JPH07163370A - 核酸の同時増幅方法 - Google Patents
核酸の同時増幅方法Info
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- JPH07163370A JPH07163370A JP6155747A JP15574794A JPH07163370A JP H07163370 A JPH07163370 A JP H07163370A JP 6155747 A JP6155747 A JP 6155747A JP 15574794 A JP15574794 A JP 15574794A JP H07163370 A JPH07163370 A JP H07163370A
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で２種以上
の核酸を増幅する場合に、特定の核酸を他の核酸よりも
優先的に増幅させる方法を提供する。 【構成】 本発明の方法によるＰＣＲの変調は、各プラ
イマーの融解温度差や、特定のプライマー比率を利用し
て行う。ＰＣＲサイクルは高速で行われる。 【効果】 本発明の方法は、検体中に比較的低濃度でし
か存在しない感染作因に係わるＤＮＡの増幅検出に特に
有用である。
の核酸を増幅する場合に、特定の核酸を他の核酸よりも
優先的に増幅させる方法を提供する。 【構成】 本発明の方法によるＰＣＲの変調は、各プラ
イマーの融解温度差や、特定のプライマー比率を利用し
て行う。ＰＣＲサイクルは高速で行われる。 【効果】 本発明の方法は、検体中に比較的低濃度でし
か存在しない感染作因に係わるＤＮＡの増幅検出に特に
有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、標的ではない核酸配列
の増幅を抑制しながら標的の核酸配列を容易に増幅し検
出できる、２種以上の核酸配列を非常に迅速に優先増幅
する方法に関する。使用する増幅技法はポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）である。
の増幅を抑制しながら標的の核酸配列を容易に増幅し検
出できる、２種以上の核酸配列を非常に迅速に優先増幅
する方法に関する。使用する増幅技法はポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）である。
【０００２】
【従来の技術】ヒトや動物の試料中に少量存在する各種
の疾患、微生物または遺伝的特徴を検出するための手段
としての価値が発見されたために、最近では核酸プロー
ブ技法が急速に開発されている。
の疾患、微生物または遺伝的特徴を検出するための手段
としての価値が発見されたために、最近では核酸プロー
ブ技法が急速に開発されている。
【０００３】微生物や細胞の中の標的とされる核酸配列
はＤＮＡ分子全体のほんのわずかな部分を占めるにすぎ
ない場合があるため、ほとんどの標識ＤＮＡプローブで
はその存在を検出することは非常に困難である。標的と
される核酸のわずかな数の分子を検出するための方法を
見い出すべく多くの研究が行われてきた。
はＤＮＡ分子全体のほんのわずかな部分を占めるにすぎ
ない場合があるため、ほとんどの標識ＤＮＡプローブで
はその存在を検出することは非常に困難である。標的と
される核酸のわずかな数の分子を検出するための方法を
見い出すべく多くの研究が行われてきた。
【０００４】当該技術分野では、非常に低濃度の標的核
酸を検出できる著しい進歩がＰＣＲである。ＰＣＲの詳
細については、例えば米国特許出願第４，６８３，１９
５号、同第４，６８３，２０２号及び同第４，９６５，
１８８号明細書に記載されている。
酸を検出できる著しい進歩がＰＣＲである。ＰＣＲの詳
細については、例えば米国特許出願第４，６８３，１９
５号、同第４，６８３，２０２号及び同第４，９６５，
１８８号明細書に記載されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ヒトや動物のＤＮＡ検
体は多数の様々な核酸を含有する。あるものはヒトや動
物の生体内に固有に（天然に）存在し、またあるもの
は、感染性作因（例、ウイルス、細菌または寄生体）の
存在などの何らかの異常状態、または発ガン性状態が原
因で発生する。原因となる微生物や作因が存在するかど
うかを知るために検出されることが往々にして望まれて
いるのがこうした「非天然の」核酸である。通常、感染
性作因や発ガン性状態に関係のある核酸は比較的低濃度
で存在する。しかし、早期診断、早期処置のためにはこ
れらをそうした濃度で検出することが望まれる。このよ
うな核酸は、しばしば「コピー数の少ない遺伝子」とか
「コピー数の少ない核酸」と呼ばれている。
体は多数の様々な核酸を含有する。あるものはヒトや動
物の生体内に固有に（天然に）存在し、またあるもの
は、感染性作因（例、ウイルス、細菌または寄生体）の
存在などの何らかの異常状態、または発ガン性状態が原
因で発生する。原因となる微生物や作因が存在するかど
うかを知るために検出されることが往々にして望まれて
いるのがこうした「非天然の」核酸である。通常、感染
性作因や発ガン性状態に関係のある核酸は比較的低濃度
で存在する。しかし、早期診断、早期処置のためにはこ
れらをそうした濃度で検出することが望まれる。このよ
うな核酸は、しばしば「コピー数の少ない遺伝子」とか
「コピー数の少ない核酸」と呼ばれている。
【０００６】これに比べて、検体となるヒトや動物に通
常存在する核酸は比較的高濃度で存在することが多い。
このような核酸は、しばしば「コピー数の多い遺伝子」
とか「コピー数の多い核酸」と呼ばれている。こうした
例の一つとしてヒトβ−グロビンＤＮＡが挙げられる。
常存在する核酸は比較的高濃度で存在することが多い。
このような核酸は、しばしば「コピー数の多い遺伝子」
とか「コピー数の多い核酸」と呼ばれている。こうした
例の一つとしてヒトβ−グロビンＤＮＡが挙げられる。
【０００７】ＰＣＲを利用する際には、検体中に存在す
る２種以上の核酸を同じ反応容器内で同時に増幅させる
ことが多い（本明細書ではこのことを「同時増幅」と称
して区別する）。同時増幅では、増幅すべき核酸の各々
に対するプライマーが容器内に同時に存在しなければな
らない。増幅工程終了時には、すべての核酸の濃度が指
数増加している。
る２種以上の核酸を同じ反応容器内で同時に増幅させる
ことが多い（本明細書ではこのことを「同時増幅」と称
して区別する）。同時増幅では、増幅すべき核酸の各々
に対するプライマーが容器内に同時に存在しなければな
らない。増幅工程終了時には、すべての核酸の濃度が指
数増加している。
【０００８】一般に、コピー数の多い核酸は、ＰＣＲ後
に高強度シグナルを与えるだけでなく、同じ検体中のコ
ピー数の少ない核酸の増幅から得られるシグナルを弱め
てしまう場合もある。このため、コピー数の少ない核酸
からのシグナルは隠れてしまい検出が困難になる恐れが
ある。偽陰性の結果が得られやすくなり、また発ガン性
状態が原因のＤＮＡやＨＩＶ−ＩのＤＮＡを検出するな
ど多くの場合において、このことは重大な結果を招くこ
とになろう。コピー数の少ない核酸のシグナルを増大さ
せるため、増幅試薬濃度が高められたが、これによって
増幅効率が常に向上するとは限らない。この方法では、
検定コストも増加してしまう。一般に、複数のプライマ
ー組を用いたコピー数の少ない核酸の同時増幅は、コピ
ー数の多い核酸のためにより困難となる。
に高強度シグナルを与えるだけでなく、同じ検体中のコ
ピー数の少ない核酸の増幅から得られるシグナルを弱め
てしまう場合もある。このため、コピー数の少ない核酸
からのシグナルは隠れてしまい検出が困難になる恐れが
ある。偽陰性の結果が得られやすくなり、また発ガン性
状態が原因のＤＮＡやＨＩＶ−ＩのＤＮＡを検出するな
ど多くの場合において、このことは重大な結果を招くこ
とになろう。コピー数の少ない核酸のシグナルを増大さ
せるため、増幅試薬濃度が高められたが、これによって
増幅効率が常に向上するとは限らない。この方法では、
検定コストも増加してしまう。一般に、複数のプライマ
ー組を用いたコピー数の少ない核酸の同時増幅は、コピ
ー数の多い核酸のためにより困難となる。
【０００９】このように、当該技術分野では、コピー数
の多い核酸の存在下でコピー数の少ない核酸を、どちら
も検出し易く且つ大きさのほぼ等しいシグナルを与える
ように増幅させる方法に対するニーズが非常に大きい。
の多い核酸の存在下でコピー数の少ない核酸を、どちら
も検出し易く且つ大きさのほぼ等しいシグナルを与える
ように増幅させる方法に対するニーズが非常に大きい。
【００１０】この課題を解決する方法の一つは、標的の
コピー数の少ない核酸に対するシグナルがコピー数の多
い核酸のシグナルと同等になるように、プライマー比率
を変える方法である。この方法では、コピー数の多い核
酸に対するプライマーの濃度を低下させなければならな
い。この方法にまつわる問題は、ＰＣＲ処理の制御が十
分には達成されないことである。
コピー数の少ない核酸に対するシグナルがコピー数の多
い核酸のシグナルと同等になるように、プライマー比率
を変える方法である。この方法では、コピー数の多い核
酸に対するプライマーの濃度を低下させなければならな
い。この方法にまつわる問題は、ＰＣＲ処理の制御が十
分には達成されないことである。
【００１１】コピー数の多い核酸に対するプライマーを
少量使用することによってＰＣＲを変調させると、その
核酸の増幅効率はＰＣＲ処理全体にわたり低下する。こ
れは、増幅を成功させるためには標的核酸（いずれのコ
ピー数のものでも）を最初の２〜３回のＰＣＲサイクル
で２倍にしなければならないので、非常に望ましくない
恐れがある。このような重要な初期サイクルで核酸の複
製に失敗すると、検体中に比較的高濃度で存在している
にもかかわらず核酸が増幅されない事態、いわゆる「不
発」を招くことがしばしばある。このため、プライマー
濃度だけを変えて得られるよりも高いＰＣＲ制御が必要
である。
少量使用することによってＰＣＲを変調させると、その
核酸の増幅効率はＰＣＲ処理全体にわたり低下する。こ
れは、増幅を成功させるためには標的核酸（いずれのコ
ピー数のものでも）を最初の２〜３回のＰＣＲサイクル
で２倍にしなければならないので、非常に望ましくない
恐れがある。このような重要な初期サイクルで核酸の複
製に失敗すると、検体中に比較的高濃度で存在している
にもかかわらず核酸が増幅されない事態、いわゆる「不
発」を招くことがしばしばある。このため、プライマー
濃度だけを変えて得られるよりも高いＰＣＲ制御が必要
である。
【００１２】同時増幅に対する別の方法は、コピー数の
多い核酸に対するプライマーがコピー数の少ない核酸に
対するプライマーよりも低速でアニールするようにＰＣ
Ｒにおけるアニーリング温度を調整する方法である。こ
の方法は、コピー数の多い核酸に対するプライマーのＴ
m よりも若干高い温度でアニールする方法を通常は意味
する。
多い核酸に対するプライマーがコピー数の少ない核酸に
対するプライマーよりも低速でアニールするようにＰＣ
Ｒにおけるアニーリング温度を調整する方法である。こ
の方法は、コピー数の多い核酸に対するプライマーのＴ
m よりも若干高い温度でアニールする方法を通常は意味
する。
【００１３】この方法にも問題がある。良好な変調（ま
たは「バイアス化」）にはプライマー対間のＴm 差が比
較的大きいことが必要である。また、コピー数の多い核
酸とコピー数の少ない核酸とでＰＣＲの収率に差がでる
場合もある。
たは「バイアス化」）にはプライマー対間のＴm 差が比
較的大きいことが必要である。また、コピー数の多い核
酸とコピー数の少ない核酸とでＰＣＲの収率に差がでる
場合もある。
【００１４】プライマーの正確なＴm は（概算は可能で
あるが）計算することができないので、これを測定しな
ければならない。当業者でここまで努力する人はおら
ず、代わりに実験を重ねてＰＣＲのアニーリング温度を
変更することで所望の結果を得ている。この作業は大変
であり、またコストもかかる。このため、ＰＣＲが活発
に進行し、しかも増幅されたコピー数の少ない核酸及び
コピー数の多い核酸からのシグナルを容易に調整できる
系の変調に大きな融通性を付与する同時増幅に対するニ
ーズがなおも存在している。
あるが）計算することができないので、これを測定しな
ければならない。当業者でここまで努力する人はおら
ず、代わりに実験を重ねてＰＣＲのアニーリング温度を
変更することで所望の結果を得ている。この作業は大変
であり、またコストもかかる。このため、ＰＣＲが活発
に進行し、しかも増幅されたコピー数の少ない核酸及び
コピー数の多い核酸からのシグナルを容易に調整できる
系の変調に大きな融通性を付与する同時増幅に対するニ
ーズがなおも存在している。
【００１５】既知の同時増幅法に対する上記問題をもた
らすことなく、同時増幅されるコピー数の多い核酸の存
在下で標的となるコピー数の少ない核酸に対する高く且
つ検出可能なシグナルを実現することが望まれる。
らすことなく、同時増幅されるコピー数の多い核酸の存
在下で標的となるコピー数の少ない核酸に対する高く且
つ検出可能なシグナルを実現することが望まれる。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明による核酸の同時
増幅法は、 Ａ）２種以上の標的核酸を含むと思われる試料を加熱す
る工程において、標的核酸の少なくとも１種はコピー数
