JP3360737B2 - エプスタイン−バールウイルスの検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、エプスタイン−バール
ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ；以
下、ＥＢＶと称することがある）の検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】エプスタイン−バールウイルス（ＥＢ
Ｖ）はヘルペス科に属するウイルスの一種で、成人の大
多数がこれに感染しており、ほぼ全員が抗体陽性であ
る。多くの人が生後３歳までに感染するが、不顕性感染
が多いので特に病状は現われない。しかし、宿主の免疫
機能が低下した場合にはＥＢＶが再活性化されることが
ある。特に、悪性腫瘍患者やＡＩＤＳ患者、更に骨髄移
植を受けた者などにＥＢＶの再活性化が見られ、その病
状として伝染性単核症の発病や予後の悪化等があり、致
命的な場合もある。従って、上咽頭癌、バーキットリン
パ腫又は日和見リンパ腫などのＥＢＶ感染症を確定的に
診断することは臨床的に極めて重要である。

【０００３】従来から、ＥＢＶの検出方法としては、生
体液（血液、唾液等）や組織又は細胞からＥＢＶを分離
して同定する方法や、血清中のウイルスカプシド抗原
（ＶＣＡ）又は核内抗原（ＥＢＮＡ）等を測定する免疫
学的な検査法が使われている。しかし、ウイルスを分離
する診断では結果を得るまでに時間がかかり、免疫学的
な方法では抗体非特異反応が起きたり、高感度が得られ
ないという問題があるほか、抗体価が変化するためにウ
イルスの消長を追跡することが難しいという欠点があっ
た。従って、臓器移植や骨髄移植などの場合だけでな
く、疾病の診断に関して、短時間で正確にＥＢＶの診断
を可能にする手法及び体外診断薬の開発が望まれてい
た。

【０００４】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、 （ａ）配列表における配列番号１の配列で表される塩基
配列からなるオリゴヌクレオチドを含有する第１のＤＮ
Ａプライマー〔以下、第１プライマー（１ａ’）と称す
ることがある〕と配列表における配列番号２の配列で表
される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含有する
第２のＤＮＡプライマー〔以下、第２プライマー（２
ａ’）と称することがある〕との組合せ、及び （ｂ）配列表における配列番号３の配列で表される塩基
配列からなるオリゴヌクレオチドを含有する第１のＤＮ
Ａプライマー〔以下、第１プライマー（１ｂ’）と称す
ることがある〕と配列表における配列番号４の配列で表
される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含有する
第２のＤＮＡプライマー〔以下、第２プライマー（２
ｂ’）と称することがある〕との組合せからなる群から
選んだ、第１のプライマーと第２のプライマーとの組合
せ少なくとも１種とＤＮＡポリメラーゼと水性液体被検
試料とを含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけ、続いて得
られた反応液を、配列表における配列番号９又は配列番
号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を含有し、標識を担持するプローブを用いるＤＮＡ検査
工程にかけることを特徴とする、エプスタイン−バール
ウイルスの検出方法に関する。本明細書の塩基配列に於
いて、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、そ
して、Ｔはチミンの意味である。以下、配列表における
配列番号１の配列で表される塩基配列の少なくとも１５
塩基からなるオリゴヌクレオチドを含有する第１のＤＮ
Ａプライマーを、第１プライマー（１ａ）と称すること
があり、配列表における配列番号２の配列で表される塩
基配列の少なくとも１５塩基からなるオリゴヌクレオチ
ドを含有する第２のＤＮＡプライマーを、第２プライマ
ー（２ａ）と称することがある。また、配列表における
配列番号３の配列で表される塩基配列の少なくとも１５
塩基からなるオリゴヌクレオチドを含有する第１のＤＮ
Ａプライマーを、第１プライマー（１ｂ）と称すること
があり、配列表における配列番号４の配列で表される塩
基配列の少なくとも１５塩基からなるオリゴヌクレオチ
ドを含有する第２のＤＮＡプライマーを、第２プライマ
ー（２ｂ）と称することがある。また、配列表における
配列番号５の配列で表される塩基配列の少なくとも１５
塩基からなるオリゴヌクレオチドを含有する第１のＤＮ
Ａプライマーを、第１プライマー（１ｃ）と称すること
があり、配列表における配列番号６の配列で表される塩
基配列の少なくとも１５塩基からなるオリゴヌクレオチ
ドを含有する第２のＤＮＡプライマーを、第２プライマ
ー（２ｃ）と称することがある。更に、配列表における
配列番号７の配列で表される塩基配列の少なくとも１５
塩基からなるオリゴヌクレオチドを含有する第１のＤＮ
Ａプライマーを、第１プライマー（１ｄ）と称すること
があり、配列表における配列番号８の配列で表される塩
基配列の少なくとも１５塩基からなるオリゴヌクレオチ
ドを含有する第２のＤＮＡプライマーを、第２プライマ
ー（２ｄ）と称することがある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、 （ａ）配列表における配列番号１の配列で表される塩基
配列の少なくとも１５塩基からなるオリゴヌクレオチド
部分を含有する第１のＤＮＡプライマー〔以下、第１プ
ライマー（１ａ）と称することがある〕と配列表におけ
る配列番号２の配列で表される塩基配列の少なくとも１
５塩基からなるオリゴヌクレオチド部分を含有する第２
のＤＮＡプライマー〔以下、第２プライマー（２ａ）と
称することがある〕との組合せ、 （ｂ）配列表における配列番号３の配列で表される塩基
配列の少なくとも１５塩基からなるオリゴヌクレオチド
部分を含有する第１のＤＮＡプライマー〔以下、第１プ
ライマー（１ｂ）と称することがある〕と配列表におけ
る配列番号４の配列で表される塩基配列の少なくとも１
５塩基からなるオリゴヌクレオチド部分を含有する第２
のＤＮＡプライマー〔以下、第２プライマー（２ｂ）と
称することがある〕との組合せ、 （ｃ）配列表における配列番号５の配列で表される塩基
配列の少なくとも１５塩基からなるオリゴヌクレオチド
部分を含有する第１のＤＮＡプライマー〔以下、第１プ
ライマー（１ｃ）と称することがある〕と配列表におけ
る配列番号６の配列で表される塩基配列の少なくとも１
５塩基からなるオリゴヌクレオチド部分を含有する第２
のＤＮＡプライマー〔以下、第２プライマー（２ｃ）と
称することがある〕との組合せ、及び （ｄ）配列表における配列番号７の配列で表される塩基
配列の少なくとも１５塩基からなるオリゴヌクレオチド
部分を含有する第１のＤＮＡプライマー〔以下、第１プ
ライマー（１ｄ）と称することがある〕と配列表におけ
る配列番号８の配列で表される塩基配列の少なくとも１
５塩基からなるオリゴヌクレオチド部分を含有する第２
のＤＮＡプライマー〔以下、第２プライマー（２ｄ）と
称することがある〕との組合せからなる群から選んだ、
第１のプライマーと第２のプライマーとの組合せ少なく
とも１種とＤＮＡポリメラーゼと水性液体被検試料とを
含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけ、続いて得られた反
応液をＤＮＡ検査工程にかけることを特徴とする、エプ
スタイン−バールウイルスの検出方法に関する。更に、
本発明は、配列表における配列番号９、配列番号１０、
配列番号１１又は配列番号１２の配列で表される塩基配
列の少なくとも１０塩基からなるオリゴヌクレオチド部
分を含有し、標識を担持するプローブと被検試料とを接
触させ、前記標識からの信号を検出することを特徴とす
る、エプスタイン−バールウイルスの検出方法にも関す
る。本明細書の塩基配列に於いて、Ａはアデニン、Ｃは
シトシン、Ｇはグアニン、そして、Ｔはチミンの意味で
ある。

