CN113265457A

CN113265457A - 一种遗传性耳聋多重检测的crRNA组合、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN113265457A
Application number: CN202110573690.XA
Authority: CN
Inventors: 朱元首; 陶生策
Original assignee: Shanghai Zhenshe Biological Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Kangmai Xinrui Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2021-05-25
Filing date: 2021-05-25
Publication date: 2021-08-17

Abstract

本发明公开了一种遗传性耳聋多重检测的crRNA组合、试剂盒及方法。所述crRNA组合同时靶向耳聋基因GJB2和SLC26A4的5个SNP位点，包括SEQ ID No.2、4、6、8、10所示的核苷酸序列。采用的遗传性耳聋多重检测试剂盒将Cas12a检测反应体系设置在孔板的微孔内，多重RPA扩增在镂空蜂巢芯片中进行，使用中空垫圈把镂空版蜂巢芯片和微孔底部进行物理隔离，从而将多重RPA扩增与Cas12a检测两个反应先进行隔离，再进行融合，实现了一步法、多重检测，也避免了开盖检测可能造成的气溶胶污染。本发明还实现了高通量检测，一次反应最多检测96个样本、同时区分5个SNP位点，适用于大规模遗传筛查。

Description

一种遗传性耳聋多重检测的crRNA组合、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是针对SNP检测领域，具体涉及一种遗传性耳聋多重检测的crRNA组合、试剂盒及方法，尤其涉及一种基于CRISPR/Cas12a的遗传性耳聋多重检测的crRNA组合、试剂盒及方法。

背景技术

耳聋是临床常见的听力神经系统缺陷性疾病，遗传和环境因素均可致病，其中遗传因素约占60％(Morton CC,et al.,2006,N Engl J Med,354(20):2151–2164)，经人类研究发现的耳聋致病基因有100余种(http://hereditaryhearingloss.org/)，但发病主要集中在 GJB2、SLC26A4、12s rRNA、GJB3等几个基因的热点突变上。据统计，在中国听力残疾人群2000多万，7岁以下聋儿达80万，每年新增聋儿3万余名，发病率为1～3‰，属于稀有突变/SNP(Li L,et al.,2012,Chin.J.Otol,10(2):246-251)。遗传筛查通常是对人群中的“稀有突变/SNP”进行大规模的检测，检测结果绝大部分都是野生型，但现有方法仍对每个人从头至尾进行检测，造成了极大的人力、物力和资源的浪费，缺乏能够在一开始就对遗传性耳聋的多个位点是否含有突变进行初筛的多重SNP检测方法。

现有的耳聋基因突变检测方法总结如下：(1)限制性片段长度多态性分析(RFLP)根据酶切图谱进行检测，成本低，只需简单的仪器，但操作繁琐、费时费力、检出率较低(Dai P,et al.,2007,Genet Med,9(5):283–289)；(2)Taqman探针法和高分辨熔解曲线(HRM)分别将荧光探针和饱和染料与PCR结合进行实时监测，操作简化，时间缩短，但依赖高分辨率的定量PCR仪，并且很难实现多重检测(Iwasa YI,2016,PLoS One, 11(12):e0166781；Mercer S,et al.,2011,Genet Test Mol Biomarkers,15(5):365–368)；(3) 测序法作为分子生物学诊断的金标准，准确率极高，但需要测序仪和专业操作，一般仅用于发现新的SNP突变位点(Shearer AE,et al.,2010,Proc Natl Acad Sci, 107(49):21104–21109)；(4)质谱法和数字PCR因其高灵敏度也被用于耳聋突变检测，但前者依赖质谱仪、步骤多耗时长，后者依赖数字PCR仪、试剂耗材贵，均不适用于大规模的遗传筛查(Peng Q,et al.,2016,Genet Test Mol Biomarkers,20(10):603–608；Fang Wang,et al.,2018,Anal Chem,90(15),8919-8926)。因此，基因芯片凭借其可同时检测大量序列(多重检测)、简单快速、成本低、高灵敏度和特异性的优点，成为耳聋突变遗传筛查的主流方法(Li CX,et al.,2008,Hum Mutat,29(2):306–314；Dai P,et al.,2019, Am J Hum Genet,105(4):803–812)。北京博奥生物利用耳聋基因芯片完成了全国269.91 万新生儿的基因筛查(http://cn.capitalbio.com/gxba/xwzx/gsxw/2018nyjd/26885.shtml)，检出新生儿耳聋突变携带率约为4～5％，但该方法的不足之处在于依赖芯片扫描仪和 PCR热循环仪，受限于多重PCR引物对之间的干扰，扩增需要分两管进行，芯片杂交步骤可能造成气溶胶污染，且很难实现高通量检测，不利于快速高效地大规模遗传筛查。