の多い標的核酸であり、また標的核酸の少なくとも１種
はコピー数の少ない標的核酸であり、コピー数の多い標
的核酸はコピー数の少ない標的核酸よりも実質的に高濃
度で存在していると思われ、加熱は、コピー数の多い標
的核酸とコピー数の少ない標的核酸の鎖を変性させるた
めに８５〜１００℃の第一温度で１〜４０秒間実施され
る前記工程； Ｂ）５〜２０秒間かけて第二温度Ｔ2 へ冷却することに
よって、増幅すべきコピー数の少ない標的核酸及びコピ
ー数の多い標的核酸の各々に対する一組のプライマーで
変性鎖をプライムする工程において、Ｔ2 は、 （ＴmL−１５）℃≦Ｔ2 ≦（ＴmL＋５）℃ として規定され、ここでＴmLはコピー数の少ない標的核
酸に対するプライマーの融解温度である前記工程； Ｃ）１）溶液１００μｌ当たり少なくとも５ユニットの
量で存在する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及び ２）２種以上のデオキシリボヌクレオチド−５’−トリ
ホスフェートの存在下でプライマー伸長生成物を形成さ
せる工程において、前記生成物は第三温度Ｔ3において
１〜８０秒間インキュベートすることによって形成さ
れ、Ｔ3 は、 （ＴmL−１５）℃≦Ｔ3 ≦（ＴmL＋１５）℃ として規定され、プライムされていないコピー数の少な
い標的核酸の出発濃度に対するプライムされたコピー数
の少ない標的核酸の濃度の比率は０．９５〜０．５であ
り、またプライムされていないコピー数の多い標的核酸
の出発濃度に対するプライムされたコピー数の多い標的
核酸の濃度の比率は０．９５〜０．０１である前記工
程； Ｄ）５〜２０秒間かけて前記プライマー伸長生成物を前
記第一温度へ加熱して、その温度で前記生成物を１〜４
０秒間保持する工程；並びに Ｅ）前記工程Ｂ〜Ｄを１サイクルとして１回以上逐次繰
り返すが、その際工程Ｂ〜Ｄの各サイクルは２０〜９０
秒で実施する工程； を含んで成る。
増幅法は、 Ａ）２種以上の標的核酸を含むと思われる試料を加熱す
る工程において、標的核酸の少なくとも１種はコピー数
の多い標的核酸であり、また標的核酸の少なくとも１種
はコピー数の少ない標的核酸であり、コピー数の多い標
的核酸はコピー数の少ない標的核酸よりも実質的に高濃
度で存在していると思われ、加熱は、コピー数の多い標
的核酸とコピー数の少ない標的核酸の鎖を変性させるた
めに８５〜１００℃の第一温度で１〜４０秒間実施され
る前記工程； Ｂ）５〜２０秒間かけて第二温度Ｔ2 へ冷却することに
よって、増幅すべきコピー数の少ない標的核酸及びコピ
ー数の多い標的核酸の各々に対する一組のプライマーで
変性鎖をプライムする工程において、Ｔ2 は、 （ＴmL−１５）℃≦Ｔ2 ≦（ＴmL＋５）℃ として規定され、ここでＴmLはコピー数の少ない標的核
酸に対するプライマーの融解温度である前記工程； Ｃ）１）溶液１００μｌ当たり少なくとも５ユニットの
量で存在する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及び ２）２種以上のデオキシリボヌクレオチド−５’−トリ
ホスフェートの存在下でプライマー伸長生成物を形成さ
せる工程において、前記生成物は第三温度Ｔ3において
１〜８０秒間インキュベートすることによって形成さ
れ、Ｔ3 は、 （ＴmL−１５）℃≦Ｔ3 ≦（ＴmL＋１５）℃ として規定され、プライムされていないコピー数の少な
い標的核酸の出発濃度に対するプライムされたコピー数
の少ない標的核酸の濃度の比率は０．９５〜０．５であ
り、またプライムされていないコピー数の多い標的核酸
の出発濃度に対するプライムされたコピー数の多い標的
核酸の濃度の比率は０．９５〜０．０１である前記工
程； Ｄ）５〜２０秒間かけて前記プライマー伸長生成物を前
記第一温度へ加熱して、その温度で前記生成物を１〜４
０秒間保持する工程；並びに Ｅ）前記工程Ｂ〜Ｄを１サイクルとして１回以上逐次繰
り返すが、その際工程Ｂ〜Ｄの各サイクルは２０〜９０
秒で実施する工程； を含んで成る。
【００１７】ポリメラーゼ連鎖反応を利用した核酸の増
幅及び検出についての一般的な原理及び条件は非常によ
く知られている。
幅及び検出についての一般的な原理及び条件は非常によ
く知られている。
【００１８】本発明は、試験試料中の１種以上のコピー
数の少ない標的核酸において存在する１種以上の特定の
核酸配列を増幅または検出することに関する。これらの
核酸は、一般に低濃度で存在し、また当該技術分野では
検体中の他の核酸と比べて「コピー数の少ない」と認識
されているものである。一般に、コピー数の少ない標的
核酸は検体中に１０-16 モル未満の量で存在する。しか
しながら、その量は、「コピー数の多い」核酸がはるか
に多量に、例えば１０００倍以上の濃度で存在する場合
には、さらに高くなる場合もある。本発明によってまた
増幅される「コピー数の多い」標的核酸は、遺伝的異
常、感染性作因及びガンに一般に関連した核酸である。
このような核酸を増幅する一方で、本発明の意図は、そ
の高濃度効果を調節または抑制することで、コピー数の
少ない標的核酸をより容易に検出できるようにすること
にある。
数の少ない標的核酸において存在する１種以上の特定の
核酸配列を増幅または検出することに関する。これらの
核酸は、一般に低濃度で存在し、また当該技術分野では
検体中の他の核酸と比べて「コピー数の少ない」と認識
されているものである。一般に、コピー数の少ない標的
核酸は検体中に１０-16 モル未満の量で存在する。しか
しながら、その量は、「コピー数の多い」核酸がはるか
に多量に、例えば１０００倍以上の濃度で存在する場合
には、さらに高くなる場合もある。本発明によってまた
増幅される「コピー数の多い」標的核酸は、遺伝的異
常、感染性作因及びガンに一般に関連した核酸である。
このような核酸を増幅する一方で、本発明の意図は、そ
の高濃度効果を調節または抑制することで、コピー数の
少ない標的核酸をより容易に検出できるようにすること
にある。
【００１９】さらに、コピー数の多い標的核酸は検定に
おいて「正制御」として使用することができる。コピー
数の多い標的核酸のＰＣＲ効率を変調することによっ
て、反応系に存在しうるＰＣＲインヒビターに対して正
制御の感受性をより高めることができる。こうして、Ｐ
ＣＲが効率的に実施された場合にのみ正制御は検出可能
となるため、偽陽性の可能性が低減される。このような
場合、コピー数の多い標的核酸は、コピー数の少ない標
的核酸の１０倍以上の濃度で存在することができる。
おいて「正制御」として使用することができる。コピー
数の多い標的核酸のＰＣＲ効率を変調することによっ
て、反応系に存在しうるＰＣＲインヒビターに対して正
制御の感受性をより高めることができる。こうして、Ｐ
ＣＲが効率的に実施された場合にのみ正制御は検出可能
となるため、偽陽性の可能性が低減される。このような
場合、コピー数の多い標的核酸は、コピー数の少ない標
的核酸の１０倍以上の濃度で存在することができる。
【００２０】試験試料には、検出可能な遺伝子ＤＮＡま
たはＲＮＡを含有する細胞体やウイルス体、髪、体液ま
たはその他の材料が含まれうる。検出の主目的は元来診
断にあるが、本発明は、ＤＮＡやメッセンジャーＲＮＡ
のクローニング効率を改善するために使用することも、
或いは化学合成で得られた核酸混合物から所望の配列を
大量に得るために使用することも可能である。
たはＲＮＡを含有する細胞体やウイルス体、髪、体液ま
たはその他の材料が含まれうる。検出の主目的は元来診
断にあるが、本発明は、ＤＮＡやメッセンジャーＲＮＡ
のクローニング効率を改善するために使用することも、
或いは化学合成で得られた核酸混合物から所望の配列を
大量に得るために使用することも可能である。
【００２１】増幅すべき核酸は、何らかのソース（例え
ば、細菌、酵母、ウイルス、植物、高等動物またはヒ
ト）に由来するプラスミドや天然のＤＮＡまたはＲＮＡ
をはじめとする各種ソースから得ることができる。核酸
は、周知の手順を用いて、血液、末梢血液単核細胞（Ｐ
ＢＭＣ）、他の組織体、または当該技術分野で知られて
いる他のソースをはじめとする各種組織から抽出するこ
ともできる。本発明は、ゲノムＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、菌
類ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡまたは細菌やウイルスに感染
した細胞に見られるＤＮＡもしくはＲＮＡに存在する核
酸配列を増幅して検出するのに特に有用である。さら
に、本発明を利用して、ガンに関連した核酸を増幅して
検出することができる。
ば、細菌、酵母、ウイルス、植物、高等動物またはヒ
ト）に由来するプラスミドや天然のＤＮＡまたはＲＮＡ
をはじめとする各種ソースから得ることができる。核酸
は、周知の手順を用いて、血液、末梢血液単核細胞（Ｐ
ＢＭＣ）、他の組織体、または当該技術分野で知られて
いる他のソースをはじめとする各種組織から抽出するこ
ともできる。本発明は、ゲノムＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、菌
類ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡまたは細菌やウイルスに感染
した細胞に見られるＤＮＡもしくはＲＮＡに存在する核
酸配列を増幅して検出するのに特に有用である。さら
に、本発明を利用して、ガンに関連した核酸を増幅して
検出することができる。
【００２２】本発明に有用なプライマーは、いくつかの
ソースから入手することができるか、または周知の技法
や装置によって調製することができる。周知の技法及び
装置には、例えば、ＡＢＩ ＤＮＡシンセサイザー（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから入手可能）や、
Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ８６００シリーズまたは８８００
シリーズのシンセサイザー（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏ
ｓｅａｒｃｈ社から入手可能）、並びにそれらの（米国
特許出願第４，９６５，１８８号明細書に記載されてい
るような）周知の使用方法が含まれる。生物学的ソース
から単離された天然プライマーも有用である。本明細書
中の用語「プライマー」は、プライマー混合物をも意味
する。
ソースから入手することができるか、または周知の技法
や装置によって調製することができる。周知の技法及び
装置には、例えば、ＡＢＩ ＤＮＡシンセサイザー（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから入手可能）や、
Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ８６００シリーズまたは８８００
シリーズのシンセサイザー（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏ
ｓｅａｒｃｈ社から入手可能）、並びにそれらの（米国
特許出願第４，９６５，１８８号明細書に記載されてい
るような）周知の使用方法が含まれる。生物学的ソース
から単離された天然プライマーも有用である。本明細書
中の用語「プライマー」は、プライマー混合物をも意味
する。
【００２３】ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーと鋳型
の複合体においてデオキシリボヌクレオシドモノホスフ
ェート分子をプライマーの３’−ヒドロキシ末端へ付加
させる酵素であるが、この付加反応は鋳型依存性（すな
わち、鋳型中の特定のヌクレオチドに依存する）であ
る。有用なＤＮＡポリメラーゼには、例えばＥ．ｃｏｌ
ｉＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌ
ｅｎｏｗポリメラーゼ、逆転写酵素、及び当該技術分野
で知られている他のポリメラーゼが含まれる。
の複合体においてデオキシリボヌクレオシドモノホスフ
ェート分子をプライマーの３’−ヒドロキシ末端へ付加
させる酵素であるが、この付加反応は鋳型依存性（すな
わち、鋳型中の特定のヌクレオチドに依存する）であ
る。有用なＤＮＡポリメラーゼには、例えばＥ．ｃｏｌ
ｉＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌ
ｅｎｏｗポリメラーゼ、逆転写酵素、及び当該技術分野
で知られている他のポリメラーゼが含まれる。
【００２４】ＤＮＡポリメラーゼは「熱安定性」である
ことが好ましい。「熱安定性」とは、一般に熱に安定で
あり、しかもより高温で、とりわけＤＮＡ鎖の変性に使
われる高温で優先的に活性が高いという意味である。
ことが好ましい。「熱安定性」とは、一般に熱に安定で
あり、しかもより高温で、とりわけＤＮＡ鎖の変性に使
われる高温で優先的に活性が高いという意味である。
【００２５】当該技術分野では、いくつかの熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼが、米国特許出願第４，９６５，１８
８号及び同第４，８８９，８１８号明細書に記載されて
いるものをはじめとする各種文献に報告されている。特
