JPH05317099A - ヒトサイトメガロウイルスの検出方法 - Google Patents
ヒトサイトメガロウイルスの検出方法Info
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- JPH05317099A JPH05317099A JP41580790A JP41580790A JPH05317099A JP H05317099 A JPH05317099 A JP H05317099A JP 41580790 A JP41580790 A JP 41580790A JP 41580790 A JP41580790 A JP 41580790A JP H05317099 A JPH05317099 A JP H05317099A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 水性液体被検試料中のヒトサイトメガロウイ
ルスの検出において、式（１ａ） （５’）−ＴＡＴＡＣＣＣＡＧＡＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡ
ＡＴＴＣＡ−（３’） または式（１ｂ） （５’）−ＡＴＧＡＡＧＴＧＴＡＴＴＧＧＧＣＴＡＡＣ
ＴＡＴＧＣ−（３’） の第１のＤＮＡプライマーおよび式（２ａ） （５’）−ＴＴＣＴＣＣＴＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＴＴ
ＴＴＡＧＣ−（３’） または式（２ｂ） （５’）−ＡＴＡＡＧＣＣＡＴＡＡＴＣＴＣＡＴＣＡＧ
ＧＧＧＡＧ−（３’） の第２のＤＮＡプライマーの組み合わせ、あるいは、式
（１ｃ） （５’）−ＴＧＡＣＧＣＧＣＡＴＡＣＡＴＣＣＣＧＡＧ
ＴＡＣＡＴ−（３’） の第１のＤＮＡプライマーおよび式（２ｃ） （５’）−ＡＴＧＡＣＧＴＴＧＣＴＣＣＧＴＧＧＡＡＡ
ＧＡＧＡＣＣ−（３’） の第２のＤＮＡプライマーの組み合わせと、を用いてＤ
ＮＡ増幅工程を行う。また、ＤＮＡ検査工程において、
式（３） （５’）−ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＡＣＡＡＧＣＣＡＴＣＣ
ＡＣＡＴＣＴＣＣＣＧ−（３’） のプローブ、式（４） （５’）−ＧＣＴＧＴＣＧＧＴＧＴＴＣＣＡＡＡＴＧＡ
ＡＣＧＧＣＣＴＧＡＴ−（３’） のプローブ、または式（５） （５’）−ＧＡＣＴＴ ＣＴＴＣＡ ＣＣＣＴＧ ＴＴ
ＣＴＴ ＣＣＴＣＧ ＣＴＡＴＣ−（３’） のプローブを用いる。 【効果】 迅速かつ確実で、特異的なＣＭＶの検出が可
能となる。
ルスの検出において、式（１ａ） （５’）−ＴＡＴＡＣＣＣＡＧＡＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡ
ＡＴＴＣＡ−（３’） または式（１ｂ） （５’）−ＡＴＧＡＡＧＴＧＴＡＴＴＧＧＧＣＴＡＡＣ
ＴＡＴＧＣ−（３’） の第１のＤＮＡプライマーおよび式（２ａ） （５’）−ＴＴＣＴＣＣＴＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＴＴ
ＴＴＡＧＣ−（３’） または式（２ｂ） （５’）−ＡＴＡＡＧＣＣＡＴＡＡＴＣＴＣＡＴＣＡＧ
ＧＧＧＡＧ−（３’） の第２のＤＮＡプライマーの組み合わせ、あるいは、式
（１ｃ） （５’）−ＴＧＡＣＧＣＧＣＡＴＡＣＡＴＣＣＣＧＡＧ
ＴＡＣＡＴ−（３’） の第１のＤＮＡプライマーおよび式（２ｃ） （５’）−ＡＴＧＡＣＧＴＴＧＣＴＣＣＧＴＧＧＡＡＡ
ＧＡＧＡＣＣ−（３’） の第２のＤＮＡプライマーの組み合わせと、を用いてＤ
ＮＡ増幅工程を行う。また、ＤＮＡ検査工程において、
式（３） （５’）−ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＡＣＡＡＧＣＣＡＴＣＣ
ＡＣＡＴＣＴＣＣＣＧ−（３’） のプローブ、式（４） （５’）−ＧＣＴＧＴＣＧＧＴＧＴＴＣＣＡＡＡＴＧＡ
ＡＣＧＧＣＣＴＧＡＴ−（３’） のプローブ、または式（５） （５’）−ＧＡＣＴＴ ＣＴＴＣＡ ＣＣＣＴＧ ＴＴ
ＣＴＴ ＣＣＴＣＧ ＣＴＡＴＣ−（３’） のプローブを用いる。 【効果】 迅速かつ確実で、特異的なＣＭＶの検出が可
能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトサイトメガロウイ
ルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ；以下、ＣＭＶ
と称することがある）の検出方法に関する。
ルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ；以下、ＣＭＶ
と称することがある）の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
は、ヘルペスウイルス科に属するウイルスの一種で、成
人の大多数がこれに感染している。多くの人が、先天的
に出産直後に感染するが、不顕性感染が多いので、特に
病状は現れない。後天的には、尿、唾液、母乳または精
液を感染原とする接触感染と、輸血または臓器移植によ
る医原性感染がある。ＣＭＶは生涯にわたって生体内に
潜伏し、宿主側のファクターによってＣＭＶが再活性化
される場合や異抗原ＣＭＶの再感染も見られる。特に、
悪性腫瘍、ＡＩＤＳ患者や臓器移植を受ける者、大量輸
血を受ける者、妊婦などにＣＭＶの再活性化が見られ、
その病状は肝疾患、肝腫、脾腫、肺炎などの感染症、下
痢、嘔吐などの軽いものから致命的なものまで多彩であ
り、ＣＭＶ感染を確定的に診断することは臨床的に極め
て重要である。
は、ヘルペスウイルス科に属するウイルスの一種で、成
人の大多数がこれに感染している。多くの人が、先天的
に出産直後に感染するが、不顕性感染が多いので、特に
病状は現れない。後天的には、尿、唾液、母乳または精
液を感染原とする接触感染と、輸血または臓器移植によ
る医原性感染がある。ＣＭＶは生涯にわたって生体内に
潜伏し、宿主側のファクターによってＣＭＶが再活性化
される場合や異抗原ＣＭＶの再感染も見られる。特に、
悪性腫瘍、ＡＩＤＳ患者や臓器移植を受ける者、大量輸
血を受ける者、妊婦などにＣＭＶの再活性化が見られ、
その病状は肝疾患、肝腫、脾腫、肺炎などの感染症、下
痢、嘔吐などの軽いものから致命的なものまで多彩であ
り、ＣＭＶ感染を確定的に診断することは臨床的に極め
て重要である。
【０００３】従来から、ＣＭＶの検出方法としては生体
液（尿、唾液等）からＣＭＶを分離して同定する方法や
中和試験法が行われているが、結果を得るまでに２〜３
週間もかかり、急を要する場合にはその結果を治療に利
用できないことがあった。また、血清学的な検出方法で
は、ＣＭＶには不顕性感染が多いために急性期や回復期
の血清を採取することができないので、適当な間隔で採
取した血液を用いてＩｇＧやＩｇＭの消長をみるしか方
法がなかった。従って、その結果からウイルスの存在ま
たは不在を判断することは難しかった。一方、新生児の
先天性感染症の診断、臓器移植または免疫機能の低下等
の場合にはＣＭＶの存否の判定を短時間に下すことが要
求されることが多いにもかかわらず、これらの要望に満
足に応じることのできる方法は従来なかった。従って、
短時間に、高精度でＣＭＶの診断を可能にする手法およ
び体外診断薬の開発が望まれていた。
液（尿、唾液等）からＣＭＶを分離して同定する方法や
中和試験法が行われているが、結果を得るまでに２〜３
週間もかかり、急を要する場合にはその結果を治療に利
用できないことがあった。また、血清学的な検出方法で
は、ＣＭＶには不顕性感染が多いために急性期や回復期
の血清を採取することができないので、適当な間隔で採
取した血液を用いてＩｇＧやＩｇＭの消長をみるしか方
法がなかった。従って、その結果からウイルスの存在ま
たは不在を判断することは難しかった。一方、新生児の
先天性感染症の診断、臓器移植または免疫機能の低下等
の場合にはＣＭＶの存否の判定を短時間に下すことが要
求されることが多いにもかかわらず、これらの要望に満
足に応じることのできる方法は従来なかった。従って、
短時間に、高精度でＣＭＶの診断を可能にする手法およ
び体外診断薬の開発が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、迅速かつ
確実にＣＭＶを検出するために、ＣＭＶに特異的な各種
の塩基配列を検索し、その配列に相補的なＤＮＡ断片を
合成して、ＣＭＶのプローブやプライマーとしての評価
を行ったところ、ＣＭＶのＤＮＡおよびＲＮＡと特異的
にハイブリダイズするプローブやプライマーとして用い
ることができるものを見出した。本発明はかかる知見に
基づくものである。
確実にＣＭＶを検出するために、ＣＭＶに特異的な各種
の塩基配列を検索し、その配列に相補的なＤＮＡ断片を
合成して、ＣＭＶのプローブやプライマーとしての評価
を行ったところ、ＣＭＶのＤＮＡおよびＲＮＡと特異的
にハイブリダイズするプローブやプライマーとして用い
ることができるものを見出した。本発明はかかる知見に
基づくものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は、式
（１ａ） （５’）−ＴＡＴＡＣ ＣＣＡＧＡ ＣＧＧＡＡ ＧＡＧＡＡ ＡＴＴＣＡ−（ ３’） （１ａ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第１のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（１ａ）と称することがある〕または式（１ｂ） （５’）−ＡＴＧＡＡ ＧＴＧＴＡ ＴＴＧＧＧ ＣＴＡＡＣ ＴＡＴＧＣ−（ ３’） （１ｂ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第１のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（１ｂ）と称することがある〕および式（２ａ） （５’）−ＴＴＣＴＣ ＣＴＡＡＧ ＴＴＣＡＴ ＣＣＴＴＴ ＴＴＡＧＣ−（ ３’） （２ａ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第２のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（２ａ）と称することがある〕または式（２ｂ） （５’）−ＡＴＡＡＧ ＣＣＡＴＡ ＡＴＣＴＣ ＡＴＣＡＧ ＧＧＧＡＧ−（ ３’） （２ｂ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第２のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（２ｂ）と称することがある〕の組み合わせ、あるい
は、式（１ｃ） （５’）−ＴＧＡＣＧ ＣＧＣＡＴ ＡＣＡＴＣ ＣＣＧＡＧ ＴＡＣＡＴ−（ ３’） （１ｃ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第１のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（１ｃ）と称することがある〕および式（１ｃ） （５’）−ＡＴＧＡＣ ＧＴＴＧＣ ＴＣＣＧＴ ＧＧＡＡＡ ＧＡＧＡＣ Ｃ −（３’） （２ｃ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第２のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（２ｃ）と称することがある〕の組み合わせと、ＤＮＡ
ポリメラーゼと、水性液体被検試料とを含む混合液をＤ
ＮＡ増幅工程にかけ、続いて、得られた反応液をＤＮＡ
検査工程にかけること特徴とする、ヒトサイトメガロウ
イルスの検出方法に関する。本明細書の塩基配列におい
て、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニンそして
Ｔはチミンの意味である。
（１ａ） （５’）−ＴＡＴＡＣ ＣＣＡＧＡ ＣＧＧＡＡ ＧＡＧＡＡ ＡＴＴＣＡ−（ ３’） （１ａ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第１のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（１ａ）と称することがある〕または式（１ｂ） （５’）−ＡＴＧＡＡ ＧＴＧＴＡ ＴＴＧＧＧ ＣＴＡＡＣ ＴＡＴＧＣ−（ ３’） （１ｂ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第１のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（１ｂ）と称することがある〕および式（２ａ） （５’）−ＴＴＣＴＣ ＣＴＡＡＧ ＴＴＣＡＴ ＣＣＴＴＴ ＴＴＡＧＣ−（ ３’） （２ａ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第２のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（２ａ）と称することがある〕または式（２ｂ） （５’）−ＡＴＡＡＧ ＣＣＡＴＡ ＡＴＣＴＣ ＡＴＣＡＧ ＧＧＧＡＧ−（ ３’） （２ｂ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第２のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（２ｂ）と称することがある〕の組み合わせ、あるい