CRISPR/Cas12a属于Cas酶的第二家族，能够与crRNA结合形成二元复合物，并在其引导下扫描双链DNA，识别TTTN的PAM序列，形成Cas12a-crRNA-dsDNA三元复合物，激活Cas12a的顺式切割活性，特异性地切割dsDNA，进而诱导产生强大的反式切割活性，非特异性地切割ssDNA(Chen JS,et al.,2018,Science,360(6387):436–439；Li SY,2018,CellRes,28(4):491–493)，所以只需在体系中加入荧光探针ssDNA reporter，就能通过荧光强度的变化区分单碱基突变，对于不含PAM序列的检测位点可以通过 PCR、RPA、LAMP等扩增方式引入。

现有专利文献CN110878343A公开了一种用于遗传性耳聋致病基因SLC26A4突变快速检测的Cpf1(Cas12a)试剂盒及检测方法，但它的RPA扩增与Cas12a检测分两步进行，开盖检测容易造成气溶胶污染，并且无法实现多个位点的同时检测，只能逐个进行，通量较低。此外，它只针对SLC26A4一个基因进行设计，覆盖面低。

因此，本发明致力于将Cas12a的单碱基识别能力、镂空蜂巢芯片的多重检测能力和标准96孔板的高通量特性有效地集成起来，开发一种操作简便、一步法、适用于大规模遗传筛查的高通量和多重SNP检测平台，同时检测GJB2和SLC26A4两个基因的 5个突变位点。

发明内容

针对现有检测方法的技术问题，本发明提供一种基于CRISPR/Cas12a和镂空蜂巢芯片的遗传性耳聋多重检测的crRNA组合、试剂盒及方法。该方法利用Cas12a的顺式和反式切割活性，针对耳聋致病基因GJB2和SLC26A4的5个热点突变设计和筛选crRNA，并结合镂空蜂巢芯片和标准96孔板，构建了一步法、多重crRNA检测体系，同时实现了高通量检测。整个扩增和检测过程处于密闭环境中，避免了气溶胶污染，借助酶标仪在1.5小时内最多可同时检测96个样本、区分5个SNP位点，极大降低了检测成本，在大规模遗传筛查中具有良好的应用前景。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种遗传性耳聋多重检测的crRNA组合，包含以下突变型crRNA：

用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.176_191del16的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.235delC的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.299_300delAT的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；；

用于检测遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点c.2168A>G的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；

用于检测遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

本发明还提供了一种遗传性耳聋多重检测及分型的crRNA组合，包含以下野生型和突变型crRNA组1～5：

用于检测遗传性耳聋突变位点GJB2(c.176_191del16)的野生型和突变型crRNA组1由SEQ ID No.1和No.2所示的核苷酸序列组成；

用于检测遗传性耳聋突变位点GJB2(c.235delC)的野生型和突变型crRNA组2由SEQ ID No.3和No.4所示的核苷酸序列组成；

用于检测遗传性耳聋突变位点GJB2(c.299_300delAT)的野生型和突变型crRNA组3由SEQ ID No.5和No.6所示的核苷酸序列组成；

用于检测遗传性耳聋突变位点SLC26A4(c.2168A>G)的野生型和突变型crRNA 组4由SEQ ID No.7和No.8所示的核苷酸序列组成；

用于检测遗传性耳聋突变位点SLC26A4(IVS7-2A>G)的野生型和突变型crRNA 组5由SEQ ID No.9和No.10所示的核苷酸序列组成。

本发明所述crRNA组合是通过在EP管内和芯片上对不同长度的crRNA(15～20nt)进行CRISPR/Cas12a检测后层层筛选获得，同时针对区分效果不好的位点进一步通过人工引入突变来提高信噪比，进而获得了同时靶向耳聋基因GJB2和SLC26A4的5个SNP 位点的crRNA组合。

本发明还提供一种遗传性耳聋多重检测反应体系，包括RPA扩增反应体系和Cas12a 检测反应体系；所述Cas12a检测反应体系包括权利要求1或2所述的crRNA组合。