に有用なポリメラーゼは、各種のサーマス（Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ）菌種から得られるものである。好ましい熱安定性
酵素は、サーマス アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス フィリフォルミス
（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、サーマス
フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）またはサ
ーマス サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ）から得られるＤＮＡポリメラーゼであ
る。
ＮＡポリメラーゼが、米国特許出願第４，９６５，１８
８号及び同第４，８８９，８１８号明細書に記載されて
いるものをはじめとする各種文献に報告されている。特
に有用なポリメラーゼは、各種のサーマス（Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ）菌種から得られるものである。好ましい熱安定性
酵素は、サーマス アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス フィリフォルミス
（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、サーマス
フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）またはサ
ーマス サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ）から得られるＤＮＡポリメラーゼであ
る。
【００２６】ＤＮＡポリメラーゼ補助因子は、酵素がそ
の活性のために必要としている非タンパク質性化合物を
意味する。有用な補助因子には、マンガンやマグネシウ
ムの塩、例えば塩化物、硫酸塩、酢酸塩及び脂肪酸塩な
どの塩が含まれるが、これらに限定はされない。塩化
物、硫酸塩及び酢酸塩などの小さい塩が好ましく、中で
も塩化マグネシウム及び硫酸マグネシウムが最も好まし
い。
の活性のために必要としている非タンパク質性化合物を
意味する。有用な補助因子には、マンガンやマグネシウ
ムの塩、例えば塩化物、硫酸塩、酢酸塩及び脂肪酸塩な
どの塩が含まれるが、これらに限定はされない。塩化
物、硫酸塩及び酢酸塩などの小さい塩が好ましく、中で
も塩化マグネシウム及び硫酸マグネシウムが最も好まし
い。
【００２７】ＰＣＲには、２種以上のデオキシリボヌク
レオシド−５’−トリホスフェート、例えばｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＵＴＰがさらに必
要である。ｄＩＴＰや７−デアザ−ｄＧＴＰなどの類似
体も有用である。ＰＣＲには４種の通常のトリホスフェ
ート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を
使用することが好ましい。
レオシド−５’−トリホスフェート、例えばｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＵＴＰがさらに必
要である。ｄＩＴＰや７−デアザ−ｄＧＴＰなどの類似
体も有用である。ＰＣＲには４種の通常のトリホスフェ
ート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を
使用することが好ましい。
【００２８】本明細書中に記載のＰＣＲ試薬は、検体中
に存在するコピー数の多い標的核酸の増幅を抑制し且つ
コピー数の少ない標的核酸を差別増幅するのに適した濃
度でＰＣＲに供与されて用いられる。
に存在するコピー数の多い標的核酸の増幅を抑制し且つ
コピー数の少ない標的核酸を差別増幅するのに適した濃
度でＰＣＲに供与されて用いられる。
【００２９】ＤＮＡポリメラーゼの最少量は、溶液１０
０μｌ当たり一般には５ユニット以上であるが、溶液１
００μｌ当たり１０〜２５ユニットであることが好まし
く、また７〜２０ユニットであるとさらに好ましい。こ
こで「ユニット」とは、７４℃において伸長している核
酸の中に３０分間に全部で１０ナノモルのヌクレオチド
（ｄＮＴＰ）を取り込ませるのに必要な酵素活性量とし
て定義される。
０μｌ当たり一般には５ユニット以上であるが、溶液１
００μｌ当たり１０〜２５ユニットであることが好まし
く、また７〜２０ユニットであるとさらに好ましい。こ
こで「ユニット」とは、７４℃において伸長している核
酸の中に３０分間に全部で１０ナノモルのヌクレオチド
（ｄＮＴＰ）を取り込ませるのに必要な酵素活性量とし
て定義される。
【００３０】コピー数の少ない標的核酸に対するプライ
マーの濃度は、プライムされていないコピー数の少ない
標的核酸の出発濃度に対するプライムされたコピー数の
少ない標的核酸の濃度の比率が０．９５〜０．５、好ま
しくは０．９〜０．８になるような濃度である。この幅
広い方の比率範囲は一般に０．１〜１０μモルのプライ
マー濃度に相当し、また狭い方の比率範囲は０．４〜２
μモルのプライマー濃度に相当する。
マーの濃度は、プライムされていないコピー数の少ない
標的核酸の出発濃度に対するプライムされたコピー数の
少ない標的核酸の濃度の比率が０．９５〜０．５、好ま
しくは０．９〜０．８になるような濃度である。この幅
広い方の比率範囲は一般に０．１〜１０μモルのプライ
マー濃度に相当し、また狭い方の比率範囲は０．４〜２
μモルのプライマー濃度に相当する。
【００３１】同様に増幅されるコピー数の多い標的核酸
に対するプライマーの濃度は、プライムされていないコ
ピー数の多い標的核酸の出発濃度に対するプライムされ
たコピー数の多い標的核酸の濃度の比率が０．９〜０．
０１、好ましくは０．５〜０．２５になるような濃度で
ある。この幅広い方の比率範囲は一般に０．０１〜０．
８μモルのプライマー濃度に相当する。好ましい実施態
様では、コピー数の多い標的核酸に対する各プライマー
濃度は０．１〜０．５μモルの範囲にある。
に対するプライマーの濃度は、プライムされていないコ
ピー数の多い標的核酸の出発濃度に対するプライムされ
たコピー数の多い標的核酸の濃度の比率が０．９〜０．
０１、好ましくは０．５〜０．２５になるような濃度で
ある。この幅広い方の比率範囲は一般に０．０１〜０．
８μモルのプライマー濃度に相当する。好ましい実施態
様では、コピー数の多い標的核酸に対する各プライマー
濃度は０．１〜０．５μモルの範囲にある。
【００３２】プライムされたコピー数の多い標的核酸ま
たはコピー数の少ない標的核酸のどちらの分率も、各プ
ライマーの相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を合成し、
そしてＰＣＲ法の一定時間、温度及び試薬条件のもと
で、ＵＶ淡色効果と常用の手順を利用してプライムされ
た相補体の量を測定することによって決定することがで
きる。
たはコピー数の少ない標的核酸のどちらの分率も、各プ
ライマーの相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を合成し、
そしてＰＣＲ法の一定時間、温度及び試薬条件のもと
で、ＵＶ淡色効果と常用の手順を利用してプライムされ
た相補体の量を測定することによって決定することがで
きる。
【００３３】反応混合物中、ＤＮＡポリメラーゼの補助
因子は一般に２〜１５ミリモルの量で存在し、また各ｄ
ＮＴＰは一般に０．２５〜３．５ミリモルで存在する。
因子は一般に２〜１５ミリモルの量で存在し、また各ｄ
ＮＴＰは一般に０．２５〜３．５ミリモルで存在する。
【００３４】ＰＣＲ試薬は、個別に供給してもよいし、
またｐＨ範囲が７〜９の緩衝液で供給してもよい。
またｐＨ範囲が７〜９の緩衝液で供給してもよい。
【００３５】コピー数の少ない標的核酸は、上記の様々
ないずれのソースからでも得ることができる。それは一
般に、プライマーやその他の反応物質との接触に利用で
きるようにする何らかの方法で抽出しなければならな
い。このことは、検体から望ましくないタンパク質や細
胞物質を適当な方法で除去することを通常は意味する。
当該技術分野では各種の手順が知られている。
ないずれのソースからでも得ることができる。それは一
般に、プライマーやその他の反応物質との接触に利用で
きるようにする何らかの方法で抽出しなければならな
い。このことは、検体から望ましくないタンパク質や細
胞物質を適当な方法で除去することを通常は意味する。
当該技術分野では各種の手順が知られている。
【００３６】増幅して検出すべきコピー数の少ない標的
核酸は２本鎖形態にあるのが普通なので、プライミング
が行える前に２本鎖を分離（すなわち、変性）しなけれ
ばならない。変性には、適当な温度（本明細書では「第
一温度」またはＴ1 と称して区別している）へ加熱する
方法が好ましい。一般に、この第一温度は、例えば１〜
４０秒の適当な時間に対して、８５〜１００℃の範囲に
ある。
核酸は２本鎖形態にあるのが普通なので、プライミング
が行える前に２本鎖を分離（すなわち、変性）しなけれ
ばならない。変性には、適当な温度（本明細書では「第
一温度」またはＴ1 と称して区別している）へ加熱する
方法が好ましい。一般に、この第一温度は、例えば１〜
４０秒の適当な時間に対して、８５〜１００℃の範囲に
ある。
【００３７】次いで、反応混合物を第二温度Ｔ2 へ冷却
することによって、適当な一組のプライマーを用いて変
性鎖をプライムする。このＴ2 は、 （ＴmL−１５）℃≦Ｔ2 ≦（ＴmL＋５）℃ として規定されるが、ここでＴmLはコピー数の少ない標
的核酸に対するプライマーの融解温度である。一般に、
Ｔ2 は５５〜７０℃の範囲内にある。冷却は、５〜２０
秒間、好ましくは５〜１５秒間かけて行う。好ましく
は、Ｔ2 は、 （ＴmL−５）℃≦Ｔ2 ≦（ＴmL＋２）℃ として規定され、６２〜６８℃のさらに狭い範囲にあ
る。
することによって、適当な一組のプライマーを用いて変
性鎖をプライムする。このＴ2 は、 （ＴmL−１５）℃≦Ｔ2 ≦（ＴmL＋５）℃ として規定されるが、ここでＴmLはコピー数の少ない標
的核酸に対するプライマーの融解温度である。一般に、
Ｔ2 は５５〜７０℃の範囲内にある。冷却は、５〜２０
秒間、好ましくは５〜１５秒間かけて行う。好ましく
は、Ｔ2 は、 （ＴmL−５）℃≦Ｔ2 ≦（ＴmL＋２）℃ として規定され、６２〜６８℃のさらに狭い範囲にあ
る。
【００３８】変性鎖をＴ2 まで冷却したならば、ＰＣＲ
試薬を含有する反応混合物を第三温度Ｔ3 で１〜８０秒
間、好ましくは１〜４０秒間インキュベートして、プラ
イマー伸長生成物を形成させる。一般に、Ｔ3 は、 （ＴmL−１５）℃≦Ｔ3 ≦（ＴmL＋１５）℃ として規定され、また５５〜７０℃の範囲にある。好ま
しくは、Ｔ3 は、 （ＴmL−５）℃≦Ｔ3 ≦（ＴmL＋２）℃ として規定され、また６２〜６８℃の範囲にある。
試薬を含有する反応混合物を第三温度Ｔ3 で１〜８０秒
間、好ましくは１〜４０秒間インキュベートして、プラ
イマー伸長生成物を形成させる。一般に、Ｔ3 は、 （ＴmL−１５）℃≦Ｔ3 ≦（ＴmL＋１５）℃ として規定され、また５５〜７０℃の範囲にある。好ま
しくは、Ｔ3 は、 （ＴmL−５）℃≦Ｔ3 ≦（ＴmL＋２）℃ として規定され、また６２〜６８℃の範囲にある。
【００３９】好ましいほとんどの実施態様では、Ｔ2 及
びＴ3 は同じであって６２〜６８℃の範囲にある。
びＴ3 は同じであって６２〜６８℃の範囲にある。
【００４０】さらにまた、コピー数の多い標的核酸に対
する各プライマーは、本明細書ではＴmHとして区別され
る融解温度を示す。ＴmLとＴmHの間の差ΔＴは２〜８℃
であり、Ｔ2 及びＴ3 はどちらもＴmLとＴmHの間にある
かまたはＴmL及びＴmHのいずれかに等しい。
する各プライマーは、本明細書ではＴmHとして区別され
る融解温度を示す。ＴmLとＴmHの間の差ΔＴは２〜８℃
であり、Ｔ2 及びＴ3 はどちらもＴmLとＴmHの間にある
かまたはＴmL及びＴmHのいずれかに等しい。
【００４１】本明細書では、融解温度（ＴmL及びＴmH）
は、相補鎖（例えば、鋳型）からプライマーの半分が変
性する温度として定義される。融解温度の測定は、例え
ば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆＣｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（第２版、Ｌｅｈｎｉｎ
ｇｅｒ，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎ
ｃ．，１９７０，ｐｐ．８７６−７）に記載されている
ように２６０ｎｍでスペクトルを監視することによっ
て、紫外線淡色効果に基づいた幾つかの標準的手順を用
いて達成することができる。融解温度の各種測定方法
は、同じＤＮＡ分子について若干異なる値を与えること
があるが、これらの値は互いに２〜３℃以上変動しては
ならない。
は、相補鎖（例えば、鋳型）からプライマーの半分が変
性する温度として定義される。融解温度の測定は、例え
ば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆＣｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（第２版、Ｌｅｈｎｉｎ