は、式（１ｃ） （５’）−ＴＧＡＣＧ ＣＧＣＡＴ ＡＣＡＴＣ ＣＣＧＡＧ ＴＡＣＡＴ−（ ３’） （１ｃ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第１のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（１ｃ）と称することがある〕および式（１ｃ） （５’）−ＡＴＧＡＣ ＧＴＴＧＣ ＴＣＣＧＴ ＧＧＡＡＡ ＧＡＧＡＣ Ｃ −（３’） （２ｃ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第２のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（２ｃ）と称することがある〕の組み合わせと、ＤＮＡ
ポリメラーゼと、水性液体被検試料とを含む混合液をＤ
ＮＡ増幅工程にかけ、続いて、得られた反応液をＤＮＡ
検査工程にかけること特徴とする、ヒトサイトメガロウ
イルスの検出方法に関する。本明細書の塩基配列におい
て、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニンそして
Ｔはチミンの意味である。
【０００６】本発明方法で用いる液体被検試料は、ＣＭ
Ｖを含有している疑いのある試料であれば特に制限され
ない。例えば、尿、咽頭拭い液、産道拭い液、血液、固
定化遊離細胞、組織切片等を用いることができる。
Ｖを含有している疑いのある試料であれば特に制限され
ない。例えば、尿、咽頭拭い液、産道拭い液、血液、固
定化遊離細胞、組織切片等を用いることができる。
【０００７】本発明による前記のＣＭＶ検出方法は、主
に、（１）ＤＮＡ増幅工程と、（２）ＤＮＡ検査工程と
からなる。このＤＮＡ増幅工程（１）では、ＰＣＲ（Ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
法を用いることができる。ＰＣＲ法を利用すると、微量
のＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域のみを自動的に約
１００万倍にまで増幅することができる（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２３９：４８７−４９１，１９８８）。ＰＣＲ法で
は、増幅させるＤＮＡ領域を挟んで＋鎖に対するプライ
マー（以下、第１プライマーと称する）および−鎖に対
するプライマー（以下、第２プライマーと称する）の２
種のＤＮＡプライマーを用いる。
に、（１）ＤＮＡ増幅工程と、（２）ＤＮＡ検査工程と
からなる。このＤＮＡ増幅工程（１）では、ＰＣＲ（Ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
法を用いることができる。ＰＣＲ法を利用すると、微量
のＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域のみを自動的に約
１００万倍にまで増幅することができる（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２３９：４８７−４９１，１９８８）。ＰＣＲ法で
は、増幅させるＤＮＡ領域を挟んで＋鎖に対するプライ
マー（以下、第１プライマーと称する）および−鎖に対
するプライマー（以下、第２プライマーと称する）の２
種のＤＮＡプライマーを用いる。
【０００８】本発明のＤＮＡ増幅工程（１）で用いる第
１プライマーと第２プライマーとの組み合わせとして
は、（イ）第１プライマー（１ａ）と第２プライマー
（２ａ）、（ロ）第１プライマー（１ａ）と第２プライ
マー（２ｂ）、（ハ）第１プライマー（１ｂ）と第２プ
ライマー（２ａ）、（ニ）第１プライマー（１ｂ）と第
２プライマー（２ｂ）、および（ホ）第１プライマー
（１ｃ）と第２プライマー（２ｃ）の５種の組み合わせ
があり、これらの組み合わせのいずれか１種を単独で用
いるか、または２種以上を同時に用いることができる。
１プライマーと第２プライマーとの組み合わせとして
は、（イ）第１プライマー（１ａ）と第２プライマー
（２ａ）、（ロ）第１プライマー（１ａ）と第２プライ
マー（２ｂ）、（ハ）第１プライマー（１ｂ）と第２プ
ライマー（２ａ）、（ニ）第１プライマー（１ｂ）と第
２プライマー（２ｂ）、および（ホ）第１プライマー
（１ｃ）と第２プライマー（２ｃ）の５種の組み合わせ
があり、これらの組み合わせのいずれか１種を単独で用
いるか、または２種以上を同時に用いることができる。
【０００９】本発明による前記の各プライマーを前記の
組み合わせ（イ）〜（ニ）で用いると、ＣＭＶの全ＤＮ
Ａ領域の中で、Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ Ｅａｒｌｙ １
（以下、ＩＥ１と称す）と称されるタンパク質をコード
するＤＮＡ領域のみを特異的に増幅することができる。
具体的には、組み合わせ（イ）によってＩＥ１遺伝子の
一部に相当する２８７ｂｐ部分が、組み合わせ（ロ）に
よってＩＥ１遺伝子の一部に相当する４２６ｂｐ部分
が、組み合わせ（ハ）によってＩＥ１遺伝子の一部に相
当する１８２ｂｐ部分が、そして組み合わせ（ニ）によ
ってＩＥ１遺伝子の一部に相当する３２１ｂｐ部分が、
それぞれ特異的に大量に増幅される。また、前記の組み
合わせ（ホ）を用いると、ＣＭＶの全ＤＮＡ領域の中
で、リン酸化タンパク質（ｐｐ７１）をコードするＤＮ
Ａ領域のみを特異的に増幅することができる。具体的に
は、ｐｐ７１遺伝子の一部に相当する３１６ｂｐ部分が
特異的に大量に増幅される。ＩＥ１は遺伝子地図上０．
７５ｍ．ｕ．付近に存在し、ｐｐ７１は遺伝子地図上
０．５３ｍ．ｕ．付近に存在する。
組み合わせ（イ）〜（ニ）で用いると、ＣＭＶの全ＤＮ
Ａ領域の中で、Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ Ｅａｒｌｙ １
（以下、ＩＥ１と称す）と称されるタンパク質をコード
するＤＮＡ領域のみを特異的に増幅することができる。
具体的には、組み合わせ（イ）によってＩＥ１遺伝子の
一部に相当する２８７ｂｐ部分が、組み合わせ（ロ）に
よってＩＥ１遺伝子の一部に相当する４２６ｂｐ部分
が、組み合わせ（ハ）によってＩＥ１遺伝子の一部に相
当する１８２ｂｐ部分が、そして組み合わせ（ニ）によ
ってＩＥ１遺伝子の一部に相当する３２１ｂｐ部分が、
それぞれ特異的に大量に増幅される。また、前記の組み
合わせ（ホ）を用いると、ＣＭＶの全ＤＮＡ領域の中
で、リン酸化タンパク質（ｐｐ７１）をコードするＤＮ
Ａ領域のみを特異的に増幅することができる。具体的に
は、ｐｐ７１遺伝子の一部に相当する３１６ｂｐ部分が
特異的に大量に増幅される。ＩＥ１は遺伝子地図上０．
７５ｍ．ｕ．付近に存在し、ｐｐ７１は遺伝子地図上
０．５３ｍ．ｕ．付近に存在する。
【００１０】前記の第１プライマーおよび第２プライマ
ーはそれぞれ１５ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることができ
るが、一般的には２０ｍｅｒ〜２５ｍｅｒであるのが好
ましい。１５ｍｅｒ未満であるとアニーリングの際の特
異性が減少し、非特異的結合が増加する。また、３０ｍ
ｅｒを越えるとプライマー分子間あるいは分子内での二
次構造を取りやすくなるので好ましくない。本発明方法
で用いる第１プライマーおよび第２プライマーのそれぞ
れを構成する各塩基は、公知の任意の態様で修飾（例え
ば、ビオチン化または発光物質によるラベル化）されて
いてもよい。
ーはそれぞれ１５ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることができ
るが、一般的には２０ｍｅｒ〜２５ｍｅｒであるのが好
ましい。１５ｍｅｒ未満であるとアニーリングの際の特
異性が減少し、非特異的結合が増加する。また、３０ｍ
ｅｒを越えるとプライマー分子間あるいは分子内での二
次構造を取りやすくなるので好ましくない。本発明方法
で用いる第１プライマーおよび第２プライマーのそれぞ
れを構成する各塩基は、公知の任意の態様で修飾（例え
ば、ビオチン化または発光物質によるラベル化）されて
いてもよい。
【００１１】本発明による前記のそれぞれの第１プライ
マーおよび第２プライマーは、通常のＤＮＡ自動合成機
（例えばアプライドバイオシステム社製）を用いて、公
知のＤＮＡ合成法（例えばホスホアミダイト法）によっ
て調製することができる。
マーおよび第２プライマーは、通常のＤＮＡ自動合成機
（例えばアプライドバイオシステム社製）を用いて、公
知のＤＮＡ合成法（例えばホスホアミダイト法）によっ
て調製することができる。
【００１２】本発明のＤＮＡ増幅工程（１）では、第１
プライマーおよび第２プライマーと共に、ＤＮＡポリメ
ラーゼ、特には耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅
サイクルを繰り返す。耐熱性ポリメラーゼとしては、特
に９５℃までの温度で活性を維持することのできるＤＮ
Ａポリメラーゼ、例えば、市販のＴａｑポリメラーゼを
用いることができる。
プライマーおよび第２プライマーと共に、ＤＮＡポリメ
ラーゼ、特には耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅
サイクルを繰り返す。耐熱性ポリメラーゼとしては、特
に９５℃までの温度で活性を維持することのできるＤＮ
Ａポリメラーゼ、例えば、市販のＴａｑポリメラーゼを
用いることができる。
【００１３】本発明のＤＮＡ増幅工程では前記の第１プ
ライマーと第２プライマーとの特定の組み合わせ、ＤＮ
Ａポリメラーゼおよび液体被検試料を含む混合液を用い
る。第１プライマー、第２プライマーおよびＤＮＡポリ
メラーゼの使用量は、液体被検試料の種類によって変化
するが、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を実行すること
ができる範囲で容易に決定することができる。この混合
液は場合により、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝
液）、安定化剤（例えば、ゼラチン）、または塩類（例
えば、塩化ナトリウム）を含有することができる。
ライマーと第２プライマーとの特定の組み合わせ、ＤＮ
Ａポリメラーゼおよび液体被検試料を含む混合液を用い
る。第１プライマー、第２プライマーおよびＤＮＡポリ
メラーゼの使用量は、液体被検試料の種類によって変化
するが、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を実行すること
ができる範囲で容易に決定することができる。この混合
液は場合により、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝
液）、安定化剤（例えば、ゼラチン）、または塩類（例
えば、塩化ナトリウム）を含有することができる。
【００１４】本発明方法では、前記の混合液を用いてＰ
ＣＲ法の増幅サイクルを実施する。増幅サイクルは、 （ｉ）ＤＮＡの変性工程（約９０℃〜９５℃で、約１０
秒〜約２分間） （ii）１本鎖ＤＮＡの第１プライマーおよび第２プライ
マーとのアニーリング工程（約３７℃〜７０℃で、約３
０秒〜約３分間）、および （iii ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（約
６５℃〜８０℃で、約３０秒〜約５分間）とからなる。
１サイクル毎にＤＮＡ量は２倍に増幅され、ｎサイクル
後には２n 倍に増幅される。本発明においては、前記の
増幅サイクルを１０〜６０回、好ましくは２０〜４０回
繰り返す。最後のサイクルにおいては、工程（iii ）で
加熱時間を約５〜１０分間に延長してＤＮＡ合成が完全
に行われるようにするのが好ましい。
ＣＲ法の増幅サイクルを実施する。増幅サイクルは、 （ｉ）ＤＮＡの変性工程（約９０℃〜９５℃で、約１０
秒〜約２分間） （ii）１本鎖ＤＮＡの第１プライマーおよび第２プライ
マーとのアニーリング工程（約３７℃〜７０℃で、約３
０秒〜約３分間）、および （iii ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（約
６５℃〜８０℃で、約３０秒〜約５分間）とからなる。
１サイクル毎にＤＮＡ量は２倍に増幅され、ｎサイクル
後には２n 倍に増幅される。本発明においては、前記の
増幅サイクルを１０〜６０回、好ましくは２０〜４０回
繰り返す。最後のサイクルにおいては、工程（iii ）で
加熱時間を約５〜１０分間に延長してＤＮＡ合成が完全
に行われるようにするのが好ましい。
【００１５】被検試料中にＣＭＶが存在する場合には、
前記の増幅サイクル終了後に、約５０〜５００ｂｐのＤ
ＮＡが大量に合成される。このＤＮＡを次のＤＮＡ検査
工程によって検出する。
