RU2006117378A

RU2006117378A - Дифференцирующий и специфический олигонуклеотиды для идентификации последовательностей днк инфекционных агентов в биологических материалах, способ видовой идентификации инфекционных агентов, биочип и набор для осуществления этого способа

Info

Publication number: RU2006117378A
Application number: RU2006117378/13A
Authority: RU
Inventors: Игорь Эдуардович Грановский (RU); Игорь Эдуардович Грановский; Игорь Петрович Белецкий (RU); Игорь Петрович Белецкий; пникова Елена Андреевна Шл (RU); Елена Андреевна Шляпникова; Александр Владимирович Гаврюшкин (RU); Александр Владимирович Гаврюшкин; Сергей Владимирович Бирюков (RU); Сергей Владимирович Бирюков
Original assignee: Закрытое акционерное общество "Молекул рно-медицинские технологии" (RU); Закрытое акционерное общество "Молекулярно-медицинские технологии"
Priority date: 2006-05-23
Filing date: 2006-05-23
Publication date: 2007-12-10
Also published as: EP2028273A1; WO2007136303A1; RU2348695C2; WO2007136303A8; EP2028273A4

Claims

1. Специфический олигонуклеотид в качестве праймера ПЦР для видовой идентификации инфекционных агентов преимущественно урогенитальной области, имеющий по крайней мере 80%-ную гомологию нуклеотидной последовательности к олигонуклеотидам, которые выбирают из любых последовательностей с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 58, представленных в перечне последовательностей.

2. Дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда для видовой идентификации инфекционных агентов преимущественно урогенитальной области, имеющий, по крайней мере, 80%-ную гомологию нуклеотидной последовательности к олигонуклеотидам, которые выбирают из любых последовательностей с SEQ ID NO: 59 по SEQ ID NO: 87, представленных в перечне последовательностей.

3. Биологический микрочип для видовой идентификации инфекционных агентов, предпочтительно урогенитальной области, представляющий собой несущий элемент, на котором в форме кластеров из нанесенных зондов иммобилизованы дифференцирующие олигонуклеотиды с последовательностью, охарактеризованной в п.2.

4. Микрочип по п.3, отличающийся тем, что несущий элемент чипа выполнен из материалов, входящих в группу, состоящую из полимеров, стекла, металлов, керамики или их комбинаций.

5. Микрочип по п.4, отличающийся тем, что полимеры выбирают из группы, состоящей из полиметилметакрилата, полибутилметакрилата, поливинилхлорида, поликарбоната, сополимеров метилметакрилата и/или сополимеров бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол, акрилонитрил.

6. Микрочип по п.5, отличающийся тем, что в качестве полимера используют полиметилметакрилат.

7. Микрочип по п.5, отличающийся тем, что в качестве полимера используют поливинилхлорид.

8. Микрочип по п.3, отличающийся тем, что несущий элемент чипа выполнен в виде плоских платформ, пленок, гранул, волокон.

9. Микрочип по п.3, отличающийся тем, что форма несущего элемента, выполненного в виде плоских платформ или пленки, представляет собой прямоугольник, квадрат, многоугольник или круг.

10. Микрочип по п.9, отличающийся тем, что толщина несущего элемента составляет от 0,5 до 5,0 мм.

11. Микрочип по п.3, отличающийся тем, что несущий элемент выполнен в форме индивидуального чипа или мультичипа.

12. Микрочип по п.11, отличающийся тем, что несущий элемент выполнен в форме мультичипа, состоящего из N отделяемых от несущего элемента индивидуальных чипов.

13. Микрочип по п.3, отличающийся тем, что количество кластеров, размещенных в рабочей зоне каждого индивидуального чипа составляет от 2 до 1000.

14. Микрочип по п.3, отличающийся тем, что количество кластеров, размещенных в рабочей зоне каждого индивидуального чипа, составляет 15.

15. Микрочип по п.3, отличающийся тем, что состав кластеров, размещенных на рабочей зоне чипа, выбирают из группы: кластеры зондов, кластеры положительных контролей, кластеры отрицательных контролей.

16. Микрочип по п.15, отличающийся тем, что соотношение между количеством кластеров, в которых размещают зонды, и кластеров, в которых размещают положительные контроли, выбирают в диапазоне от 1:1 до 500:1.