ｇｅｒ，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎ
ｃ．，１９７０，ｐｐ．８７６−７）に記載されている
ように２６０ｎｍでスペクトルを監視することによっ
て、紫外線淡色効果に基づいた幾つかの標準的手順を用
いて達成することができる。融解温度の各種測定方法
は、同じＤＮＡ分子について若干異なる値を与えること
があるが、これらの値は互いに２〜３℃以上変動しては
ならない。
【００４２】下式を用いて融解温度を計算することが好
ましい。 Ｔm （℃）＝６７．５＋０．３４（％Ｇ＋Ｃ）−３９５／Ｎ 上式中、「Ｇ」及び「Ｃ」はグアニンヌクレオチド及び
シトシンヌクレオチドをそれぞれ表し、また「Ｎ」はオ
リゴヌクレオチド（すなわち、プライマー）中のヌクレ
オチド総数を表す。この計算式で得られる融解温度は、
塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、
塩化ナトリウム及び当業者には明らかな他の塩のような
１種以上の無機または有機塩によってイオン強度を６０
ミリモル以上とした１０ミリモルのトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．５）に含まれる
プライマー溶液について常用のＵＶ淡色効果及び常用の
Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ製ダイオードアレイ分
光光度計（走査速度１℃／分）を用いて室温で実験的に
求められた値と非常によく相関する。上記融解温度式を
求めるために用いられたプライマー及びその相補体の溶
液中の量は、光学濃度０．５〜１．０（ＯＤ単位）を与
えるのに十分な量とした。
ましい。 Ｔm （℃）＝６７．５＋０．３４（％Ｇ＋Ｃ）−３９５／Ｎ 上式中、「Ｇ」及び「Ｃ」はグアニンヌクレオチド及び
シトシンヌクレオチドをそれぞれ表し、また「Ｎ」はオ
リゴヌクレオチド（すなわち、プライマー）中のヌクレ
オチド総数を表す。この計算式で得られる融解温度は、
塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、
塩化ナトリウム及び当業者には明らかな他の塩のような
１種以上の無機または有機塩によってイオン強度を６０
ミリモル以上とした１０ミリモルのトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．５）に含まれる
プライマー溶液について常用のＵＶ淡色効果及び常用の
Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ製ダイオードアレイ分
光光度計（走査速度１℃／分）を用いて室温で実験的に
求められた値と非常によく相関する。上記融解温度式を
求めるために用いられたプライマー及びその相補体の溶
液中の量は、光学濃度０．５〜１．０（ＯＤ単位）を与
えるのに十分な量とした。
【００４３】プライマー伸長生成物を形成させた後、反
応混合物を５〜２０秒間にわたりＴ 1 まで加熱し、そし
てその温度で１〜４０秒間維持する。これで増幅サイク
ルが完了する。
応混合物を５〜２０秒間にわたりＴ 1 まで加熱し、そし
てその温度で１〜４０秒間維持する。これで増幅サイク
ルが完了する。
【００４４】ＰＣＲは、一般には２０サイクル以上、好
ましくは２０〜５０サイクル実施する。各サイクルの時
間は、一般には２０〜９０秒、好ましくは３０〜７５秒
である。
ましくは２０〜５０サイクル実施する。各サイクルの時
間は、一般には２０〜９０秒、好ましくは３０〜７５秒
である。
【００４５】本発明の増幅法は、自動化された連続方式
で行って反応混合物を制御しながら所望の回数だけ温度
サイクルすることが好ましい。当業者であれば周知であ
るように、この目的のためにいくつかの器械や器具が開
発されている。このような器械や器具の一つが、米国特
許出願第４，９６５，１８８号及び欧州特許出願第０２
３６ ０６９号明細書に記載されている。
で行って反応混合物を制御しながら所望の回数だけ温度
サイクルすることが好ましい。当業者であれば周知であ
るように、この目的のためにいくつかの器械や器具が開
発されている。このような器械や器具の一つが、米国特
許出願第４，９６５，１８８号及び欧州特許出願第０２
３６ ０６９号明細書に記載されている。
【００４６】欧州特許出願第０ ４０２ ９９４号明細
書は、米国特許出願第５，０８９，２３３号明細書に記
載されている器械を用いて処理できる有用な化学テスト
用パックについて詳細に記載している。また、その中に
は、本発明の方法に適した間欠的に繰り返しテスト用パ
ックを加熱、冷却するための手段も記載されている。有
用なＰＣＲ処理装置に関するさらに詳細な記載は、当該
技術分野における相当の文献から得ることができ、また
当業者であれば容易に確認できるであろう。
書は、米国特許出願第５，０８９，２３３号明細書に記
載されている器械を用いて処理できる有用な化学テスト
用パックについて詳細に記載している。また、その中に
は、本発明の方法に適した間欠的に繰り返しテスト用パ
ックを加熱、冷却するための手段も記載されている。有
用なＰＣＲ処理装置に関するさらに詳細な記載は、当該
技術分野における相当の文献から得ることができ、また
当業者であれば容易に確認できるであろう。
【００４７】上記の化学テスト用パックの他に、米国特
許出願第４，９０２，６２４号、同第５，１７３，２６
０号及び同第５，２２９，２９７号明細書に詳細に記載
されているような別の容器内で本法を実施してもよい。
このようなテスト用パックは、増幅または検出法におけ
る各種段階で有用な各種の試薬、緩衝液及び他の物質を
含有する複数の反応室を有する。
許出願第４，９０２，６２４号、同第５，１７３，２６
０号及び同第５，２２９，２９７号明細書に詳細に記載
されているような別の容器内で本法を実施してもよい。
このようなテスト用パックは、増幅または検出法におけ
る各種段階で有用な各種の試薬、緩衝液及び他の物質を
含有する複数の反応室を有する。
【００４８】上記のように、本発明の方法を使用してコ
ピー数の少ない標的核酸の検出または特性決定が可能で
ある。米国特許出願第４，９６５，１８８号明細書に記
載されているようないくつかの周知の方法で検出を行う
ことができる。
ピー数の少ない標的核酸の検出または特性決定が可能で
ある。米国特許出願第４，９６５，１８８号明細書に記
載されているようないくつかの周知の方法で検出を行う
ことができる。
【００４９】一つの実施態様では、問題の核酸配列が所
望量得られてそのプライマー伸長生成物を最後に変性さ
せたならば、検出用に標識されており且つプライマー伸
長生成物の一方に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ
を用いて、先に増幅した標的核酸を検出する。標識の結
合手順やプローブの調製法は当該技術分野ではよく知ら
れており、例えば、ＡｇｒａｗａｌらのＮｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１４，ｐｐ．６２２７−４５
（１９８６）、ビオチン標識に関する米国特許出願第
４，９１４，２１０号明細書、酵素標識に関する米国特
許出願第４，９６２，０２９号明細書及びこれらの文献
中に引用されている文献などに記載されている。有用な
標識には、放射性同位元素、電子高密度試薬、色素源、
蛍光源、リン光部分、フェリチン及び他の磁気粒子（米
国特許出願第４，７９５，６９８号及び同第４，９２
０，０６１号明細書を参照されたい）、化学発光部分並
びに酵素（好ましい）が含まれる。有用な酵素には、グ
ルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカー
ゼ、アルカリホスファターゼ及び当該技術分野では周知
のその他が含まれる。このような酵素用の基質や色素形
成組成物もよく知られている。
望量得られてそのプライマー伸長生成物を最後に変性さ
せたならば、検出用に標識されており且つプライマー伸
長生成物の一方に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ
を用いて、先に増幅した標的核酸を検出する。標識の結
合手順やプローブの調製法は当該技術分野ではよく知ら
れており、例えば、ＡｇｒａｗａｌらのＮｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１４，ｐｐ．６２２７−４５
（１９８６）、ビオチン標識に関する米国特許出願第
４，９１４，２１０号明細書、酵素標識に関する米国特
許出願第４，９６２，０２９号明細書及びこれらの文献
中に引用されている文献などに記載されている。有用な
標識には、放射性同位元素、電子高密度試薬、色素源、
蛍光源、リン光部分、フェリチン及び他の磁気粒子（米
国特許出願第４，７９５，６９８号及び同第４，９２
０，０６１号明細書を参照されたい）、化学発光部分並
びに酵素（好ましい）が含まれる。有用な酵素には、グ
ルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカー
ゼ、アルカリホスファターゼ及び当該技術分野では周知
のその他が含まれる。このような酵素用の基質や色素形
成組成物もよく知られている。
【００５０】好ましい実施態様では、標的核酸を検出す
るために用いられる各プライマー組の一方または両方の
プライマーを特異的結合部分で標識する。特異的結合部
分は、プライマーの各々の組に対して同じであっても異
なってもよい。このような標識には、特異的結合部分と
特異的に反応するレセプター分子をはじめとする分子が
含まれる。特異的結合対（一方を標識してもよい）の例
として、アビジン／ビオチン、ストレプトアビジン／ビ
オチン、糖／レクチン、抗体／ハプテン、抗体／抗原、
及び当業者であれば明白であるその他、が含まれるが、
これらに限定はされない。次いで、周知の技法で、酵素
などの検出可能な標識部分とレセプターを複合させる。
るために用いられる各プライマー組の一方または両方の
プライマーを特異的結合部分で標識する。特異的結合部
分は、プライマーの各々の組に対して同じであっても異
なってもよい。このような標識には、特異的結合部分と
特異的に反応するレセプター分子をはじめとする分子が
含まれる。特異的結合対（一方を標識してもよい）の例
として、アビジン／ビオチン、ストレプトアビジン／ビ
オチン、糖／レクチン、抗体／ハプテン、抗体／抗原、
及び当業者であれば明白であるその他、が含まれるが、
これらに限定はされない。次いで、周知の技法で、酵素
などの検出可能な標識部分とレセプターを複合させる。
【００５１】最も好ましくは、各プライマー組の一方ま
たは両方のプライマーをビオチン（またはその等価な誘
導体）で標識し、そしてアビジン（またはストレプトア
ビジン）と酵素の複合体によって増幅したコピー数の少
ない標的核酸を検出する。
たは両方のプライマーをビオチン（またはその等価な誘
導体）で標識し、そしてアビジン（またはストレプトア
ビジン）と酵素の複合体によって増幅したコピー数の少
ない標的核酸を検出する。
【００５２】増幅した標的核酸を検出するために、それ
を反応媒体中の他の物質と分離することが有用な場合も
しばしばある（が、必ずしも必要ではない）。分離は、
水不溶性担体に共有結合されている捕捉プローブを有す
る捕捉試薬を用いる方法をはじめとするいくつかの方法
のいずれかによって行われる。
を反応媒体中の他の物質と分離することが有用な場合も
しばしばある（が、必ずしも必要ではない）。分離は、
水不溶性担体に共有結合されている捕捉プローブを有す
る捕捉試薬を用いる方法をはじめとするいくつかの方法
のいずれかによって行われる。
【００５３】捕捉プローブは、周知の結合技法によって
水不溶性担体に結合することができる。このような技法
の一つが欧州特許出願公開第０ ４３９ ２２２号明細
書に記載されている。他の技法が、例えば米国特許出願
第４，７１３，３２６号、同第４，９１４，２１０号及
び欧州特許第０ ０７０ ６８７号明細書に記載されて
いる。
水不溶性担体に結合することができる。このような技法
の一つが欧州特許出願公開第０ ４３９ ２２２号明細
書に記載されている。他の技法が、例えば米国特許出願
第４，７１３，３２６号、同第４，９１４，２１０号及
び欧州特許第０ ０７０ ６８７号明細書に記載されて
いる。
【００５４】捕捉試薬の特に有用な組合せが、例えばＪ
Ｐ−Ａ−０ ５０８ ８２３や米国特許出願第５，１７
３，２６０号明細書に記載されている。捕捉プローブを
同じタイプの高分子量粒子に（直接にまたは化学結合基
を介して）共有結合させ、そして得られた捕捉試薬を、
熱または超音波でシール可能な担体（例えば、シート、
膜、繊維状マット、フィルム）に固定化する。特に有用
なシール可能な担体の一つは、ポリエチレンテレフタレ
ートなどのポリエチレンとポリエステルのラミネートで
ある。捕捉試薬は、（上記のような）適当なテスト素子
の一部である水不溶性担体表面の区別された領域に配置
することができる。このようなテスト素子は、診断要素
として定義してもよい。例えば、担体表面に、各種捕捉
試薬の複数のストライプまたはスポットを配置すること
ができる。
Ｐ−Ａ−０ ５０８ ８２３や米国特許出願第５，１７
３，２６０号明細書に記載されている。捕捉プローブを
