  • Fig. C (c) shows a variant of a multichip with recesses between the chips and with the placement of two identifiers. Separate microchips are obtained by separating the chip from the carrier element, the separation being carried out by breaking off, cutting, chopping off.
  • nitrocellulose, glass, plastics, Teflon, metal, and combinations thereof can be used as the basis for creating multichips.
  • not all materials listed in the group have the ability to covalently immobilize oligonucleotide probes. It is proposed to use polymers, glass, ceramics or their compositions as the material of the supporting element for creating a multichip.
  • Polymers are not fragile and can be manufactured using various technologies, including, but not limited to, stamping, casting, and machining methods.
  • the group of polymers used includes, but is not limited to, polymethyl methacrylate, polybutyl methacrylate, polyvinyl chloride, polycarbonate, copolymers of methyl methacrylate and / or copolymers of butyl methacrylate with other monomers, such as styrene, acrylonitrile and others. It is more preferable to use polymethyl methacrylate which is less transparent. make the basis of composite bearing surfaces. Polyvinyl chloride allows for efficient surface modification and is the basis for the manufacture of individual n multi-chips.
  • the ratios between the width and length of the multichip lie in the range from 1: 1 to 1:50.
  • chips whose dimensions are 12.5 mm x 75 mm, or mini-chips 25 mm x 37.5 m or 12.5 mm x 37.5 mm in size.
  • an individual biological microchip which can be included in the diagnostic kit either as an individual chip or as an element that is part of a multichip, contains 15 groups (clusters) of DNA probes, each of which is represented by one of 15 immobilized oligonucleotides (Fig.6 and table 1).
  • the chip contains 15 clusters of individual differentiating oligonucleotides applied in 4 or 9 repetitions, of which 12 clusters of oligonucleotides for one or two of the 15 infectious agents shown in table 1, 2 cluster of positive control and 1 cluster of negative control.
  • the resulting hybridization picture of the prototype is compared with positive and negative controls, which allows for reliable species identification.
  • the invention is known [18], in which the chip has two barcodes for identifying two working areas.
  • the invention is known [16], in which each individual zone with its encoded information in the form of a single identifier can be separated from the multichip and used individually.
  • the invention is known [19], which discusses the use of identifiers in conjunction with a computer to control the quality of chip manufacturing.
  • the difference of the present invention from the known variants is that an individual chip and a multichip has, depending on the type of medical diagnostics, at least two or three-level identification of data on a multifunctional multichip, which includes N individual chips.
  • the first identifier related to the identification of biological data is the object of research and, optionally, the second identifier with manufacturer data on the date of manufacture, type and parameters of the probes, and a multi-function multi-chip on the fastener zone of all chips further comprises a third identifier, which may be identical to the second identifier.
  • the first identifier is associated with the first code
  • the second identifier is associated with the second code, different from the first code.
  • These codes form unique N pairs of codes characterizing a multifunctional chip.
  • the identifier can be made in the form of digital and / or letter designations that serve as a code or in the form of bar codes or combinations thereof.
  • the first identifier of an individual chip may include the following data included in the group consisting of: a) a disease code, b) a code that characterizes the object from which the sample was taken (blood, lymph, scraping, saliva, etc.), ' c) the patient code or data code identifying the patient (name, age), d) the code of the medical institution and / or insurance company, e) the date of diagnosis.
  • the parameters of the second and third identifiers identifying the multichip may contain: a) the code of the batch number and / or date of manufacture, b) the code of the manufacturer, c) the code identifying the method of surface modification, d) the screening type code (serial, parallel), e) the code of the number of individual chips, e) the code of the number of clusters.
  • Such information can be useful for determining the qualitative characteristics of not only a multichip, but also its constituent components.
  • the combination of the first and second code or the first, second and third code should provide a unique code that corresponds to only one multichip. An appeal to such a unique code will provide a quick search of information in the databases of all samples during parallel screening, or information about sequential measurements.
  • Figure 4 shows a block diagram of an installation for conducting parallel and sequential screenings of biological objects. It includes: a computer 201, to which devices belonging to the group consisting of a display 202, a printer 203 and devices for scanning multi-chips or individual chips that can be selected from the group consisting of: a flatbed scanner 210, digital can be connected CCD cameras 211, scanner 212, individual chips 110, multi-chip scanner 213 located on disk 140, hand scanner 214.
  • a computer 201 to which devices belonging to the group consisting of a display 202, a printer 203 and devices for scanning multi-chips or individual chips that can be selected from the group consisting of: a flatbed scanner 210, digital can be connected CCD cameras 211, scanner 212, individual chips 110, multi-chip scanner 213 located on disk 140, hand scanner 214.
  • This information using a local network or via the Internet can be used by several users using their computers 207, for example, handhelds.
  • scanning devices for acquiring diagnostic data, which can implement at least one of three known methods: transmission measurement, reflection measurement, fluorescence measurement.
  • the fluorescence signal is detected using a detecting device, for example, an experimental setup consisting of a fluorescence microscope, a CCD camera and a computer, or a dark-field setup with a connected CCD camera [20], which is given in this description as a reference in which laser light is used light diodes.
  • a detecting device for example, an experimental setup consisting of a fluorescence microscope, a CCD camera and a computer, or a dark-field setup with a connected CCD camera [20], which is given in this description as a reference in which laser light is used light diodes.
  • Colorimetric detection for example, biotinylated DNA, is also carried out after washing the microchip using scanning devices, for example, an experimental setup consisting of a scanner and a computer, as a means for interpreting and storing diagnostic results and special software.
  • the hardware complex contains devices that are part of a group consisting of: hand-held barcode and image scanners, automatic flatbed scanners, scanners that provide information from individual individual chips and other scanners.
  • the scanner converts images of the working area of the chip that is part of the multichip or specific clusters located in the working area of the chip into signals obtained by measuring fluorescence, transmittance, colorimetric measurements, reflection signals, into digital data that is sent to a computer for further processing according to different algorithms.
  • a description of such hardware and software systems is well known in the literature. Interpretation of the results
  • FIG. 6 a block diagram of one embodiment, which includes but does not limit the scope of the invention, is shown in FIG. 6.
  • Differentiating oligonucleotides are divided into 12 (twelve) groups depending on the type of pathogen.
  • the signal intensity of the resulting perfect or imperfect duplexes within each group is significantly higher than the signal intensity of the negative controls, which allows reliable species identification of infectious pathogens.
  • Interpretation of the results is carried out on the basis of a hybridization picture, which is obtained using an experimental setup, including, for example, a scanner, a computer, and special software.
  • the “Madcan-l” program is used for digital image processing.
  • the interpretation of the results is as follows.
  • the intensities of fluorescent or colorimetric signals in each group of DNA probes containing oligonucleotides that are species-specific for one of the 12 infectious agents are compared using special software with the groups of probes of the positive (maximum signal intensity) and negative (minimum signal intensity) control.
  • a hybridization pattern is formed, which is different for the groups of positive control, negative control and 12 types of infectious agents, which allows us to unambiguously interpret the obtained data.
  • Each multichip is characterized by a multitude of parameters, which are included in the group consisting of: a) the signal intensity values in each specific cluster of the working area for each individual chip, b) the number of clusters in the working area of each individual chip and their distribution according to the objects of study, c) the number and the location of the positive and / or negative controls in the working area of each of the chips, d) the method of acquiring data on the signal intensity, e) the image of the working area of the chip in the form of a graphic image.
  • These parameters are formed according to certain algorithms into a computer file, which is transferred to a database, for example, to a general clinic computer.
  • the file includes a unique identification code, consisting of a combination of the first identification code of each individual chip and / or the second and third identification codes characterizing the parameters of the multichip.
  • a computer program identifies a unique multichip code in an automatic or interactive mode and processes the parameters recorded in a computer file when scanning a multichip or its individual components. Processing data are recorded in a file and, depending on the structure of information storage in each particular medical institution, are stored either on disks in a card file with a patient’s card, or stored in computer form on hard disks of the hospital’s central computer. These data can be contacted by a doctor. Moreover, the search for files is performed by entering the patient code and / or scanning barcodes from the patient’s card.
  • individual chips can be stored in the patient’s card and when scanning the barcode of the chip and entering a request into the central computer, the latter gives complete information on a file that characterizes all the parameters and diagnostic codes.
  • the doctor can compare the data obtained at different stages of the treatment of the disease according to the results of independent diagnostics, and adjust the treatment or intake of certain drugs in accordance with the diagnostic data.
  • the unique code of the multichip and its components makes it possible to simplify the program of searching for the necessary files and save diagnostic data in various forms, from computer files to storage of individual chips during the treatment of the patient.
  • kits for the species identification of infectious agents including: a) at least one biological individual microchip for one-time diagnostics or a biological multichip for parallel or sequential screening, described in paragraph 27; b) reagents that are selected from reagents for sample preparation, reagents for PCR, reagents for hybridization, and combinations thereof. c) specific oligonucleotides as PCR primers for species identification of an infectious agent, with sequences selected from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 58.
  • the kit according to p. 48 characterized in that it further comprises a device for conducting hybridization and / or a device for scanning and interpreting the results of the analysis, and for scanning using a device included in the group consisting of: a hand scanner, a scanner of individual chips, a tablet multi-chip scanner, disk multi-chip scanner and computer.
  • Example 1 Sewing oligonucleotide probes to the surface of amino-modified glass.
  • oligonucleotides modified with the phosphate group (p) at the 5'-position of ID SEQ No: 59, 68, 90 and 91 were used. Oligonucleotides were applied in clusters of 4 points.
  • the glasses were placed in a sealed container and kept at room temperature for one hour in a humid atmosphere to prevent droplets from drying out. Then the glasses were washed on a shaker with 1 M NaCI solution for 10 minutes to remove non-covalently bound oligonucleotide molecules, treated with distilled water and stored at 4 0 C.
  • the PCR mixture consisted of 10 mM Tris-Hcl pH 8.8, 50 mM KCl, 0.8% Nopidet P40, 2 mM MgCl 2 , 100 nr DNA of the analyzed sample, specific oligonucleotide primers ID SEQ No: 1, 2, 19, 20, 88 and 89 and 8 units.
  • Taq polymerase in a volume of 20 ⁇ l.
  • Oligonucleotides ID SEQ No: 1, 19 and 88 used at a concentration of 0.05 ⁇ M.
  • Oligonucleotides ID SEQ No: 2, 20, and 89 modified with biotin at the 5 'position were used at a concentration of 0.25 ⁇ M.
  • the reaction was carried out on a Master-Susler DNA amplifier (Herrepdorf, Germany) under the conditions given in Table 3.
  • microchip was dried at room temperature for 5-10 minutes.
  • the original streptavidin-peroxidase conjugate (Imbio, Russia) was diluted sequentially 200 times with Ix SSC containing 1% BSA.
  • the conjugate was applied to the working area of the substrate, covered with a coverslip and kept in a humid atmosphere at room temperature for 30 minutes. Unbound conjugate was washed with 2x SSC for 5 minutes, Ix SSC for 5 minutes, and O 3 IxSSC for 1 minute.
  • the substrate was poured with a freshly prepared solution of the substrate dimethylaminobenzidine. For this, not more than half an hour before the reaction, 1 mg DAB in 1 ml 0.1 x SSC was dissolved, 20 ⁇ l of a 3% hydrogen peroxide solution was added and mixed. The working area was poured with the prepared substrate solution, covered with a coverslip and kept for 10 to 30 minutes at room temperature. In the case of a positive reaction, brown spots of the oxidized substrate appeared. Then the glass was washed with distilled water and placed in a vertical position in a container for drying and further storage. Example 5. Detection of a chromogenic probe.
  • FIG. Figure 5 presents a hybridization picture of a mixture of DNA samples taken from smears of patients infected with urogenital agents. DNA was isolated from the mixture and performed PCR analysis of a mixture of 13 pairs of primers specific for 12 pathogens belonging to the group consisting of: Shlatudia trashotatis, Neisseria goporrhoeae, Trishotopas vagipalis, Urearlasta irealutisit, Candida albisaps, Musorlasta gepitaliit, Musorlasta hotipis, Gardperella vagipalis , Stertosossi agalastiae, Nitap herresviris 1, Nitap herviris 2, Nitap herviris 4, Nitap herviris 5 and DNA positive control.
  • Shlatudia trashotatis Neisseria goporrhoeae
  • Trishotopas vagipalis Trishotopas vagipalis
  • Urearlasta irealutisit Candida alb
  • the method for the specific identification of infectious agents, mainly the urogenital area, on a biological microchip compares favorably with the speed of analysis, the simplicity of the method used to prepare a DNA sample for hybridization, the ability to simultaneously identify up to 15 of the most common pathogens, and the possibility of analysis in laboratory or field conditions, and also relative cheapness.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области микробиологии, вирусологии, биотехнологии, молекулярной биологии и генной инженерии и предназначено для выявления типичных последовательностей ДНК различных инфекционных агентов (бактерий, вирусов, грибов и т.д.), в образцах биологических материалов (кровь, биопсийный материал, слюна, слезные выделения, моча, бронхо-авеолярный лаваж, ликвор, спинномозговая жидкость и др.) человека и животных. Способ идентификации последовательностей ДНК в биологическом материале включает выделение нуклеиновых кислот, проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции с использованием выделенной из анализируемого материала ДНК и последующую гибридизацию флуоресцентно меченых или биотинилированных продуктов этой реакции на специализированных биочипах. Предложены набор олигонуклеотидов, биологический микрочип и набор реактивов для проведения такого способа. Предложенная группа изобретений позволяет ускорить проведение анализа и повысить его точность. Изобретение может быть использовано в медицине, ветеринарии и вирусологии. Метод пригоден для массового скрининга образцов биологических материалов.