17. Микрочип по п.15, отличающийся тем, что соотношение между количеством кластеров, в которых размещают зонды, и кластеров, в которых размещают отрицательные контроли, которые выбирают в диапазоне от 1:1 до 500:1.

18. Микрочип по п.16 или 17, отличающийся тем, что соотношение между количеством кластеров, в которых размещают зонды, и кластеров, в которых размещают положительные и отрицательные контроли, составляет соответственно 6:1 и 12:1.

19. Микрочип по п.3, отличающийся тем, что количество нанесенных зондов одного типа дифференцирующего олигонуклеотида на поверхности каждого кластера составляет от 1 до 50.

20. Микрочип по п.19, отличающийся тем, что количество нанесенных зондов одного типа дифференцирующего олигонуклеотида в каждом кластере составляет 4 или 9.

21. Микрочип по п.19, отличающийся тем, что объем капель каждого зонда составляет не менее 0,005 мкл.

22. Микрочип по п.12, отличающийся тем, что отдельные чипы получают посредством отделения чипа от несущего элемента, причем отделение осуществляют отламыванием, отрезанием, отрубанием или их комбинацией.

24. Способ видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, включающий выделение ДНК, амплификацию ДНК при помощи ПЦР, приготовление биологического микрочипа и регистрацию результатов анализа, отличающийся тем, что а) приготовляют биологический микрочип, охарактеризованный в п.3, в соответствии с которым необязательно модифицируют поверхность микрочипа и далее проводят иммобилизацию, по крайней мере, одного из группы дифференцирующих олигонуклеотидов, охарактеризованных в п.2; б) проводят амплификацию фрагментов ДНК инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, методом ассимметричной ПЦР с использованием по крайней мере двух специфических олигонуклеотидов, охарактеризованных в п.1, один из составляющих пару праймеров содержит метку для получения амплифицированной меченной одноцепочечной ДНК; в) проводят гибридизацию одноцепочечной ДНК, полученной на стадии б), с указанными дифференцирующими олигонуклеотидами на биологическом микрочипе, охарактеризованном в п.3 и полученном согласно стадии а), путем инкубации указанного микрочипа с гибридизационной смесью для образования дуплексов амплифицированных фрагментов ДНК с дифференцирующими олигонуклеотидами микрочипа; г) проводят регистрацию полученного результата, осуществляемую путем детектирования, д) проводят идентификацию и интерпретацию полученных результатов.

25. Способ по п.24, отличающийся тем, что ДНК выделяют, по крайней мере, из одного образца биологического материала человека, входящего в группу, состоящую из крови, биопсийного материала, слюны, слезных выделений, мочи, бронхо-авеолярного лаважа, ликвора, или их комбинаций.

26. Способ по п.24, отличающийся тем, что детектирование и/или идентификацию полученных результатов осуществляют путем сравнительного анализа уровня сигналов исследуемого образца, положительного и отрицательного контролей.

27. Способ по п.24, отличающийся тем, что определяемую метку выбирают из группы, состоящей из каталитической, лигандной, флуоресцентной или радиоактивной.

28. Способ по п.27, отличающийся тем, что каталитическая молекула выбрана из группы, включающей гемин, цианкобаламин или флавин.

29. Способ по п.27, отличающийся тем, что лигандная молекула выбрана из группы, включающей биотин, дигоксигенин или динитробензол.

30. Способ по п.25, отличающийся тем, что флуоресцентная молекула выбрана из группы, включающей FAM, TAMRA, Су3, Су5, Cy7, R6G, R110, ROX или JOE.

31. Набор для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, включающий

а) биологический микрочип или биологический мультичип для проведения параллельных или последовательных скринингов, охарактеризованный в п.3;

б) набор специфических олигонуклеотидов, охарактеризованных в п.2;

в) реагенты, которые выбирают из группы, состоящей из реагентов для подготовки образца, реагентов для проведения ПЦР, реагентов для проведения гибридизации или их комбинации;

г) устройство (устройства) для проведения гибридизации и/или для сканирования и интерпретации результатов анализа.

32. Набор по п.30, в котором в качестве устройства для сканирования используют, по крайней мере, одно сканирующее устройство, входящее в группу, состоящую из ручного сканера, сканера индивидуальных чипов, планшетного сканера мультичипов, сканера дисковых мультичипов и компьютера.