同じタイプの高分子量粒子に（直接にまたは化学結合基
を介して）共有結合させ、そして得られた捕捉試薬を、
熱または超音波でシール可能な担体（例えば、シート、
膜、繊維状マット、フィルム）に固定化する。特に有用
なシール可能な担体の一つは、ポリエチレンテレフタレ
ートなどのポリエチレンとポリエステルのラミネートで
ある。捕捉試薬は、（上記のような）適当なテスト素子
の一部である水不溶性担体表面の区別された領域に配置
することができる。このようなテスト素子は、診断要素
として定義してもよい。例えば、担体表面に、各種捕捉
試薬の複数のストライプまたはスポットを配置すること
ができる。
【００５５】
【実施例】以下の実施例では、特に断らない限りパーセ
ントはすべて重量％である。
ントはすべて重量％である。
【００５６】サーマス アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の組換えＤＮＡポリメラ
ーゼは、欧州特許出願公開第０ ４８２ ７１４号明細
書に記載されているような周知の手順によって調製した
ものであり、タンパク質１ｍｇ当たり２５０，０００ユ
ニットの活性を示した。このＤＮＡポリメラーゼを、反
応混合物１００μｌ当たり７．５〜８ユニットの量で使
用した。
ｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の組換えＤＮＡポリメラ
ーゼは、欧州特許出願公開第０ ４８２ ７１４号明細
書に記載されているような周知の手順によって調製した
ものであり、タンパク質１ｍｇ当たり２５０，０００ユ
ニットの活性を示した。このＤＮＡポリメラーゼを、反
応混合物１００μｌ当たり７．５〜８ユニットの量で使
用した。
【００５７】標準的ホスホルアミダイト化学及びＡＢＩ
１μモルスケールの高速サイクルプロトコールを採用
したＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３８０Ｂ
型の３本カラム式ＤＮＡ合成機によって、既知の出発と
手順を利用してプライマー及びプローブを調製した。ヌ
クレオシド−３’−ホスホルアミダイトとヌクレオシド
誘導体化気孔制御ガラス担体はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。プライマーは、下記の配
列を有するものとした。それらの５’末端を２個のテト
ラエチレングリコールスペーサーに続いて１個の市販の
（ＤｕＰｏｎｔ社製）ビオチンホスホルアミダイトで官
能化した。プローブは、米国特許出願第４，９１４，２
１０号明細書に従い、その３’末端を２個のテトラエチ
レングリコールスペーサーに続いて１個のアミノジオー
ル結合基によって官能化した。精製は、核酸精製用カラ
ムを使用した後に逆相ＨＰＬＣ技法を採用した。
１μモルスケールの高速サイクルプロトコールを採用
したＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３８０Ｂ
型の３本カラム式ＤＮＡ合成機によって、既知の出発と
手順を利用してプライマー及びプローブを調製した。ヌ
クレオシド−３’−ホスホルアミダイトとヌクレオシド
誘導体化気孔制御ガラス担体はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。プライマーは、下記の配
列を有するものとした。それらの５’末端を２個のテト
ラエチレングリコールスペーサーに続いて１個の市販の
（ＤｕＰｏｎｔ社製）ビオチンホスホルアミダイトで官
能化した。プローブは、米国特許出願第４，９１４，２
１０号明細書に従い、その３’末端を２個のテトラエチ
レングリコールスペーサーに続いて１個のアミノジオー
ル結合基によって官能化した。精製は、核酸精製用カラ
ムを使用した後に逆相ＨＰＬＣ技法を採用した。
【００５８】上記のＤＮＡポリメラーゼに特異的な「Ｔ
Ｐ４」モノクローナル抗体をＪＰ−Ａ−０ ２７４ ８
１２に記載されているように調製した。一般に、それは
ハイブリドーマセルライン（ＡＴＣＣのＨＢ１１１２６
または１１１２７）及びＭｉｌｓｔｅｉｎらのＮａｔｕ
ｒｅ ２５６，ｐｐ．４９５〜４９７，１９７５に記載
されているような常用手順を用いてＤＮＡポリメラーゼ
免疫化マウスの免疫細胞から調製した。この方法によ
り、宿主動物の抗体産生細胞をリンパ様組織（例えば、
脾臓）から単離し、ポリエチレングリコールの存在下で
ＳＰ２／０−Ａｇ１４ネズミミエローマ細胞と融合さ
せ、選択培地中で希釈し、そしてマルチウェル組織培養
皿内で平板培養した。７〜１４日後、抗体を含有するハ
イブリドーマ細胞を収穫し、そして常用技法で精製し
た。
Ｐ４」モノクローナル抗体をＪＰ−Ａ−０ ２７４ ８
１２に記載されているように調製した。一般に、それは
ハイブリドーマセルライン（ＡＴＣＣのＨＢ１１１２６
または１１１２７）及びＭｉｌｓｔｅｉｎらのＮａｔｕ
ｒｅ ２５６，ｐｐ．４９５〜４９７，１９７５に記載
されているような常用手順を用いてＤＮＡポリメラーゼ
免疫化マウスの免疫細胞から調製した。この方法によ
り、宿主動物の抗体産生細胞をリンパ様組織（例えば、
脾臓）から単離し、ポリエチレングリコールの存在下で
ＳＰ２／０−Ａｇ１４ネズミミエローマ細胞と融合さ
せ、選択培地中で希釈し、そしてマルチウェル組織培養
皿内で平板培養した。７〜１４日後、抗体を含有するハ
イブリドーマ細胞を収穫し、そして常用技法で精製し
た。
【００５９】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物
（１００ｍｌ）は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン緩衝液（１０ミリモル、ｐＨ８）、塩化カリウム
（５０ミリモル）、塩化マグネシウム（１０ミリモ
ル）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各
１．５モル）、プライマー（後記、特に表示しない限り
各１μモル）、ゼラチン（０．０１％）、上記熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼ（７．５〜８ユニット／１００ｍ
ｌ）、及びＴＰ４モノクローナル抗体（ＤＮＡポリメラ
ーゼに対する比率５０：１）を含有するものとした。
（１００ｍｌ）は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン緩衝液（１０ミリモル、ｐＨ８）、塩化カリウム
（５０ミリモル）、塩化マグネシウム（１０ミリモ
ル）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各
１．５モル）、プライマー（後記、特に表示しない限り
各１μモル）、ゼラチン（０．０１％）、上記熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼ（７．５〜８ユニット／１００ｍ
ｌ）、及びＴＰ４モノクローナル抗体（ＤＮＡポリメラ
ーゼに対する比率５０：１）を含有するものとした。
【００６０】ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡ（ｇａｇ領域）の増幅
及び検出のために実施例で使用したプライマーの配列は
以下のとおりである。 配列番号１：５’−Ｘ−ＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴ ＧＴＣ
ＴＴＡＴＧＴＣ ＣＡＧＡＡＴＧＣ−３’；及び 配列番号２：５’−Ｘ−ＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣ ＴＡＴ
ＣＣＣＡＧＴＡ ＧＧＡＧＡＡＡＴ−３’ 上式中、Ｘは、米国特許出願第４，９６２，０２９号明
細書に記載の手順によって２個のアミノテトラエチレン
グリコールスペーサー基を介してオリゴヌクレオチドに
結合されているビオチンを表す。
及び検出のために実施例で使用したプライマーの配列は
以下のとおりである。 配列番号１：５’−Ｘ−ＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴ ＧＴＣ
ＴＴＡＴＧＴＣ ＣＡＧＡＡＴＧＣ−３’；及び 配列番号２：５’−Ｘ−ＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣ ＴＡＴ
ＣＣＣＡＧＴＡ ＧＧＡＧＡＡＡＴ−３’ 上式中、Ｘは、米国特許出願第４，９６２，０２９号明
細書に記載の手順によって２個のアミノテトラエチレン
グリコールスペーサー基を介してオリゴヌクレオチドに
結合されているビオチンを表す。
【００６１】実施例２で用いたＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡ（ｇ
ａｇ領域）の増幅及び検出用プライマーは以下のとおり
である。 配列番号３：５’−Ｘ−ＣＴＡＡＡＧＧＧＴＴ ＣＣＴ
ＴＴＧＧＴＣＣ ＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧ ＴＣＣＡＧＡ
ＡＴＧＣ−３’；及び 配列番号４：５’−Ｘ−ＧＡＴＧＧＡＴＧＡＣ ＡＡＡ
ＴＡＡＴＣＣＡ ＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧ ＴＡＧＧＡＧ
ＡＡＡＴ−３’ 上式中、Ｘは先に定義したとおりである。
ａｇ領域）の増幅及び検出用プライマーは以下のとおり
である。 配列番号３：５’−Ｘ−ＣＴＡＡＡＧＧＧＴＴ ＣＣＴ
ＴＴＧＧＴＣＣ ＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧ ＴＣＣＡＧＡ
ＡＴＧＣ−３’；及び 配列番号４：５’−Ｘ−ＧＡＴＧＧＡＴＧＡＣ ＡＡＡ
ＴＡＡＴＣＣＡ ＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧ ＴＡＧＧＡＧ
ＡＡＡＴ−３’ 上式中、Ｘは先に定義したとおりである。
【００６２】どちらの実施例においてもβ−グロビンＤ
ＮＡの増幅及び検出用のプライマーは以下のとおりであ
る。 配列番号５：５’−Ｘ−ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣ ＣＡＣ
ＧＴＴＣＡＣＣ−３’；及び 配列番号６：５’−ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴ ＧＴＴＣＡ
ＣＴＡＧＣ−３’ 上式中、Ｘは先に定義したとおりである。
ＮＡの増幅及び検出用のプライマーは以下のとおりであ
る。 配列番号５：５’−Ｘ−ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣ ＣＡＣ
ＧＴＴＣＡＣＣ−３’；及び 配列番号６：５’−ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴ ＧＴＴＣＡ
ＣＴＡＧＣ−３’ 上式中、Ｘは先に定義したとおりである。
【００６３】アビジン−ペルオキシダーゼ複合体溶液
は、市販（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）
のアビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼの複合体（１
２６μｌ／ｌ）、カゼイン（０．５％）及びメルチオレ
ート（０．５％）をリン酸緩衝生食水（２５ミリモルの
リン酸ナトリウム及び７５ミリモルの塩化ナトリウム）
中に含むものとした。複合体の最終濃度は１５６ｎｇ／
ｍｌとした。
は、市販（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）
のアビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼの複合体（１
２６μｌ／ｌ）、カゼイン（０．５％）及びメルチオレ
ート（０．５％）をリン酸緩衝生食水（２５ミリモルの
リン酸ナトリウム及び７５ミリモルの塩化ナトリウム）
中に含むものとした。複合体の最終濃度は１５６ｎｇ／
ｍｌとした。
【００６４】洗浄液（ｐＨ７．４）は、第一リン酸ナト
リウム１水和物（２５ミリモル）、塩化ナトリウム（３
７３ミリモル）、（エチレンジニトリロ）４酢酸２ナト
リウム塩（２．５ミリモル）、エチルマーキュリチオサ
リチル酸ナトリウム塩（２５μモル）及びデシル硫酸ナ
トリウム（３８ミリモル）を含むものとした。
リウム１水和物（２５ミリモル）、塩化ナトリウム（３
７３ミリモル）、（エチレンジニトリロ）４酢酸２ナト
リウム塩（２．５ミリモル）、エチルマーキュリチオサ
リチル酸ナトリウム塩（２５μモル）及びデシル硫酸ナ
トリウム（３８ミリモル）を含むものとした。
【００６５】色素付与組成物（ｐＨ６．８）は、４，５
−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒ
ドロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾール（２５
０μモル）、ポリ（ビニルピロリドン）（１１２ミリモ
ル）、ジエチレントリアミン５酢酸（１００μモル）、
４’−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル）及び第
一リン酸ナトリウム１水和物（１０ミリモル）を含むも