优选地，所述RPA扩增反应体系包括序列如SEQ ID NO.11～20所示的RPA引物对。RPA扩增的目的是给待检测的SNP位点附近引入CRISPR-Cas12a检测所必须的PAM序列(TTTN)。

本发明还提供了一种遗传性耳聋多重检测试剂盒，包括镂空蜂巢芯片、中空垫圈(3)、孔板(8)和加样头(5)；

所述中空垫圈(3)设置在镂空蜂巢芯片下方，中空垫圈(3)和镂空蜂巢芯片放置于孔板(8)的微孔(4)中；

所述镂空蜂巢芯片包括芯片底座(2)和多根毛细管(1)，所述芯片底座(2)为中空的环形结构，多根毛细管(1)沿芯片底座(2)的圆周方向均匀设置；各所述毛细管(1)的上端延伸至芯片底座(2)的上表面以上，毛细管(1)的下端与芯片底座(2) 的下表面齐平；

各所述毛细管(1)内预固定有RPA引物对，序列如SEQ ID NO.11～20所示；

所述各微孔(4)底部添加有不含模板DNA的Cas12a反应体系，所述Cas12a反应体系包括权利要求1所述的crRNA组合。

优选地，所述加样头(5)的中间设置有加样口(6)，加样口呈漏斗状；所述加样头(5)的底面中部为凹面，加样时形成样品池(7)，样品池(7)的直径小于芯片底座(2)的外径，样品池(7)的下底面可覆盖各毛细管(1)的顶面。

优选地，所述孔板(8)为96孔板；

所述孔板(8)的各微孔(4)中，均放置一个镂空蜂巢芯片和中空垫圈(3)；

所述毛细管(1)的数量为5根，每一根毛细管(1)中预固定一对不同的RPA引物对；

所述多重检测试剂盒结构还包括封口膜，封口膜设置在微孔(4)上方；所述封口膜的材质为具有光学透性的膜材料；

所述中空垫圈(3)的外径与芯片底座(2)的外径相同，各毛细管的下端与中空垫圈(3)的中空部位连通。

优选地，所述Cas12a多重检测体系是在96孔板的微孔底部，通过中空垫圈将镂空蜂巢芯片内的多重RPA扩增与微孔底部的多重Cas12a检测进行一步法集成，避免开盖检测可能造成的污染，反应温度37℃，不依赖热循环仪。

优选地，所述镂空蜂巢芯片是由中间镂空的PDMS基底集成5根毛细管而成，并对其表面进行疏水修饰，形成“孔内亲水、孔外疏水”的模式，配合加样头能实现各毛细管同时虹吸进样而又不相互干扰；毛细管内分别预固定不同的RPA引物对，能针对5 个耳聋突变位点同时进行扩增，而芯片中间镂空的设计利于酶标仪进行荧光检测，避免遮挡光线。

优选地，所述垫圈为外径6.3mm、内径5.3mm的中空PMMA圆环，将其置于96 孔板的微孔内能将镂空版蜂巢芯片支撑起来，形成两个反应空间：镂空蜂巢芯片用于多重RPA扩增、微孔底部空间用于多重Cas12a检测，二者互不影响，而当RPA反应结束后，只需一步离心，扩增产物就可进入微孔底部激活Cas12a切割活性。

优选地，所述Cas12a检测体系还包括Cas12a蛋白、ssDNA reporter；只要芯片内的多重RPA扩增产物能与Cas12a检测体系中任意一种crRNA匹配，就能激活Cas12a的切割活性，达到一次反应检测多个SNP位点的目的。

优选地，所述ssDNA reporter是利用六氯-6-甲基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记产物为/5HEX/NNNNNNNNNNNN/3BHQ1/(N表示随机的碱基，没有固定的序列)，用超纯水溶解后备用。

本发明还提供了一种基于前述的试剂盒的遗传性耳聋多重检测方法，所述方法包括以下步骤：

S1、配制包含权利要求1所述crRNA组合的Cas12a检测反应体系，加到孔板的微孔底部；

S2、配制包含待检测的基因模板的RPA反应体系，通过加样头加到镂空蜂巢芯片的毛细管中，用封口膜进行密封；所述毛细管内预固定有RPA引物对；

S3、将孔板置于酶标仪中反应，使预固定的RPA引物和待检测的基因模板进行多重RPA扩增；此时孔板各微孔底部的Cas12a反应液因不含模板，处于未激活的状态；

S4、将反应结束后的孔板取出离心，使扩增产物进入孔板底部的Cas12a检测反应体系中，激活Cas12a的切割活性，然后放回酶标仪中进行检测，采集荧光，根据实时荧光曲线对待检测的基因模板是否含有耳聋突变位点进行快速判定。