前記の増幅サイクル終了後に、約５０〜５００ｂｐのＤ
ＮＡが大量に合成される。このＤＮＡを次のＤＮＡ検査
工程によって検出する。
【００１６】ＤＮＡ検査工程としては、ゲル電気泳動法
およびエチジウムブロマイド染色を利用する方法、サザ
ンブロットハイブリッド法、またはジデオキシ法による
塩基配列決定法などを用いることができる。ゲル電気泳
動法を行う場合には、例えば、アガロースゲルを担体と
したサブマリーン型電気泳動、またはアクリルアミドを
用いたスラブ型電気泳動を使用することができる。
およびエチジウムブロマイド染色を利用する方法、サザ
ンブロットハイブリッド法、またはジデオキシ法による
塩基配列決定法などを用いることができる。ゲル電気泳
動法を行う場合には、例えば、アガロースゲルを担体と
したサブマリーン型電気泳動、またはアクリルアミドを
用いたスラブ型電気泳動を使用することができる。
【００１７】サザンブロットハイブリッド法、またはｉ
ｎ ｓｉｔｕハイブリッド法を行う場合には、非放射性
プローブ（例えば、酵素標識プローブ、ビオチン化プロ
ーブ、ジゴキシゲニン化プローブまたは化学発光物質、
蛍光物質でラベルしたプローブ）を用いることができ
る。
ｎ ｓｉｔｕハイブリッド法を行う場合には、非放射性
プローブ（例えば、酵素標識プローブ、ビオチン化プロ
ーブ、ジゴキシゲニン化プローブまたは化学発光物質、
蛍光物質でラベルしたプローブ）を用いることができ
る。
【００１８】更に、ジデオキシ法による塩基配列決定法
を利用する場合には、蛍光ラベルを使用したＤＮＡオー
トシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社）を
用いることができる。
を利用する場合には、蛍光ラベルを使用したＤＮＡオー
トシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社）を
用いることができる。
【００１９】本発明は、更に、ＣＭＶ−ＤＮＡの特異的
な検出に用いることのできる３種類のＤＮＡプローブを
提供するものでもある。これらのＤＮＡプローブは、式
（３） （５’）−ＣＴＣＣＴ ＴＡＡＴＡ ＣＡＡＧＣ ＣＡＴＣＣ ＡＣＡＴＣ Ｔ ＣＣＣＧ−（３’） （３） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有するプローブ（以下、プローブＡと称することがあ
る）、および式（４） （５’）−ＧＣＴＧＴ ＣＧＧＴＧ ＴＴＣＣＡ ＡＡＴＧＡ ＡＣＧＧＣ Ｃ ＴＧＡＴ−（３’） （４） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有するプローブ（以下、プローブＢと称することがあ
る）、および式（５） （５’）−ＧＡＣＴＴ ＣＴＴＣＡ ＣＣＣＴＧ ＴＴＣＴＴ ＣＣＴＣＧ Ｃ ＴＡＴＣ−（３’） （５） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有するプローブ（以下、プローブＣと称することがあ
る）である。これらのプローブを単独で、または２種づ
つを組み合わせて、更に３者を同時に用いることができ
る。また、これらのプローブを用いるＤＮＡ検査工程
は、プライマー（１ａ）〜（１ｃ）とプライマー（２
ａ）〜（２ｃ）との組み合わせを用いる前記のＤＮＡ増
幅工程と組み合わせて、あるいは組み合わせず単独に実
施することができる。
な検出に用いることのできる３種類のＤＮＡプローブを
提供するものでもある。これらのＤＮＡプローブは、式
（３） （５’）−ＣＴＣＣＴ ＴＡＡＴＡ ＣＡＡＧＣ ＣＡＴＣＣ ＡＣＡＴＣ Ｔ ＣＣＣＧ−（３’） （３） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有するプローブ（以下、プローブＡと称することがあ
る）、および式（４） （５’）−ＧＣＴＧＴ ＣＧＧＴＧ ＴＴＣＣＡ ＡＡＴＧＡ ＡＣＧＧＣ Ｃ ＴＧＡＴ−（３’） （４） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有するプローブ（以下、プローブＢと称することがあ
る）、および式（５） （５’）−ＧＡＣＴＴ ＣＴＴＣＡ ＣＣＣＴＧ ＴＴＣＴＴ ＣＣＴＣＧ Ｃ ＴＡＴＣ−（３’） （５） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有するプローブ（以下、プローブＣと称することがあ
る）である。これらのプローブを単独で、または２種づ
つを組み合わせて、更に３者を同時に用いることができ
る。また、これらのプローブを用いるＤＮＡ検査工程
は、プライマー（１ａ）〜（１ｃ）とプライマー（２
ａ）〜（２ｃ）との組み合わせを用いる前記のＤＮＡ増
幅工程と組み合わせて、あるいは組み合わせず単独に実
施することができる。
【００２０】前記のプローブＡは、ＩＥ１をコードする
遺伝子のエクソン４部分に特異的である。プローブＡの
長さは被検試料に対する前処理の種類によって異なる。
被検試料がＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経たもので
ある場合には、１０ｂｐ乃至ＰＣＲ法で増幅されるＤＮ
Ａ断片の大きさまでであることができる。また、被検試
料がＰＣＲ法のＤＮＡ増幅工程を経たものでなく、プロ
ーブＡをｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法に用いる場合に
は、プローブＡの長さは１０ｂｐ乃至エクソン４部分の
全ＤＮＡ（１２２１ｂｐ）の大きさまで可能である。式
（３）で表される塩基配列のＤＮＡプローブ（３０ｍｅ
ｒ）は、被検試料がＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経
たものであっても、あるいはｉｎ ｓｉｔｕハイブリッ
ド法の場合であっても、いずれにも用いることができる
ので好ましい。
遺伝子のエクソン４部分に特異的である。プローブＡの
長さは被検試料に対する前処理の種類によって異なる。
被検試料がＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経たもので
ある場合には、１０ｂｐ乃至ＰＣＲ法で増幅されるＤＮ
Ａ断片の大きさまでであることができる。また、被検試
料がＰＣＲ法のＤＮＡ増幅工程を経たものでなく、プロ
ーブＡをｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法に用いる場合に
は、プローブＡの長さは１０ｂｐ乃至エクソン４部分の
全ＤＮＡ（１２２１ｂｐ）の大きさまで可能である。式
（３）で表される塩基配列のＤＮＡプローブ（３０ｍｅ
ｒ）は、被検試料がＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経
たものであっても、あるいはｉｎ ｓｉｔｕハイブリッ
ド法の場合であっても、いずれにも用いることができる
ので好ましい。
【００２１】前記のプローブＢは、リン酸化タンパク質
（ｐｐ７１）をコードする遺伝子に特異的である。プロ
ーブＢの長さも被検試料に対する前処理の種類によって
異なり、被検試料がＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経
たものである場合には、１０ｂｐ乃至ＰＣＲ法で増幅さ
れるＤＮＡ断片の大きさまでであることができる。ま
た、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法に用いる場合には、
プローブＢの長さは１０ｂｐ乃至ｐｐ７１ｃＤＮＡ（１
６８０ｂｐ）の大きさまで可能である。式（４）で表さ
れる塩基配列のＤＮＡプローブ（３０ｍｅｒ）は、被検
試料がＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経たものであっ
ても、あるいはｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法の場合で
あっても、いずれにも用いることができるので好まし
い。
（ｐｐ７１）をコードする遺伝子に特異的である。プロ
ーブＢの長さも被検試料に対する前処理の種類によって
異なり、被検試料がＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経
たものである場合には、１０ｂｐ乃至ＰＣＲ法で増幅さ
れるＤＮＡ断片の大きさまでであることができる。ま
た、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法に用いる場合には、
プローブＢの長さは１０ｂｐ乃至ｐｐ７１ｃＤＮＡ（１
６８０ｂｐ）の大きさまで可能である。式（４）で表さ
れる塩基配列のＤＮＡプローブ（３０ｍｅｒ）は、被検
試料がＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経たものであっ
ても、あるいはｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法の場合で
あっても、いずれにも用いることができるので好まし
い。
【００２２】前記のプローブＣは、ＩＥ１をコードする
遺伝子のエクソン５部分に特異的である。プローブＣは
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法に用いる。プローブＣの
長さは、１０ｂｐ乃至エクソン５部分の全ＤＮＡ（５８
５ｂｐ）の大きさまで可能である。
遺伝子のエクソン５部分に特異的である。プローブＣは
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法に用いる。プローブＣの
長さは、１０ｂｐ乃至エクソン５部分の全ＤＮＡ（５８
５ｂｐ）の大きさまで可能である。
【００２３】プローブＡ、プローブＢおよびプローブＣ
の調製法としては、サクシノイミド（例えば、ジサクシ
ニミジルスベレイト）を用いる方法、更に、マレイミド
法、活性ハロゲン（Ａｃｔｉｖｅ Ｈａｌｏｇｅｎ）
法、アジドを用いた光反応、あるいはカルボジイミド法
を挙げることができる。
の調製法としては、サクシノイミド（例えば、ジサクシ
ニミジルスベレイト）を用いる方法、更に、マレイミド
法、活性ハロゲン（Ａｃｔｉｖｅ Ｈａｌｏｇｅｎ）
法、アジドを用いた光反応、あるいはカルボジイミド法
を挙げることができる。
【００２４】プローブＡ、プローブＢおよびプローブＣ
の標識物質としては、従来公知の任意の物質を使用する
ことができる。好ましくは、非放射性物質（酵素、蛍光
色素、発光物質、ビオチン等）を用いる。標識化ＤＮＡ
の合成法には、大別すると（１）ＤＮＡの合成過程で直
接的に標識化ＤＮＡを調製する方法と（２）リンカーが
結合したＤＮＡを合成してから単離し、これに標識試薬
を作用させる方法とがあり、特に方法（２）は目的に応
じて標識の型を容易に変更でき、応用面で優れているの
で好ましい。方法（２）で用いるリンカーとしては、
５’−ジメトキシトリチル−５−〔Ｎ−（トリフルオロ
アセチルアミノヘキシル）−３−アクリルイミド〕−
２’−デオキシウリジン−３’−〔（２−シアノエチ
ル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル〕］ホスホルアミダイ
ト等を挙げることができる。
の標識物質としては、従来公知の任意の物質を使用する
ことができる。好ましくは、非放射性物質（酵素、蛍光
色素、発光物質、ビオチン等）を用いる。標識化ＤＮＡ
の合成法には、大別すると（１）ＤＮＡの合成過程で直
接的に標識化ＤＮＡを調製する方法と（２）リンカーが
結合したＤＮＡを合成してから単離し、これに標識試薬
を作用させる方法とがあり、特に方法（２）は目的に応
じて標識の型を容易に変更でき、応用面で優れているの
で好ましい。方法（２）で用いるリンカーとしては、
５’−ジメトキシトリチル−５−〔Ｎ−（トリフルオロ
アセチルアミノヘキシル）−３−アクリルイミド〕−
２’−デオキシウリジン−３’−〔（２−シアノエチ
ル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル〕］ホスホルアミダイ
ト等を挙げることができる。
【００２５】プローブに結合されている標識から信号を
発生させ、更にその信号を測定する方法も、従来から公
知の任意の方法を用いることができる。
発生させ、更にその信号を測定する方法も、従来から公
知の任意の方法を用いることができる。
【００２６】
【作用】本発明方法においては、被検試料中にＣＭＶが
存在する場合にのみ、前記の第１プライマーと第２プラ
イマーとの組み合わせによりそれぞれＩＥ１遺伝子の一
部分またはｐｐ７１遺伝子の一部分に相当する塩基部分
が短時間のうちに特異的に大量に増幅合成される。従っ
て、被検試料中におけるＣＭＶの存在を極めて特異的に
検出することができる。更に、被検試料中のＣＭＶ量が
微量であってもＤＮＡが増幅合成されるので高感度であ
る。
存在する場合にのみ、前記の第１プライマーと第２プラ
イマーとの組み合わせによりそれぞれＩＥ１遺伝子の一
部分またはｐｐ７１遺伝子の一部分に相当する塩基部分
が短時間のうちに特異的に大量に増幅合成される。従っ
て、被検試料中におけるＣＭＶの存在を極めて特異的に