のとした。
−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒ
ドロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾール（２５
０μモル）、ポリ（ビニルピロリドン）（１１２ミリモ
ル）、ジエチレントリアミン５酢酸（１００μモル）、
４’−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル）及び第
一リン酸ナトリウム１水和物（１０ミリモル）を含むも
のとした。
【００６６】ＨＩＶ−Ｉのコピー数の少ない標的核酸を
常用手順で８Ｅ５／ＬＡＶセルライン（ＨＩＶ−Ｉゲノ
ムが１個組み込まれているセルライン）から抽出し、そ
して細胞溶解とタンパク質消化に続いて、フェノール／
クロロホルム抽出法（トリス飽和フェノール（７５０μ
ｌ）を細胞懸濁液へ加えてフェノール／溶菌液を混合
し、そして遠心分離で分離）によって精製した。次い
で、その水相を２ｍｌの新たなチューブへ移した。クロ
ロホルムイソアミルアルコールを用いてこの手順を繰り
返した。水層を０．３モル酢酸ナトリウム溶液とした。
９５％の常温エタノールを添加して−７０℃で１時間保
存することによって核酸を沈殿させた。その後、ＨＩＶ
−Ｉ ＤＮＡの濃度をＡ260 において測定し、そして実
験用にＴＥ緩衝液〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン（１ミリモル）及び（エチレンジニトリロ）４酢
酸（０．１ミリモル）〕によるコピー数の異なる一連の
希釈液を調製した。各希釈液の試料（５〜１０μｌ）を
各ＰＣＲ反応混合物（２００μｌ）へ添加した。
常用手順で８Ｅ５／ＬＡＶセルライン（ＨＩＶ−Ｉゲノ
ムが１個組み込まれているセルライン）から抽出し、そ
して細胞溶解とタンパク質消化に続いて、フェノール／
クロロホルム抽出法（トリス飽和フェノール（７５０μ
ｌ）を細胞懸濁液へ加えてフェノール／溶菌液を混合
し、そして遠心分離で分離）によって精製した。次い
で、その水相を２ｍｌの新たなチューブへ移した。クロ
ロホルムイソアミルアルコールを用いてこの手順を繰り
返した。水層を０．３モル酢酸ナトリウム溶液とした。
９５％の常温エタノールを添加して−７０℃で１時間保
存することによって核酸を沈殿させた。その後、ＨＩＶ
−Ｉ ＤＮＡの濃度をＡ260 において測定し、そして実
験用にＴＥ緩衝液〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン（１ミリモル）及び（エチレンジニトリロ）４酢
酸（０．１ミリモル）〕によるコピー数の異なる一連の
希釈液を調製した。各希釈液の試料（５〜１０μｌ）を
各ＰＣＲ反応混合物（２００μｌ）へ添加した。
【００６７】細胞１個当たり２コピーのβ−グロビン遺
伝子を有すると仮定されているヒト胎盤ＤＮＡ（０．５
ｍｇ／ｍｌ）において、β−グロビンのコピー数の多い
標的核酸を得た。
伝子を有すると仮定されているヒト胎盤ＤＮＡ（０．５
ｍｇ／ｍｌ）において、β−グロビンのコピー数の多い
標的核酸を得た。
【００６８】ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡ用の捕捉プローブは以
下のとおりとした。 配列番号７：５’−ＡＴＣＣＴＧＧＡＡＴ ＴＡＡＡＴ
ＡＡＡＡＴ ＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧ ＴＡＴＡＧＣＣＣ
ＴＡ Ｃ−Ｙ−３’ 上式中、Ｙは２個のテトラエチレングリコールスペーサ
ーに続いて１個のアミンジオール結合基を含むものであ
る。
下のとおりとした。 配列番号７：５’−ＡＴＣＣＴＧＧＡＡＴ ＴＡＡＡＴ
ＡＡＡＡＴ ＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧ ＴＡＴＡＧＣＣＣ
ＴＡ Ｃ−Ｙ−３’ 上式中、Ｙは２個のテトラエチレングリコールスペーサ
ーに続いて１個のアミンジオール結合基を含むものであ
る。
【００６９】β−グロビンＤＮＡ用の捕捉プローブは以
下のとおりとした。 配列番号８：５’−ＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧ ＡＣＡＣＣ
ＡＴＧＧＴ ＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴ Ｃ−Ｙ−３’ 上式中、Ｙは先に定義したとおりである。
下のとおりとした。 配列番号８：５’−ＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧ ＡＣＡＣＣ
ＡＴＧＧＴ ＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴ Ｃ−Ｙ−３’ 上式中、Ｙは先に定義したとおりである。
【００７０】上記の捕捉プローブを以下の方法でポリ
〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロ
パン酸〕粒子（モル比９５：５、平均粒径１μｍ）に結
合することによって捕捉試薬を調製した。上記粒子の水
懸濁液を２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸緩
衝液（０．１モル、ｐＨ６）で２回洗浄し、そして固形
分が約１０％になるように懸濁させた。洗浄済粒子の試
料（３．３ｍｌ）を緩衝液（０．１モル）で固形分が
３．３３％になるように希釈し、そして１−（３−ジメ
チルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸
塩（水１ｍｌ当たり８４ｍｇのもの２．１ｍｌ）及び適
当なプローブ（ナノ純度水１ｍｌ当たり４４．４４ＯＤ
のもの９８３μｌ）と混合した。得られた懸濁液を、間
欠的に混合及び遠心分離を行いながら水浴中、５０℃に
２時間加熱した。（エチレンジニトリロ）４酢酸２ナト
リウム塩（０．０００１モル）を含むトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン緩衝液（０．０１モル、ｐＨ
８）で粒子を３回洗浄し、そして固形分が４％になるよ
うにその緩衝液に再懸濁させた。希釈して固形分を０．
２５％としてから、米国特許出願第４，９４８，５６１
号明細書に記載されているようなＳＵＲＥＣＥＬＬ（商
品名）ディスポーザブルテスト素子（Ｅａｓｔｍａｎ
Ｋｏｄａｋ社より市販）のテストウェルにおける微孔質
膜（Ｐａｌｌ社製のＬＯＰＲＯＤＹＮＥ（商品名）ポリ
アミド膜、平均孔径５μｍ）の画定された領域において
捕捉試薬を適用（１．２μｌ）して乾燥させた。
〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロ
パン酸〕粒子（モル比９５：５、平均粒径１μｍ）に結
合することによって捕捉試薬を調製した。上記粒子の水
懸濁液を２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸緩
衝液（０．１モル、ｐＨ６）で２回洗浄し、そして固形
分が約１０％になるように懸濁させた。洗浄済粒子の試
料（３．３ｍｌ）を緩衝液（０．１モル）で固形分が
３．３３％になるように希釈し、そして１−（３−ジメ
チルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸
塩（水１ｍｌ当たり８４ｍｇのもの２．１ｍｌ）及び適
当なプローブ（ナノ純度水１ｍｌ当たり４４．４４ＯＤ
のもの９８３μｌ）と混合した。得られた懸濁液を、間
欠的に混合及び遠心分離を行いながら水浴中、５０℃に
２時間加熱した。（エチレンジニトリロ）４酢酸２ナト
リウム塩（０．０００１モル）を含むトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン緩衝液（０．０１モル、ｐＨ
８）で粒子を３回洗浄し、そして固形分が４％になるよ
うにその緩衝液に再懸濁させた。希釈して固形分を０．
２５％としてから、米国特許出願第４，９４８，５６１
号明細書に記載されているようなＳＵＲＥＣＥＬＬ（商
品名）ディスポーザブルテスト素子（Ｅａｓｔｍａｎ
Ｋｏｄａｋ社より市販）のテストウェルにおける微孔質
膜（Ｐａｌｌ社製のＬＯＰＲＯＤＹＮＥ（商品名）ポリ
アミド膜、平均孔径５μｍ）の画定された領域において
捕捉試薬を適用（１．２μｌ）して乾燥させた。
【００７１】個々の試薬と溶液のためのチャンバーを含
むディスポーザブルの化学テスト用パックにおいてＰＣ
Ｒを実施した。これらのチャンバーは、ポリエチレンを
被覆したポリエステルシート（厚さ０．０１ｃｍ）から
形成されており、直径１．３ｃｍの環状チャンバーとす
るために折り曲げられたものである。ＰＣＲ試薬混合物
を添加してそれを真空によりチャンバーへ引き込むため
に開口部を設けた。その後、開口部をヒートシールし
た。増幅後、チャンバーの角部を切断し、そして反応混
合物を、生成物の検出を実施するまで４℃で保存するた
めのミクロ遠心管へ移した。以下に記載の加熱及び冷却
プロトコールのサイクルを採用し、米国特許出願第５，
０８９，２３３号明細書に詳しく記載されているＫｏｄ
ａｋ製自動ＰＣＲ処理機でＰＣＲプロトコールを実施し
た。
むディスポーザブルの化学テスト用パックにおいてＰＣ
Ｒを実施した。これらのチャンバーは、ポリエチレンを
被覆したポリエステルシート（厚さ０．０１ｃｍ）から
形成されており、直径１．３ｃｍの環状チャンバーとす
るために折り曲げられたものである。ＰＣＲ試薬混合物
を添加してそれを真空によりチャンバーへ引き込むため
に開口部を設けた。その後、開口部をヒートシールし
た。増幅後、チャンバーの角部を切断し、そして反応混
合物を、生成物の検出を実施するまで４℃で保存するた
めのミクロ遠心管へ移した。以下に記載の加熱及び冷却
プロトコールのサイクルを採用し、米国特許出願第５，
０８９，２３３号明細書に詳しく記載されているＫｏｄ
ａｋ製自動ＰＣＲ処理機でＰＣＲプロトコールを実施し
た。
【００７２】ＰＣＲ反応混合物は、コピー数の少ないＨ
ＩＶ−Ｉ標的核酸２５コピーとコピー数の多いβ−グロ
ビン標的核酸約１００万コピーとを含有した。
ＩＶ−Ｉ標的核酸２５コピーとコピー数の多いβ−グロ
ビン標的核酸約１００万コピーとを含有した。
【００７３】ＳＵＲＥＣＥＬＬ（商品名）テスト素子を
用いた増幅生成物の検出は、増幅生成物反応混合物の一
部（５μｌ）を緩衝液（１０ミリモルのリン酸２水素ナ
トリウム、１５０ミリモルの塩化ナトリウム及び１ミリ
モルのエチレンジアミン４酢酸、ｐＨ７．４）（９５μ
ｌ）と混合し、９５℃で５分間インキュベートして核酸
を変性させることによって実施した。次いで、得られた
溶液をＳＵＲＥＣＥＬＬ（商品名）テスト素子へ移し、
膜表面に固定化した捕捉試薬と増幅した標的核酸を５０
℃でハイブリダイズさせた。上記の緩衝液中にデシル硫
酸ナトリウム（１％）を含む溶液でテスト素子のテスト
ウェルを５５℃で洗浄した。各テストウェルへアビジン
−ペルオキシダーゼ複合体溶液（５０μｌ）を添加し、
室温で膜中を流動させた。２分後、テストウェルを再度
洗浄した。色素付与組成物（１００μｌ）を添加し、そ
して素子を室温で２分間インキュベートした。アジ化ナ
トリウム（０．１％）の溶液（１００μｌ）を添加して
発色を停止させ、そして得られた色素シグナルを０〜１
０（最高濃度）の濃度スケールを基準に目測で等級付け
した。膜表面の捕捉試薬が付着していない領域からバッ
クグラウンドの読みを得た。
用いた増幅生成物の検出は、増幅生成物反応混合物の一
部（５μｌ）を緩衝液（１０ミリモルのリン酸２水素ナ
トリウム、１５０ミリモルの塩化ナトリウム及び１ミリ
モルのエチレンジアミン４酢酸、ｐＨ７．４）（９５μ
ｌ）と混合し、９５℃で５分間インキュベートして核酸
を変性させることによって実施した。次いで、得られた
溶液をＳＵＲＥＣＥＬＬ（商品名）テスト素子へ移し、
膜表面に固定化した捕捉試薬と増幅した標的核酸を５０
℃でハイブリダイズさせた。上記の緩衝液中にデシル硫
酸ナトリウム（１％）を含む溶液でテスト素子のテスト
ウェルを５５℃で洗浄した。各テストウェルへアビジン
−ペルオキシダーゼ複合体溶液（５０μｌ）を添加し、
室温で膜中を流動させた。２分後、テストウェルを再度
洗浄した。色素付与組成物（１００μｌ）を添加し、そ
して素子を室温で２分間インキュベートした。アジ化ナ
トリウム（０．１％）の溶液（１００μｌ）を添加して
発色を停止させ、そして得られた色素シグナルを０〜１
０（最高濃度）の濃度スケールを基準に目測で等級付け
した。膜表面の捕捉試薬が付着していない領域からバッ
クグラウンドの読みを得た。
【００７４】実施例２では、エチジウムブロマイド（４
μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ）で予め染色しておいたアガロー
スゲル（４％）へ増幅生成物の混合物（６．７５μｌ）
を添加することによってゲル電気泳動を実施した。エチ
ジウムブロマイド（２４μｌ）を含有する電気泳動緩衝
液（６００ｍｌ）を用いて約１６０ボルト／ｃｍで約１
時間電気泳動した。緩衝液はトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタンと、ホウ酸塩と、エチレンジアミン４
酢酸との混合物とした。得られたバンドを分子量マーカ