优选地，步骤S3中，所述反应条件为37℃反应30min；

步骤S4中，所述离心条件为1000rpm离心30s，所述检测条件为37℃检测60min。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、提供了一套能够同时检测遗传性耳聋5个SNP位点的crRNA组合和RPA扩增引物，灵敏度高，特异性强。

2、建立了基于CRISPR/Cas12a和镂空版蜂巢芯片的遗传性耳聋多重检测试剂盒及方法，将Cas12a的单碱基识别能力、蜂巢芯片的多重检测能力和96孔板的高通量特性进行有效集成，能够在一开始就对遗传性耳聋的多个位点是否含有突变进行初筛，排除绝大部分的野生型样本，为突变型样本的后续分析节约时间和降低成本，适用于大规模遗传筛查。

3、通过使用垫圈把镂空版蜂巢芯片和96孔板的微孔底部进行物理隔离，从而将多重RPA扩增与Cas12a检测两个反应先进行隔离，再进行融合，在实现一步法检测的同时实现多重检测，也避免了开盖检测可能造成的气溶胶污染。

4、全过程反应温度37℃，无需热循环仪，只需借助常规的酶标仪，即可完成荧光信号的实时检测，直接生成荧光曲线，这相对于终点法检测更准确。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明实施例1中基于Cas12a两步法筛选到的最适crRNA的检测结果，其中图1a为具体筛选的反应过程示意图；图1b为针对GJB2 c.176-191del16突变位点的检测结果；图1c为针对GJB2 c.235delC突变位点的检测结果；图1d为针对GJB2 c.299_300delAT突变位点的检测结果；图1e为针对SLC26A4 c.2168A>G突变位点的检测结果；图1f为针对SLC26A4 IVS7-2A>G突变位点的检测结果；

图2为本发明实施例2中针对2个耳聋基因组样本的检测结果；

图3为本发明开发的耳聋基因多重、高通量和一步法SNP检测平台的示意图；

图4为镂空蜂巢芯片结构的俯视图；

图5为镂空蜂巢芯片与中空垫圈结合的剖视图；

图6为多重检测试剂盒的结构示意图；

图7为孔板结构示意图；

图4-图7中，1-毛细管；2-芯片底座；3-中空垫圈；4-微孔；5-加样头；6-加样口； 7-样品池；8-孔板；

图8为本发明实施例3中基于Cas12a一步法进行耳聋基因多重检测的结果；其中，图8a为加样示意图；图8b为加入野生型或突变型GJB2 c.176-191del16的检测结果；图8c为加入野生型或突变型GJB2 c.299_300delAT的检测结果；图8d为加入野生型或突变型GJB2 c.235delC的检测结果；图8e为加入野生型或突变型SLC26A4 c.2168A>G的检测结果；图8f为加入野生型或突变型SLC26A4 IVS7-2A>G的检测结果；图8g为同时加入5种野生型模板DNA的检测结果以及再加入突变型c.171-196del16 的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明中，crRNA体外转录试剂盒HiScribe^TMT7 Quick High Yield RNASynthesis Kit 和Cas12a反应缓冲液NEBuffer 3.0均购自New England Biolabs公司；crRNA纯化试剂 RNAXP clean beads购自Beckman Coulter公司；RPA扩增试剂盒

Basic Kit 购自TwistDx公司；RNase inhibitor购自Takara公司；荧光探针ssDNA reporter和RPA 引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；质粒模板均由华大青兰生物科技(无锡)有限公司合成。