検出することができる。更に、被検試料中のＣＭＶ量が
微量であってもＤＮＡが増幅合成されるので高感度であ
る。
【００２７】また、本発明方法においては、（場合によ
り増幅した）ＣＭＶ−ＤＮＡに特異的な標識化ＤＮＡプ
ローブを用いるので、極めて正確にＣＭＶを検出するこ
とができる。更に、前記の第１および第２プライマーを
用いる増幅工程と前記のプローブを用いる検査工程とを
併用すると、検査の所要時間はエチジウム染色の場合は
４〜５時間程度であり、サザンブロットハイブリッド法
まで行う場合でも４８〜５０時間程度であり、迅速に結
果を得ることができる。
り増幅した）ＣＭＶ−ＤＮＡに特異的な標識化ＤＮＡプ
ローブを用いるので、極めて正確にＣＭＶを検出するこ
とができる。更に、前記の第１および第２プライマーを
用いる増幅工程と前記のプローブを用いる検査工程とを
併用すると、検査の所要時間はエチジウム染色の場合は
４〜５時間程度であり、サザンブロットハイブリッド法
まで行う場合でも４８〜５０時間程度であり、迅速に結
果を得ることができる。
【００２８】
【実施例】以下に実施例によって本発明を更に詳細に説
明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
【００２９】実施例１：プライマーの合成 ３８１Ａ型自動ＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシス
テムズ社）に、アデニンＣＰＧカラムを装着してプライ
マー（１ａ）を合成し、更に、シトシンＣＰＧカラムを
装着してプライマー（１ｂ）とプライマー（２ａ）とプ
ライマー（２ｃ）とを合成し、グアニンＣＰＧカラムを
装着してプライマー（２ｂ）を合成し、そしてチミンＣ
ＰＧカラムを装着してプライマー（１ｃ）をそれぞれ合
成した。アンモニア水（約３０％）２．５mlを入れたデ
ィスポシリンジ（２．５ml）を、合成工程が完了したＣ
ＰＧカラムに接続し、アンモニア水をカラム内に押し出
して、合成したＤＮＡフラグメントを溶出した。回収し
たＤＮＡアンモニア溶液の入ったバイアル瓶を密栓し、
６５℃で６時間加温した後、室温まで冷やしてから濃縮
した。濃縮物を凍結乾燥し、１０ｍＭトリエチルアンモ
ニウムアセテート（以下、ＴＥＡ−Ａと称す）（ｐＨ
７．４）に溶解し、沈澱を除いてから、Ｌ−６２００型
高速液体クロマトグラフィー装置（日立製作所）（以
下、ＨＰＬＣと称す）に分離用カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃ
ｋ ＯＤＳ−ＡＭ３１３：ＹＭＣ社）を装着し、５％ア
セトニトリルを含んだ９５ｍＭ−ＴＥＡ−Ａとアセトニ
トリルとによる濃度勾配を用いて精製し、メインピーク
を集めた。得られた残渣に８０％酢酸（アセトニトリル
で調整）を加えて懸濁させ、室温で３０分間保持してか
ら減圧乾燥した。乾燥物を１０ｍＭ−ＴＥＡ−Ａに溶解
し、ジエチルエーテルで抽出してから減圧乾燥した。乾
燥したＤＮＡ試料をＴＥＡ−Ａに溶解し、沈澱を除いて
から、２回目のＨＰＬＣによる精製を行い、メインピー
クを集めた。こうして得られた精製ＤＮＡプライマーを
減圧乾燥して保存し、後記の実施例３で用いた。
テムズ社）に、アデニンＣＰＧカラムを装着してプライ
マー（１ａ）を合成し、更に、シトシンＣＰＧカラムを
装着してプライマー（１ｂ）とプライマー（２ａ）とプ
ライマー（２ｃ）とを合成し、グアニンＣＰＧカラムを
装着してプライマー（２ｂ）を合成し、そしてチミンＣ
ＰＧカラムを装着してプライマー（１ｃ）をそれぞれ合
成した。アンモニア水（約３０％）２．５mlを入れたデ
ィスポシリンジ（２．５ml）を、合成工程が完了したＣ
ＰＧカラムに接続し、アンモニア水をカラム内に押し出
して、合成したＤＮＡフラグメントを溶出した。回収し
たＤＮＡアンモニア溶液の入ったバイアル瓶を密栓し、
６５℃で６時間加温した後、室温まで冷やしてから濃縮
した。濃縮物を凍結乾燥し、１０ｍＭトリエチルアンモ
ニウムアセテート（以下、ＴＥＡ−Ａと称す）（ｐＨ
７．４）に溶解し、沈澱を除いてから、Ｌ−６２００型
高速液体クロマトグラフィー装置（日立製作所）（以
下、ＨＰＬＣと称す）に分離用カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃ
ｋ ＯＤＳ−ＡＭ３１３：ＹＭＣ社）を装着し、５％ア
セトニトリルを含んだ９５ｍＭ−ＴＥＡ−Ａとアセトニ
トリルとによる濃度勾配を用いて精製し、メインピーク
を集めた。得られた残渣に８０％酢酸（アセトニトリル
で調整）を加えて懸濁させ、室温で３０分間保持してか
ら減圧乾燥した。乾燥物を１０ｍＭ−ＴＥＡ−Ａに溶解
し、ジエチルエーテルで抽出してから減圧乾燥した。乾
燥したＤＮＡ試料をＴＥＡ−Ａに溶解し、沈澱を除いて
から、２回目のＨＰＬＣによる精製を行い、メインピー
クを集めた。こうして得られた精製ＤＮＡプライマーを
減圧乾燥して保存し、後記の実施例３で用いた。
【００３０】実施例２：酵素標識プローブの調製 ＤＮＡプローブの合成は前記実施例１と同様の装置を用
い、同様の条件で行ったが、但し、プローブＡの合成で
はグアニンＣＰＧカラムを用いて５’末端から１８番目
のＴを、プローブＢについてはチミンＣＰＧカラムを用
いて５’末端から１８番目のＴを、そしてプローブＣに
ついてはシトシンＣＰＧカラムを用いて５’末端から１
７番目のＴを、それぞれ５’−ジメトキシトリチル−５
−〔Ｎ−（トリフルオロアセチルアミノヘキシル）−３
−アクリルイミド〕−２’−デオキシウリジン−３’−
〔（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ
ル）〕−ホスホルアミダイト（グレンリサーチ社）（以
下、リンカーと称す）に置き換えた。なお、リンカーの
位置はこの部位に限らず、他のチミン部位を置き換える
ことも可能である。リンカー付きプローブの精製も実施
例１に記載した条件で行った。
い、同様の条件で行ったが、但し、プローブＡの合成で
はグアニンＣＰＧカラムを用いて５’末端から１８番目
のＴを、プローブＢについてはチミンＣＰＧカラムを用
いて５’末端から１８番目のＴを、そしてプローブＣに
ついてはシトシンＣＰＧカラムを用いて５’末端から１
７番目のＴを、それぞれ５’−ジメトキシトリチル−５
−〔Ｎ−（トリフルオロアセチルアミノヘキシル）−３
−アクリルイミド〕−２’−デオキシウリジン−３’−
〔（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ
ル）〕−ホスホルアミダイト（グレンリサーチ社）（以
下、リンカーと称す）に置き換えた。なお、リンカーの
位置はこの部位に限らず、他のチミン部位を置き換える
ことも可能である。リンカー付きプローブの精製も実施
例１に記載した条件で行った。
【００３１】精製したリンカー付きプローブ３ナノモル
を８μｌの滅菌水に溶解した。この溶液に０．２Ｍ−Ｎ
ａＨＣＯ3 ／４ｍＭ−ＥＤＴＡ溶液８μｌを加えた後、
ジサクシニミジルスベレイト（Ｐｉｅｒｃｅ社）（以
下、ＤＳＳと称す）のジメチルスルホキシド溶液（１０
ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを加え、室温で暗所にて１５分間
反応させた。反応終了後、反応液に滅菌水３０μｌを加
えて遠心し、上清をＨＰＬＣ（カラムとして東ソ−Ｇ３
０００ＰＷを用い、移動相に水を用いた）に通して、Ｄ
ＳＳを結合したＤＮＡ（以下、装飾リンカーＤＮＡと称
す）を分取し、凍結乾燥した。乾燥した装飾リンカーＤ
ＮＡにアルカリホスファターゼＥＩＡ用（ベーリンガー
マンハイム社）を２倍に濃縮して調製した試薬：２０ｍ
ｇ／ｍｌ（以下、ＡＰと称す）４０μｌを加え、室温で
暗所にて１６時間反応させた。反応終了後、０．１Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）２．５ｍｌを加え、ＨＰ
ＬＣ（カラム：東ソ−ＤＥＡＥ−５ＰＷ）で処理した。
まず、０．１Ｍ−ＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．４）で未反応のＡＰを除き、０．３３Ｍ
−ＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．４）
で目的のＡＰ標識ＤＮＡを溶出した。分取した精製ＡＰ
標識ＤＮＡの溶出液約６ｍｌを３Ｍ−ＮａＣｌを含む
０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．４）に対して透析した
後、１ｍｌに濃縮した。この濃縮物をＡＰ標識プローブ
として後記の実施例４等で用いた。
を８μｌの滅菌水に溶解した。この溶液に０．２Ｍ−Ｎ
ａＨＣＯ3 ／４ｍＭ−ＥＤＴＡ溶液８μｌを加えた後、
ジサクシニミジルスベレイト（Ｐｉｅｒｃｅ社）（以
下、ＤＳＳと称す）のジメチルスルホキシド溶液（１０
ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを加え、室温で暗所にて１５分間
反応させた。反応終了後、反応液に滅菌水３０μｌを加
えて遠心し、上清をＨＰＬＣ（カラムとして東ソ−Ｇ３
０００ＰＷを用い、移動相に水を用いた）に通して、Ｄ
ＳＳを結合したＤＮＡ（以下、装飾リンカーＤＮＡと称
す）を分取し、凍結乾燥した。乾燥した装飾リンカーＤ
ＮＡにアルカリホスファターゼＥＩＡ用（ベーリンガー
マンハイム社）を２倍に濃縮して調製した試薬：２０ｍ
ｇ／ｍｌ（以下、ＡＰと称す）４０μｌを加え、室温で
暗所にて１６時間反応させた。反応終了後、０．１Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）２．５ｍｌを加え、ＨＰ
ＬＣ（カラム：東ソ−ＤＥＡＥ−５ＰＷ）で処理した。
まず、０．１Ｍ−ＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．４）で未反応のＡＰを除き、０．３３Ｍ
−ＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．４）
で目的のＡＰ標識ＤＮＡを溶出した。分取した精製ＡＰ
標識ＤＮＡの溶出液約６ｍｌを３Ｍ−ＮａＣｌを含む
０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．４）に対して透析した
後、１ｍｌに濃縮した。この濃縮物をＡＰ標識プローブ
として後記の実施例４等で用いた。
【００３２】実施例３：ＰＣＲ法によるＣＭＶ−ＤＮＡ
の増幅 サイトメガロウイルス（Ｔｏｗｎｅ株）を２．５ｎｇ／
３０μｌとなるように調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＤＮＡ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（宝酒造）の１０
×ＰＣＲ用緩衝液５μｌと、ｄＮＴＰ混合液８μｌと、
２０倍希釈したＴａｑポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ：シータス社）液５μｌと、前記
実施例１で調製したプライマー各１μＭとを加え、滅菌
水で全体を５０μｌに調整した後、ＤＮＡサーマルサイ
クラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社）を
用いて、１サイクルが（１）９４℃で１分間、（２）６
０℃で２分間、および（３）７２℃で３分間の処理から
なる工程を３０サイクル行い、最後に７２℃で７分間の
処理を行うプログラムでＤＮＡの増幅を行った。
の増幅 サイトメガロウイルス（Ｔｏｗｎｅ株）を２．５ｎｇ／
３０μｌとなるように調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＤＮＡ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（宝酒造）の１０
×ＰＣＲ用緩衝液５μｌと、ｄＮＴＰ混合液８μｌと、
２０倍希釈したＴａｑポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ：シータス社）液５μｌと、前記
実施例１で調製したプライマー各１μＭとを加え、滅菌
水で全体を５０μｌに調整した後、ＤＮＡサーマルサイ
クラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社）を
用いて、１サイクルが（１）９４℃で１分間、（２）６
０℃で２分間、および（３）７２℃で３分間の処理から
なる工程を３０サイクル行い、最後に７２℃で７分間の
処理を行うプログラムでＤＮＡの増幅を行った。
【００３３】実施例４：電気泳動による増幅ＤＮＡの確
認 電気泳動用のゲルは、トリス塩基５．４ｇと硼酸２．７
５ｇと０．５Ｍ−ＥＤＴＡ２mlとを含む緩衝液（ｐＨ
８．０）（以下、０．５×ＴＢＥと称す）１リットルに
アガロースゲル１．８％または０．７％を溶解し、ムピ
ド（アドバンス社）のゲルプレートに流して調製した。
次に、ＰＣＲ反応後の溶液１０μｌに、０．２５％ブロ
モフェノールブルーおよびフィコールタイプ４００（フ
ァルマシア社）の１５％水溶液２μｌを混合し、その混
合物全量をサンプルウエルに入れた。０．５×ＴＢＥを