Description

Способ идентификации урогенитальной инфекции, олигонуклеотид, комбинация олигонуклеотидов, биочип и набор на его основе.
Область техники
Изобретение относится к области микробиологии, вирусологии, биотехнологии, молекулярной биологии и генной инженерии, а именно, к видовой идентификации инфекционных патогенов (бактерий, вирусов, грибов и т.д.) в биологических образцах, включающей этапы амплификации ДНК и последующей гибридизации амплифицированной ДНК на биологическом микрочипе. Изобретение также раскрывает состав высокоспецифичных ДНК- зондов и олигонуклеотидов, набор реактивов и способ регистрации и интерпретации результатов. Уровень техники
В настоящее время для видовой идентификации инфекционных патогенов применяются методы иммуноферментного анализа - ИФА [1,2], методы микробиологического анализа [3], методы вирусологического анализа [4], методы, основанные на ПЦР [5], в том числе с последующим анализом длины амплифицированного фрагмента [6] или с последующим определением нуклеотидной последовательности (секвенирование) [7].
Эффективность ИФА зависит от типа исследуемого материала и наличия высокоспецифичных моноклональных антител для каждого вида патогенов. Вввиду близкого антигенного родства различных патогенов, результаты исследования инфекционных агентов не всегда достоверны.
Методы микробиологического и вирусологического анализа являются культуральными методами и, соответственно, требуют специального оборудования и высококвалифицированного персонала. Анализ занимает несколько дней и связан с особыми мерами предосторожности из-за повышенной биологической опасности.
Серьезным недостатком метода традиционной ПЦР [6] является визуальный характер оценки результатов, что может приводить к их ложной интерпретации. В случае метода с определением нуклеотидной последовательности процедуры анализа довольно продолжительны и дорогостоящи. Кроме того, они также требуют наличия специального оборудования и высококвалифицированного персонала.
Известно изобретение, в котором диагностику урогенитальных болезней осуществляют, исследуя в одном образце комплексы, содержащие грамм- положительные бактерии и другие микроорганизмы, такие как дрожжи, простейшие микроорганизмы, микоплазма и грамм-отрицательные бактерии [8].
Известно изобретение, в котором рассматривается способ диагностики, в котором используются группы нуклеиновых кислот для формирования проб, гибридизующихся с областью 16S рРНК или 16S рДНК Urеарlаsта иrеаlуtiсιιт [9].
Известно изобретение, в котором одновременно детектируется множество микроорганизмов, выбираемых из группы Nеϊssеriа gопоrrhоеае, Nеissеriа тепiпgitidis, Наеторhilιιs dιιсrеуi, Вrапhатеllа саtаrrhаlis, Воrdеtеllа реrtиssis, Наеторhihιs iпflиепzае, Strерtососсиs рпеитопiае, Strерtососсиs аgаlасtiае, Сатруlоbасtеr jеjιtпi, СатруlоЪасtеr соli Или их комбинаций. В этом изобретении нуклеиновые кислоты многих микроорганизмов приводят в контакт с мембраной, содержащей области, в которых нанесены образцы нуклеиновых кислот взятых из транскипционного участка гена между 16S и 23 S рРНК гена прокариотического микроорганизма и содержащего от 15 до 100 нуклеотидов [10].
В изобретении [11] приведены праймеры для амплификации участков 16S- 23 S рРНК и последующей гибридизации для обнаружения микроорганизмов, входящих в группу штаммов Мусоbасtеήит, Сhlатуdiа, Ыstеriа, Вrисеllа и Yеrsiпiа епtеrоlitiса. В изобретении [12] приведено техническое решение по применению ПЦР в реальном времени для диагностики любых эубактерий, используя высококонсервативную область 16S рРНК гена.
В изобретении [13] приведены олигонуклеотиды и амшшфикационные праймеры для определения наличия бактерий или грибов, входящих в группу Епtеrососсгιs fаесiит, Ыstеriа топосуtоgепеs, Nеissеrа тепiпgitidis, Strерtососсиs аgаlасtiае, Сапdidа аlbiсапs, Епtеrососсиs gепиs, Nеissеriа gепиs, Stарhуlососсиs gепиs, Strерtососсиs gепиs апd Сапdidа gепиs. Амплификацию осуществляют с помощью ПЦР и других систем: LCR, NASBA, 3SR, SDA, bDNА, (TMA), CPT, гнездовой ПЦР и мультиплексной ПЦР. Известны праймеры и наборы ПЦР для идентификации Неrреs siтрlех virиs tуреs 1 апd 2 [23, 24] и Неrреs siтрlех virиs tуреs 4 вируса Эпштейна-Барра
[25]. Значительная часть известных технических решений относится к решению конкретных задач, связанных либо с поиском новых типов праймеров или технологий их применения для задач диагностики [26 - 37].
Наиболее близким решением к данному изобретению относится изобретение [14]. В данном изобретении описывается способ определения положения множества образцов с разными генотипами на поверхности одного микрочипа. Данный метод относится к применению мультипраймерной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием, флуоресцентно меченых праймеров для получения амплифицированных одноцепочечных ДНК. Под мультипраймерной ПЦР принято понимать процесс совместной амплификации нескольких ДНК-матриц в одной реакционной среде с использованием нескольких пар праймеров, что позволяет проводить скрининг сразу по нескольким инфекционным возбудителям.
Однако данный способ неприменим без значительных доработок для создания относительно недорогого микрочипа или мультичипа, состоящего из нескольких чипов, для идентификации урогенитальных инфекций. Общие принципы проведения мультипраймерных ПЦР содержат свои особенности, связанные с выбором температур проведения ПЦР, длиной праймеров и выбором последовательностей праймеров, не оказывающих влияния друг на друга в процессе амплификации. Кроме того, эффективность диагностики во многом определяется выбором перечня патогенных организмов, с помощью которых осуществляют идентификацию смешанной урогенитальной инфекции. Задача настоящего изобретения состоит в повышении эффективности диагностики и создании недорогого способа определения смешанной урогенитальной инфекции с помощью идентификации до 15 видов патогенов на биологических микрочипах.
Другой задачей изобретения является разработка биологического микрочипа и мультичипа для проведения диагностики в лабораторных условиях без применения сложного диагностического оборудования. Сущность изобретения
Одним из объектов изобретения является способ идентификации урогенитальной инфекции, включающий обеспечение образца исследуемой ДНК, прямых и обратных праймеров, специфичных к идентификации инфекционных агентов в урогенитальной области, и биологического микрочипа, содержащего дифференцирующие олигонуклеотиды, проведение ПЦР в присутствии образца ДНК и праймеров с зондами, специфичных к идентификации инфекционных агентов, инкубацию ПЦР-продукта с биологическим микрочипом в условиях гибридизации, определение урогенитальной инфекции детекцией образованных гибридизационных комплексов на микрочипе, причем биологический микрочип содержит дифференцирующие олигонуклеотиды с последовательностями, представленными в SEQ ID NO:59-87, в качестве специфичных праймеров используют праймеры, последовательность которых выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-58, в качестве ПЦР используют асимметричную ПЦР, причем в паре прямого и обратного праймеров один праймер содержит метку, которую после гибридизации ДНК детектируют, регистрируют данные детекции и используют данные регистрации для идентификации инфекционных агентов в урогенитальной области. Другим объектом изобретения является специфический олигонуклеотид в качестве праймера ПЦР для видовой идентификации инфекционного агента в способе идентификации урогенитальной инфекции с последовательностями, представленными от SEQ ID NO : 1 по SEQ ID NO: 58.
Другим объектом изобретения является дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда для видовой идентификации инфекционного агента в способе идентификации урогенитальной инфекции с последовательностями, представленными от SEQ ID NO: 59 по SEQ ID NO: 87.
Другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Сhlаiпуdiа trасhотаtis, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, либо SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
Другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Nеissеriа gопоrrhоеае, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 61 и SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, либо SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 84, либо SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10.
Другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Тriсhотопаs vаgiпаlis, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 64 и SEQ
ID NO: И и SEQ ID NO: 12, либо SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO:
14.
Другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Urеорlаsта иrеаlуtiсит и/или Urеарlаsта раrvит, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 66 и SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, либо SEQ ID NO: 67 и
SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18.
Другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Сапdidа аlbiсапs, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 68 и SEQ
ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, либо SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO:
22.
Другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Мусорlаsта gепitаliит, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 70 и SEQ
ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24, либо SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO:
26, либо SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28.
Другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Мусорlаsта hотiпis, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 73 и SEQ
ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30, либо SEQ ID NO: 74 и SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO:
32 , либо SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34.
Другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Gаrdпеrеllа vаgiпаlis, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 76 и SEQ
ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36, либо SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO:
38, либо SEQ ID NO: 78 и SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40.
Другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Strерtососсиs аgаlасliае , которая включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO:.41 и SEQ ID NO: 42. -
Другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Strерtососсиs аgаlасtiае и/или Strерtососсиs руоgепеs, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO: 80 и SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44.
Другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Нитап hеrреsvirиs 1 и/или Нитап hеrреsvirиs 2, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 81 и SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46, либо SEQ ID NO: 82 и SEQ ID
NO: 47 и SEQ ID NO: 48.
Другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Нитап hеrреsvirиs 4, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 50, либо SEQ ID NO: 84 и SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO:
52, либо SEQ ID NO: 85 и SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54.
Другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Нитап hеrреsvirиs 5, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 86 и SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 56, либо SEQ ID NO: 87 и SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO:
58.
Другим объектом изобретения является биологический микрочип для видовой идентификации инфекционных агентов, представляющий собой несущий элемент, на котором иммобилизованы дифференцирующие олигонуклеотиды с одной или более последовательностями, представленными в
SEQ ID NO:59 до SEQ ID NO:87.
Другим объектом изобретения является набор для видовой идентификации инфекционных агентов, включающий: а) по меньшей мере, один биологический индивидуальный микрочип для проведения разовой диагностики или биологический мультичип для проведения параллельного или последовательного скрининга, содержащий дифференцирующие олигонуклеотиды с одной или более последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 59 по SEQ ID NO: 87. б) реагенты, которые выбирают из реагентов для подготовки образца, реагентов для проведения ПЦР, реагентов для проведения гибридизации и их комбинации. в) специфические олигонуклеотиды в качестве праймеров ПЦР для видовой идентификации инфекционного агента с последовательностями, которые выбирают от SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 58.
Другим объектом изобретения является набор, который, кроме биологического микрочипа или мультичипа, реагентов для подготовки образца, реагентов для проведения ПЦР, реагентов для проведения гибридизации и их комбинации и специфических олигонуклеотидов в качестве праймеров ПЦР для видовой идентификации инфекционного агента, дополнительно содержит устройство для проведения гибридизации и/или устройство для сканирования и интерпретации результатов анализа, причем для сканирования используют устройство, входящее в группу, состоящую из: ручного сканера, сканера индивидуальных чипов, планшетного сканера мультичипов, сканера дисковых мультичипов и компьютера, как средства для интерпретации и хранения результатов диагностики.
Перечень фигур Фиг. 1. Размещение основных элементов мультичипа на поверхности несущего элемента: а) и б) - распределение зон на несущем элементе мультичипа; в) вариант мультичипа с комбинацией выемок и сквозных отверстий между чипами с размещением двух идентификаторов; г) вариант мультичипа с выемками между чипами с размещением одного идентификатора.
Фиг. 2. Сечение несущего элемента мультичипа для разных вариантов выемок: а) треугольная выемка, б) сферическая выемка, в) прямоугольная выемка, г) многоугольная выемка, д) вариант выемки с двух сторон несущего элемента. Фиг. 3. Размещение основных элементов мультичипа на поверхности несущего элемента с формированием общей зоны на несущем элементе: а) распределение зон на несущем элементе мультичипа; б) вариант мультичипа с комбинацией выемок и сквозных отверстий между чипами с размещением трех идентификаторов; в) вариант мультичипа с комбинацией выемок и сквозных отверстий между чипами с размещением двух идентификаторов.
Фиг. 4. Блок-схема системы для сбора, обработки и передачи данных, считанных с мультичипов, на индивидуальные компьютеры пользователей. Фиг. 5. Изображение точек при детекции экспериментального слайда для проверки эффективности выбора зондов и праймеров, а также положительных и отрицательных контролей для диагностирования урогенитальной инфекции.
Фиг. 6. Структурная схема медицинского чипа.
Сокращения
ИФА - иммуноферментный анализ
Позиции 100 - относятся к конструктивным элементам мультичипа.
Позиции 200 - относятся к системе для анализа результатов диагностики.
Описание изобретения
В общем случае, способ видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, включает следующие стадии: выбор мишени, выбор праймеров и зондов, синтез зондов и праймеров, приготовление биологического микрочипа (например, модификация поверхности), нанесение зондов, выделение ДНК, амплификация ДНК при помощи ПЦР, гибридизация ДНК на микрочипе, детектирование и регистрация полученного результата, идентификация и интерпретация полученных результатов.
Выбор мишени. В процессе изучения способов диагностики урогенитальных инфекций и известных диагностических микрочипов было обнаружено, что большинство известных решений, связанных с выбором перечня патогенных организмов для диагностики, не учитывает тот факт, что в последнее время идет быстрый рост заболеваний, связанных со смешанной урогенитальной инфекцией [38]. К неочевидному решению в рамках настоящего изобретения можно отнести выбор перечня патогенных организмов, с помощью которых осуществляют идентификацию смешанной урогенитальной инфекции. Перечень, представленный в таблице N°l, составлен таким образом, что он устраняет недостатки известных изобретений. В перечень, в совокупности с бактериями, дрожжами и грибами, широко встречающимися в урогенитальной диагностике, включены вирусы, а именно вирусы Нитап hеrреsvirиs 1 и/или Нитап hеrреsvirиs 2, Нитап hеrреsvirиs 4 и Нитап hеrреsvirиs 5. Такая совокупность вирусов, бактерий, дрожжей и грибов позволяет реализовать техническую задачу изобретения, связанную с повышением эффективности диагностики одновременно, быстро и с минимальными затратами диагностировать в одном анализе от 1 до 15 патогенов, основанном на идентификации до 26 участков ДНК, специфичных для этих патогенных организмов.
Таблица Ng 1. Перечень патогенных организмов и мишеней.