【０００６】本発明方法で用いる検体は、ＥＢＶを含有
している疑いのある試料であれば特に限定されない。例
えば、唾液、血液又は組織からの抽出物を用いることが
できる。

【０００７】プライマーの組合せを用いる本発明のＥＢ
Ｖ検出方法は、主に、（１）ＤＮＡ増幅工程と、（２）
ＤＮＡ検出工程とからなる。本発明のＥＢＶ検出方法に
おいては、最初にＤＮＡ増幅工程を行うのが好ましい。

【０００８】本発明のＤＮＡ増幅工程（１）では、ＰＣ
Ｒ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ）法を用いることができる。ＰＣＲ法を利用する
と、微量のＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域のみを自
動的に約１００万倍にまで増幅できる（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２３９：４８７−４９１，１９８８）。ＰＣＲ法で
は、増幅させるＤＮＡ領域を挟んで＋鎖に対するプライ
マー（以下、第１プライマーと称する）及び−鎖に対す
るプライマー（以下、第２プライマーと称する）の２種
のＤＮＡプライマーを用いる。

【０００９】本発明のＤＮＡ増幅工程（１）で用いる第
１プライマーと第２プライマーとの組合せとしては、 （ａ）第１プライマー（１ａ）と第２プライマー（２
ａ） （ｂ）第１プライマー（１ｂ）と第２プライマー（２
ｂ） （ｃ）第１プライマー（１ｃ）と第２プライマー（２
ｃ） （ｄ）第１プライマー（１ｄ）と第２プライマー（２
ｄ） の４種の組合せがあり、これらの組合せのいずれか１種
を単独で用いるか、又は２種以上を同時に用いることが
できる。

【００１０】本発明による前記の各プライマーの組合せ
（ａ）又は（ｂ）を用いると、ＥＢＶの全ＤＮＡ配列の
中で、ＢａｍＨＩ Ｗ領域（リピート領域）のみのＤＮ
Ａ領域を特異的に増幅できる。ここで、プライマーの組
合せ（ａ）で増幅する領域をＢａｍＨＩＷ−１と称し、
そして、プライマーの組合せ（ｂ）で増幅する領域をＢ
ａｍＨＩＷ−２と称する。具体的にはＢａｍＨＩＷ−１
に相当する１９５ｂｐ部分、又は、ＢａｍＨＩＷ−２に
相当する１３４ｂｐ部分が、それぞれ特異的に大量に増
幅される。また、プライマーの組合せ（ｃ）を用いる
と、ＥＢＶの全ＤＮＡ配列の中で、ＥＢＥＲ１領域のみ
のＤＮＡ領域を特異的に増幅できる。ここで、プライマ
ーの組合せ（ｃ）で増幅する領域をＥＢＥＲと称する。
具体的にはＥＢＥＲに相当する１５７ｂｐ部分が、特異
的に大量に増幅される。最後に、プライマーの組合せ
（ｄ）を用いると、ＥＢＶの全ＤＮＡ配列の中で、ＬＭ
Ｐ領域（ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅ
ｉｎ）のみのＤＮＡ領域を特異的に増幅できる。ここ
で、プライマーの組合せ（ｄ）で増幅する領域をＬＭＰ
と称する。具体的にはＬＭＰに相当する３１８ｂｐ部分
が、特異的に大量に増幅される。