電極槽に入れて、室温で１００Ｖにて、４５分間電気泳
動を行った。電気泳動終了後に、アガロースゲルをエチ
ジウムブロマイドで染色し、ＵＶイルミネイター照射下
で電気泳動の結果を確認した。結果を図１に示す。図１
において、はＤＮＡマーカー、は第１プライマー
（１ａ）と第２プライマー（２ａ）との組み合わせ
（イ）、は第１プライマー（１ｂ）と第２プライマー
（２ａ）との組み合わせ（ハ）、は第１プライマー
（１ｂ）と第２プライマー（２ｂ）との組み合わせ
（ニ）、は第１プライマー（１ａ）と第２プライマー
（２ｂ）との組み合わせ（ロ）、は第１プライマー
（１ｃ）と第２プライマー（２ｃ）との組み合わせ
（ホ）、そしては組み合わせ（ロ）と組み合わせ
（ホ）とを同時に使用した場合の、それぞれの増幅され
たバンド（図１のＳ領域）を示す。なお、ＤＮＡマーカ
ーは、下から２５０ｂｐ、５００ｂｐ、６５０ｂｐ、９
００ｂｐ、１１００ｂｐ、１４１０ｂｐ、２０００ｂｐ
および５０００ｂｐである。また、Ｒ領域に現れるバン
ドはプライマーおよびその２量体と思われる。
認 電気泳動用のゲルは、トリス塩基５．４ｇと硼酸２．７
５ｇと０．５Ｍ−ＥＤＴＡ２mlとを含む緩衝液（ｐＨ
８．０）（以下、０．５×ＴＢＥと称す）１リットルに
アガロースゲル１．８％または０．７％を溶解し、ムピ
ド（アドバンス社）のゲルプレートに流して調製した。
次に、ＰＣＲ反応後の溶液１０μｌに、０．２５％ブロ
モフェノールブルーおよびフィコールタイプ４００（フ
ァルマシア社）の１５％水溶液２μｌを混合し、その混
合物全量をサンプルウエルに入れた。０．５×ＴＢＥを
電極槽に入れて、室温で１００Ｖにて、４５分間電気泳
動を行った。電気泳動終了後に、アガロースゲルをエチ
ジウムブロマイドで染色し、ＵＶイルミネイター照射下
で電気泳動の結果を確認した。結果を図１に示す。図１
において、はＤＮＡマーカー、は第１プライマー
（１ａ）と第２プライマー（２ａ）との組み合わせ
（イ）、は第１プライマー（１ｂ）と第２プライマー
（２ａ）との組み合わせ（ハ）、は第１プライマー
（１ｂ）と第２プライマー（２ｂ）との組み合わせ
（ニ）、は第１プライマー（１ａ）と第２プライマー
（２ｂ）との組み合わせ（ロ）、は第１プライマー
（１ｃ）と第２プライマー（２ｃ）との組み合わせ
（ホ）、そしては組み合わせ（ロ）と組み合わせ
（ホ）とを同時に使用した場合の、それぞれの増幅され
たバンド（図１のＳ領域）を示す。なお、ＤＮＡマーカ
ーは、下から２５０ｂｐ、５００ｂｐ、６５０ｂｐ、９
００ｂｐ、１１００ｂｐ、１４１０ｂｐ、２０００ｂｐ
および５０００ｂｐである。また、Ｒ領域に現れるバン
ドはプライマーおよびその２量体と思われる。
【００３４】図１から明らかなように、本発明による各
種プライマーを用いてＰＣＲ法を行うことによって、目
的とするＣＭＶの特定部位を増幅することが可能とな
る。また、複数のプライマーを混在させてもそれぞれを
増幅することができる。
種プライマーを用いてＰＣＲ法を行うことによって、目
的とするＣＭＶの特定部位を増幅することが可能とな
る。また、複数のプライマーを混在させてもそれぞれを
増幅することができる。
【００３５】電気泳動像を確認した後、１Ｍ−ＮａＣｌ
を含む０．５Ｎ−ＮａＯＨ溶液約５００ｍｌにアガロー
スゲルを３０分間浸漬させ、続いて、１．５Ｍ−ＮａＣ
ｌを含む０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１
時間浸漬して中和した。中和したアガロースゲルに、２
０×ＳＳＣで濡らしたナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎ
ｄ−Ｎ：アマーシャム社）を載せ、室温で１６時間ブロ
ッティングした。ナイロンフィルターを１時間、減圧下
で乾燥させた後、８０℃で１時間ベイキングした。次
に、サルコシン０．１％、ＳＤＳ０．２％、核酸ハイブ
リダイゼイション用ブロッキング剤（ベーリンガーマン
ハイム社）５％およびホルムアミド３０％を含む５×Ｓ
ＳＣ（以下、ハイブリダイゼイション用緩衝液Ｉと称
す）中で前記のナイロンフィルターを４２℃にて６０分
間保持した後、実施例２で調製したＡＰ標識プローブ
（３ピコモル）を加えたハイブリダイゼイション用緩衝
液Ｉ（５ｍｌ）に前記のナイロンフィルターを移し、４
２℃で一夜反応させた。ＡＰ標識プローブとのハイブリ
ダイゼイション処理が済んだフィルターについて、１ｍ
Ｍ塩化亜鉛を含む２×ＳＳＣ（以下、洗浄液Ｉと称す）
（１００ｍｌ）による室温での５分間の洗浄を３回繰り
返した。次に、０．１％ＳＤＳを含む洗浄液Ｉ（１００
ｍｌ）中で４２℃にて４５分間静置した。更に、洗浄液
Ｉ（１００ｍｌ）により、室温での５分間の洗浄を３回
繰り返した。最後に、０．１Ｍ−ＮａＣｌおよび１０ｍ
Ｍ−ＭｇＣｌ2 を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
９．５）（以下、発色液と称す）に３０秒から１分間、
フィルターを浸して馴染ませた。
を含む０．５Ｎ−ＮａＯＨ溶液約５００ｍｌにアガロー
スゲルを３０分間浸漬させ、続いて、１．５Ｍ−ＮａＣ
ｌを含む０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１
時間浸漬して中和した。中和したアガロースゲルに、２
０×ＳＳＣで濡らしたナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎ
ｄ−Ｎ：アマーシャム社）を載せ、室温で１６時間ブロ
ッティングした。ナイロンフィルターを１時間、減圧下
で乾燥させた後、８０℃で１時間ベイキングした。次
に、サルコシン０．１％、ＳＤＳ０．２％、核酸ハイブ
リダイゼイション用ブロッキング剤（ベーリンガーマン
ハイム社）５％およびホルムアミド３０％を含む５×Ｓ
ＳＣ（以下、ハイブリダイゼイション用緩衝液Ｉと称
す）中で前記のナイロンフィルターを４２℃にて６０分
間保持した後、実施例２で調製したＡＰ標識プローブ
（３ピコモル）を加えたハイブリダイゼイション用緩衝
液Ｉ（５ｍｌ）に前記のナイロンフィルターを移し、４
２℃で一夜反応させた。ＡＰ標識プローブとのハイブリ
ダイゼイション処理が済んだフィルターについて、１ｍ
Ｍ塩化亜鉛を含む２×ＳＳＣ（以下、洗浄液Ｉと称す）
（１００ｍｌ）による室温での５分間の洗浄を３回繰り
返した。次に、０．１％ＳＤＳを含む洗浄液Ｉ（１００
ｍｌ）中で４２℃にて４５分間静置した。更に、洗浄液
Ｉ（１００ｍｌ）により、室温での５分間の洗浄を３回
繰り返した。最後に、０．１Ｍ−ＮａＣｌおよび１０ｍ
Ｍ−ＭｇＣｌ2 を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
９．５）（以下、発色液と称す）に３０秒から１分間、
フィルターを浸して馴染ませた。
【００３６】ニトロブルーテトラゾリウム（ベーリンガ
ーマンハイム社）７５ｍｇを３０％滅菌水−７０％ジメ
チルホルムアミド混合液１ｍｌに溶解した（以下、この
溶液をＮＢＴ溶液と称す）。また、５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリルリン酸（ベーリンガーマンハイム
社）５０ｍｇをジメチルホルムアミド１ｍｌに溶解した
（以下、この溶液をＢＣＩＰ溶液と称す）。ＮＢＴ溶液
４０μｌおよびＢＣＩＰ溶液４０μｌを加えた発色液１
０ｍｌを、前記発色液に馴染ませたナイロンフィルター
の入ったプラスチックバックに入れ、室温で５分間から
１６時間保持して発色させた。ＡＰとの反応は、１０ｍ
Ｍ−ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）５０ｍｌにフィルターを浸漬することにより停
止させた。
ーマンハイム社）７５ｍｇを３０％滅菌水−７０％ジメ
チルホルムアミド混合液１ｍｌに溶解した（以下、この
溶液をＮＢＴ溶液と称す）。また、５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリルリン酸（ベーリンガーマンハイム
社）５０ｍｇをジメチルホルムアミド１ｍｌに溶解した
（以下、この溶液をＢＣＩＰ溶液と称す）。ＮＢＴ溶液
４０μｌおよびＢＣＩＰ溶液４０μｌを加えた発色液１
０ｍｌを、前記発色液に馴染ませたナイロンフィルター
の入ったプラスチックバックに入れ、室温で５分間から
１６時間保持して発色させた。ＡＰとの反応は、１０ｍ
Ｍ−ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）５０ｍｌにフィルターを浸漬することにより停
止させた。
【００３７】これらの実験結果を図２に示す。図２の
〜は、前記図１の〜に相当する。図２から明らか
なように、本発明のプローブは、増幅した部位に相補性
を有し、ＣＭＶ含有試料においては、増幅されたＤＮＡ
バンドがＡＰ標識プローブにより特異的に染色される。
従って、本発明のプライマーおよびプローブによりＣＭ
Ｖ感染症の診断ができることが分かる。
〜は、前記図１の〜に相当する。図２から明らか
なように、本発明のプローブは、増幅した部位に相補性
を有し、ＣＭＶ含有試料においては、増幅されたＤＮＡ
バンドがＡＰ標識プローブにより特異的に染色される。
従って、本発明のプライマーおよびプローブによりＣＭ
Ｖ感染症の診断ができることが分かる。
【００３８】実施例５：ＡＰ標識プローブによるＣＭＶ
の検出 ＨＥＬ細胞（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏ Ｌｕｎｇ Ｃ
ｅｌｌ）をチェンバースライドグラス（インターメッド
社：２１．３ｍｍ×２０．０ｍｍ）上で３日間培養した
後、ＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ株）を感染させた。ウイルス感
染ＨＥＬ細胞および非感染ＨＥＬ細胞をスライドグラス
上で同じ期間（４８時間）培養した。そのスライドグラ
スを、４％ホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．２）に１０分間浸漬した後、
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）（以
下、ＮａＰＢと称す）による３分間の洗浄を３回繰り返
した。次に、０．２Ｎ塩酸で１０分間処理してから、Ｎ
ａＰＢで３回洗浄した。更に、７０％、９０％および１
００％エチルアルコールで各３分間づつ脱水し、クロロ
ホルムに１０分間浸漬した。最後に、１００％エチルア
ルコールに３分間づつ２回浸漬してから、風乾した。
の検出 ＨＥＬ細胞（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏ Ｌｕｎｇ Ｃ
ｅｌｌ）をチェンバースライドグラス（インターメッド
社：２１．３ｍｍ×２０．０ｍｍ）上で３日間培養した
後、ＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ株）を感染させた。ウイルス感
染ＨＥＬ細胞および非感染ＨＥＬ細胞をスライドグラス
上で同じ期間（４８時間）培養した。そのスライドグラ
スを、４％ホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．２）に１０分間浸漬した後、
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）（以
下、ＮａＰＢと称す）による３分間の洗浄を３回繰り返
した。次に、０．２Ｎ塩酸で１０分間処理してから、Ｎ
ａＰＢで３回洗浄した。更に、７０％、９０％および１
００％エチルアルコールで各３分間づつ脱水し、クロロ
ホルムに１０分間浸漬した。最後に、１００％エチルア
ルコールに３分間づつ２回浸漬してから、風乾した。
【００３９】１０％デキストラン硫酸ナトリウム塩、３
０％ホルムアミド、０．０２５％鰊精子ＤＮＡおよび１
×デンハルトを含む４×ＳＳＣ（１００μｌ）に、実施
例２で調製したＡＰ標識プローブ（２ピコモル）を溶か
してスライドグラス上に拡げ、３７℃の湿箱中で１６時
間保持した。次に、スライドグラスを取り出し、４×Ｓ
ＳＣで１０分間洗浄した後、０．１ｍＭ塩化亜鉛を含む
１×ＳＳＣ中で４５℃にて１．５−２時間洗浄した。３
０分毎に新鮮な洗浄液に交換した。更に、０．１ｍＭ塩
化亜鉛を含む１×ＳＳＣに３分間浸漬してから、０．１
５Ｍ−ＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）に１０分間漬けた。最後に、０．１Ｍ−ＮａＣ
ｌおよび１０ｍＭ塩化マグネシウムを含む０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）（以下、ＡＰ緩衝液と称
す）で３分間平衡させた。
０％ホルムアミド、０．０２５％鰊精子ＤＮＡおよび１
×デンハルトを含む４×ＳＳＣ（１００μｌ）に、実施
例２で調製したＡＰ標識プローブ（２ピコモル）を溶か
してスライドグラス上に拡げ、３７℃の湿箱中で１６時
間保持した。次に、スライドグラスを取り出し、４×Ｓ
ＳＣで１０分間洗浄した後、０．１ｍＭ塩化亜鉛を含む
１×ＳＳＣ中で４５℃にて１．５−２時間洗浄した。３
０分毎に新鮮な洗浄液に交換した。更に、０．１ｍＭ塩