Figure imgf000011_0001
5.
0 ,
5
0
Figure imgf000012_0001
Выбор специфических и дифференцирующих олигонуклеотидов и их возможные 5 комбинации.
Выбор специфических олигонуклеотидов для ГЩР.
Праймеры выбраны с учетом требований высокой специфичности к консервативным участкам генов исследуемых патогенов, что позволяет избирательно амплифицировать фрагмент ДНК патогенного организма 0 непосредственно из выделенного биологического образца. При этом исходили из требований, стандартно применяемых к праймерам, в которые входят: отсутствие высокостабильных вторичных структур, малое расхождение температур плавления, не превышающее 2-3 °C, а также выбор длины праймеров в диапазоне от 15 до 55 н.о. Для составления праймеров выбирались последовательности, характерные для идентифицируемого патогенного организма и представленные в базе данных нуклеотидных последовательностей GепВапk (http://ncbi.nlm.nih.gov), в которых выбирались наиболее консервативные участки, не используемые ранее и неочевидные для составления специфических и дифференцирующих олигонуклеотидов для создания биологических чипов.
Каждая пара олигонуклеотидов для ПЦР, специфичных к какой-либо мишени патогенов, состоит из одного немеченого (не содержащего одну или несколько меток, необходимых для последующего анализа и интерпретации результатов) специфического олигонуклеотида из перечисленных в списке последовательностей с любым нечетным номером с SEQ ID NO: 1- по SEQ ID
NO: 57 и меченого (содержащего одну или несколько меток, необходимых для последующего анализа и интерпретации результатов) специфического олигонуклеотида из перечисленных в списке последовательностей с любым четным номером с SEQ ID NO: 2 по SEQ ID NO: 58, следующим сразу за первым специфическим олигонуклеотидом пары.
Выбор дифференцирующих олигонуклеотидов.
Дифференцирующие олигонуклеотиды выбирали с учетом требований высокой специфичности к консервативным участкам генов исследуемых патогенов, что позволяет проводить избирательную гибридизацию фрагментов ДНК, амплифицируемых со специфическими олигонуклеотидами при помощи ПЦР непосредственно из биологических образцов, а также исходя из отсутствия высокостабильных вторичных структур и имеющие длину от 15 до 55 н.о.
Дифференцирующие олигонуклеотиды характеризуются видовой специфичностью к патогенам, преимущественно урогенитальной области.
Допустимо использование олигонуклеотидов, гомологичных указанным в перечне последовательностей олигонуклеотидам, не менее, чем на 80% , предпочтительно, не менее чем на 90%, наиболее предпочтительно, не менее чем на 95% . Допустимо использование олигонуклеотидов, имеющих делеции или вставки одного или нескольких нуклеотидов.
Комбинации олигонуклеотидов
1. Для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида Сhlатуdiа trасhотаtis используют любую из двух комбинаций, в которую входят один
И дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров ПЦР. В одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 59 и два специфических SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 олигонуклеотида, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 60 и два специфических SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 олигонуклеотида.
2. Для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида Nеissеriа gопоrrhоеае используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров ПЦР. В одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 61 и два специфических SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 олигонуклеотида, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 62 и два специфических SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 84 олигонуклеотида и в третью комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 63 и два специфических SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 олигонуклеотида.
3. Для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида Тriсhотопаs vаgiпаlis используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров ПЦР. В одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 64 и два специфических SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 олигонуклеотида, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 65 и два специфических SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 олигонуклеотида.
4. Для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида Urеарlаsта иrеаlуtiсит и/или Urеарlаsта раrvит используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров ПЦР. В одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 66 и два специфических SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 67 и два специфических SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18 олигонуклеотида.
5. Для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления грибов вида Сапdidа аlbiсапs используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров ПЦР. В одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 68 и два специфических SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20 олигонуклеотида, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 69 и два специфических SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22 олигонуклеотида.
6. Для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида
Мусорlаsта gепitάliит используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров ПЦР. В одну из комбинаций входят дифференцирующий ,,SEQ ID NO: 70 и два специфических SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 71 и два специфических SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26 олигонуклеотида и в третью комбинацию входит дифференцирующий SEQ ID NO: 72 и два специфических SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28 олигонуклеотида.
7. Для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида Мусорlаsта hотiпis используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров ПЦР. В одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 73 и два специфических SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30 олигонуклеотида, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 74 и два специфических SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32 олигонуклеотида и в третью комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 75 и два специфических SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 3 4 олигонуклеотида.
8. Для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида Gаrdпеrгllа vаgiпаlis используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров ПЦР. В одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 76 и два специфических SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 77 и два специфических SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38 олигонуклеотида и в третью комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 78 и два специфических SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40 олигонуклеотида.
9. Для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида Strерtососсиs аgаlасtiае используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров ПЦР. В одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 79 и два специфических SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 42 олигонуклеотида.
10. Для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида
Strерtососсиs аgаlасtiае и/или Strерtососсиs руоgепеs используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров ПЦР. В одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 80 и два специфических SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44 олигонуклеотида.
11. Для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления вирусов Нитап hеrреsvirιιs 1 и/или Нитап hеrреsvirиs 2 используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров ПЦР. В одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 81 и два специфических SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46 олигонуклеотида, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 82 и два специфических SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48 олигонуклеотида.
12. Для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления вирусов Нитап hеrреsvirиs 4 используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров ПЦР. В одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 83 и два специфических SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 50 олигонуклеотида, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 84 и два специфических SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52 олигонуклеотида и в третью группу входят дифференцирующий SEQ ID NO: 85 и два специфических SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54 олигонуклеотида.
13. Для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области,- и специфического выявления вирусов Нитап hеrреsvirиs 5 используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров ПЦР. В одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 86 и два специфических SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 56 олигонуклеотида, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 87 и два специфических SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58 олигонуклеотида. Таблица 1-1. Специфические олигонуклеотиды (часть 1).
Figure imgf000018_0001
Таблица 1-2. Специфические олигонуклеотиды (часть 2).
Figure imgf000019_0001
Таблица 1-3. Специфические олигонуклеотиды (часть 3).
Figure imgf000020_0001
Таблица 2-1. Дифференциирующие олигонуклеотиды (часть 1).
Figure imgf000021_0001
Таблица 2-2. Дифференциирующие олигонуклеотиды (часть 2).
Figure imgf000022_0001
Синтез зондов и праймеров
Олигонуклеотиды синтезируют на автоматическом синтезаторе (например, модель "Gепе Аssеmblеr" фирмы Рhаrmасiа стандартным амидофосфитным методом. Для иммобилизации на поверхности чипа дифференцирующие олигонуклеотиды модифицируют по 5'- или 3' -концу, например, 5'- концевую фосфатную группу вводят в процессе синтеза. Один из пары специфических олигонуклеотидов для проведения ПЦР модифицируют по 5'-кoнцy меткой, которую выбирают из группы, состоящей из: каталитической, лигандной, флуоресцентной и радиоактивной, которую вводят химическими методами или энзиматически .
Приготовление биологического микрочипа (модификация поверхности) Матрицу, имеющую поверхностные аминогруппы, изготовляют с помощью раствора 3-aминoпpoпилтpиэтoкcиcилaнa (АПТЭС) в различных растворителях в зависимости от типа подложек. Например, стеклянные подложки инкубируют в растворе 3-aминoпpoпилтpиэтoкcиcилaнa в ацетоне или в этаноле. Концентрацию АПТЭС варьируют от 0,1 до 10% по объему. Если реакцию проводят в ацетоне, стекла трижды промывают ацетоном по 5 минут, затем этанолом 2 раза по 3 минуты и прокаливают при температуре 120-1300C в течение 20 минут.
Нанесение зондов .
Реакционную смесь, содержащую 1 мкМ олигонуклеотида и 60 мМ гидрохлорида l-этил-3-(3-димeтилaминoпpoпил)-кapбoдиимидa в 0.1 M 1- метилимидазоле, рН 7.0, наносят на поверхность матрицы роботом (Хрrеss Lапе, США). Объем капель каждого зонда составляет не менее 0.005 мкл. Матрицы с нанесенными олигонуклеотидами помещают в герметичную емкость, выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа во влажной атмосфере и промывают на шейкере 1 M раствором NaCI в течение 10 минут, затем дистиллированной водой. Биочип высушивают и хранят при комнатной температуре. Концентрация олигонуклеотида в объеме капель каждого зонда составляет от 0.5 до 100 мкМ.
Выделение ДНК и подготовка материала для амплификации. Выделение ДНК из биологического образца (кровь, биопсийный материал, слюна, слезные выделения, моча, бронхо-авеолярный лаваж, ликвор, спинномозговая жидкость и др.) проводят с использованием общепринятых методик, основанных, например, на щелочном лизисе, применении детергентов, протеиназы К, экстракции фенолом, хлороформом и/или смесью фенол/хлороформ, либо очистку на диатомовой земле или диоксида кремния. Перед выделением ДНК к образцу добавляют ДНК положительного контроля.
Положительные и отрицательные контроли. В рамках данного изобретения положительные контроли используютея в диагностическом наборе для подтверждения соблюдения оптимальных условий проведения процедур, необходимых для идентификации заявленных патогенных организмов, а именно, выделения ДНК из биологического материала, проведения ПЦР и гибридизации. В качестве положительного контроля 1 служит ДНК с известной нуклеотидной последовательностью. Такой ДНК может быть как природная ДНК какого-либо организма, либо искусственная последовательность, например, рекомбинантная ДНК, либо фрагмент такой ДНК, полученный при помощи ПЦР или другим способом. ДНК положительного контроля 1 амплифицируют при помощи асимметричной ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидов так же, как исследуемые образцы. Специфические олигонуклеотиды для амплификации ДНК положительного контроля 1 подбирают таким образом, чтобы ее амплификацию можно было проводить при помощи ПЦР в тех же условиях, что и для определяемых патогенных организмов. Для идентификации ДНК положительного контроля 1 на чип иммобилизуют дифференцирующий олигонуклеотид, комплементарный последовательности ДНК положительного контроля, нарабатываемой в одноцепочечной форме. В качестве положительного контроля 2 на чип иммобилизуют олигонуклеотид или несколько олигонуклеотидов, комплементарных специфическим олигонуклеотидам для ПЦР, которые модифицированы по 5 '-концу меткой из группы, приведенной в п. «Cинтeз зондов и пpaймepoв».
Отрицательные контроли в рамках данного изобретения используют для подтверждения соблюдения оптимальных условий гибридизации. В качестве отрицательного контроля на чип иммобилизуют олигонуклеотид, частично комплементарный последовательности ДНК положительного контроля, нарабатываемой в одноцепочечной форме, или олигуноклеотиды, частично комплементарные специфическим олигонуклеотидам для ПЦР, которые модифицированы по 5 '-концу меткой из группы, приведенной в п. «Cинтeз зондов и пpaймepoв». В последовательности дифференцирующего олигонуклеотида, служащего в качестве отрицательного контроля, количество и положение нуклеотидов, несоответствующих последовательности ДНК положительного контроля или специфическим олигонуклеотидам для ПЦР, подбирают таким образом, чтобы этот дифференцирующий олигонуклеотид был способен образовывать и сохранять несовершенный дуплекс с одноцепочечной ДНК положительного контроля или специфического олигонуклеотида для ПЦР при несоблюдении условий гибридизации и отмывки, а именно, при проведении гибридизации и отмывки в условиях, более мягких по сравнению с оптимальными. В качестве примера, который включает, но не ограничивает объем изобретения, в перечне последовательности приведены специфические олигонуклеотиды ID SEQ No: 88 и 89, которые используют для амплификации ДНК плазмиды pUC18 при помощи асимметричной ПЦР, а также дифференцирующие олигонуклеотиды ID SEQ No: 90 и 91, которые иммобилизуют на поверхности чипа и используют в качестве, соответственно, положительного и отрицательного контролей.
Выбор метки
Известно большое число патентов, в которых рассматриваются разные типы меток для построения биологических чипов. Известна классификация меток на группы, состоящие из: каталитических, лигандных, флуоресцентных или радиоактивных молекул [21,22]. Указанные патенты приведены в качестве ссылок. Каталитическую молекулу выбирают из группы, включающей гемин, цианкобаламин или флавин. Лигандную молекулу выбирают из группы, включающей биотин, диоксигенин или динитробензол. Флуоресцентную молекулу выбирают из группы, включающей FAM, TAMRA, СуЗ, Cy5, Cy7, R6G, RI lO, ROX или JOE. Амплификация ДНК при помощи ГЩР
Однонитевые фрагменты ДНК типичных последовательностей инфекционных агентов, приведенных в таблице 1, получают в реакции асимметричной ПЦР с использованием высокоспецифичных праймеров.
Условия ПIJР.
В состав ПЦР-смеси входит lх-кратный реакционный буфер, например, от 10 до 80 мМ трис-НСl pH8,8, до 50 мМ KCl и\или до 25 mМ (NH4)2SO4, 0,1% тритон X-IOO, или 0,1% Тwееп 20, или 0,8% Nопidеt P40, от 1 мМ до 5 мМ, оптимально от 1,5 мМ до 2,5 мМ, MgCl2 или MgSO4, от 10 мкг до 300 мкг, оптимально от 50 мкг до 200 мкг, ДНК анализируемого образца и не менее одной пары специфических олигонуклеотидных праймеров для каждой мишени. Общее количество пар специфических олигонуклеотидов может варьировать от 1 до 29 в сочетаниях для идентификации, по меньшей мере, одного инфекционного агента в форме патогенных микроорганизмов и/или грибов и/или вирусов. В состав ПЦР-смеси входит от 1 ед. до 20 ед., оптимально от 6 ед. до 14 ед., наиболее оптимально от 8 ед. до 12 ед. активности Таq-полимеразы. В состав ПЦР смеси могут входить реагенты, повышающие специфичность и эффективность ПЦР, например, такие как бетаин, эктаин и его производные, а также трегалоза, диметилсульфоксид, глицерин.