【００１１】前記の各第１プライマー及び各第２プライ
マーはそれぞれ１５ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることがで
きるが、一般的には２０ｍｅｒ〜２５ｍｅｒであるのが
好ましい。１５ｍｅｒ未満であると塩基配列の特異性が
低下し、また、３０ｍｅｒを越えると特異性は上がるが
合成コストが高くなる。本発明方法で用いる第１プライ
マー及び第２プライマーをそれぞれ構成する各塩基は、
公知の任意の態様で修飾（例えばビオチン化又は発光物
質によるラベル化）されていてもよい。本発明による前
記のそれぞれの第１プライマー及び第２プライマーは、
通常のＤＮＡ自動合成機（例えばアプライドバイオシス
テム社製）を用いて、公知のＤＮＡ合成法（例えばホス
ソアミダイド法）によって調製することができる。

【００１２】本発明のＤＮＡ増幅工程（１）では、第１
プライマー及び第２プライマーとともに、ＤＮＡポリメ
ラーゼ、特に耐熱性ポリメラーゼを用いて増幅サイクル
を繰り返す。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に
９５℃までの温度で活性を維持することができるＤＮＡ
ポリメラーゼ、例えば、市販のＴａｑポリメラーゼを用
いることができる。

【００１３】本発明のＤＮＡ増幅工程では、前記の第１
プライマーと第２プライマーとの特定のプライマーの組
み合わせ、ＤＮＡポリメラーゼ及び液体被検試料を含む
混合液を用いる。第１プライマー、第２プライマー及び
ＤＮＡポリメラーゼの使用量は、液体被検試料の種類に
よって変化するが、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を実
施することができる範囲で容易に決定することができ
る。この混合液は場合により、緩衝液（例えば、トリス
塩酸緩衝液）、安定化剤（例えば、ゼラチン）、又は塩
類（例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム）を含
有することができる。

【００１４】本発明方法では、前記の混合液を用いてＰ
ＣＲ法の増幅サイクルを実施する。増幅サイクルは、 （ｉ）ＤＮＡの変性工程（約９０℃〜９５℃、約１０秒
〜２分間）、 （ii）１本鎖ＤＮＡと第１プライマー及び第２プライマ
ーとのアニーリング工程（約３７℃〜７０℃、約３０秒
〜３分間）、及び （iii)ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（約６
５℃〜８０℃、約３０秒〜５分間）とからなる。

【００１５】１サイクル毎にＤＮＡ量は２倍に増幅さ
れ、ｎサイクル後には２ⁿ 倍に増幅される。本発明にお
いては、増幅サイクル数を１０〜６０回、好ましくは２
０〜４０回繰り返す。最後のサイクルにおいては、工程
（iii)の条件で加熱時間を約５〜１０分間延長してＤＮ
Ａ合成が完全に行われるようにするのが好ましい。被検
試料中にＥＢＶ−ＤＮＡが存在する場合には、前記の増
幅工程で増幅サイクル終了後に、約５０〜５００ｂｐの
ＤＮＡが大量に合成される。このＤＮＡを次のＤＮＡ検
査工程によって検出する。

【００１６】ＤＮＡ検査工程としては、ゲル電気泳動
後、エチジウムブロマイド染色を利用する方法、電気泳
動後にフィルターに移してサザンブロットハイブリッド
法を行う方法、増幅したＤＮＡをそのままフィルターに
ブロットしてドットブロットハイブリッド法を行う方
法、又は、ジデオキシ法による塩基配列決定法などを用
いることができる。ゲル電気泳動法を行う場合には、例
えば、アガロースゲルを担体としたサブマリーン型電気
泳動、又はアクリルアミドを用いたスラブ型電気泳動を
使用することができる。

【００１７】サザンブロットハイブリッド法、ドットブ
ロットハイブリッド法、又は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリ
ッド法を行う場合には、非放射性プローブ（例えば、酵
素標識プローブ、ビオチン化プローブ、ジゴキシゲニン
化プローブ、又は、化学発光物質、蛍光物質で標識した
プローブ）を用いることができる。

【００１８】更に、ジデオキシ法による塩基配列決定法
を利用する場合には、蛍光ラベルを使用したＤＮＡオー
トシークエンサー（例えば、アプライドバイオシステム
ズ社）を用いることができる。

【００１９】前記第１プライマー及び第２プライマーの
各種組合せを用いる本発明方法においては、被検試料中
にＥＢＶ−ＤＮＡが存在する場合のみ、前記の組合せに
応じて、それぞれＢａｍＨＩ Ｗ領域の一部分、ＥＢＥ
Ｒ１領域の一部分、及び、ＬＭＰ領域の一部分に相当す
る塩基配列部分が短時間のうちに特異的に大量に増幅合
成される。従って、被検試料中におけるＥＢＶ−ＤＮＡ
の存在をきわめて特異的に検出することができる。更
に、被検試料中のＥＢＶ−ＤＮＡ量が微量であってもＤ
ＮＡが増幅合成されるので高感度である。