化亜鉛を含む１×ＳＳＣに３分間浸漬してから、０．１
５Ｍ−ＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）に１０分間漬けた。最後に、０．１Ｍ−ＮａＣ
ｌおよび１０ｍＭ塩化マグネシウムを含む０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）（以下、ＡＰ緩衝液と称
す）で３分間平衡させた。
【００４０】ＡＰ緩衝液１ｍｌにＮＢＴ溶液４μｌとＢ
ＣＩＰ溶液４μｌと５％ナトリウム溶液１０μｌとを加
えて混合し、その混合液３００μｌを取って、先に調製
したスライドグラスに載せ、２５℃で２４時間反応させ
た。発色は、１０ｍＭ−ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で５分間処理して停止させ
た。
ＣＩＰ溶液４μｌと５％ナトリウム溶液１０μｌとを加
えて混合し、その混合液３００μｌを取って、先に調製
したスライドグラスに載せ、２５℃で２４時間反応させ
た。発色は、１０ｍＭ−ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で５分間処理して停止させ
た。
【００４１】これらの実験結果を図３、図４および図５
に示す。図３はプローブ（Ａ）を用いた感染細胞、図４
はプローブ（Ｂ）を用いた感染細胞、図５はプローブ
（Ｃ）を用いた感染細胞の結果をそれぞれ示す。なお、
非感染細胞に対してプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）お
よびプローブ（Ｃ）を用いた場合には発色が現れなかっ
た。図３、図４および図５から明らかなように、使用し
たプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）およびプローブ
（Ｃ）は（１）正常ＨＥＬ細胞のＲＮＡおよびＤＮＡと
交差反応しないこと、および（２）ＣＭＶ感染細胞のウ
イルス特異的なＲＮＡおよびＤＮＡとはハイブリダイゼ
イションすることが分かる。
に示す。図３はプローブ（Ａ）を用いた感染細胞、図４
はプローブ（Ｂ）を用いた感染細胞、図５はプローブ
（Ｃ）を用いた感染細胞の結果をそれぞれ示す。なお、
非感染細胞に対してプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）お
よびプローブ（Ｃ）を用いた場合には発色が現れなかっ
た。図３、図４および図５から明らかなように、使用し
たプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）およびプローブ
（Ｃ）は（１）正常ＨＥＬ細胞のＲＮＡおよびＤＮＡと
交差反応しないこと、および（２）ＣＭＶ感染細胞のウ
イルス特異的なＲＮＡおよびＤＮＡとはハイブリダイゼ
イションすることが分かる。
【００４２】実施例６：ウイルス分離による診断法との
感度比較 実施例５で用いたウイルス感染ＨＥＬ細胞の培養上清を
用い、従来のウイルス分離法による感度と、実施例３記
載の条件でウイルスＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅する
方法の感度とを比較した。実施例３のエチジウムブロマ
イド染色によれば、少なくとも０．１ＰＦＵ（Ｐｌａｑ
ｕｅ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ）まで検出できた。更
に、実施例３記載の条件でＡＰ標識プローブを用いてサ
ザンブロットハイブリダイゼイションを行ったところ、
少なくとも０．０１ＰＦＵまで検出できた。
感度比較 実施例５で用いたウイルス感染ＨＥＬ細胞の培養上清を
用い、従来のウイルス分離法による感度と、実施例３記
載の条件でウイルスＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅する
方法の感度とを比較した。実施例３のエチジウムブロマ
イド染色によれば、少なくとも０．１ＰＦＵ（Ｐｌａｑ
ｕｅ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ）まで検出できた。更
に、実施例３記載の条件でＡＰ標識プローブを用いてサ
ザンブロットハイブリダイゼイションを行ったところ、
少なくとも０．０１ＰＦＵまで検出できた。
【００４３】実施例７：プライマーの特異性 本発明によるＣＭＶ増幅用プライマーの特異性を調べ
た。ウイルスとしては、ＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ株）、単純
ヘルペスウイルス−Ｉ型（ＨＳＶ−１：ＨＦ株）、単純
ヘルペスウイルス−II型（ＨＳＶ−２：ＵＷ２６８
株）、水痘・帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ：Ｈ−Ｎ３
株）、ＥＢウイルス（ＥＢＶ：Ｂ９５−Ｂ株）およびＨ
ＨＶ−６（突発性発疹症分離株）を用い、実施例３記載
の条件で、プライマー（１ｂ）とプライマー（２ａ）お
よびプライマー（１ｃ）とプライマー（２ｃ）とを混在
させ、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅を行い、交差反応の有
無を調べた。
た。ウイルスとしては、ＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ株）、単純
ヘルペスウイルス−Ｉ型（ＨＳＶ−１：ＨＦ株）、単純
ヘルペスウイルス−II型（ＨＳＶ−２：ＵＷ２６８
株）、水痘・帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ：Ｈ−Ｎ３
株）、ＥＢウイルス（ＥＢＶ：Ｂ９５−Ｂ株）およびＨ
ＨＶ−６（突発性発疹症分離株）を用い、実施例３記載
の条件で、プライマー（１ｂ）とプライマー（２ａ）お
よびプライマー（１ｃ）とプライマー（２ｃ）とを混在
させ、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅を行い、交差反応の有
無を調べた。
【００４４】これらの実験結果を図６に示す。図６にお
いて、ＭはＤＮＡマーカー（図１と同じマーカー）、１
および７はＨＳＶ−１、２および８はＨＳＶ−２、３お
よび９はＶＺＶ、４および１０はＥＢＶ、５および１１
はＣＭＶ、そして６および１２はＨＨＶ−６の結果を示
す。そして、１〜６はアニーリング温度５５℃および７
〜１２はアニーリング温度６０℃の結果である。図６の
試料５および１１にのみ１８２ｂｐおよび３１６ｂｐ
（下から順）にバンドが現れる（ＳおよびＲは図１と同
様）ことから明らかなように、本発明によれば、ＣＭＶ
を特異的に検出することができる。
いて、ＭはＤＮＡマーカー（図１と同じマーカー）、１
および７はＨＳＶ−１、２および８はＨＳＶ−２、３お
よび９はＶＺＶ、４および１０はＥＢＶ、５および１１
はＣＭＶ、そして６および１２はＨＨＶ−６の結果を示
す。そして、１〜６はアニーリング温度５５℃および７
〜１２はアニーリング温度６０℃の結果である。図６の
試料５および１１にのみ１８２ｂｐおよび３１６ｂｐ
（下から順）にバンドが現れる（ＳおよびＲは図１と同
様）ことから明らかなように、本発明によれば、ＣＭＶ
を特異的に検出することができる。
【００４５】
【発明の効果】本発明による各種のプライマーを用いる
と、被検試料中に微量に含まれているヒトサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）ＤＮＡの特定部位が特異的にしかも
確実に増幅されるので、ＣＭＶの検出を短時間に高精度
で実施することができる。また、本発明のプローブを用
いると、被検試料中に微量に含まれているＣＭＶ−ＤＮ
Ａの特定部位を特異的にしかも確実に検出することがで
きるので、ＣＭＶの検出を短時間に高精度で実施するこ
とができる。
と、被検試料中に微量に含まれているヒトサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）ＤＮＡの特定部位が特異的にしかも
確実に増幅されるので、ＣＭＶの検出を短時間に高精度
で実施することができる。また、本発明のプローブを用
いると、被検試料中に微量に含まれているＣＭＶ−ＤＮ
Ａの特定部位を特異的にしかも確実に検出することがで
きるので、ＣＭＶの検出を短時間に高精度で実施するこ
とができる。
【００４６】
【００４７】配列番号：１ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： TATACCCAGA CGGAAGAGAA ATTCA
【００４８】配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： ATGAAGTGTA TTGGGCTAAC TATGC
【００４９】配列番号：３ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： TTCTCCTAAG TTCATCCTTT TTAGC
【００５０】配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列 ATAAGCCATA ATCTCATCAG GGGAG
【００５１】配列番号：５ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列 TGACGCGCAT ACATCCCGAG TACAT
【００５２】配列番号：６ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列 ATGACGTTGC TCCGTGGAAA GAGACC
【００５３】配列番号：７ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列 CTCCTTAATA CAAGCCATCC ACATCTCCCG
【００５４】配列番号：８ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列 GCTGTCGGTG TTCCAAATGA ACGGCCTGAT
【００５５】配列番号：９ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列 GACTTCTTCA CCCTGTTCTT CCTCGCTATC
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の各種プライマーを用いたＰＣＲ反応に
より増幅されたＤＮＡに関する電気泳動の結果を示す図
面に代わる写真である。
より増幅されたＤＮＡに関する電気泳動の結果を示す図
面に代わる写真である。
【図２】図１の電気泳動像を、酵素標識プローブを用い
たサザンブロットハイブリッド法により確認した結果を
模式的に示す説明図である。
たサザンブロットハイブリッド法により確認した結果を
模式的に示す説明図である。
【図３】ＣＭＶに感染したＨＥＬ細胞に対して、本発明
のプローブを用いて、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼー
ションを実施した結果を模式的に示す説明図である。
のプローブを用いて、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼー
ションを実施した結果を模式的に示す説明図である。
【図４】ＣＭＶに感染したＨＥＬ細胞に対して、本発明
の別のプローブを用いて、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼ
ーションを実施した結果を模式的に示す説明図である。
の別のプローブを用いて、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼ
ーションを実施した結果を模式的に示す説明図である。
【図５】ＣＭＶに感染したＨＥＬ細胞に対して、本発明
の更に別のプローブを用いて、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリ
ダイゼーションを実施した結果を模式的に示す説明図で
ある。
の更に別のプローブを用いて、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリ
ダイゼーションを実施した結果を模式的に示す説明図で
ある。
【図６】各種のウイルスに対する本発明のプライマーの
特異性に関する電気泳動の結果を示す図面に代わる写真
である。
特異性に関する電気泳動の結果を示す図面に代わる写真
である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年４月２６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００５】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は、式