实施例1：基于Cas12a两步法筛选最适crRNA

据文献报道，CRISPR/Cas12a的crRNA由Direct repeat和Spacer两部分组成，其中Direct repeat主要起锚定Cas蛋白的作用，Spacer主要起识别模板DNA的作用，并且不同长度的Spacer对于Cas12a识别和区分突变位点的效率影响很大(Zetsche B,et al.,2015,Cell,163(3):759–771；Dong D,et al.,2016,Nature,532(7600):522–526；Li SY,et al.,2018, Cell Discov,4:20)。因此，我们首先根据GJB2基因突变位点c.176-191del16、c.235delC、 c.299_300delAT和SLC26A4基因突变位点c.2168A>G、IVS7-2A>G设计不同长度的 crRNA，其中Direct repeat序列不变，改变Spacer序列的长度(15～24nt)；同时，对于仍无法得到信噪比高的crRNA，进一步通过在倒数第2位或第3位引入突变的方式改进，最终得到如表1所示的用于遗传性耳聋SNP位点检测的最适crRNA。

表1.用于遗传性耳聋SNP位点检测的最适crRNA

此外，在crRNA与模板DNA互补配对之前，Cas12a需要先识别富含胸腺嘧啶的 PAM序列(TTTN)，而待测突变位点的附近并不含有，需要通过额外的扩增方式引入。 RPA(Recombinase polymerase amplification)作为常用的等温扩增方式，37℃反应30min 即可达到PCR的扩增效率，且与Cas12a的反应温度相同，因此我们将RPA扩增与Cas12a 检测结合起来，即为Cas12a两步法检测，所涉及的RPA引物如表2所示，具体检测体系如表3所示。

表2.五个用于遗传性耳聋SNP位点检测的RPA引物

表3.Cas12a两步法检测体系

表3中所述的ssDNA reporter是利用六氯-6-甲基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记产物为/5HEX/NNNNNNNNNNNN/3BHQ1/(N表示随机的碱基，没有固定的序列)。

Cas12a两步法检测过程如下：首先我们分别将5个突变位点采用表2中的相应引物序列进行RPA扩增，37℃反应30min，然后吸取1μL的产物(即作为表3中的模板 DNA)，加入分别含有针对各突变位点设计的不同长度野生型和突变型crRNA的Cas12a 反应液(即表3所示的不包含模板DNA的检测体系)中，37℃反应40min，每个反应设置3个重复，通过酶标仪读取荧光曲线。根据野生型(Wild Type)和突变型(Mutant Type)模板的信号差异，选择信噪比最大的crRNA作为最适crRNA，结果如图1所示，得到了针对5个SNP位点的10条最适crRNA(包含5条野生型crRNA和5条突变型 crRNA，如表1所示)。

实施例2：耳聋基因组样本的检测与分型

将实施例1筛选到的最适crRNA用于耳聋基因组样本的检测，检测方法与实施例1相同，每个体系加入1μL的待测基因组样本，每个反应设置3个重复，检测结果如图2 所示。由图2的结果可见，当用c.299_300delAT位点的crRNA-Wild-19nt和 crRNA-Mutant-20nt检测样本1时，荧光曲线明显升高，表明该crRNA能够与基因组 DNA完成互补配对，进而激活Cas12a切割ssDNA reporter的活性，证明该样本含有GJB2 (c.299_300delAT)突变位点，且是杂合突变型；而当用IVS7-2A>G位点的crRNA-Wild-18 nt和crRNA-Muatnt-18nt-mis 2检测样本2时，突变型crRNA-Muatnt-18nt-mis 2对应的荧光曲线无上升趋势，表明该crRNA不能与基因组DNA完成互补配对，Cas12a处于未激活状态，证明该样本不含有SLC24A4(IVS7-2A>G)突变位点，同时野生型 crRNA-Wild-18nt对应的荧光曲线明显升高，表明野生型crRNA能够与基因组DNA完成互补配对，进一步证明了样本2是野生型样本。

实施例3：基于Cas12a一步法测试多重检测的有效性

由于实施例1和2已经证明crRNA单重检测的有效性，本实施例将基于镂空蜂巢芯片平台(如图3所示)测试Cas12a一步法进行多重检测的有效性。

所采用的试剂盒结构如图4-图7所示，包括镂空蜂巢芯片、中空垫圈3、孔板8和加样头5；

所述中空垫圈3设置在镂空蜂巢芯片下方，中空垫圈3和镂空蜂巢芯片放置于孔板8的微孔4中；

所述镂空蜂巢芯片包括芯片底座2和多根毛细管1，所述芯片底座2为中空的环形结构，多根毛细管1沿芯片底座2的圆周方向均匀设置；各所述毛细管1的上端延伸至芯片底座2的上表面以上，毛细管1的下端与芯片底座2的下表面齐平；