【００２０】本発明は、更に、ＥＢＶ−ＤＮＡの特異的
な検出に用いることのできる４種類のＤＮＡプローブを
提供するものでもある。これらのＤＮＡプローブは、 （Ａ）配列表における配列番号９の配列で表される塩基
配列の少なくとも１０塩基からなるオリゴヌクレオチド
部分を含有するプローブ（以下、プローブＡと称するこ
とがある）、 （Ｂ）配列表における配列番号１０の配列で表される塩
基配列の少なくとも１０塩基からなるオリゴヌクレオチ
ド部分を含有するプローブ（以下、プローブＢと称する
ことがある）、 （Ｃ）配列表における配列番号１１の配列で表される塩
基配列の少なくとも１０塩基からなるオリゴヌクレオチ
ド部分を含有するプローブ（以下、プローブＣと称する
ことがある）、 （Ｄ）配列表における配列番号１２の配列で表される塩
基配列の少なくとも１０塩基からなるオリゴヌクレオチ
ド部分を含有するプローブ（以下、プローブＤと称する
ことがある）である。これらのプローブを単独あるいは
同時に用いることができる。

【００２１】前記プローブＡは、ＢａｍＨＩ Ｗ領域
（リピート領域）のＤＮＡ領域に特異的であり、プロー
ブＡの長さは被検試料に対する前処理の種類によって異
なる。被検試料が前記組合せ（ａ）の第１プライマー
（１ａ）と第２プライマー（２ａ）とを用いるＰＣＲ法
によるＤＮＡ増幅工程を経たものである場合には、１０
ｂｐからＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡ断片の大きさまで
であることができる。また、被検試料がＰＣＲ法のＤＮ
Ａ増幅工程を経たものでなく、プローブＡをｉｎ ｓｉ
ｔｕハイブリッド法に用いる場合には、プローブＡの長
さは１０ｂｐからＢａｍＨＩ Ｗ領域（約３ｋｂｐ）の
大きさまで可能である。配列表における配列番号９の配
列で表される４０塩基のＤＮＡプローブ（４０ｍｅｒ）
は、被検試料がＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経たも
のであっても、あるいは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド
法の場合であっても、いずれにも用いることができるの
で好ましい。

【００２２】前記プローブＢは、ＢａｍＨＩ Ｗ領域
（リピート領域）のＤＮＡ領域に特異的であり、プロー
ブＢの長さは被検試料に対する前処理の種類によって異
なる。被検試料が前記組合せ（ｂ）の第１プライマー
（１ｂ）と第２プライマー（２ｂ）とを用いるＰＣＲ法
によるＤＮＡ増幅工程を経たものである場合には、１０
ｂｐからＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡ断片の大きさまで
であることができる。また、被検試料がＰＣＲ法のＤＮ
Ａ増幅工程を経たものでなく、プローブＢをｉｎ ｓｉ
ｔｕハイブリッド法に用いる場合には、プローブＢの長
さは１０ｂｐからＢａｍＨＩ Ｗ領域（約３ｋｂｐ）の
大きさまで可能である。配列表における配列番号１０の
配列で表される４０塩基のＤＮＡプローブ（４０ｍｅ
ｒ）は、被検試料がＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経
たものであっても、あるいは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリ
ッド法の場合であっても、いずれにも用いることができ
るので好ましい。

【００２３】前記プローブＣは、ＥＢＥＲ１領域のＤＮ
Ａ領域に特異的であり、プローブＣの長さは被検試料に
対する前処理の種類によって異なる。被検試料が前記組
合せ（ｃ）の第１プライマー（１ｃ）と第２プライマー
（２ｃ）とを用いるＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経
たものである場合には、１０ｂｐからＰＣＲ法で増幅さ
れるＤＮＡ断片の大きさまでであることができる。ま
た、被検試料がＰＣＲ法のＤＮＡ増幅工程を経たもので
なく、プローブＣをｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法に用
いる場合には、プローブＣの長さは１０ｂｐからＥＢＥ
Ｒ１領域（１７３ｂｐ）の大きさまで可能である。配列
表における配列番号１１の配列で表される４０塩基のＤ
ＮＡプローブ（４０ｍｅｒ）は、被検試料がＰＣＲ法に
よるＤＮＡ増幅工程を経たものであっても、あるいは、
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法の場合であっても、いず
れにも用いることができるので好ましい。

【００２４】前記のプローブＤは、ＬＭＰ（ｌａｔｅｎ
ｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする
遺伝子領域のＤＮＡ領域に特異的であり、プローブＤの
長さは被検試料に対する前処理の種類によって異なる。
被検試料が前記組合せ（ｄ）の第１プライマー（１ｄ）
と第２プライマー（２ｄ）とを用いるＰＣＲ法によるＤ
ＮＡ増幅工程を経たものである場合には、１０ｂｐから
ＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡ断片の大きさまでであるこ
とができる。また、被検試料がＰＣＲ法のＤＮＡ増幅工
程を経たものでなく、プローブＤをｉｎ ｓｉｔｕハイ
ブリッド法に用いる場合には、プローブＤの長さは１０
ｂｐからＬＭＰ領域（約２ｋｂｐ）の大きさまで可能で
ある。配列表における配列番号１２の配列で表される４
０塩基のＤＮＡプローブ（４０ｍｅｒ）は、被検試料が
ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経たものであっても、
あるいは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法の場合であっ
ても、いずれにも用いることができるので好ましい。