（１ａ） （５’）−ＴＡＴＡＣ ＣＣＡＧＡ ＣＧＧＡＡ ＧＡＧＡＡ ＡＴＴＣＡ−（ ３’） （１ａ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第１のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（１ａ）と称することがある〕または式（１ｂ） （５’）−ＡＴＧＡＡ ＧＴＧＴＡ ＴＴＧＧＧ ＣＴＡＡＣ ＴＡＴＧＣ−（ ３’） （１ｂ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第１のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（１ｂ）と称することがある〕および式（２ａ） （５’）−ＴＴＣＴＣ ＣＴＡＡＧ ＴＴＣＡＴ ＣＣＴＴＴ ＴＴＡＧＣ−（ ３’） （２ａ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第２のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（２ａ）と称することがある〕または式（２ｂ） （５’）−ＡＴＡＡＧ ＣＣＡＴＡ ＡＴＣＴＣ ＡＴＣＡＧ ＧＧＧＡＧ−（ ３’） （２ｂ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第２のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（２ｂ）と称することがある〕の組み合わせ、あるい
は、式（１ｃ） （５’）−ＴＧＡＣＧ ＣＧＣＡＴ ＡＣＡＴＣ ＣＣＧＡＧ ＴＡＣＡＴ−（ ３’） （１ｃ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第１のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（１ｃ）と称することがある〕および式（２ｃ） （５’）−ＡＴＧＡＣ ＧＴＴＧＣ ＴＣＣＧＴ ＧＧＡＡＡ ＧＡＧＡＣ Ｃ −（３’） （２ｃ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第２のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（２ｃ）と称することがある〕の組み合わせと、ＤＮＡ
ポリメラーゼと、水性液体被検試料とを含む混合液をＤ
ＮＡ増幅工程にかけ、続いて、得られた反応液をＤＮＡ
検査工程にかけること特徴とする、ヒトサイトメガロウ
イルスの検出方法に関する。本明細書の塩基配列におい
て、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニンそして
Ｔはチミンの意味である。
（１ａ） （５’）−ＴＡＴＡＣ ＣＣＡＧＡ ＣＧＧＡＡ ＧＡＧＡＡ ＡＴＴＣＡ−（ ３’） （１ａ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第１のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（１ａ）と称することがある〕または式（１ｂ） （５’）−ＡＴＧＡＡ ＧＴＧＴＡ ＴＴＧＧＧ ＣＴＡＡＣ ＴＡＴＧＣ−（ ３’） （１ｂ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第１のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（１ｂ）と称することがある〕および式（２ａ） （５’）−ＴＴＣＴＣ ＣＴＡＡＧ ＴＴＣＡＴ ＣＣＴＴＴ ＴＴＡＧＣ−（ ３’） （２ａ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第２のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（２ａ）と称することがある〕または式（２ｂ） （５’）−ＡＴＡＡＧ ＣＣＡＴＡ ＡＴＣＴＣ ＡＴＣＡＧ ＧＧＧＡＧ−（ ３’） （２ｂ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第２のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（２ｂ）と称することがある〕の組み合わせ、あるい
は、式（１ｃ） （５’）−ＴＧＡＣＧ ＣＧＣＡＴ ＡＣＡＴＣ ＣＣＧＡＧ ＴＡＣＡＴ−（ ３’） （１ｃ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第１のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（１ｃ）と称することがある〕および式（２ｃ） （５’）−ＡＴＧＡＣ ＧＴＴＧＣ ＴＣＣＧＴ ＧＧＡＡＡ ＧＡＧＡＣ Ｃ −（３’） （２ｃ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第２のＤＮＡプライマー〔以下、プライマー
（２ｃ）と称することがある〕の組み合わせと、ＤＮＡ
ポリメラーゼと、水性液体被検試料とを含む混合液をＤ
ＮＡ増幅工程にかけ、続いて、得られた反応液をＤＮＡ
検査工程にかけること特徴とする、ヒトサイトメガロウ
イルスの検出方法に関する。本明細書の塩基配列におい
て、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニンそして
Ｔはチミンの意味である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】実施例１：プライマーの合成 ３８１Ａ型自勤ＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシス
テムズ社）に、アデニンＣＰＧカラムを装着して、配列
表における配列番号１の配列に記載の塩基２５個からな
るプライマー（１ａ）を合成し、更に、シトシンＣＰＧ
カラムを装着して配列表における配列番号２の配列に記
載の塩基２５個からなるプライマー（１ｂ）と配列表に
おける配列番号３の配列に記載の塩基２５個からなるプ
ライマー（２ａ）と配列表における配列番号６の配列に
記載の塩基２６個からなるプライマー（２ｃ）とを合成
し、グアニンＣＰＧカラムを装着して配列表における配
列番号４の配列に記載の塩基２５個からなるプライマー
（２ｂ）を合成し、そしてチミンＣＰＧカラムを装着し
て配列表における配列番号５の配列に記戴の塩基２５個
からなるプライマー（１ｃ）をそれぞれ合成した。アン
モニア水（約３０％）２．５ｍｌを入れたディスポシリ
ンジ（２．５ｍｌ）を、合成工程が完了したＣＰＧカラ
ムに接続し、アンモニア水をカラム内に押し出して、合
成したＤＮＡフラグメントを溶出した。回収したＤＮＡ
アンモニア溶液の入ったバイアル瓶を密栓し、６５℃で
６時間加温した後、室温まで冷やしてから濃縮した。濃
縮物を凍結乾燥し、１０ｍＭトリエチルアンモニウムア
セテート（以下、ＴＥＡ−Ａと称す）（ｐＨ７．４）に
溶解し、沈澱を除いてから、Ｌ−６２００型高速液体ク
ロマトグラフィー装置（日立製作所）（以下、ＨＰＬＣ
と称す）に分離用カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−
ＡＭ３１３：ＹＭＣ社）を装着し、５％アセトニトリル
を含んだ９５ｍＭ−ＴＥＡ−Ａとアセトニトリルとによ
る濃度勾配を用いて精製し、メインピークを集めた。得
られた残渣に８０％酢酸（アセトニトリルで調整）を加
えて懸濁させ、室温で３０分間保持してから減圧乾燥し
た。乾燥物を１０ｍＭ−ＴＥＡ−Ａに溶解し、ジエチル
エーテルで抽出してから減圧乾燥した。乾燥したＤＮＡ
試料をＴＥＡ−Ａに溶解し、沈澱を除いてから、２回目
のＨＰＬＣによる精製を行い、メインピークを集めた。
こうして得られた精製ＤＮＡプライマーを減圧乾燥して
保存し、後記の実施例３で用いた。
テムズ社）に、アデニンＣＰＧカラムを装着して、配列
表における配列番号１の配列に記載の塩基２５個からな
るプライマー（１ａ）を合成し、更に、シトシンＣＰＧ
カラムを装着して配列表における配列番号２の配列に記
載の塩基２５個からなるプライマー（１ｂ）と配列表に
おける配列番号３の配列に記載の塩基２５個からなるプ
ライマー（２ａ）と配列表における配列番号６の配列に
記載の塩基２６個からなるプライマー（２ｃ）とを合成
し、グアニンＣＰＧカラムを装着して配列表における配
列番号４の配列に記載の塩基２５個からなるプライマー
（２ｂ）を合成し、そしてチミンＣＰＧカラムを装着し
て配列表における配列番号５の配列に記戴の塩基２５個
からなるプライマー（１ｃ）をそれぞれ合成した。アン
モニア水（約３０％）２．５ｍｌを入れたディスポシリ
ンジ（２．５ｍｌ）を、合成工程が完了したＣＰＧカラ
ムに接続し、アンモニア水をカラム内に押し出して、合
成したＤＮＡフラグメントを溶出した。回収したＤＮＡ
アンモニア溶液の入ったバイアル瓶を密栓し、６５℃で
６時間加温した後、室温まで冷やしてから濃縮した。濃
縮物を凍結乾燥し、１０ｍＭトリエチルアンモニウムア
セテート（以下、ＴＥＡ−Ａと称す）（ｐＨ７．４）に
溶解し、沈澱を除いてから、Ｌ−６２００型高速液体ク
ロマトグラフィー装置（日立製作所）（以下、ＨＰＬＣ
と称す）に分離用カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−
ＡＭ３１３：ＹＭＣ社）を装着し、５％アセトニトリル
を含んだ９５ｍＭ−ＴＥＡ−Ａとアセトニトリルとによ
る濃度勾配を用いて精製し、メインピークを集めた。得
られた残渣に８０％酢酸（アセトニトリルで調整）を加
えて懸濁させ、室温で３０分間保持してから減圧乾燥し
た。乾燥物を１０ｍＭ−ＴＥＡ−Ａに溶解し、ジエチル
エーテルで抽出してから減圧乾燥した。乾燥したＤＮＡ
試料をＴＥＡ−Ａに溶解し、沈澱を除いてから、２回目
のＨＰＬＣによる精製を行い、メインピークを集めた。
こうして得られた精製ＤＮＡプライマーを減圧乾燥して
保存し、後記の実施例３で用いた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】実施例２：酵素標識プローブの調製 ＤＮＡプローブの合成は前記実施例１と同様の装置を用
い、同様の条件で行ったが、但し、配列表における配列
番号７の配列に記載の塩基３０個からなるプローブＡの
合成ではグアニンＣＰＧカラムを用いて５’末端から１
８番目のＴを、配列表における配列番号８の配列に記載
の塩基３０個からなるプローブＢについてはチミンＣＰ
Ｇカラムを用いて５’末端から１８番目のＴを、そして
配列表における配列番号９の配列に記戦の塩基３０個か
らなるプローブＣについてはシトシンＣＰＧカラムを用
いて５’末端から１７番目のＴを、それぞれ５’−ジメ
トキシトリチル−５−〔Ｎ−（トリフルオロアセチルア
ミノヘキシル）−３−アクリルイミド〕−２’−デオキ
シウリジン−３’−〔（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ
−ジイソプロピル）〕−ホスホルアミダイト（グレンリ
サーチ社）（以下、リンカーと称す）に置き換えた。な
お、リンカーの位置はこの部位に限らず、他のチミン部
位を置き換えることも可能である。リンカー付きプロー
ブの精製も実施例１に記載した条件で行った。 ─────────────────────────────────────────────────────
い、同様の条件で行ったが、但し、配列表における配列
番号７の配列に記載の塩基３０個からなるプローブＡの
合成ではグアニンＣＰＧカラムを用いて５’末端から１
８番目のＴを、配列表における配列番号８の配列に記載
の塩基３０個からなるプローブＢについてはチミンＣＰ
Ｇカラムを用いて５’末端から１８番目のＴを、そして
配列表における配列番号９の配列に記戦の塩基３０個か
らなるプローブＣについてはシトシンＣＰＧカラムを用
いて５’末端から１７番目のＴを、それぞれ５’−ジメ
トキシトリチル−５−〔Ｎ−（トリフルオロアセチルア
ミノヘキシル）−３−アクリルイミド〕−２’−デオキ
シウリジン−３’−〔（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ
−ジイソプロピル）〕−ホスホルアミダイト（グレンリ
サーチ社）（以下、リンカーと称す）に置き換えた。な
お、リンカーの位置はこの部位に限らず、他のチミン部
位を置き換えることも可能である。リンカー付きプロー
ブの精製も実施例１に記載した条件で行った。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年１２月１９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００５】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は、式
（１ａ） （５’）−ＴＡＴＡＣ ＣＣＡＧＡ ＣＧＧＡＡ ＧＡＧＡＡ ＡＴＴＣＡ−（ ３’） （１ａ） で表される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有する第１のＤＮＡプライマー〔以
下、プライマー（１ａ）と称することがある〕または式
（１ｂ） （５’）−ＡＴＧＡＡ ＧＴＧＴＡ ＴＴＧＧＧ ＣＴＡＡＣ ＴＡＴＧＣ−（ ３’） （１ｂ） で表される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有する第１のＤＮＡプライマー〔以