Концентрация немеченого специфического олигонуклеотида в ПЦР может составлять от 0,025 мкМ до 0,2 мкМ, оптимально от 0,05 мкМ до 0,1 мкМ, и концентрация меченого специфического олигонуклеотида в ПЦР составляет от 0,125 мкМ до 1 мкМ, оптимально от 0,25 мкМ до 0,5 мкМ. Соотношение немеченого олигонуклеотида к меченому составляет от 1/2 до 1/50, оптимально от 1/5 до 1/10. Объем реакционной смеси может составлять от 5 мкл до 200 мкл, оптимально от 20 мкл до 50 мкл. Реакцию можно проводить под минеральным маслом или без него, в зависимости от конструкции ДНК-амплификатора. ПЦР проводят с использованием ДНК амплификатора (например Терцик, ДНК- технология, Россия или Маstеrсусlеr, Еррепdоrf, Германия), в условиях, приведенных в Таблице 2. Таблица 2. Условия проведения ПЦР.
Figure imgf000027_0001
Проведение гибридизации.
Меченые продукты ПЦР гибридизуются с ДНК-зондами (дифференцирующими олигонуклеотидами), иммобилизованными на биочипе, в специально подобранном буфере.
Условия гибридизации:
Гибридизацию проводят в буфере, 'содержащем 0,5 х — 5 х SSC, 0,1% SDS, до 25% формамида и\или до 10 мМ ЭДТА в течение 1 часа при 35 — 5O0C. Затем чип промывают при комнатной температуре на орбитальном шейкере от 5 до 10 раз растворами 0,5 х — 5 х SSC, 0,1% SDS. В случае использования ферментов для проявления результатов гибридизации последние 3 промывки проводят раствором SSC, не содержащим SDS.
Проведение пероксидазной реакции
В случае, если продукты ПЦР мечены биотином, то для дальнейшей идентификации проводят реакцию с коньюгатом стрептавидин- пероксидаза или стрептавидин - фосфатаза.
Структура биочипа
Биологический микрочип для видовой идентификации инфекционных агентов, предпочтительно урогенитальной области, может представлять собой как индивидуальный чип, так и мультичип, выполненный на поверхности общего несущего элемента содержащего N индивидуальных чипов. В рабочей зоне индивидуальный чипа иммобилизованы в форме кластеров дифференцирующие олигонуклеотиды-зонды с одной или более последовательностями, представленными в SEQ ID NO:59-87. Несущий элемент микрочипа может быть выполнен в виде плоских платформ или пленок.
Известно выполнение мультичипа в форме прямоугольных платформ [15], прямоугольных листов [16] или в форме плоского диска [17] . Предпочтительной формой мультичипа является плоский лист разной толщины. В рамках настоящего изобретения форму мультичипа выбирают на основании предварительной информации о типе материала для мультичипа, о предполагаемом способе модификации поверхности, информации о предполагаемом способе обработки данных анализа и выборе оборудования для съема и обработки информации. Форма мультичипа может представлять собой прямоугольник, квадрат, диск, многоугольник. Толщина несущего элемента может составлять от 0,5 до 5мм.
На фиг.1 показаны варианты размещения основных элементов мультичипа на поверхности несущего элемента без формирования общей зоны. На фиг.l(a) - (г) приведено распределение зон на несущем элементе мультичипа для разных вариантов. В общем случае, мультичип содержит несущий элемент 100, на поверхности которого размещают N отделяемых от несущего элемента индивидуальных чипов в секторах 102, количество N индивидуальных чипов в мультичипе выбирают не менее 2. На поверхности каждого сектора 102, принадлежащего индивидуальному чипу, формируют группу зон: а) рабочую зону чипа для нанесения зондов 103, б) зону для нанесения первого идентификатора 104 и необязательно второго идентификатора 105. Причем рабочая зона индивидуального чипа состоит из группы кластеров 106, каждый из которых формируется своим зондом. В группу типов зондов, которые выбирают для размещения на рабочей поверхности чипа, кроме зондов, относящихся к диагностике проб, входит группа зондов, относящихся к положительным или отрицательным контролям, а также группа зондов, выполненных в форме меток, например, меток, идентифицирующих положение чипа. Дополнительно каждый сектор контактирует с зоной 107, контактируемой с границами, по крайней мере, двух индивидуальных чипов, прилегающих к внешнему контуру каждого сектора. В зоне 107 выполняют выемки 108 и/или сквозные отверстия между чипами 109. Сквозные отверстия могут быть выполнены в виде перфораций, прорезей, промежутков или интервалов между боковыми границами чипов. ( На фиг.l(в) приведен вариант мультичипа с комбинацией выемок и сквозных отверстий в между чипами с размещением двух идентификаторов. На фиг.l(г) приведен вариант мультичипа с одним идентификатором. Выемки и/или сквозные отверстия между чипами упрощают отделение индивидуальных чипов 110 от несущего элемента 100 или друг от друга. Возможность простого отделения индивидуальных чипов от мультичипа позволяет проведение последовательного скрининга с использованием одного мультичипа, в котором все индивидуальные чипы изготовлены в одинаковых условиях, что позволяет сравнивать отдельные чипы в процессе проведения последовательных диагностик, например, при лечении пациента. При этом при проведении последовательного скрининга проб от группы индивидуальных чипов в процессе диагностирования последовательно отделяют, по крайней мере, один индивидуальный чип, который используют для гибридизации с продуктами ПЦР в индивидуальной камере.
На фиг.l(a) приведен вариант мультичипа с формированием на поверхности мультичипа одних выемок без сквозных отверстий между чипами и с размещением двух идентификаторов. Такое решение предпочтительно при проведении массовых скринингов, когда все чипы мультичипа должны проходить параллельную обработку и после проведения диагностики могут быть одновременно отделены от мультичипа.
В предлагаемом изобретении проблема кросс-контаминации устраняется за счет комбинации выемок и сквозных отверстий, выполненных в виде перфораций, прорезей, промежутков или интервалов между боковыми границами чипов. В этом случае излишки гибридизационной смеси будут стекать в выемки или сквозные отверстия. При отливке или штамповке несущего элемента мультичипа возможно формировать дополнительные углубления на поверхности рабочей части каждого индивидуального чипа глубиной от 0,1 до 5мм для размещения в них зондов индивидуальных чипов и введения в рабочую зону гибридизационной смеси, что позволяет свободно отделять от тела мультичипа отдельные чипы или группу чипов для проведения сканирования в выбранном сканере, либо сканировать мультичип целиком на планшетном сканере с одновременным считыванием данных всех идентификаторов.
На фиг.2 приведены примеры форм сечений несущего элемента мультичипа для разных вариантов выемок: а) треугольная выемка 120, б) сферическая выемка 121, в) прямоугольная выемка 122, г) многоугольная выемка 123, д) вариант выемки с двух сторон несущего элемента 124. Причем выемки, предпочтительно при штамповке или отливке, могут быть организованы как с одной, так и с двух сторон мультичипа. Толщину несущего элемента выбирают от 0,5 до 5мм. При этом соотношение толщины слоя несущего элемента к глубине выемки мультичипа выбирается исходя из механических и физических параметров выбранного материала (твердость, хрупкость) для мультичипа и может составлять отношение от 2:1 до 100:1. Если используют комбинацию выемок и сквозных отверстий в зоне 107, то соотношение между длинами выемок и сквозных отверстий между чипами выбирают в пределах от 1 :10 до 10:1. Соотношение ширины выемки к ширине сквозных отверстий можно выбирать в пределах от 1:10 до 10:1. Ширину выемки выбирают в пределах от 0,1мм до 5мм.
На фиг. 3 показаны варианты размещения основных элементов мультичипа на поверхности несущего элемента, на котором формируется общая зона 111. Общая зона 111 несущего элемента мультичипа 100 может быть расположена сбоку, сверху, снизу или в центре массива чипов. Она может представлять форму прямоугольника или иметь, например, крестообразную форму. Общая зона выполняет две функции. Первая связана с ее использованием для формирования на ней установочных и крепежных отверстий 112, которые способствуют креплению заготовок мультичипов при модификации поверхности, многочисленных промывках и очистках поверхности перед нанесением зондов. Второй функцией общей зоны является размещение на ее поверхности третьего идентификатора 113, на котором может быть размещена информация, полезная для последующего анализа данных диагностики при проведении параллельного или последовательного скрининга биополимеров. На фиг. 3(a) приведено распределение зон на несущем элементе мультичипа. В общем случае мультичип содержит несущий элемент 100, на поверхности которого размещают N чипов, размещенных в секторах 102, на поверхности каждого сектора формируют группу зон: а) рабочую зону чипа для нанесения зондов 103, б) зону для нанесения первого идентификатора 104 и необязательно второго идентификатора 105. Причем рабочая зона индивидуального чипа состоит из группы кластеров 106, каждый из которых формируется своим зондом. В Состав кластеров, размещенных на рабочей зоне чипа, выбирают из группы: кластеры зондов, кластеры положительных контролей, кластеры отрицательных контролей. Количество кластеров, размещенных в рабочей зоне каждого индивидуального чипа, может составлять от 2 до 1000. Для недорогих чипов количество кластеров, размещенных в рабочей зоне каждого индивидуального чипа, может составлять 15.
Количество нанесенных зондов одного типа дифференцирующего олигонуклеотида на поверхности каждого кластера составляет от 1 до 50. Для дешевых чипов предпочтительно, если количество нанесенных зондов одного типа дифференцирующего олигонуклеотида на поверхности каждого кластера составляет 4 или 9.
В группу зондов, размещаемых на поверхности рабочей зоны, кроме зондов относящихся к диагностике проб, входит группа зондов, относящихся к положительным или отрицательным контролям, может быть размещена группа зондов, выполненных в форме меток, например меток, идентифицирующих положение чипа. Соотношение между количеством кластеров, в которых размещают зонды, и кластеров, в которых размещают положительные или отрицательные контроли, выбирают в диапазоне от 1:1 до 500:1. Каждый сектор 102 контактирует с зоной 107, контактируемой с границами, по крайней мере, двух индивидуальных чипов прилегающих к внешнему контуру каждого сектора и границей общей зоны мультичипа. В зоне 107 выполняют выемки 108 и/или сквозные отверстия между чипами 109. На фиг.3(6) приведен вариант мультичипа с комбинацией выемок и сквозных отверстий между чипами с размещением трех идентификаторов. Выемки и/или сквозные отверстия промежутки между чипами обеспечивают отделение чипов 110 от несущего элемента 100 или друг относительно друга. На фиг.З(в) приведен вариант мультичипа с выемками между чипами и с размещением двух идентификаторов. Отдельные микрочипы получают посредством отделения чипа от несущего элемента, причем отделение осуществляют отламыванием, отрезанием, отрубанием.
Известно [16], что в качестве основы для создания мультичипов можно использовать нитроцеллюлозу, стекло, пластики, тефлон, металл и их комбинации. Однако, как уже указывалось, не все материалы, перечисленные в группе, обладают способностью ковалентно иммобилизовать олигонуклеотидные зонды. В качестве материала несущего элемента для создания мультичипа предлагается использовать полимеры, стекло, керамику или их композиции.
Для такого материала как стекло разработано большое число способов модификации поверхности для последующей иммобилизации зондов. Однако массовое применение стеклянных мультичипов ограничивается хрупкостью этого материала, затрудняющего их производство и транспортировку. Выполнение двухсторонних выемок - или выемок и сквозных отверстий между чипами позволяет отделять стеклянные слайды друг от друга без нарушения основы чипа.
Полимеры не обладают хрупкостью и могут быть изготовлены с помощью разных технологий, включающих, но не ограничивающих, способы штамповки, отливки, механической обработки. Группа используемых полимеров включает, но не ограничивает, полиметилметакрилат, полибутилметакрилат, поливинилхлорид, поликарбонат, сополимеры метилметакрилата и/или сополимеров бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол, акрилонитрил и др. Более предпочтительно использовать полиметилметакрилат, который имеет меньший уровень автофлуоресценции, прозрачен и может составлять основу композитных несущих поверхностей. Поливинилхлорид позволяет эффективно проводить модификацию поверхности и являться основой для изготовления индивидуальных н мультичипов. В варианте, когда форма мультичипа представляет собой форму прямоугольника, предпочтительно, чтобы соотношения между шириной и длиной мультичипа лежали в пределах от 1:1 до 1:50. В некоторых вариантах предпочтительно выбирать размеры мультичипа в пределах размеров стандартных листов бумаги, например, размер A4, на которые рассчитаны сканеры. Учитывая высокие характеристики разрешения современных сканеров и совершенство способов .нанесения зондов на поверхность чипов, более предпочтительно использовать не только стандартные размеры индивидуальных чипов 25мм х 75мм, но и другие размеры. Например, для сокращения расходов на подготовку индивидуальных чипов в составе мультичипа, возможно использовать чипы, габариты которых составляют значение 12,5мм х 75 мм, либо мини-чипы размером 25мм х 37,5м, либо 12,5мм х 37,5мм.
В качестве варианта реализации данного изобретения индивидуальный биологический микрочип, который может входить в набор для диагностики либо как индивидуальный чип, либо как элемент, входящий в состав мультичипа, содержит 15 групп (кластеров) ДНК-зондов, каждая из которых представлена одним из 15 иммобилизованных олигонуклеотидов (Фиг.6 и таблица 1). Чип содержит 15 кластеров индивидуальных дифференцирующих олигонуклеотидов, нанесенных в 4-х или 9 повторах, из них 12 кластеров олигонуклеотидов для одного или двух из 15 инфекционных агентов, представленных в таблице 1, 2 кластера положительного контроля и 1 кластер отрицательного контроля. Получаемая гибридизационная картина опытного образца сравнивается с положительными и отрицательными контролями, что позволяет проводить достоверную видовую идентификацию.
Идентификация данных мультичипа
Существует много примеров применения идентификаторов для идентификации биочипов. Например, известно изобретение [18], в котором чип имеет два штрих-кода для идентификации двух рабочих зон. Известно изобретение [16], в котором каждая индивидуальная зона с принадлежащей ей кодированной информацией в виде одного идентификатора может быть отделена от мультичипа и использована индивидуально. Известно изобретение [19], в котором рассматриваются вопросы применения идентификаторов совместно с компьютером для контроля качества изготовления чипов. Отличие предлагаемого изобретения от известных вариантов состоит в том, что индивидуальный чип и мультичип имеет, в зависимости от типа медицинской диагностики, по крайней мере, двух- или трехуровневую идентификацию данных о многофункциональном мультичипе, в который входит N индивидуальных чипов. С этой целью на каждом из индивидуальных чипов размещают, по крайней мере, один, первый идентификатор, относящийся к идентификации данных о биологическом - объекте исследования и необязательно второй идентификатор с данными производителя о дате изготовления, типе и параметрах зондов, причем многофункциональный мультичип на зоне крепежа всех чипов дополнительно содержит третий идентификатор, который может быть идентичен второму идентификатору. Причем первый идентификатор связан с первым кодом, второй идентификатор связан со вторым кодом, отличным от первого кода. Указанные коды образуют уникальные N пар кодов, характеризующих многофункциональный чип. Идентификатор может быть выполнен в виде цифровых и/или буквенных обозначений, которые выполняют функцию кода или в виде штрих-кодов или их комбинаций.
В качестве примера, включающего, но не ограничивающего объема данного изобретения, ниже приведены параметры, которые могут быть введены в параметры первого идентификатора при определении или диагностики заболеваний млекопитающих. Первый идентификатор отдельного чипа может включать в себя следующие данные, входящие в группу, состоящую из: а) кода болезни, б) кода, характеризующего объект, из которого взята проба (кровь, лимфа, соскоб, слюна и т.д.),' в) код пациента или код данных, идентифицирующий пациента (ФИО, возраст), г) код медицинского учреждения и/или страховой компании, д) дата диагностики. В свою очередь, параметры второго и третьего идентификатора, идентифицирующие мультичип, могут содержать: а) код номера партии и/или даты изготовления, б) код фирмы изготовителя, в) код, идентифицирующий способ модификации поверхности, г) код типа скрининга (последовательный, параллельный), д) код количества индивидуальных чипов, е) код количества кластеров.