【００２５】プローブＡ、Ｂ、Ｃ、及び、Ｄの調製法と
しては、サクシノイミド（例えば、ジサクシミジルスベ
レイト）を用いる方法、マレイミド法、活性ハロゲン
（ａｃｔｉｖｅ ｈａｌｏｇｅｎ）法、アジド化合物で
の光反応、あるいは、カルボジイミド法を挙げることが
できる。プローブＡ、Ｂ、Ｃ、及び、Ｄの標識物質とし
ては、従来公知の任意の物質を使用することができる。
好ましくは、非放射性物質（例えば、酵素、ビオチン、
ジゴキシゲニン、化学発光物質、又は、蛍光物質等）を
用いる。

【００２６】標識化ＤＮＡの合成方法には、大別する
と、 （１）ＤＮＡ合成過程で直接的に標識化ＤＮＡを調製す
る方法と、 （２）リンカーを結合させたＤＮＡを合成してから、こ
れを単離し、標識試薬を作用させる方法とがあり、特に
方法（２）は目的に応じて標識物質を容易に変更でき、
応用面で優れているので好ましい。方法（２）で用いる
リンカーとしては、５’−ジメトキシトリエチル−５−
〔Ｎ−（トリフルオロアセチルアミノヘキシル）−３−
アクリルイミド〕−２’−デオキシウリジン−３’−
〔（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ
ル）〕ホスホルアミダイト等を挙げることができる。プ
ローブに結合されている標識物質から信号を発生させ、
更にその信号を測定する方法も、従来から公知の任意の
方法を用いることができる。

【００２７】前記のプローブを用いる本発明方法におい
ては、（場合によりＰＣＲ法で増幅した）ＥＢＶ−ＤＮ
Ａに特異的な標識ＤＮＡプローブを用いるので、極めて
正確にＥＢＶ−ＤＮＡを検出することができる。

【００２８】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：プライマーの合成 ３８１Ａ型自動ＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシス
テムズ社）に、アデニンＣＰＧカラムを装着して配列表
の配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６
の各配列に記載の塩基２５個のプライマー（１ａ’）、
（１ｂ’）、（１ｃ’）及び（２ｃ’）と、配列表の配
列番号７の配列に記載の塩基２３個のプライマー（１
ｄ’）と、配列表の配列番号８の配列に記載の塩基２２
個のプライマー（２ｄ’）を合成し、グアニンＣＰＧカ
ラムを装着して配列表の配列番号２の配列に記載の塩基
２５個のプライマー（２ａ’）を合成し、そしてシトシ
ンＣＰＧカラムを装着して配列表の配列番号４の配列に
記載の塩基２５個のプライマー（２ｂ’）をそれぞれ合
成した。アンモニア水（約３０％）２．５mlを入れたデ
ィスポシリンジ（２．５ml）を、合成が完了したＣＰＧ
カラムに接続し、アンモニア水をカラム内に押し出し
て、合成したＤＮＡフラグメントを溶出した。回収した
ＤＮＡアンモニア溶液の入ったバイアル瓶を密栓し、６
５℃で６時間加温した後、室温まで冷やしてから濃縮し
た。濃縮物を完全に乾燥し、１０mMトリエチレンアンモ
ニウムアセテート（pH７．４）（以下、ＴＥＡ−Ａと称
す）に溶解した。一方、予めＮｅｎｎｓｏｒｂ^TMＰｒｅ
ｐ（ＮＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）カラムを１
０mlのメタノールで洗浄して、次に５mlのＴＥＡ−Ａを
入れ、カラムを平衡化した。このカラムに前記のプライ
マー溶液を通して、１０％アセトニトリルを含むＴＥＡ
−Ａ（１０ml）でカラムを洗浄した後、このカラムに
０．５％トリフルオロ酢酸２５mlを通した。更に、ＴＥ
Ａ−Ａ（１０ml）でカラムを洗浄した後、カラムに吸着
しているプライマーを３５％メタノール５mlで溶出し
た。溶出したプライマー溶液を減圧下で乾燥して、保存
し、後記の実施例３等で用いた。

【００２９】実施例２：酵素標識プローブの調製 ４種のＤＮＡプローブ合成を前記実施例１と同様の装置
を用いて、同様の条件で行ったが、但し、配列表の配列
番号９の配列に記載の塩基４０個のプローブＡ’の合成
ではアデニンＣＰＧカラムを用いて５’末端から３０番
目のＴを、配列表の配列番号１０の配列に記載の塩基４
０個のプローブＢ’はアデニンＣＰＧカラムを用いて
５’末端から１５番目のＴを、配列表の配列番号１１の
配列に記載の塩基４０個のプローブＣ’はシトシンＣＰ
Ｇカラムを用いて５’末端から１０番目のＴを、そして
配列表の配列番号１２の配列に記載の塩基４０個のプロ
ーブＤ’はグアニンＣＰＧカラムを用いて５’末端から
２０番目のＴをそれぞれ５’−ジメトキシトリエチル−
５−〔Ｎ−（トリフルオロアセチルアミノヘキシル）−
３−アクリルイミド〕−２’−デオキシウリジン−３’
−〔（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ
ル）〕ホスホルアミダイト（グレインリサーチ社）（以
下、リンカーと称す）に置き換えた。尚、リンカーの位
置はこの部位に限らず、他のチミン部位に置き換えるこ
とも可能である。リンカー付きプローブの精製も実施例
１に記載した条件で行った。