所述各微孔4底部添加有不含模板DNA的Cas12a检测反应体系。

所述加样头5的中间设置有加样口6，加样口呈漏斗状；所述加样头5的底面中部为凹面，加样时形成样品池7，样品池7的直径小于芯片底座2的外径，样品池7的下底面可覆盖各毛细管1的顶面。加样头5配合移液器使用，加样完成后移除。加样头5 进行加样时，由于毛细管1的顶端全部为超疏水表面，表面张力会阻碍液体在其表面扩散，同时加样头5底面的凹面形成的样品池7的表面为亲水(即凹面亲水)，因此反应液从加样口到达凹面后，会迅速充满样品池，形成液面，进而靠虹吸作用进入并充满与其紧密接触的各毛细管1。

所述孔板8为96孔板；

所述孔板8的各微孔4中，均放置一个镂空蜂巢芯片和中空垫圈3；

所述毛细管1数量为5根，每一根毛细管1中预固定一对不同的RPA引物对。

所述多重检测试剂盒结构还包括封口膜，封口膜设置在微孔4上方；所述封口膜的材质为具有光学透性的膜材料；

所述中空垫圈3的外径与芯片底座2的外径相同，各毛细管的下端与中空垫圈(3)的中空部位连通。所述中空垫圈3的外径为6.3mm、内径为5.3mm，所述芯片底座的外径为6.3mm、内径为2.6mm；所述样品池的直径为5.5mm，高度为0.2mm。

具体检测步骤如下：

(1)将实施例1设计的5对RPA引物(0.96μM，表2所示)干燥固定在镂空蜂巢芯片的毛细管内，每根毛细管对应一对RPA引物，分别针对GJB2基因突变位点 c.171-196del16、c.235delC、c.299_300delAT和SLC26A4基因突变位点c.2168A>G、 IVS7-2A>G进行扩增；

(2)如图3所示，将96孔板、垫圈、镂空蜂巢芯片从下而上依次组装；

(3)按照表4所示的Cas12a一步法检测体系，配制包含5种特异性crRNA、不含模板DNA的Cas12a反应液(41.5μL)，用多通道移液器加到96孔板的各微孔底部；

(4)按照RPA试剂盒说明书，依次配制仅含1种突变型或野生型待检测的模板的RPA反应液，并配制不含任何模板和同时含5种野生型待检测的模板的反应液作为对照，然后用200μL多通道移液器吸取反应液，插上加样头，置于96孔板内的镂空蜂巢芯片上方进行加样，保证每根毛细管充满RPA反应液(1.7μL)，移除加样头，贴上封口膜；

(5)将96孔板置于酶标仪中37℃反应30min，此时镂空蜂巢芯片同时存在预固定的RPA引物和待检测的模板，可以进行多重RPA反应，而96孔板底部的Cas12a反应液因不含模板，处于未激活的状态；

(6)将96孔板取出1000rpm离心1min，放回酶标仪，37℃检测60min，每分钟采集荧光一次，此时镂空蜂巢芯片中的RPA产物(8.5μL，即作为表4中的模板DNA) 经过离心进入96孔板微孔底部的Cas12a反应液(41.5μL)中，激活Cas12a的切割活性。

(7)根据酶标仪的实时荧光曲线判定样本是否含有这5个耳聋基因突变位点。

图8a为加样示意图；图8b-图8f为结果显示，在同时含有5种crRNA的Cas12a 多重检测体系中，加入任意一种突变型模板DNA，均会导致荧光曲线上升，显示阳性结果；而加入任意一种野生型模板DNA，荧光曲线都保持低平，显示阴性结果。进一步地，图8g的结果显示，即使同时加入5种野生型模板DNA，荧光曲线也不会上升，只有当突变型模板DNA(如c.171-196del16)加入，才会引起曲线上升。此外，图8结果也侧面表明镂空蜂巢芯片中的多重RPA成功扩增，物理隔离的方式避免了引物对之间的干扰，可进一步提高重数。由于微阵列集成了标准的96孔板，只需配合多通道移液器，即可实现高通量检测。

表4.Cas12a一步法检测体系

本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海真测生物科技有限公司

<120> 一种遗传性耳聋多重检测的crRNA组合、试剂盒及方法

<130> DD14200T

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aauuucuacu guuguagaug ccaggcugca agaacg 36

<210> 2

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aauuucuacu guuguagaug ccagcuacga ucacua 36