ーと比較し、そして生成物のバンド強度を０〜５のスケ
ールで記録（ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡについては１２９マ
ー、そしてβ−グロビンＤＮＡについては１１０マー）
した。ここで０は検出不能のシグナルを、また５は最高
シグナルを表す。
μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ）で予め染色しておいたアガロー
スゲル（４％）へ増幅生成物の混合物（６．７５μｌ）
を添加することによってゲル電気泳動を実施した。エチ
ジウムブロマイド（２４μｌ）を含有する電気泳動緩衝
液（６００ｍｌ）を用いて約１６０ボルト／ｃｍで約１
時間電気泳動した。緩衝液はトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタンと、ホウ酸塩と、エチレンジアミン４
酢酸との混合物とした。得られたバンドを分子量マーカ
ーと比較し、そして生成物のバンド強度を０〜５のスケ
ールで記録（ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡについては１２９マ
ー、そしてβ−グロビンＤＮＡについては１１０マー）
した。ここで０は検出不能のシグナルを、また５は最高
シグナルを表す。
【００７５】テスト用パックで実施したＰＣＲプロトコ
ールは以下のとおりである。（Ａ）最初に核酸を９５℃
で３分間変性させ、そして（Ｂ）以下の１〜３、（１）
１０〜１２秒間かけて６４〜６８℃へ冷却し、（２）６
４〜６８℃において表記の時間に従いプライマー伸長生
成物を形成させ、そして（３）平均６〜７秒間かけて９
５℃へ加熱する を４０サイクル繰り返す。
ールは以下のとおりである。（Ａ）最初に核酸を９５℃
で３分間変性させ、そして（Ｂ）以下の１〜３、（１）
１０〜１２秒間かけて６４〜６８℃へ冷却し、（２）６
４〜６８℃において表記の時間に従いプライマー伸長生
成物を形成させ、そして（３）平均６〜７秒間かけて９
５℃へ加熱する を４０サイクル繰り返す。
【００７６】実施例１：様々なプライマー濃度を使用し
たＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡとβ−グロビンＤＮＡの同時増幅
法 この実施例は、コピー数の多い標的核酸（β−グロビン
ＤＮＡ）が存在する場合に、コピー数の少ない標的核酸
（ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡ）を、両方の標的核酸のプライマ
ー濃度を操作することによって検出する本発明の実施を
例示するものである。その上、プライマー濃度の効果を
観測することができるように、６５℃におけるプライマ
ー伸長生成物の形成に用いられる時間の長さを変更し
た。以下の表１に示した結果にあるように、ＰＣＲサイ
クルを高速にすると（すなわち、プライマー伸長時間を
短くすると）、コピー数の多い標的核酸の増幅効率を低
下させることができるので、そのシグナルが弱まり、そ
の結果増幅されたコピー数の少ない標的核酸がわかり易
くなる。
たＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡとβ−グロビンＤＮＡの同時増幅
法 この実施例は、コピー数の多い標的核酸（β−グロビン
ＤＮＡ）が存在する場合に、コピー数の少ない標的核酸
（ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡ）を、両方の標的核酸のプライマ
ー濃度を操作することによって検出する本発明の実施を
例示するものである。その上、プライマー濃度の効果を
観測することができるように、６５℃におけるプライマ
ー伸長生成物の形成に用いられる時間の長さを変更し
た。以下の表１に示した結果にあるように、ＰＣＲサイ
クルを高速にすると（すなわち、プライマー伸長時間を
短くすると）、コピー数の多い標的核酸の増幅効率を低
下させることができるので、そのシグナルが弱まり、そ
の結果増幅されたコピー数の少ない標的核酸がわかり易
くなる。
【００７７】上記のプライマー（各１μモル）を用いる
とＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡとβ−グロビンＤＮＡとが両方共
に増幅された。その結果から、コピー数の多い標的核酸
の増幅抑制レベルがプライマー伸長時間を短縮するにつ
れて増大したことがわかる。その上、β−グロビンＤＮ
Ａ用プライマー濃度をＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡ用プライマー
濃度の２．５倍以上低くすると、ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡの
増幅がより効率的に進行した。プライマー伸長時間のす
べてにおいて、β−グロビン用プライマー濃度は、コピ
ー数の多い標的核酸が効率よく増幅されない濃度以下で
観測された。コピー数の多い標的核酸の増幅は、プライ
マー伸長時間が短い（すなわち、約８０秒未満）場合に
プライマー濃度に対する感受性がより高くなった。
とＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡとβ−グロビンＤＮＡとが両方共
に増幅された。その結果から、コピー数の多い標的核酸
の増幅抑制レベルがプライマー伸長時間を短縮するにつ
れて増大したことがわかる。その上、β−グロビンＤＮ
Ａ用プライマー濃度をＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡ用プライマー
濃度の２．５倍以上低くすると、ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡの
増幅がより効率的に進行した。プライマー伸長時間のす
べてにおいて、β−グロビン用プライマー濃度は、コピ
ー数の多い標的核酸が効率よく増幅されない濃度以下で
観測された。コピー数の多い標的核酸の増幅は、プライ
マー伸長時間が短い（すなわち、約８０秒未満）場合に
プライマー濃度に対する感受性がより高くなった。
【００７８】
【表１】
【００７９】実施例２：様々な融解温度のプライマーを
用いた同時増幅 この実施例は、様々なＴm 値を有するプライマーを用い
てコピー数の多い標的核酸に対するＰＣＲ効率を変調
（すなわち、低下）させるための本発明の実施を例示す
るものである。それゆえ、コピー数の多い標的核酸に対
するプライマーのＴm よりも高い温度でプライマー伸長
を実施することによってＰＣＲ効率は低下する。本発明
の条件下、すなわち高速ＰＣＲサイクル（例、２０秒の
プライマー伸長）では、ＰＣＲ効率の変調効果は増大す
る。
用いた同時増幅 この実施例は、様々なＴm 値を有するプライマーを用い
てコピー数の多い標的核酸に対するＰＣＲ効率を変調
（すなわち、低下）させるための本発明の実施を例示す
るものである。それゆえ、コピー数の多い標的核酸に対
するプライマーのＴm よりも高い温度でプライマー伸長
を実施することによってＰＣＲ効率は低下する。本発明
の条件下、すなわち高速ＰＣＲサイクル（例、２０秒の
プライマー伸長）では、ＰＣＲ効率の変調効果は増大す
る。
【００８０】この実施例では、ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡは２
５コピー存在し、またβ−グロビンＤＮＡは約１０6 コ
ピー存在した。β−グロビンに対するプライマー（配列
番号５及び配列番号６）は、それぞれ６４．５℃及び６
７℃のＴm 値を示した。ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡのプライマ
ー（配列番号３及び配列番号４）は、それぞれ７２℃及
び７４℃のＴm 値を示した。各プライマーは、ＰＣＲ混
合物中に１μモル存在し、また７．５ユニット／１００
μｌのＤＮＡポリメラーゼを使用した。上記のプロトコ
ールに従いＰＣＲを実施した。
５コピー存在し、またβ−グロビンＤＮＡは約１０6 コ
ピー存在した。β−グロビンに対するプライマー（配列
番号５及び配列番号６）は、それぞれ６４．５℃及び６
７℃のＴm 値を示した。ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡのプライマ
ー（配列番号３及び配列番号４）は、それぞれ７２℃及
び７４℃のＴm 値を示した。各プライマーは、ＰＣＲ混
合物中に１μモル存在し、また７．５ユニット／１００
μｌのＤＮＡポリメラーゼを使用した。上記のプロトコ
ールに従いＰＣＲを実施した。
【００８１】結果を以下の表２に示す。色素濃度シグナ
ル及びゲル電気泳動の結果が示すように、別々の反応に
おいてどちらの標的核酸もより低いプライマー伸長温度
（６４〜６６℃）で増幅された。しかしながら、そのよ
うな温度では、「高速」（すなわち、プライマー伸長時
間２０秒）サイクル条件と「低速」（すなわち、プライ
マー伸長時間１２０秒）サイクル条件のどちらにおいて
も、コピー数の多い標的核酸からのシグナルが強すぎる
ものとなった。
ル及びゲル電気泳動の結果が示すように、別々の反応に
おいてどちらの標的核酸もより低いプライマー伸長温度
（６４〜６６℃）で増幅された。しかしながら、そのよ
うな温度では、「高速」（すなわち、プライマー伸長時
間２０秒）サイクル条件と「低速」（すなわち、プライ
マー伸長時間１２０秒）サイクル条件のどちらにおいて
も、コピー数の多い標的核酸からのシグナルが強すぎる
ものとなった。
【００８２】プライマー伸長温度を６７〜６８℃へ上昇
させると、コピー数の多い標的核酸からのシグナルが
「低速」サイクル条件下では若干低下した。「高速」サ
イクル条件下では、コピー数の多い標的核酸からのシグ
ナルが著しく低下した。６８℃では、β−グロビンＤＮ
Ａに対するゲルバンドは検出できなかった。
させると、コピー数の多い標的核酸からのシグナルが
「低速」サイクル条件下では若干低下した。「高速」サ
イクル条件下では、コピー数の多い標的核酸からのシグ
ナルが著しく低下した。６８℃では、β−グロビンＤＮ
Ａに対するゲルバンドは検出できなかった。
【００８３】「低速」サイクル条件下で２種の標的核酸
を同じ反応混合物中で増幅（すなわち、同時増幅）させ
た場合、温度範囲全体にわたりどちらに対しても増幅は
効率的に見え、またどちらの核酸も他方に有意な影響を
及ぼすことはなかったようである。プライマー伸長温度
を上昇させると、ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡのシグナル（ゲル
バンド強度）は若干高くなるが、β−グロビンＤＮＡの
シグナルは低下した。６８℃では、２種の信号は一般に
同等であった。
を同じ反応混合物中で増幅（すなわち、同時増幅）させ
た場合、温度範囲全体にわたりどちらに対しても増幅は
効率的に見え、またどちらの核酸も他方に有意な影響を
及ぼすことはなかったようである。プライマー伸長温度
を上昇させると、ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡのシグナル（ゲル
バンド強度）は若干高くなるが、β−グロビンＤＮＡの
シグナルは低下した。６８℃では、２種の信号は一般に
同等であった。
【００８４】２種の核酸を「高速」サイクル条件下、６
４℃で増幅させると、ＨＩＶ−ＩＤＮＡの増幅効率は、
ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡの色素または電気泳動シグナルがま
ったく検出できないほど低下した。プライマー伸長温度
を６７℃まで上昇させると、ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡのシグ
ナルが着実に増大し且つβ−グロビンＤＮＡのシグナル
が低下するためこれらのシグナルは実質的に同等となっ
た。プライマー伸長温度を６８℃にすると、β−グロビ
ンＤＮＡのシグナルは完全に消えるので、ＨＩＶ−Ｉ
ＤＮＡのシグナルがわかりやすくなった。
４℃で増幅させると、ＨＩＶ−ＩＤＮＡの増幅効率は、
ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡの色素または電気泳動シグナルがま
ったく検出できないほど低下した。プライマー伸長温度
を６７℃まで上昇させると、ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡのシグ
ナルが着実に増大し且つβ−グロビンＤＮＡのシグナル
が低下するためこれらのシグナルは実質的に同等となっ
た。プライマー伸長温度を６８℃にすると、β−グロビ
ンＤＮＡのシグナルは完全に消えるので、ＨＩＶ−Ｉ
ＤＮＡのシグナルがわかりやすくなった。
【００８５】
【表２】
【００８６】
【発明の効果】本発明は、特にコピー数の少ない標的核
酸に対するシグナルを潜在的にあいまいにしてしまう恐
れのあるコピー数の多い核酸の存在下で、コピー数の少
ない核酸を優先的に増幅して検出するための非常に高速
で且つ効率の高い方法を提供する。本発明の方法は高速
であるため、通常達成しうる時間よりも短時間で結果を
得ることができる。アニーリングする時間を短縮するこ
とによって、ＰＣＲにおけるプライマー比率の変更やプ
ライマーのＴm の調整といった利益が増大する。この特