【００３０】精製したリンカー付きプローブ３ｎモルを
８μｌの滅菌水に溶解した。この溶液に０．２Ｍ−Ｎａ
ＨＣＯ₃ ／４ｍＭ−ＥＤＴＡ溶液８μｌを加えた後、ジ
サクシニミジルスベレイト（Ｐｉｅｒｃｅ社）（以下、
ＤＳＳと称す）のジメチルスルホキシド溶液（１０mg／
ml）５０μｌを加え、室温で暗所にて１５分間反応させ
た。反応終了後、反応液に滅菌水３０μｌを加えて遠心
し、上清をＨＰＬＣ（東ソ−Ｇ３０００ＰＷカラム；移
動相＝水）にかけ、ＤＳＳと結合したＤＮＡ（以下、修
飾リンカーＤＮＡと称す）を分取し、凍結乾燥した。乾
燥した修飾リンカーＤＮＡにアルカリホスファターゼ
（ベーリンガーマンハイム社のＥＩＡ用試薬を２倍に濃
縮して調製した試薬：２０mg／ml：以下、ＡＰと称す）
４０μｌを加え、室温で暗所にて１６時間反応させた。
反応終了後、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．４）で
未反応のＡＰを除き、０．３３Ｍ−ＮａＣｌを含む０．
１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．４）で目的のＡＰ標識Ｄ
ＮＡを溶出した。分取した精製ＡＰ標識ＤＮＡの溶出液
（約６ml）を３Ｍ−ＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス塩酸
緩衝液（pH８．４）に対して透析した後、１mlに濃縮し
た。この濃縮物をＡＰ標識プローブとして後記の実施例
５等で用いた。

【００３１】実施例３：ＰＣＲ法によるＥＢＶ−ＤＮＡ
の増幅及び検出感度 精製したＥＢＶ−ＤＮＡ〔ＥＢＶ感染細胞株（東京医科
歯科大学難治疾患研究所保存；Ｎｏ．ＭＤＨ０６０１）
から採取したＤＮＡを精製した〕の希釈列（５ｐｇ〜
０．００００５ｐｇ）を調製して試料とした。試料５μ
ｌに、ＧｅｎｅＡｍｐ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎキット（宝酒造）の１０×ＰＣＲ用緩衝液５μ
ｌ、ｄＮＴＰ混合液８μｌ、２０倍希釈したＴａｑポリ
メラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、シー
タス社）溶液５μｌ、前記実施例１で調製したプライマ
ーを各０．４μＭを加え、滅菌水で全量を５０μｌに調
製した後、ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社）を用いて、１サイクルが
（１）９４℃で１分間、（２）６０℃で２分間、及び
（３）７２℃で３分間の処理工程を３０サイクル行い、
最後に７２℃で７分間の処理を行うプログラムでＤＮＡ
の増幅を行った。

【００３２】実施例４：電気泳動による増幅ＤＮＡの確
認 電気泳動用のゲルは、トリス塩基５．４ｇ、硼酸２．７
ｇ、及び０．５Ｍ−ＥＤＴＡ２mlを含む緩衝液（pH８．
０）（以下、０．５×ＴＢＥと称す）１リットルにアガ
ロース１．８％又は０．７％を溶解し、ミューピッド
（アドバンス社）のゲルプレートに流して調製した。次
に、実施例３においてＰＣＲ反応の終了した溶液１０μ
ｌに、０．２５％プロモフェノールブルー及び１５％フ
ィコール（ファルマシア社）の溶液２μｌを混合し、そ
の混合溶液全量をサンプルウエルに入れた。０．５×Ｔ
ＢＥを電極槽に入れて、室温で１００Ｖにて、４５分間
電気泳動した。電気泳動終了後、アガロースをエチジウ
ムブロマイドで染色し、ＵＶイルミネーター照射下で電
気泳動の結果を観察したところ、１９５ｂｐ、１３４ｂ
ｐ、１５７ｂｐ及び３１８ｂｐにバンドを確認すること
ができた。結果を図１に示す。図１のＢａｍＨＩ−１
〔上段〕は前記第１プライマー（１ａ’）と第２プライ
マー（２ａ’）とを用いた場合、ＢａｍＨＩ−２〔上
段〕は前記第１プライマー（１ｂ’）と第２プライマー
（２ｂ’）とを用いた場合、ＥＢＥＲ〔上段〕は前記第
１プライマー（１ｃ’）と第２プライマー（２ｃ’）と
を用いた場合、そしてＬＭＰ〔上段〕は前記第１プライ
マー（１ｄ’）と第２プライマー（２ｄ’）とを用いた
場合にそれぞれ相当する。エチジウムブロマイド染色で
は、プライマー（１ａ’）とプライマー（２ａ’）、及
びプライマー（１ｂ’）とプライマー（２ｂ’）との組
み合わせでは０．００５ｐｇまで検出でき、プライマー
（１ｃ’）とプライマー（２ｃ’）、及びプライマー
（１ｄ’）とプライマー（２ｄ’）との組み合わせでは
０．０５ｐｇまで検出できた。