Такая информация может быть полезна для выяснения качественных характеристик не только мультичипа, но и его составных компонентов. Причем сочетание первого и второго кода или первого, второго и третьего кода должна обеспечить уникальный код, соответствующий только одному мультичипу. Обращение к такому уникальному коду обеспечит быстрый поиск информации в базах данных о всех образцах при параллельном скрининге, либо к информации о последовательных измерениях.
Аппаратные и программные средства идентификации данных диагностики
Для реализации возможностей мультичипа по проведению параллельных и последовательных скринингов биологических объектов необходим комплекс аппаратных и программных средств для обработки полученных данных, их идентификации и занесения в базу данных. На фиг.4 показана блок-схема установки для проведения параллельных и последовательных скринингов биологических объектов. В ее состав входят: компьютер 201, к которому могут быть подключены устройства, входящие в группу, состоящую из дисплея 202, принтера 203 и устройства для сканирования мультичипов или индивидуальных чипов, которые могут быть выбраны из группы, состоящей из: планшетного сканера 210, цифровой ПЗС-камеры 211, сканера 212, индивидуальных чипов 110, сканера 213 мультичипа, размещенного на диске 140, ручного сканера 214. Данные, полученные посредством сканирования с прямоугольных 130 или дисковых 140 мультичипов, а также с индивидуальных чипов 110, обрабатываются в компьютере 201 и обработанные данные выдаются либо в форме, записанной на твердых носителях, например, на СД диске 204 , либо посредством связи через Интернет или по локальной сети на компьютер 205, на основе которого формируется база данных множества диагностик, которые хранятся, например, на жестких дисках 206. Этой информацией с помощью локальной сети или через Интернет могут пользоваться несколько пользователей с помощью своих компьютеров 207, например, карманных.
Предпочтительно использовать для съема данных диагностики сканирующие устройства, которые могут реализовать, по крайней мере, один из трех известных способов: измерение пропускания, измерение отражения, измерение флуоресценции.
Детекция флуоресцентного сигнала производится с использованием детектирующего устройства, например, экспериментальной установки, состоящей из флуоресцентного микроскопа, ПЗС-камеры и компьютера либо темнопольной установки с подключенной ПЗС-камерой [20], приведенной в данном описании в качестве ссылки, в которой используется возбуждающий свет лазерных свето диодов. Колориметрическая детекция, например, биотинилированной ДНК, осуществляется также после отмывки микрочипа с использованием сканирующих устройств, например, экспериментальной установки, состоящей из сканера и компьютера, как средства для интерпретации и хранения результатов диагностики и специального программного обеспечения.
Предпочтительно, чтобы комплекс аппаратных средств содержал устройства, входящие в группу, состоящую из: ручных сканеров штрих-кода и изображений, автоматических сканеров планшетного типа, сканеров, обеспечивающих съем информации с отдельных индивидуальных чипов и других сканеров.
Сканер преобразует изображения рабочей зоны чипа, входящего в состав мультичипа или конкретных кластеров, расположенных в рабочей зоне чипа, в сигналы, полученные с помощью измерения флуоресценции, измерения пропускания, колориметрического измерения, сигналов отражения, в цифровые данные, которые поступают на компьютер для последующей обработки по разным алгоритмам. Описание подобных аппаратных и программных систем хорошо известно из литературы. Интерпретация полученных результатов
В случае медицинских чипов, структурная схема одного из вариантов, который включает, но не ограничивает объем изобретения, приведена на фиг. 6. Дифференцирующие олигонуклеотиды разделены на 12 (двенадцать) групп в зависимости от вида патогена. Интенсивность сигнала образующихся совершенных или несовершенных дуплексов внутри каждой группы существенно выше интенсивности сигнала отрицательных контролей, что позволяет проводить надежную видовую идентификацию инфекционных патогенов. Интерпретацию результатов проводят исходя из гибридизационной картины, которую получают, используя экспериментальную установку, включающую, например, сканер, компьютер и специальное программное обеспечение. Для цифровой обработки изображений применяют программу «Meдcкaн-l».
Интерпретацию результатов проводят следующим образом. Интенсивности флуоресцентных или колорометрических сигналов в каждой группе ДНК-зондов, в которой содержатся олигонуклеотиды, видоспецифичные для одного из 12 инфекционных агентов, с помощью специального программного обеспечения сравнивают с группами зондов положительного (максимальная интенсивность сигнала) и отрицательного (минимальная интенсивность сигнала) контроля. В результате образуется гибридизационная картина, различная для групп положительного контроля, отрицательного контроля и 12 видов инфекционных агентов, что позволяет однозначно интерпретировать полученные данные.
Особенности аппаратной и программной систем, разработанных в рамках настоящего изобретения, относятся к использованию мультичипов в качестве объекта диагностики. Каждый мультичип характеризуется множеством параметров, которые входят в группу, состоящую из: а) значения интенсивности сигналов в каждом конкретном кластере рабочей зоны для каждого индивидуального чипа, б) количестве кластеров в рабочей зоне каждого индивидуального чипа и их распределение по объектам исследования, в) количество и расположение положительных и/или отрицательных контролей в рабочей зоне каждого из чипов, г) способа съема данных об интенсивности сигналов, д) изображение рабочей зоны чипа в виде графического изображения. Данные параметры формируются по определенным алгоритмам в компьютерный файл, который передается в базу данных, например, в общий компьютер клиники. В дополнение к данным параметрам в состав файла входит уникальный идентификационный код, состоящий из комбинации первого идентификационного кода каждого отдельного чипа и/или второго и третьего идентификационных кодов, характеризующих параметры мультичипа.
Компьютерная программа идентифицирует уникальный код мультичипа в автоматическом или диалоговом режиме и производит обработку параметров, занесенных в компьютерный файл при сканировании мультичипа или его индивидуальных компонентов. Данные обработки заносятся в файл и, в зависимости от структуры хранения информации в каждом конкретном лечебном заведении, хранятся либо на дисках в картотеке вместе с картой больного, либо хранятся в компьютерной форме на жестких дисках центрального компьютера больницы. К этим данным может обращаться врач. Причем поиск файлов осуществляется при введении кода пациента и/или сканировании штрих-кодов с карты больного. После получения результатов диагностики отдельные чипы могут храниться в карте больного и при сканировании штрих-кода чипа и введении запроса в центральный компьютер, последний выдает полную информацию по файлу, характеризующему все параметры и коды диагностики. Врач может сравнивать данные, полученные на разных этапах лечения болезни по результатам независимых диагностик, и корректировать лечение или прием тех или иных лекарств в соответствии с данными диагностики. Таким образом, уникальный код мультичипа и его компонентов позволяет упростить программы поиска необходимых файлов и сохранять данные о диагностике в разных формах, начиная от компьютерных файлов, кончая хранением индивидуальных чипов в период лечения больного.
Набор для диагностики
Другим объектом защиты, предлагаемым настоящим изобретением, является набор для видовой идентификации инфекционных агентов, включающий: а) по меньшей мере, один биологический индивидуальный микрочип для проведения разовой диагностики или биологический мультичип для проведения параллельного или последовательного скрининга, охарактеризованный в п.27; б) реагенты, которые выбирают из реагентов для подготовки образца, реагентов для проведения ПЦР, реагентов для проведения гибридизации и их комбинации. в) специфические олигонуклеотиды в качестве праймеров ПЦР для видовой идентификации инфекционного агента, с последовательностями, которые выбирают от SEQ ID NO : 1 по SEQ ID NO: 58.
49. Набор по п.48, отличающийся тем, что дополнительно содержит устройство для проведения гибридизации и/или устройство для сканирования и интерпретации результатов анализа, причем для сканирования используют устройство, входящее в группу, состоящую из: ручного сканера, сканера индивидуальных чипов, планшетного сканера мультичипов, сканера дисковых мультичипов и компьютера.
Примеры
Ниже приведены примеры, которые включают, но не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Пришивка олигонуклеотидных зондов к поверхности амино- модифицированного стекла.
В качестве зондов использовали олигонуклеотиды, модифицированные фосфатной группой (р) по 5'-пoлoжeнию ID SEQ No: 59, 68, 90 и 91. Олигонуклеотиды наносили кластерами по 4 точки. Реакционную смесь, содержащую 4 мкМ олигонуклеотида и 60 мМ гидрохлорида 3- диметиламинопропилэтилкарбодиимида в 0,1 M 1-мeтилимидaзoлe, рН 7,0, наносили на поверхность стекла роботом (Хрrеss Lапе, США), объем капель составлял от 10 до 50 нл. Стекла помещали в герметичную емкость и выдерживали при комнатной температуре в течение часа во влажной атмосфере для предотвращения высыхания капель. Затем стекла промывали на шейкере 1 M раствором NaCI в течение 10 минут для удаления нековалентно связанных молекул олигонуклеотидов, обрабатывали дистиллированной водой и хранили при 4 0C.
Пример 2 Проведение асимметричной ПЦР.
ПЦР-смесь состояла из 10 мМ трис-НСl рН 8,8, 50 мМ KCl, 0,8% Nопidеt P40, 2 мМ MgCl2 , 100 нr ДНК анализируемого образца, специфических олигонуклеотидных праймеров ID SEQ No: 1, 2, 19, 20, 88 и 89 и 8 ед. Таq- полимеразы в объеме 20 мкл. Олигонуклеотиды ID SEQ No: 1, 19 и 88 использовали в концентрации 0,05 мкМ. Олигонуклеотиды ID SEQ No: 2, 20 и 89, модифицированные биотином по 5 '-положению, использовали в концентрации 0,25 мкМ. Реакцию проводили на ДНК-амплификаторе Маstеrсусlеr (Еррепdоrf, Германия) при условиях, приведенных в Таблице 3.
Таблица 3. Условия проведения ПЦР.
Figure imgf000039_0001
Пример 3. Гибридизация.
К 21 мкл ПЦР смеси добавляли 3 мкл 5 х SSC, 3 мкл формамида, 3 мкл 10% SDS, наносили на рабочую зону подложки, накрывали предметным стеклом и инкубирули в течение 1 часа при 450C. По окончании реакции гибридизации поверхность чипа промывали на орбитальном шейкере следующими растворами:
A) 0,5χ SSC, 0.1% SDS - 2 раза по 5 минут; Б) 5χ SSC, 0.1% SDS - 2 раза по 5 минут;
B) 0,1 х SSC, 0.1% SDS - 2 раза по 5 минут; Г) 0,1 х SSC - 3 раза по 1 минуте.
По окончании промывки микрочип высушивали при комнатной температуре 5-10 минут.
Пример 4. Проведение пероксидазной реакции. -
Исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат ("Имбио", Россия) разбавляли последовательно в 200 раз Ix SSC, содержащим 1% BSA. Конъюгат наносили на рабочую зону подложки, накрывали покровным стеклом и выдерживали во влажной атмосфере при комнатной температуре в течение 30 минут. Отмывку несвязавшегося конъюгата проводили 2x SSC в течение 5 минут, Ix SSC - 5 минут и O3IxSSC в течение 1 минуты.
Подложку заливали свежеприготовленным раствором субстрата - диметиламинобензидина. Для этого, не более чем за полчаса до проведения реакции, растворяли lмг DAB в 1 мл 0.1 х SSC, добавляли 20 мкл 3%-нoгo раствора пероксида водорода и перемешивали. Рабочую зону заливали приготовленным раствором субстрата, накрывали покровным стеклом и выдерживали от 10 до 30 минут при комнатной температуре. В случае положительной реакции появлялись коричневые пятна окисленного субстрата. Затем стекло промывали дистиллированной водой и помещали в вертикальном положении в контейнер для осушки и дальнейшего хранения. Пример 5. Детекция хромогенного зонда.
Для получения изображений гибридизационных микрозон использовали слайд сканер Nikоп СооlSсап 9000ED. Затем проводили количественную обработку изображений с помощью оригинальной программы "АпGепе". Результат анализа изображений гибридизационной микрозоны на подложке из стекла дает усредненную интенсивность окраски в зонах, равную 43,9, и интенсивность фона - 1.2 (в условных единицах).
На фиг. 5 представлена картина гибридизации смеси образцов ДНК взятых из мазков пациентов инфицированных урогенитальными агентами. ДНК была выделена из смеси и проведен ПЦР анализ со смесью из 13 пар праймеров, специфичных к 12 патогенам входящих в группу, состоящую из: Сhlатуdiа trасhотаtis, Nеissеriа gопоrrhоеае, Тriсhотопаs vаgiпаlis, Urеарlаsта иrеаlуtiсит, Сапdidа аlbiсапs, Мусорlаsта gепitаliит, Мусорlаsта hотiпis, Gаrdпеrеllа vаgiпаlis, Strерtососсиs аgаlасtiае, Нитап hеrреsvirиs 1, Нитап hеrреsvirиs 2, Нитап hеrреsvirиs 4, Нитап hеrреsvirиs 5 и к ДНК положительного контроля. После ПЦР проведена гибридизация на биочипе (структурная схема которого приведена на фиг. 6). Видно, что для каждой ДНК характерна своя индивидуальная гибридизационная картина. В смеси образцов ДНК, взятых из мазков пациентов инфицированных урогенитальными агентами, не было обнаружено Сhlатуdiа trасhотаtis, Нитап hеrреsvirиs 1, Нитап hеrреsvirиs 2, Нитап hеrреsvirиs 4. Кластер, соответствующий отрицательному контролю, не проявился. На фиг.6 представлена структурная схема медицинского чипа. На схеме приведено расположение кластеров на рабочей зоне биочипа. Данный вариант включает, ноне ограничивает других вариантов расположения кластеров.
Промышленная применимость Способ видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, на биологическом микрочипе выгодно отличается быстротой проведения анализа, простотой используемой методики подготовки образца ДНК для гибридизации, возможностью одновременного выявления до 15 наиболее широко распространенных патогенов, возможностью проведения анализа в лабораторных или полевых условиях, а также относительной дешевизной.
Тексты патентов и патентных заявок рассматриваются в тексте данного описания в качестве ссылок.
Литература
1. Агатова JI. А. и др. Способ диагностики поражения организма инфекциями. Заявка на патент RU 2001133477 (2003.08.20).
2. Юрьев С. Ю. Способ серологической диагностики активной хламидийной инфекции у беременных женщин. Патент RU 2272293 (2006.03.20). 3. Шипулин Г. А. Питательная среда для выявления Urеарlаsта Urеаlуtiсит и способ диагностики урогенитальных уреаплазмозов. Патент RU 2265656 (2005.12.10).
4. Александрова H. В. и др. Способ диагностики инфекций, вызванной вирусом Эпштейн-Барр. Патент RU 2247390 (2005.02.27). 5. Кошкин С. В. и др. Способ повышения чувствительности метода ПЦР диагностики микоплазменной урогенитальной инфекции у больных с выражением экссудативным воспалением. Патент RU 2274449 (2006.04.20).
6. Ротман P. Э. и др. Количественный анализ, позволяющий одновременно обнаружить и идентифицировать бактериальные инфекции. Патент RU 2004128442 (2005.05.27).
7. Ghаrizаdеh, В. Таrgеt-sресifiс multiрlе sеquепсiпg рrimеr рооl fоr miсrоbiаl tурiпg апd sеquепсiпg аррliсаtiопs iп DNА-sеquепсiпg tесhпоlоgiеs. US Раtепt Аррliс. 20050202436 (Sерtеmbеr 15, 2005). 8. Sheiness D. К. еt аl. Меthоds fоr sеlесtivеlу dеtесtiпg miсrооrgапisms аssосiаtеd with vаgiпаl iпfесtiопs iп соmрlех biоlоgiсаl sаmрlеs. US Раtепt 5,700,636 (Dесеmbеr 23,1997)
9. Wеisburg W. G. еt аl. Nuсlеiс асid рrоbеs fоr thе dеtесtiоп fоr gепitаl mусорlаsmаs. US Раtепt 5,843,667 (Dесеmbеr 1, 1998).
10. Rоssаu R. еt аl. Нуbridizаtiоп рrоbеs dеrivеd frоm thе sрасеr rеgiоп bеtwееп thе lбs апd 23s RRNA gепеs fоr thе dеtесtiоп оf поп-virаl miсrооrgапisms. US Раtепt 6,277,577 (Аugust 21, 2001).
11. Jаппеs , еt аl. Dеtесtiоп апd idепtifiсаtiоп оf рsеudоmопаs sресiеs usiпg thе 16S-23S rRNА sрасеr. US Раtепt 6,811,978 (Nоvеmbеr 2, 2004).
12. Rоthmап R.Е. ; еt аl. Quапtitаtivе аssау fоr thе simultапеоus dеtесtiоп апd sресiаtiоп оf bасtеriаl iпfесtiопs. US Раtепt Аррliс. 20030124545 (My 3, 2003).