徴の組合せによって本発明の方法のいずれの特徴に対す
る感受性も非常に高くなる。一度方法を開始するとプラ
イマー濃度やプライマーのＴm 値よりもＰＣＲの温度条
件や時間条件の方が容易に変更できるので、さらに別の
融通性が得られる。加えて、ＤＮＡポリメラーゼ及びプ
ライマーの濃度が臨界的に規定され、またアニーリング
（第二）温度はコピー数の多い核酸のプライミング効率
を低下させるような温度である。この特徴の組合せによ
って、上記の問題が克服され、また検体中にコピー数の
多い核酸が存在しているにも係わらず、コピー数の少な
い標的核酸を効果的且つ高速に同時増幅して検出するこ
とができる。
酸に対するシグナルを潜在的にあいまいにしてしまう恐
れのあるコピー数の多い核酸の存在下で、コピー数の少
ない核酸を優先的に増幅して検出するための非常に高速
で且つ効率の高い方法を提供する。本発明の方法は高速
であるため、通常達成しうる時間よりも短時間で結果を
得ることができる。アニーリングする時間を短縮するこ
とによって、ＰＣＲにおけるプライマー比率の変更やプ
ライマーのＴm の調整といった利益が増大する。この特
徴の組合せによって本発明の方法のいずれの特徴に対す
る感受性も非常に高くなる。一度方法を開始するとプラ
イマー濃度やプライマーのＴm 値よりもＰＣＲの温度条
件や時間条件の方が容易に変更できるので、さらに別の
融通性が得られる。加えて、ＤＮＡポリメラーゼ及びプ
ライマーの濃度が臨界的に規定され、またアニーリング
（第二）温度はコピー数の多い核酸のプライミング効率
を低下させるような温度である。この特徴の組合せによ
って、上記の問題が克服され、また検体中にコピー数の
多い核酸が存在しているにも係わらず、コピー数の少な
い標的核酸を効果的且つ高速に同時増幅して検出するこ
とができる。
【００８７】
配列番号：１ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC 28
【００８８】配列番号：２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT 28
【００８９】配列番号：３ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 CTAAAGGGTT CCTTTGGTCC TTGTCTTATG TCCAGAATGC 40
【００９０】配列番号：４ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 GATGGATGAC AAATAATCCA CCTATCCCAG TAGGAGAAAT 40
【００９１】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 CAACTTCATC CACGTTCACC 20
【００９２】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 ACACAACTGT GTTCACTAGC 20
【００９３】配列番号：７ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 ATCCTGGAAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C 41
【００９４】配列番号：８ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT C 31
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョン ブルース フィンドレイ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14612, ロチェスター，クロスローズ レーン 148 (72)発明者 ジョン ウィリアム エイチ．サザーラン ド アメリカ合衆国，ニューヨーク 14620, ロチェスター，カルバー ロード 57 (72)発明者 マーレン エム．キング アメリカ合衆国，ニューヨーク 14526, ペンフィールド，ゲッパート ロード 28
Claims (1)
- 【請求項１】 Ａ）２種以上の標的核酸を含むと思われ
る試料を加熱する工程において、標的核酸の少なくとも
１種はコピー数の多い標的核酸であり、また標的核酸の
少なくとも１種はコピー数の少ない標的核酸であり、コ
ピー数の多い標的核酸はコピー数の少ない標的核酸より
も実質的に高濃度で存在していると思われ、加熱は、コ
ピー数の多い標的核酸とコピー数の少ない標的核酸の鎖
を変性させるために８５〜１００℃の第一温度で１〜４
０秒間実施される前記工程； Ｂ）５〜２０秒間かけて第二温度Ｔ2 へ冷却することに
よって、各標的核酸に対する一組のプライマーで変性鎖
をプライムする工程において、Ｔ2 は、 （ＴmL−１５）℃≦Ｔ2 ≦（ＴmL＋５）℃ として規定され、ここでＴmLはコピー数の少ない標的核
酸に対するプライマーの融解温度である前記工程； Ｃ）１）溶液１００μｌ当たり少なくとも５ユニットの
量で存在する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及び ２）２種以上のデオキシリボヌクレオチド−５’−トリ
ホスフェートの存在下でプライマー伸長生成物を形成さ
せる工程において、前記生成物は第三温度Ｔ3において
１〜８０秒間インキュベートすることによって形成さ
れ、Ｔ3 は、 （ＴmL−１５）℃≦Ｔ3 ≦（ＴmL＋１５）℃ として規定され、プライムされていないコピー数の少な
い標的核酸の出発濃度に対するプライムされたコピー数
の少ない標的核酸の濃度の比率は０．９５〜０．５であ
り、またプライムされていないコピー数の多い標的核酸
の出発濃度に対するプライムされたコピー数の多い標的
核酸の濃度の比率は０．９〜０．０１である前記工程； Ｄ）５〜２０秒間かけて前記プライマー伸長生成物を前
記第一温度へ加熱して、その温度で前記生成物を１〜４
０秒間保持する工程；並びに Ｅ）前記工程Ｂ〜Ｄを１サイクルとして１回以上逐次繰
り返すが、その際工程Ｂ〜Ｄの各サイクルは２０〜９０
秒で実施する工程；を含んで成る核酸の同時増幅方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8998793A | 1993-07-08 | 1993-07-08 | |
| US089987 | 1993-07-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07163370A true JPH07163370A (ja) | 1995-06-27 |
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Family
ID=22220547
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15574794A Expired - Lifetime JP4047395B2 (ja) | 1993-07-08 | 1994-07-07 | 核酸の同時増幅方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5674717A (ja) |
| EP (1) | EP0648845B1 (ja) |
| JP (1) | JP4047395B2 (ja) |
| AT (1) | ATE225856T1 (ja) |
| DE (1) | DE69431510T2 (ja) |
| DK (1) | DK0648845T3 (ja) |
| SG (1) | SG68568A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US5705366A (en) * | 1994-09-15 | 1998-01-06 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Coamplification of target nucleic acids using volume exclusion agent in reaction composition, test kit and test device useful therefor |
| JPH11505126A (ja) * | 1995-05-19 | 1999-05-18 | アボツト・ラボラトリーズ | プライマーシリーズ集団を使用する広い動的範囲の核酸検出 |
| US5853990A (en) | 1996-07-26 | 1998-12-29 | Edward E. Winger | Real time homogeneous nucleotide assay |
| WO1998011259A2 (en) * | 1996-09-09 | 1998-03-19 | Visible Genetics Inc. | Composition, method and kit for detection and identification of sexually transmitted disease microorganisms |
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| EP1111044A4 (en) * | 1998-09-08 | 2003-06-04 | Takara Shuzo Co | DNA SYNTHESIS PROCESS |
| WO2000032820A1 (en) * | 1998-11-23 | 2000-06-08 | Exact Laboratories, Inc. | Method for detecting target sequences in small proportions in heterogeneous samples |
| JP2002537777A (ja) | 1999-02-25 | 2002-11-12 | エグザクト サイエンシーズ コーポレイション | Ｄｎａの完全性を保存するための方法 |
| US6586177B1 (en) | 1999-09-08 | 2003-07-01 | Exact Sciences Corporation | Methods for disease detection |
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| US7776524B2 (en) | 2002-02-15 | 2010-08-17 | Genzyme Corporation | Methods for analysis of molecular events |
| EP2019687B1 (en) | 2006-03-29 | 2014-03-19 | Merial Limited | Vaccine against streptococci |
| US8119352B2 (en) * | 2006-06-20 | 2012-02-21 | Cepheld | Multi-stage amplification reactions by control of sequence replication times |
| CA2999886A1 (en) * | 2015-09-24 | 2017-03-30 | Abvitro Llc | Single amplicon activated exclusion pcr |
Family Cites Families (9)
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|---|---|---|---|---|
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| US5008182A (en) * | 1986-01-10 | 1991-04-16 | Cetus Corporation | Detection of AIDS associated virus by polymerase chain reaction |
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1994
- 1994-07-02 AT AT94201913T patent/ATE225856T1/de active
- 1994-07-02 EP EP94201913A patent/EP0648845B1/en not_active Expired - Lifetime
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- 1994-07-02 DE DE69431510T patent/DE69431510T2/de not_active Expired - Lifetime
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- 1994-07-07 JP JP15574794A patent/JP4047395B2/ja not_active Expired - Lifetime
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1995
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