【００３３】実施例５：サザンブロットハイブリッド法
による増幅ＤＮＡの確認 前記実施例４で電気泳動を確認した後、１Ｍ−ＮａＣｌ
を含む０．５Ｎ−ＮａＯＨ溶液５００mlにアガロースゲ
ルを３０分間浸漬させ、次に、１．５Ｍ−ＮａＣｌを含
む０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．４）５００mlにア
ガロースゲルを移して３０分間中和した。中和したアガ
ロースゲルを２０×ＳＳＣで濡らした濾紙（ワットマン
社）（濾紙の両端を２０×ＳＳＣに漬けておく）の上に
置き、そのアガロースゲルの上に滅菌水で濡らしたナイ
ロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ⁺ 、アマーシャム
社）を載せ、更に、キムタオル（十條キンバリー社）を
約５cmの高さに載せて、約５００ｇの負荷をかけて室温
で１６時間放置して、ＤＮＡをアガロースゲルからフィ
ルターにブロッティングした。フィルターを減圧下で１
時間乾燥させた後、８０℃で１時間ベーキングした。次
に、サルコシン０．１％、ＳＤＳ０．５％、核酸ハイブ
リダイゼーション用ブロッキング剤（ベーリンガーマン
ハイム社）５％、及びホルムアミド３０％を含む５×Ｓ
ＳＣ（以下、ハイブリダイゼーション用緩衝液と称す）
中で前記のフィルターを３７℃で１時間放置した後、実
施例２で調製したＡＰ標識プローブ（３ｐモル）を加え
たハイブリダイゼーション用緩衝液５mlに前記のフィル
ターを移し、３７℃で一夜反応させた。ＡＰ標識プロー
ブとのハイブリダイゼーション処理が済んだフィルター
を２×ＳＳＣ１００mlで室温で５分間の洗浄を３回行
い、次に、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ１００ml中
で４２℃で４５分間静置した。更に、２×ＳＳＣ１００
ml中で室温で５分間の洗浄を３回行った。最後に、０．
１Ｍ−ＮａＣｌ、１０mM−ＭｇＣｌ₂ を含む０．１Ｍト
リス塩酸緩衝液（pH９．５）（以下、発色液と称す）に
３０秒間〜１分間フィルターを浸漬して馴染ませた。

【００３４】ニトロブルーテトラゾリウム（ベーリンガ
ーマンハイム社）７５mgを３０％滅菌水−７０％ジメチ
ルホルムアミド混合液１mlに溶解した溶液（以下、ＮＢ
Ｔ溶液と称する）を調製した。また、５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリルリン酸（ベーリンガーマンハイ
ム社）５０mgをジメチルホルムアミド混合液１mlに溶解
した溶液（以下、ＢＣＩＰ溶液と称する）を調製した。
前記発色液に馴染ませたフィルターの入ったプラスチッ
クバッグに、ＮＢＴ溶液４０μｌ、及びＢＣＩＰ４０μ
ｌを加えた発色液１０mlを入れ、３７℃で５分間〜５時
間静置して発色させた。ＡＰの反応は、１０mM−ＥＤＴ
Ａを含む１０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．５）５０mlに
フィルターを浸漬することで停止させた。この結果、１
９５ｂｐのバンドにはプローブＡ’がハイブリダイズ
し、そして１３４ｂｐのバンドにはプローブＢ’が、１
５７ｂｐのバンドにはプローブＣ’が、更に３１８ｂｐ
のバンドにはプローブＤ’がそれぞれハイブリダイズし
たことを確認することができた。結果を図１に示す。図
１のＢａｍＨＩ−１〔下段〕はプローブＡ’、ＢａｍＨ
Ｉ−２〔下段〕はプローブＢ’、ＥＢＥＲ〔下段〕はプ
ローブＣ’、そしてＬＭＰ〔下段〕はプローブＤ’をそ
れぞれ用いた場合に相当する。サザンブロットハイブリ
ッド法では、プライマー（１ａ’）とプライマー（２
ａ’）、及びプライマー（１ｂ’）とプライマー（２
ｂ’）との組み合わせで増幅させたＤＮＡを、それぞれ
プローブＡ’、及びプローブＢ’で反応させた場合は
０．０００５ｐｇまで検出でき、プライマー（１ｃ’）
とプライマー（２ｃ’）、及びプライマー（１ｄ’）と
プライマー（２ｄ’）との組み合わせで増幅させたＤＮ
Ａを、それぞれプローブＣ’、及びプローブＤ’で反応
させた場合は０．００５ｐｇまで検出できた。

【００３５】実施例６：ＥＢＶ及びその他のウイルスに
対するプライマーの特異性 本発明によるＥＢＶ増幅用プライマーの特異性を調べ
た。ウイルスとしては、ヒトサイトメガロウイルス（Ｈ
ＣＭＶ：Ｔｏｗｎｅ株）、単純ヘルペスウイルス−Ｉ型
（ＨＳＶ−Ｉ：ＨＦ株）、単純ヘルペスウイルス−II型
（ＨＳＶ−II：ＵＷ２６８株）、バリセロ−ゾースター
ウイルス（ＶＺＶ：帯状性泡しん分離株：Ｈ−Ｎ３
株）、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ：Ｂ９５
−８株）、及びＨＨＶ−６（突発性発疹分離株）を用
い、実施例３記載の条件でＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅を
行い、交差反応の有無を調べた。結果を図２に示す。図
２のＢａｍＨＩ−１は前記第１プライマー（１ａ）と第
２プライマー（２ａ）とを用いた場合、ＢａｍＨＩ−２
は前記第１プライマー（１ｂ）と第２プライマー（２
ｂ）とを用いた場合、ＥＢＥＲは前記第１プライマー
（１ｃ）と第２プライマー（２ｃ）とを用いた場合、そ
してＬＭＰは前記第１プライマー（１ｄ）と第２プライ
マー（２ｄ）とを用いた場合にそれぞれ相当する。ＥＢ
Ｖ−ＤＮＡのみに各プライマーで増幅された特異的なＤ
ＮＡバンドが検出され、ＥＢＶ以外のウイルスＤＮＡと
は交差反応をしないことが示された。