下、プライマー（１ｂ）と称することがある〕および式
（２ａ） （５’）−ＴＴＣＴＣ ＣＴＡＡＧ ＴＴＣＡＴ ＣＣＴＴＴ ＴＴＡＧＣ−（ ３’） （２ａ） で表される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマー〔以
下、プライマー（２ａ）と称することがある〕または式
（２ｂ） （５’）−ＡＴＡＡＧ ＣＣＡＴＡ ＡＴＣＴＣ ＡＴＣＡＧ ＧＧＧＡＧ−（ ３’） （２ｂ） で表される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマー〔以
下、プライマー（２ｂ）と称することがある〕の組み合
わせ、あるいは、式（１ｃ） （５’）−ＴＧＡＣＧ ＣＧＣＡＴ ＡＣＡＴＣ ＣＣＧＡＧ ＴＡＣＡＴ−（ ３’） （１ｃ） で表される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有する第１のＤＮＡプライマー〔以
下、プライマー（１ｃ）と称することがある〕および式
（２ｃ） （５’）−ＡＴＧＡＣ ＧＴＴＧＣ ＴＣＣＧＴ ＧＧＡＡＡ ＧＡＧＡＣ Ｃ −（３’） （２ｃ） で表される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマー〔以
下、プライマー（２ｃ）と称することがある〕の組み合
わせと、ＤＮＡポリメラーゼと、水性液体被検試料とを
含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけ、続いて、得られた
反応液をＤＮＡ検査工程にかけること特徴とする、ヒト
サイトメガロウイルスの検出方法に関する。本明細書の
塩基配列において、Ａはアデニン残基、Ｃはシトシン残
基、Ｇはグアニン残基、そしてＴはチミン残基である。
（１ａ） （５’）−ＴＡＴＡＣ ＣＣＡＧＡ ＣＧＧＡＡ ＧＡＧＡＡ ＡＴＴＣＡ−（ ３’） （１ａ） で表される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有する第１のＤＮＡプライマー〔以
下、プライマー（１ａ）と称することがある〕または式
（１ｂ） （５’）−ＡＴＧＡＡ ＧＴＧＴＡ ＴＴＧＧＧ ＣＴＡＡＣ ＴＡＴＧＣ−（ ３’） （１ｂ） で表される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有する第１のＤＮＡプライマー〔以
下、プライマー（１ｂ）と称することがある〕および式
（２ａ） （５’）−ＴＴＣＴＣ ＣＴＡＡＧ ＴＴＣＡＴ ＣＣＴＴＴ ＴＴＡＧＣ−（ ３’） （２ａ） で表される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマー〔以
下、プライマー（２ａ）と称することがある〕または式
（２ｂ） （５’）−ＡＴＡＡＧ ＣＣＡＴＡ ＡＴＣＴＣ ＡＴＣＡＧ ＧＧＧＡＧ−（ ３’） （２ｂ） で表される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマー〔以
下、プライマー（２ｂ）と称することがある〕の組み合
わせ、あるいは、式（１ｃ） （５’）−ＴＧＡＣＧ ＣＧＣＡＴ ＡＣＡＴＣ ＣＣＧＡＧ ＴＡＣＡＴ−（ ３’） （１ｃ） で表される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有する第１のＤＮＡプライマー〔以
下、プライマー（１ｃ）と称することがある〕および式
（２ｃ） （５’）−ＡＴＧＡＣ ＧＴＴＧＣ ＴＣＣＧＴ ＧＧＡＡＡ ＧＡＧＡＣ Ｃ −（３’） （２ｃ） で表される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマー〔以
下、プライマー（２ｃ）と称することがある〕の組み合
わせと、ＤＮＡポリメラーゼと、水性液体被検試料とを
含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけ、続いて、得られた
反応液をＤＮＡ検査工程にかけること特徴とする、ヒト
サイトメガロウイルスの検出方法に関する。本明細書の
塩基配列において、Ａはアデニン残基、Ｃはシトシン残
基、Ｇはグアニン残基、そしてＴはチミン残基である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】本発明は、更に、ＣＭＶ−ＤＮＡの特異的
な検出に用いることのできる３種類のＤＮＡプローブを
提供するものでもある。これらのＤＮＡプローブは、式
（３） （５’）−ＣＴＣＣＴ ＴＡＡＴＡ ＣＡＡＧＣ ＣＡＴＣＣ ＡＣＡＴＣ Ｔ ＣＣＣＧ−（３’） （３） で表される塩基配列の少なくとも１０塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有するプローブ（以下、プローブＡと
称することがある）、および式（４） （５’）−ＧＣＴＧＴ ＣＧＧＴＧ ＴＴＣＣＡ ＡＡＴＧＡ ＡＣＧＧＣ Ｃ ＴＧＡＴ−（３’） （４） で表される塩基配列の少なくとも１０塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有するプローブ（以下、プローブＢと
称することがある）、および式（５） （５’）−ＧＡＣＴＴ ＣＴＴＣＡ ＣＣＣＴＧ ＴＴＣＴＴ ＣＣＴＣＧ Ｃ ＴＡＴＣ−（３’） （５） で表される塩基配列の少なくとも１０塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有するプローブ（以下、プローブＣと
称することがある）である。これらのプローブを単独
で、または２種づつを組み合わせて、更に３者を同時に
用いることができる。また、これらのプローブを用いる
ＤＮＡ検査工程は、プライマー（１ａ）〜（１ｃ）とプ
ライマー（２ａ）〜（２ｃ）との組み合わせを用いる前
記のＤＮＡ増幅工程と組み合わせて、あるいは組み合わ
せず単独に実施することができる。
な検出に用いることのできる３種類のＤＮＡプローブを
提供するものでもある。これらのＤＮＡプローブは、式
（３） （５’）−ＣＴＣＣＴ ＴＡＡＴＡ ＣＡＡＧＣ ＣＡＴＣＣ ＡＣＡＴＣ Ｔ ＣＣＣＧ−（３’） （３） で表される塩基配列の少なくとも１０塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有するプローブ（以下、プローブＡと
称することがある）、および式（４） （５’）−ＧＣＴＧＴ ＣＧＧＴＧ ＴＴＣＣＡ ＡＡＴＧＡ ＡＣＧＧＣ Ｃ ＴＧＡＴ−（３’） （４） で表される塩基配列の少なくとも１０塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有するプローブ（以下、プローブＢと
称することがある）、および式（５） （５’）−ＧＡＣＴＴ ＣＴＴＣＡ ＣＣＣＴＧ ＴＴＣＴＴ ＣＣＴＣＧ Ｃ ＴＡＴＣ−（３’） （５） で表される塩基配列の少なくとも１０塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有するプローブ（以下、プローブＣと
称することがある）である。これらのプローブを単独
で、または２種づつを組み合わせて、更に３者を同時に
用いることができる。また、これらのプローブを用いる
ＤＮＡ検査工程は、プライマー（１ａ）〜（１ｃ）とプ
ライマー（２ａ）〜（２ｃ）との組み合わせを用いる前
記のＤＮＡ増幅工程と組み合わせて、あるいは組み合わ
せず単独に実施することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山口 優樹 東京都千代田区東神田１丁目11番４号 株 式会社ヤトロン内 (72)発明者 喜多 寛 東京都千代田区東神田１丁目11番４号 株 式会社ヤトロン内
Claims (2)
- 【請求項１】 式（１ａ） （５’）−ＴＡＴＡＣ ＣＣＡＧＡ ＣＧＧＡＡ ＧＡＧＡＡ ＡＴＴＣＡ−（ ３’） （１ａ） または式（１ｂ） （５’）−ＡＴＧＡＡ ＧＴＧＴＡ ＴＴＧＧＧ ＣＴＡＡＣ ＴＡＴＧＣ−（ ３’） （１ｂ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第１のＤＮＡプライマーおよび式（２ａ） （５’）−ＴＴＣＴＣ ＣＴＡＡＧ ＴＴＣＡＴ ＣＣＴＴＴ ＴＴＡＧＣ−（ ３’） （２ａ） または式（２ｂ） （５’）−ＡＴＡＡＧ ＣＣＡＴＡ ＡＴＣＴＣ ＡＴＣＡＧ ＧＧＧＡＧ−（ ３’） （２ｂ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第２のＤＮＡプライマーの組み合わせ、あるい
は、式（１ｃ） （５’）−ＴＧＡＣＧ ＣＧＣＡＴ ＡＣＡＴＣ ＣＣＧＡＧ ＴＡＣＡＴ−（ ３’） （１ｃ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第１のＤＮＡプライマーおよび式（２ｃ） （５’）−ＡＴＧＡＣ ＧＴＴＧＣ ＴＣＣＧＴ ＧＧＡＡＡ ＧＡＧＡＣ Ｃ −（３’） （２ｃ） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有する第２のＤＮＡプライマーの組み合わせと、ＤＮ
Ａポリメラーゼと、水性液体被検試料とを含む混合液を
ＤＮＡ増幅工程にかけ、続いて、得られた反応液をＤＮ
Ａ検査工程にかけること特徴とする、ヒトサイトメガロ
ウイルスの検出方法。 - 【請求項２】 式（３） （５’）−ＣＴＣＣＴ ＴＡＡＴＡ ＣＡＡＧＣ ＣＡＴＣＣ ＡＣＡＴＣ Ｔ ＣＣＣＧ−（３’） （３） 式（４） （５’）−ＧＣＴＧＴ ＣＧＧＴＧ ＴＴＣＣＡ ＡＡＴＧＡ ＡＣＧＧＣ Ｃ ＴＧＡＴ−（３’） （４） または式（５） （５’）−ＧＡＣＴＴ ＣＴＴＣＡ ＣＣＣＴＧ ＴＴＣＴＴ ＣＣＴＣＧ Ｃ ＴＡＴＣ−（３’） （５） で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を
含有し、標識を担持するプローブと被検試料とを接触さ
せ、前記標識からの信号を検出することを特徴とする、
ヒトサイトメガロウイルスの検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP41580790A JPH05317099A (ja) | 1990-12-28 | 1990-12-28 | ヒトサイトメガロウイルスの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP41580790A JPH05317099A (ja) | 1990-12-28 | 1990-12-28 | ヒトサイトメガロウイルスの検出方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11211291A Division JP2000032992A (ja) | 1999-07-26 | 1999-07-26 | ヒトサイトメガロウイルスの検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05317099A true JPH05317099A (ja) | 1993-12-03 |
Family
ID=18524090
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP41580790A Pending JPH05317099A (ja) | 1990-12-28 | 1990-12-28 | ヒトサイトメガロウイルスの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05317099A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007136303A1 (ru) * | 2006-05-23 | 2007-11-29 | Closed Company "Molecular-Medicine Technologies" | Способ идентификации урогенитальной инфекции, олигонуклеотид, комбинация олигонуклеотидов, биочип и набор на его основе |
-
1990
- 1990-12-28 JP JP41580790A patent/JPH05317099A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007136303A1 (ru) * | 2006-05-23 | 2007-11-29 | Closed Company "Molecular-Medicine Technologies" | Способ идентификации урогенитальной инфекции, олигонуклеотид, комбинация олигонуклеотидов, биочип и набор на его основе |
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