13. Веrgеrоп, Мiсhеl G. ; еt аl. Sресiеs-sресifiс, gепus-sресifiс апd uпivеrsаl DNA рrоbеs апd аmрlifiсаtiоп рrimеrs tо rарidlу dеtесt апd idепtifу соmmоп bасtеriаl апd fuпgаl раthоgепs апd аssосiаtеd апtibiоtiс rеsistапсе gепеs frоm сliпiсаl sресimепs fоr diаgпоsis iп miсюbiоlоgу lаbоrаtоriеs. US Раtепt Аррliс. 20040185478 (September 23, 2004 ).
14. Sсhепа, M. А. Мiсrоаrrау теthоd оf gепоtурiпg тultiрlе sаmрlеs аt тultiрlе lосi. US Раtепt Аррliс. 20050153318 (JuIy 14, 2005). 15. Rаvа R.P. еt аl. Меthоds fоr сопсurrепtlу рrосеssiпg тultiрlе biоlоgiсаl сhiр аssауs. US Раtепt 6,720,149 (Арril 13, 2004).
16. Dеlliпgеr DJ. еt аl. Quаlitу сопtrоl теthоd fоr аrrау тапufасturе. US Раt. Аррliс. 20050186580 (Аugust 25, 2005).
17. Rетасlе J. еt аl. Dеtесtiоп апd/оr quапtifiсаtiоп теthоd оf а tаrgеt тоlесulе bу а biпdiпg with а сарturе тоlесulе fiхеd оп thе surfасе оf а disс. US Раt. Аррliс.
20020177144 (Nоvетbег 28, 2002).
18. Zеlепу R. еt аl. Аutотаtiс iтаgiпg апd апаlуsis оf тiсrоаrrау biосhiрs. US Раtепt 6,215,894 (Арril 10, 2001).
19.Cattell Н.F. Сhеmiсаl аrrау fаbriсаtiоп апd usе. US Раt. 6,879,915(April 12, 2005).
20. Барский В.Е. Флуоресцентный микроскоп. Патент RU 2182328 (2002.05.10).
21. Белецкий И.П. и др. Набор праймеров для детекции и/или идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и его содержащих продуктах (варианты), праймер (варианты), пара праймеров (варианты), способ детекции и/или идентификации с их использованием (варианты) и устройство для осуществления способа. Патент RU2265668 2005.12.10 22. Мирзабеков А. Д. и др. Способ идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и продуктах на его основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления этого способа. Патент RU 2270254 (2006.02.20).
23. Wоlfе, Dаvid M. Dеtесtiоп оf hеrреs simрlех viшs tуреs 1 апd 2 bу пuсlеiс асid аmрlifюаtiоп. 20050042601 (Fеbшаrу 24, 2005).
24. Маtsumоtо T. еt аl. Меthоd оf tуре-sресifiс dеtесtiоп оf hеrреs simрlех virus. 5,354,653 (Осtоbеr 11, 1994).
25. Grоеп P. еt аl. Quапtitаtivе ерstеiп bаrr virus PCR rарid аssау. 6,790,952 (Sерtеmbеr 14, 2004).
26. Наrris R. еt аl. DETECTION AND QUАNТIFIСАТЮN OF HUMAN HЕRРЕS VIRUSES. PCT Аррl. WO/2002/034953 (02.05.2002).
27. Smith T. NUCLEIC ACID PROBES AND METHODS FOR DETECTING СLINIСАLLY. PCT Аррl. WO/2000/073499 (07.12.2000). 28. Fаrrаr G. GENETIC SUРРRЕSSЮN AND RЕРLАСЕМЕNТ. PCT
Apρl.WO/2004/020631 (11.03.2004)
29. Liпdпеr H. VARIANTS OF АМINОАСYLАSЕ, NUCLEIC ACIDS CODING SAME, AND USES THEREOF. PCT Аррl. WO/2004/113524 (29.12.2004).
30. Grаu О. ОLIGОNUСLЕОТIDЕ SEQUENCES FOR THE SPECIFIC DETECTION OF МОLLIСUТЕS BY АМРLIFIСАТЮN OF PRESERVED GENES.
PCT Аррl. WO/1994/003634 (17.02.1994).
31. Нirаi К. DETECTION OF HUMAN С YTOMEG ALO VIRUS. JP2000032992 (2000-02-02).
32.Yoshida T. Rарid dеtесtiоп оf Мусорlаsmа gепitаlium, Мусорlаsmа hоmiпis, Urеарlаsmа раrvum, апd Urеарlаsmа urеаlуtiсum оrgапisms iп gепitоuriпаrу sаmрlеs bу РСR-miсrоtitеr рlаtе hуbridizаtiоп аssау. J Сliп Мiсrоbiоl. 2003 May;41(5):1850-5.
33. Рurоhit А. еt аl. Меthоd, rеаgепts апd kits fоr thе dеtесtiоп оf Nеissеriа gопоrrhоеае. US Раtепt 5,550,040 (Аugust 27, 1996).
34. Моrrisоп С. еt аl. Меthоds апd соmроsitiопs fоr thе dеtесtiоп оf Сапdidа sрр. US Раtепt 6,235,890 (Мау 22, 2001). .
35. Lott T. еt аl. Nuсlеiс асid рrоbеs fоr dеtесtiпg Сапdidа sресiеs. US Раtепt 6,242,178 (Juпе 5, 2001). •
36. Hammond P. еt аl. Nuсlеiс асid hуbridizаtiоп аssау рrоbеs, hеlреr рrоbеs апd аmрlifiсаtiоп oligonucleotides targeted to Mycoplasma pneumoniae пuсlеiс асid. US Раtепt 5,656,427 (Аugust 12, 1997).
37. Smith T. еt аl. Dеtесtiоп оf hеrреs simрlех virus. US Раtепt Аррl. 20020164586 (Nоvеmbеr 7, 2002).
38. Дидковский H. А . и др. Герпес-вирусная инфекция: клиническое значение и принципы терапии. НИИ физико-химической медицины МЗ РФ, Москва MMA имени И.М. Сеченова
(http://www.medpeterburg.m/news/812317O6.html).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ идентификации урогенитальной инфекции, включающий обеспечение образца исследуемой ДНК, прямых и обратных праймеров, специфичных к идентификации инфекционных агентов в урогенитальной области, и биологического микрочипа, содержащего дифференцирующие олигонуклеотиды, проведение ПЦР в присутствии образца ДНК и праймеров с зондами, специфичных к идентификации инфекционных агентов, инкубацию ПЦР- продукта с биологическим микрочипом в условиях гибридизации, определение урогенитальной инфекции детекцией образованных гибридизационных комплексов на микрочипе, отличающийся тем, что биологический микрочип содержит дифференцирующие олигонуклеотиды, с последовательностями, представленными в SEQ ID NO:59-87, в качестве специфичных праймеров используют праймеры, последовательность которых выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-58, в качестве ПЦР используют асимметричную ПЦР, причем в паре прямого и обратного праймеров, один праймер содержит метку, которую после гибридизации ДНК детектируют, регистрируют данные детекции и используют данные регистрации для идентификации инфекционных агентов в урогенитальной области.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят детекцию образцов на наличие в них, по крайней мере одной ДНК, принадлежащей гену, входящему в группу, состоящую из: Сhlатуdiа trасhотаtis, Nеissеriа gопоrrhоеае, Тriсhотопаs vаgiпаlis, Urеарlаsта иrеаlуliсит, Urеарlаsта раrvит, Сапdidа аlbiсапs, Мусорlаsта gепitаliит, Мусорlаsта hотiпis, Gаrdпеrеllа vаgiпаlis, Strерiососсиs аgаlасtiае, Strерtососсиs руоgепеs, Нитап hеrреsvirиs 1, Нитап hеrреsvirиs 2, Нитап hеrреsvirиs 4, Нитап hеrреsvirиs 5.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образец исследуемой ДНК выделяют, по крайней мере, из одного образца биологического материала человека, входящего в группу, состоящую из крови, биопсийного материала, слюны, слезных выделений, мочи, бронхо-авеолярного лаважа, ликвора, или их комбинаций.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биологический микрочип получают модификацией несущей поверхности микрочипа и иммобилизуют на нее дифференциальные олигонуклеотиды.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что модификация поверхности несущего элемента микрочипа осуществлена с применением раствора 3- аминопропилтриэтоксисилана.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гибридизацию проводят при температуре от 35 до 5O0C в буфере, содержащем от 0,5 х до 5 х SSC; 0,1% SDS; до
25% формамида и\или до 10 мМ ЭДТА.
7. Способ по п.l, отличающийся тем, что определяемую метку выбирают из группы, состоящей из каталитических, лигандных, флуоресцентных или радиоактивных молекул. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что каталитическую молекулу выбирают из группы, включающей гемин, цианкобаламин или флавин.
9. Способ по п.7, отличающийся тем, что лигандная молекула выбрана из группы, включающей биотин, диоксигенин или динитробензол.
10. Способ по п.7, отличающийся тем, что флуоресцентная молекула выбрана из группы, включающей FAM, TAMRA, СуЗ, Cy5, Cy7, R6G, Rl 10, ROX или JOE.
11. Способ по п.l, отличающийся тем, что детектирование и/или идентификацию инфекционных агентов осуществляют путем сравнительного анализа уровня сигналов исследуемого образца, положительного и отрицательного контролей.
12. Специфический олиrонуклеотид в качестве праймера ПЦР для видовой идентификации инфекционного агента в способе идентификации урогенитальной инфекции по п. п. 1-1 1 с последовательностями, представленными от SEQ ID NO : 1 по SEQ ID NO: 58. 13. Дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда для видовой идентификации инфекционного агента в способе идентификации урогенитальной инфекции по п.п. 1-11 с последовательностями, представленными от SEQ ID NO: 59 по SEQ ID NO: 87.
14. Комбинация для идентификации инфекционного агента Сhlатуdiа trасhотаtis, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, либо SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
15. Комбинация для идентификации инфекционного агента Nеissеriа gопоrrhоеае, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 61 и SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, либо SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 84, либо SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10.
16. Комбинация для идентификации инфекционного агента Тriсhотопаs vаgiпаlis, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, либо SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14.
17. Комбинация для идентификации инфекционного агента Urеарlаsта иrеаlуtiсит и/или Urеарlаsта раrvит, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 66 и SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, либо SEQ ID NO: 67 и SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18.
18. Комбинация для идентификации инфекционного агента Сапdidа аlbiсапs, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, либо SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22.
19. Комбинация для идентификации инфекционного агента Мусорlаsта gепitаliит, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 70 и SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24, либо SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, либо SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28.
20. Комбинация для • идентификации инфекционного агента Мусорlаsта hотiпis, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30, либо SEQ ID NO: 74 и SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32 , либо SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34.
21. Комбинация для идентификации инфекционного агента Gаrdпеrеllа vаgiпаlis, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 76 и SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36, либо SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38, либо SEQ ID NO: 78 и SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40.
22. Комбинация для идентификации инфекционного агента Strерtососсиs аgаlасtiае отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 42. 23, Комбинация для идентификации инфекционного агента Strерtососсиs аgаlасtiае и/или Strерtососсиs руоgепеs, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO: 80 и SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44. 24. Комбинация для идентификации инфекционного агента Нитап hеrреsvirиs 1 и/или Нитап hеrреsvirиs 2, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 81 и SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46, либо SEQ ID NO: 82 и SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48.
25. Комбинация для идентификации инфекционного агента Нитап hеrреsvirиs 4, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 50, либо SEQ ID NO: 84 и SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52, либо SEQ ID NO: 85 и SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54.
26. Комбинация для идентификации инфекционного агента Нитап hеrреsvirиs 5, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 86 и SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 56, либо SEQ ID NO: 87 и SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58.
27. Биологический микрочип для видовой идентификации инфекционных агентов, входящих в группу, состоящую из: Сhlатуdiа trасhотаtis, Nеissеriа gопоrrhоеае, Тriсhотопаs vаgiпаlis, Urеарlаsта иrеаlуtiсит, Urеарlаsта раrvит, Сапdidа аlbiсапs, Мусорlаsта gепitаliит, Мусорlаsта hотiпis, Gаrdпеrеllа vаgiпаlis, Strерtососсиs аgаlасdае, Strерlососсиs руоgепеs, Нитап hеrреsvirиs 1, Нитап hеrреsvirиs 2, Нитап hеrреsvirиs 4, Нитап hеrреsvirиs 5, представляющий собой несущий элемент, на котором иммобилизованы дифференцирующие олигонуклеотиды с одной, или более последовательностями, выбранными из SEQ ID NO: 59-87.
28. Микрочип по п.27, отличающийся тем, что несущий элемент чипа выполнен из материалов, входящих в группу, состоящую из: полимеров, стекла, металлов, керамики или их комбинаций. 29. Микрочип по п.28, отличающийся тем, что полимеры выбирают из группы, состоящей из: полиметилметакрилата, полибутилметакрилата, поливинилхлорида, поликарбоната, сополимеров метилметакрилата и/или сополимеров бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол, акрилонитрил.
30. Микрочип по п.29, отличающийся тем, что в качестве полимера используют полиметилметакрилат.
31. Микрочип по п.29, отличающийся тем, что в качестве полимера используют поливинилхлорид. 32. Микрочип по п.27, отличающийся тем, что несущий элемент чипа выполнен в виде плоских платформ, пленок.
33. Микрочип по п.27, отличающийся тем, что форма несущего элемента, выполненного в виде плоских платформ или пленки, представляет собой прямоугольник, квадрат, многоугольник или круг. 34. Микрочип по п.33, отличающийся тем, что толщина несущего элемента составляет от 0,5 до 5,0 мм.
35. Микрочип по п.27, отличающийся тем, что несущий элемент выполнен в форме индивидуального чипа или мультичипа.
36. Микрочип по п.35, отличающийся тем, что несущий элемент выполнен в форме мультичипа, состоящего из N отделяемых от несущего элемента индивидуальных чипов.
37. Микрочип по п.27, отличающийся тем, что дифференцирующие олигонуклеотиды иммобилизованы на несущей поверхности в форме кластеров.
38. Микрочип по п.37, отличающийся тем, что количество кластеров, размещенных в рабочей зоне каждого индивидуального чипа, составляет от 2 до
1000.
39. Микрочип по п.37, отличающийся тем, что количество кластеров, размещенных в рабочей зоне каждого индивидуального чипа, составляет 15.
40. Микрочип по п.37, отличающийся тем, что состав кластеров, размещенных на рабочей зоне чипа, выбирают из группы: кластеры зондов, кластеры положительных контролей, кластеры отрицательных контролей.
41. Микрочип по п.40, отличающийся тем, что соотношение между количеством кластеров, в которых размещают зонды, и кластеров, в которых размещают положительные контроли, выбирают в диапазоне от 1 :1 до 500:1. 42. Микрочип по п.40, отличающийся тем, что соотношение между количеством кластеров, в которых размещают зонды, и кластеров, в которых размещают отрицательные контроли, выбирают в диапазоне от 1 :1 до 500:1. 43. Микрочип по п.37, отличающийся тем, что количество нанесенных зондов одного типа дифференцирующего олигонуклеотида на поверхности каждого кластера составляет от 1 до 50.
45. Микрочип по п.37, отличающийся тем, что количество нанесенных зондов одного типа дифференцирующего олигонуклеотида в каждом кластере составляет 4 или 9. 46. Микрочип по п.40, отличающийся тем, что объем капель каждого зонда составляет не менее 0,005 мкл.
47. Микрочип по п.36, отличающийся тем, что отдельные микрочипы получают посредством отделения чипа от несущего элемента, причем отделение осуществляют отламыванием, отрезанием, отрубанием. 48. Набор для видовой идентификации инфекционных агентов, включающий: а) по меньшей мере, один биологический индивидуальный микрочип для проведения разовой диагностики или биологический мультичип для проведения параллельного или последовательного скрининга, содержащий дифференцирующие олигонуклеотиды с одной или более последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 59 по SEQ ID NO: 87. б) реагенты, которые выбирают из реагентов для подготовки образца, реагентов для проведения ПЦР, реагентов для проведения гибридизации и их комбинации. в) специфические олигонуклеотиды в качестве праймеров ПЦР для видовой идентификации инфекционных агентов, входящих в группу, состоящую из: Сhlатуdiа trасhотаtis, Nеissеriа gопоrrhоеае, Тriсhотопаs vаgiпаlis, Urгарlаsта иrеаlуtiсит, Urеарlаsта раrvит, Сапdidа άϊЫсапs, Мусорlаsта gепitаliит, Мусорlаsта hотiпis, Gаrdпеrеllа vаgiпаlis, Strерtососсиs аgаlасtiае, Strерtососсиs руоgепеs, Нитап hеrреsvirиs 1, Нитап hеrреsvirиs 2, Нитап hеrреsvirиs 4, Нитап hеrреsvirиs 5, которые обладают нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO : 1 -: 58.
49. Набор по п.48, отличающийся тем, что дополнительно содержит устройство для проведения гибридизации и/или устройство для сканирования и интерпретации результатов анализа, причем для сканирования используют устройство, входящее в группу, состоящую из: ручного сканера, сканера индивидуальных чипов, планшетного сканера мультичипов, сканера дисковых мультичипов и компьютера, как средства для интерпретации и хранения результатов диагностики.
PCT/RU2007/000248 2006-05-23 2007-05-21 Способ идентификации урогенитальной инфекции, олигонуклеотид, комбинация олигонуклеотидов, биочип и набор на его основе WO2007136303A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07794002A EP2028273A4 (de) 2006-05-23 2007-05-21 Verfahren zum nachweis einer infektions des urogenitalbereichs, oligonukleotid, oligonukleotidkombination, biochip und darauf basierendes set