<210> 3

<211> 35

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aauuucuacu guuguagauc ugcagggccc auagc 35

<210> 4

<211> 35

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aauuucuacu guuguagauc ugcaggccca uagcc 35

<210> 5

<211> 38

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aauuucuacu guuguagauu ucucaugucu ccgguagg 38

<210> 6

<211> 39

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aauuucuacu guuguagauu ucucgucucc gguaggcca 39

<210> 7

<211> 37

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aauuucuacu guuguagaua ucauggaccg ucaaaaa 37

<210> 8

<211> 37

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aauuucuacu guuguagaua ucacggaccg ucaaaaa 37

<210> 9

<211> 37

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aauuucuacu guuguagauu uucagacgau aauugcu 37

<210> 10

<211> 37

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aauuucuacu guuguagauu uucggccgau aauugcu 37

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccgactttgt ctgcaacacc ctttagccag 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcttctcatg tctccggtag gccacgtgca 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aggaggtgtg gggagatgag caggccgact 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agcgctggcg tggacacgaa gatttgctgc 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgtgtgctac gatcactact tccccatctc 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctcccccttg atgaacttcc ttttcttctc 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttcaagatta tgtgatagaa aagctggagc 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

acttggttct gtagatagag tatttcatca 30

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttggttgaca aacaaggaat tattaaaacc 30

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccagcattgt aatttttttc caggttggct cc 32

Claims

1.一种遗传性耳聋多重检测的crRNA组合，其特征在于，包含以下突变型crRNA：

用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.235delC的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQID No.4所示；

2.一种遗传性耳聋多重检测及分型的crRNA组合，其特征在于，包含以下野生型和突变型crRNA组1～5：

用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.176_191del16的野生型和突变型crRNA组1由SEQ ID No.1和No.2所示的核苷酸序列组成；

用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.235delC的野生型和突变型crRNA组2由SEQID No.3和No.4所示的核苷酸序列组成；

用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.299_300delAT的野生型和突变型crRNA组3由SEQ ID No.5和No.6所示的核苷酸序列组成；

用于检测遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点c.2168A>G的野生型和突变型crRNA组4由SEQ ID No.7和No.8所示的核苷酸序列组成；

用于检测遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G的野生型和突变型crRNA组5由SEQ ID No.9和No.10所示的核苷酸序列组成。

3.一种遗传性耳聋多重检测反应体系，其特征在于，包括RPA扩增反应体系和Cas12a检测反应体系；所述Cas12a检测反应体系包括权利要求1或2所述的crRNA组合。

4.根据权利要求3所述的遗传性耳聋多重检测反应体系，其特征在于，所述RPA扩增反应体系包括序列如SEQ ID NO.11～20所示的RPA引物对。

5.一种遗传性耳聋多重检测试剂盒，其特征在于，包括镂空蜂巢芯片、中空垫圈(3)、孔板(8)和加样头(5)；

所述镂空蜂巢芯片包括芯片底座(2)和多根毛细管(1)，所述芯片底座(2)为中空的环形结构，多根毛细管(1)沿芯片底座(2)的圆周方向均匀设置；各所述毛细管(1)的上端延伸至芯片底座(2)的上表面以上，毛细管(1)的下端与芯片底座(2)的下表面齐平；

6.根据权利要求5所述的遗传性耳聋多重检测试剂盒，其特征在于，所述加样头(5)的中间设置有加样口(6)，加样口呈漏斗状；所述加样头(5)的底面中部为凹面，加样时形成样品池(7)，样品池(7)的直径小于芯片底座(2)的外径，样品池(7)的下底面可覆盖各毛细管(1)的顶面。

7.根据权利要求5所述的遗传性耳聋多重检测试剂盒，其特征在于，所述孔板(8)为96孔板；

8.根据权利要求5所述的遗传性耳聋多重检测试剂盒，其特征在于，所述Cas12a反应体系还包括Cas12a蛋白、ssDNA reporter。

9.根据权利要求8所述的遗传性耳聋多重检测试剂盒，其特征在于，所述的ssDNAreporter是利用六氯-6-甲基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记产物为/5HEX/NNNNNNNNNNNN/3BHQ1/。

10.一种基于权利要求5-9任一项所述的试剂盒的遗传性耳聋多重检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S3、将孔板置于酶标仪中反应，使预固定的RPA引物和待检测的基因模板进行多重RPA扩增；