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2006117378 2006-05-23
RU2006117378/13A RU2348695C2 (ru) 2006-05-23 2006-05-23 Дифференцирующий и специфический олигонуклеотиды для идентификации последовательностей днк инфекционных агентов в биологических материалах, способ видовой идентификации инфекционных агентов, биочип и набор для осуществления этого способа

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2007136303A1 true WO2007136303A1 (ru) 2007-11-29
WO2007136303A8 WO2007136303A8 (ru) 2009-07-16

Family

ID=38723544

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2007/000248 WO2007136303A1 (ru) 2006-05-23 2007-05-21 Способ идентификации урогенитальной инфекции, олигонуклеотид, комбинация олигонуклеотидов, биочип и набор на его основе

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP2028273A4 (ru)
RU (1) RU2348695C2 (ru)
WO (1) WO2007136303A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10876174B2 (en) 2009-04-07 2020-12-29 Koninklijke Philips N.V. Method for the detection and characterization of a toxinogenic Clostridium difficile strain

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101251538B1 (ko) * 2009-04-17 2013-04-08 (주)아벨리노 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머
EP2829616B1 (en) * 2009-06-23 2018-09-26 Gen-Probe Incorporated Composition and methods for detecting nucleic acid from mollicutes
RU2470987C1 (ru) * 2011-12-22 2012-12-27 Ахматфаиль Магсумович Фахриев Нейтрализатор сероводорода и способ его получения
KR20170041907A (ko) * 2014-08-14 2017-04-17 메메드 다이어그노스틱스 리미티드 매니폴드 및 초평면을 이용한 생물학적 데이터의 컴퓨터 분석법
RU2595398C1 (ru) * 2015-03-12 2016-08-27 Общество с ограниченной ответственностью "ИнтерЛабСервис" Набор реагентов для выявления днк neisseria gonorrhoeae и его применение
RU2663453C1 (ru) * 2017-12-26 2018-08-06 ООО "НекстБио" Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis в слизистой оболочке влагалища
RU2663454C1 (ru) * 2017-12-26 2018-08-06 Общество с ограниченной ответственностью "НекстБио" Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК возбудителей вульвовагинального кандидоза в слизистой оболочке влагалища

Citations (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05317099A (ja) * 1990-12-28 1993-12-03 Iatron Lab Inc ヒトサイトメガロウイルスの検出方法
WO1994003634A1 (fr) 1992-07-30 1994-02-17 Institut Pasteur Sequences d'oligonucleotides pour la detection specifique de mollicutes par amplification de genes conserves
US5354653A (en) 1991-02-25 1994-10-11 Iatron Laboratories, Inc. Method of type-specific detection of herpes simplex virus
US5550040A (en) 1993-06-23 1996-08-27 Hoffman-La Roche Inc. Method, reagents and kits for the detection of Neisseria gonorrhoeae
US5656427A (en) 1994-08-29 1997-08-12 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid hybridization assay probes, helper probes and amplification oligonucleotides targeted to Mycoplasma pneumoniae nucleic acid
US5700636A (en) 1990-10-19 1997-12-23 Becton Dickinson And Company Methods for selectively detecting microorganisms associated with vaginal infections in complex biological samples
US5843667A (en) 1991-03-22 1998-12-01 Amoco Corporation Nucleic acid probes for the detection for genital mycoplasmas
JP2000032992A (ja) 1999-07-26 2000-02-02 Iatron Lab Inc ヒトサイトメガロウイルスの検出方法
WO2000073499A2 (en) 1999-05-28 2000-12-07 Innogenetics N.V. Nucleic acid probes and methods for detecting clinically important fungal pathogens
US6215894B1 (en) 1999-02-26 2001-04-10 General Scanning, Incorporated Automatic imaging and analysis of microarray biochips
US6235890B1 (en) 1996-09-16 2001-05-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods and compositions for the detection of Candida spp.
US6242178B1 (en) 1997-07-30 2001-06-05 Centers For Disease Control And Prevention Nucleic acid probes for detecting Candida species
US6277577B1 (en) 1990-04-18 2001-08-21 N.V. Innogenetics S.A. Hybridization probes derived from the spacer region between the 16s and 23s rRNA genes for the detection of non-viral microorganisms
WO2002034953A2 (en) 2000-10-24 2002-05-02 Vigen Laboratories, Inc. Detection and quantification of human herpes viruses
RU2182328C2 (ru) 2000-02-17 2002-05-10 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Флуоресцентный микроскоп
US20020164586A1 (en) 2001-01-31 2002-11-07 Smith Thomas F. Detection of herpes simplex virus
US20020177144A1 (en) 1997-12-30 2002-11-28 Jose Remacle Detection and/or quantification method of a target molecule by a binding with a capture molecule fixed on the surface of a disc
US20030124545A1 (en) 2001-03-01 2003-07-03 Rothman Richard Eric Quantitative assay for the simultaneous detection and speciation of bacterial infections
RU2001133477A (ru) 2001-12-13 2003-08-20 Лидия Алексеевна Агатова Способ диагностики поражения организма инфекциями
WO2004020631A2 (en) 1996-04-02 2004-03-11 Optigen Patents Limited Genetic suppression and replacement
US6720149B1 (en) 1995-06-07 2004-04-13 Affymetrix, Inc. Methods for concurrently processing multiple biological chip assays
US6790952B2 (en) 2001-02-13 2004-09-14 Cincinnati Children's Hospital Research Foundation Quantitative epstein barr virus PCR rapid assay
US20040185478A1 (en) 1997-11-04 2004-09-23 Bergeron Michel G. Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories
US6811978B2 (en) 1994-06-24 2004-11-02 Innogenetics N.V. Detection and identification of pseudomonas species using the 16S-23S rRNA spacer
WO2004113524A1 (en) 2003-06-23 2004-12-29 National Research Council Of Canada Variants of aminoacylase, nucleic acids coding same, and uses thereof
US20050042601A1 (en) 2003-04-25 2005-02-24 Wolfe David M. Detection of herpes simplex virus types 1 and 2 by nucleic acid amplification
RU2247390C2 (ru) 2002-02-19 2005-02-27 Научно-исследовательский институт детских инфекций (НИИДИ) Способ диагностики инфекции, вызванной вирусом эпштейн- барр
US6879915B2 (en) 2001-01-31 2005-04-12 Agilent Technologies, Inc. Chemical array fabrication and use
US20050153318A1 (en) 2000-07-10 2005-07-14 Schena Mark A. Microarray method of genotyping multiple samples at multiple loci
US20050186580A1 (en) 2004-02-23 2005-08-25 Dellinger Douglas J. Quality control method for array manufacture
US20050202436A1 (en) 2002-07-30 2005-09-15 Baback Gharizadeh Target-specific multiple sequencing primer pool for microbial typing and sequencing applications in DNA-sequencing technologies
RU2265668C1 (ru) 2004-09-15 2005-12-10 Общество с ограниченной ответственностью Инновационная Корпорация "БИОЗАЩИТА" Набор праймеров для детекции и/или идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и его содержащих продуктах (варианты), праймер (варианты), пара праймеров (варианты), способ детекции и/или идентификации с их использованием (варианты) и устройство для осуществления способа
RU2265656C1 (ru) 2004-03-22 2005-12-10 Общество с ограниченной ответственностью "ИнтерЛабСервис" Питательная среда для выявления ureaplasma urealyticum и способ диагностики урогенитальных уреаплазмозов
RU2270254C2 (ru) 2004-04-30 2006-02-20 Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук Способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления этого способа
RU2272293C1 (ru) 2004-08-17 2006-03-20 Сергей Юрьевич Юрьев Способ серологической диагностики активной хламидийной инфекции у беременных женщин
RU2274449C1 (ru) 2004-10-19 2006-04-20 Кировская государственная медицинская академия (КГМА) Способ повышения чувствительности метода пцр диагностики микоплазменной урогенитальной инфекции у больных с выраженным экссудативным воспалением

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1261716A2 (en) * 1999-11-16 2002-12-04 Apollo Biotechnology, Inc. Method for rapid and accurate identification of microorganisms

Patent Citations (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6277577B1 (en) 1990-04-18 2001-08-21 N.V. Innogenetics S.A. Hybridization probes derived from the spacer region between the 16s and 23s rRNA genes for the detection of non-viral microorganisms
US5700636A (en) 1990-10-19 1997-12-23 Becton Dickinson And Company Methods for selectively detecting microorganisms associated with vaginal infections in complex biological samples
JPH05317099A (ja) * 1990-12-28 1993-12-03 Iatron Lab Inc ヒトサイトメガロウイルスの検出方法
US5354653A (en) 1991-02-25 1994-10-11 Iatron Laboratories, Inc. Method of type-specific detection of herpes simplex virus
US5843667A (en) 1991-03-22 1998-12-01 Amoco Corporation Nucleic acid probes for the detection for genital mycoplasmas
WO1994003634A1 (fr) 1992-07-30 1994-02-17 Institut Pasteur Sequences d'oligonucleotides pour la detection specifique de mollicutes par amplification de genes conserves
US5550040A (en) 1993-06-23 1996-08-27 Hoffman-La Roche Inc. Method, reagents and kits for the detection of Neisseria gonorrhoeae
US6811978B2 (en) 1994-06-24 2004-11-02 Innogenetics N.V. Detection and identification of pseudomonas species using the 16S-23S rRNA spacer
US5656427A (en) 1994-08-29 1997-08-12 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid hybridization assay probes, helper probes and amplification oligonucleotides targeted to Mycoplasma pneumoniae nucleic acid
US6720149B1 (en) 1995-06-07 2004-04-13 Affymetrix, Inc. Methods for concurrently processing multiple biological chip assays
WO2004020631A2 (en) 1996-04-02 2004-03-11 Optigen Patents Limited Genetic suppression and replacement
US6235890B1 (en) 1996-09-16 2001-05-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods and compositions for the detection of Candida spp.
US6242178B1 (en) 1997-07-30 2001-06-05 Centers For Disease Control And Prevention Nucleic acid probes for detecting Candida species
US20040185478A1 (en) 1997-11-04 2004-09-23 Bergeron Michel G. Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories
US20020177144A1 (en) 1997-12-30 2002-11-28 Jose Remacle Detection and/or quantification method of a target molecule by a binding with a capture molecule fixed on the surface of a disc
US6215894B1 (en) 1999-02-26 2001-04-10 General Scanning, Incorporated Automatic imaging and analysis of microarray biochips
WO2000073499A2 (en) 1999-05-28 2000-12-07 Innogenetics N.V. Nucleic acid probes and methods for detecting clinically important fungal pathogens
JP2000032992A (ja) 1999-07-26 2000-02-02 Iatron Lab Inc ヒトサイトメガロウイルスの検出方法
RU2182328C2 (ru) 2000-02-17 2002-05-10 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Флуоресцентный микроскоп
US20050153318A1 (en) 2000-07-10 2005-07-14 Schena Mark A. Microarray method of genotyping multiple samples at multiple loci
WO2002034953A2 (en) 2000-10-24 2002-05-02 Vigen Laboratories, Inc. Detection and quantification of human herpes viruses
US6879915B2 (en) 2001-01-31 2005-04-12 Agilent Technologies, Inc. Chemical array fabrication and use
US20020164586A1 (en) 2001-01-31 2002-11-07 Smith Thomas F. Detection of herpes simplex virus
US6790952B2 (en) 2001-02-13 2004-09-14 Cincinnati Children's Hospital Research Foundation Quantitative epstein barr virus PCR rapid assay
RU2329305C2 (ru) 2001-03-01 2008-07-20 Дзе Джонс Хопкинс Юниверсити Количественный анализ, позволяющий одновременно обнаруживать и идентифицировать бактериальные инфекции
US20030124545A1 (en) 2001-03-01 2003-07-03 Rothman Richard Eric Quantitative assay for the simultaneous detection and speciation of bacterial infections
RU2001133477A (ru) 2001-12-13 2003-08-20 Лидия Алексеевна Агатова Способ диагностики поражения организма инфекциями
RU2247390C2 (ru) 2002-02-19 2005-02-27 Научно-исследовательский институт детских инфекций (НИИДИ) Способ диагностики инфекции, вызванной вирусом эпштейн- барр
US20050202436A1 (en) 2002-07-30 2005-09-15 Baback Gharizadeh Target-specific multiple sequencing primer pool for microbial typing and sequencing applications in DNA-sequencing technologies
US20050042601A1 (en) 2003-04-25 2005-02-24 Wolfe David M. Detection of herpes simplex virus types 1 and 2 by nucleic acid amplification
WO2004113524A1 (en) 2003-06-23 2004-12-29 National Research Council Of Canada Variants of aminoacylase, nucleic acids coding same, and uses thereof
US20050186580A1 (en) 2004-02-23 2005-08-25 Dellinger Douglas J. Quality control method for array manufacture
RU2265656C1 (ru) 2004-03-22 2005-12-10 Общество с ограниченной ответственностью "ИнтерЛабСервис" Питательная среда для выявления ureaplasma urealyticum и способ диагностики урогенитальных уреаплазмозов
RU2270254C2 (ru) 2004-04-30 2006-02-20 Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук Способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления этого способа
RU2272293C1 (ru) 2004-08-17 2006-03-20 Сергей Юрьевич Юрьев Способ серологической диагностики активной хламидийной инфекции у беременных женщин
RU2265668C1 (ru) 2004-09-15 2005-12-10 Общество с ограниченной ответственностью Инновационная Корпорация "БИОЗАЩИТА" Набор праймеров для детекции и/или идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и его содержащих продуктах (варианты), праймер (варианты), пара праймеров (варианты), способ детекции и/или идентификации с их использованием (варианты) и устройство для осуществления способа
RU2274449C1 (ru) 2004-10-19 2006-04-20 Кировская государственная медицинская академия (КГМА) Способ повышения чувствительности метода пцр диагностики микоплазменной урогенитальной инфекции у больных с выраженным экссудативным воспалением

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE EMBL [online] HIRAI K. ET AL.: "PCR primer to detect Cytomegalovirus DNA encoding Immediate Early 1 protein", XP008092839, Database accession no. (E05993) *
See also references of EP2028273A4 *
YOSHIDA. T.: "Rapid detection of Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma parvum, and Ureaplasma urealyticum organisms in genitourinary samples by PCR-microtiter plate hybridization assay", J. CLIN MICROBIOL., vol. 41, no. 5, May 2003 (2003-05-01), pages 1850 - 5, XP002444074, DOI: doi:10.1128/JCM.41.5.1850-1855.2003

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10876174B2 (en) 2009-04-07 2020-12-29 Koninklijke Philips N.V. Method for the detection and characterization of a toxinogenic Clostridium difficile strain

Also Published As

Publication number Publication date
EP2028273A1 (de) 2009-02-25
EP2028273A4 (de) 2010-09-01
WO2007136303A8 (ru) 2009-07-16
RU2348695C2 (ru) 2009-03-10
RU2006117378A (ru) 2007-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10584392B2 (en) Method for simultaneous detection and discrimination of bacterial, fungal, parasitic and viral infections of eye and central nervous system
JP4860869B2 (ja) 固相支持体上の複数のポリヌクレオチドを増幅し、検出する方法
RU2435865C2 (ru) Способ обнаружения наличия микроорганизмов в биологическом образце
US7205104B2 (en) Identification of biological (micro) organisms by detection of their homologous nucleotide sequences on arrays
WO2007136303A1 (ru) Способ идентификации урогенитальной инфекции, олигонуклеотид, комбинация олигонуклеотидов, биочип и набор на его основе
US20020086322A1 (en) Microarray-based analysis of polynucleotide sequence variations
Diaz et al. Use of a suspension array for rapid identification of the varieties and genotypes of the Cryptococcus neoformans species complex
Zhang et al. Library on a slide for bacterial comparative genomics
EP1332208A2 (en) Partially double-stranded nucleic acids, methods of making, and use thereof
US8741565B2 (en) Oligonucleotide microarray for identification of pathogens
US10538805B2 (en) Quantitative multiplexed identification of nucleic acid targets
Tabraue-Chávez et al. A colorimetric strategy based on dynamic chemistry for direct detection of Trypanosomatid species
JP2002537824A (ja) 細菌の同定
WO2006097232A2 (en) Antibiotic susceptibility and virulence factor detection in pseudomonas aeruginosa
JP2004507207A (ja) サンプル中の生物学的実体を検出するための方法
Frans et al. Detection and identification of fish pathogens: what is the future?
KR100819634B1 (ko) 성 전파 질환 검사를 위한 신규한 올리고뉴클레오티드프로브와 이를 이용한 성 전파 질환 검사용 ｄｎａ칩,분석키트 및 그 제조 방법
US7297477B2 (en) Methods and compositions for detecting viral nucleic acid in a cell
RU2509804C2 (ru) Набор дифференцирующих и специфических олигонуклеотидов для идентификации днк возбудителей острых кишечных инфекций, способ идентификации оки, микрочип и диагностическая система для осуществления способа
US20050095606A1 (en) Partially double-stranded nucleic acids, methods of making, and use thereof
Wang et al. Direct detection of 16S rRNA using oligonucleotide microarrays assisted by base stacking hybridization and tyramide signal amplification
Díaz-Mochón A colorimetric strategy based on dynamic chemistry for direct detection of trypanosomatid species
Morschhäuser et al. CARE-2 fingerprinting of Candida albicans isolates
EP1926830A1 (en) Pcr-based detection method for chlamydia treachomatis
KR20080104118A (ko) 패혈증 관련 질환 원인 세균의 감별 및 동정을 위한올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이와 이를이용한 검출 방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07794002

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007794002

Country of ref document: EP