【００３６】実施例７：ＥＢＶ非感染細胞株及びＥＢＶ
分離株を用いたプライマーの特異性 ＥＢＶ非感染細胞株及びＥＢＶ分離株を用いてプライマ
ーの特異性を調べた。ＥＢＶ非感染細胞としては、ＢＪ
ＡＢ株（東京医科歯科大学難治疾患研究所保存Ｎｏ．Ｍ
ＤＨ０１０１）及びＭｏｌｔ４株（東京医科歯科大学難
治疾患研究所保存Ｎｏ．ＭＤＨ０２００）を、また、Ｅ
ＢＶ感染細胞としては、Ｒａｊｉ株（東京医科歯科大学
難治疾患研究所保存Ｎｏ．ＭＤＨ０３０１）、Ｐ３ＨＲ
−１株（東京医科歯科大学難治疾患研究所保存Ｎｏ．Ｍ
ＤＨ０４０１）、Ｂ９５−８株（東京医科歯科大学難治
疾患研究所保存Ｎｏ．ＭＤＨ０６０１）及びＡＫＡＴＡ
株（東京医科歯科大学難治疾患研究所保存Ｎｏ．ＭＤＨ
０５０１）を用い、実施例３記載の条件でＰＣＲ法によ
るＤＮＡ増幅を行い、ヒトリンパ球のＤＮＡとの交差反
応の有無、及びウイルス感染細胞中のＥＢＶ−ＤＮＡを
検出できるかどうかを調べた。結果を図３に示す。図３
のＢａｍＨＩ−１、ＢａｍＨＩ−２、ＥＢＥＲ、及びＬ
ＭＰは前記図２と同じ意味である。ＥＢＶ非感染細胞で
あるＢＪＡＢ及びＭｏｌｔ４細胞株のＤＮＡでは特異的
反応によるＤＮＡバンドは検出されなかった。また、Ｅ
ＢＶ感染細胞では、全てのプライマーの組合せで特異的
なＤＮＡバンドが検出され、これら本発明によるプライ
マーは、ＥＢＶ−ＤＮＡがよく保存されている領域に設
定されていることが示された。

【００３７】実施例８：ＥＢＶ感染患者由来試料中のＥ
ＢＶ−ＤＮＡの検出 以下の被検試料を調製した。即ち、ＥＢＶを含有する伝
染性単核症患者から採取した血液中の単核球画分（１×
１０⁶ 個）に滅菌水１mlを加えて試料とした。試料５μ
ｌを用いて実施例３〜５と同様に操作を行った結果、エ
チジウムブロマイド染色によると、１９５ｂｐ、１３４
ｂｐ、１５７ｂｐ及び３１８ｂｐにバンドを観察するこ
とができた。更に、サザンブロットハイブリッド法によ
ると、１９５ｂｐにはプローブＡ’が、１３４ｂｐには
プローブＢ’が、１５７ｂｐにはプローブＣ’が、３１
８ｂｐにはプローブＤ’が、それぞれハイブリダイズし
たことを確認することができた。

【００３８】実施例９：ＡＰ標識プローブによるＥＢＶ
−ＤＮＡの検出 ＥＢＶ産生細胞であるＢ９５−８細胞株（東京医科歯科
大学難治疾患研究所保存Ｎｏ．ＭＤＨ０６０１）を１０
％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬）
で５％ＣＯ₂ 存在下で３７℃で１週間継代培養した。培
養したＢ９５−８細胞株を遠心して細胞を集め、１×１
０⁶ 細胞／mlになるようにＰＢＳに懸濁し、スライドグ
ラスに１０μｌのせた後、風乾した。乾燥したスライド
グラスをＰＢＳで室温で５分間洗浄し、更に乾燥させ
た。このスライドグラスを４％ホルマリン／０．１Ｍ燐
酸ナトリウム緩衝液（pH７．２）〔以下、０．１Ｍ燐酸
ナトリウム緩衝液（pH７．２）をＮａＰＢと称す〕に室
温で５分間漬けた。０．１Ｍ−ＮａＰＢで室温で各３分
間、３回洗浄し、２×ＳＳＣ（pH７．０）に室温で５分
間浸漬し、ＲＮａｓｅ（宝酒造）２mgを溶解したＰＢＳ
１mlを細胞上に広げ、湿箱中で３７℃で１時間放置し、
０．１Ｍ−ＮａＰＢで室温で３分間洗浄し、４％ホルマ
リン／ＮａＰＢに室温で５分間漬けた。次に、０．１Ｍ
−ＮａＰＢで室温で各３分間、３回洗浄し、０．２Ｎ−
ＨＣｌに室温で５分間漬けた後に、０．１Ｍ−ＮａＰＢ
で３分間洗浄した。次に、７０％、９０％、及び１００
％エタノールに室温で各３分間浸漬して脱水し、クロロ
ホルムに室温で１０分間浸漬した。最後に、１００％エ
タノールに室温で３分間づつ２回浸漬し、風乾した。乾
燥した細胞を０．０７Ｎ−ＮａＯＨに２分間浸漬し、最
後に、０．１Ｍ−ＮａＰＢで室温で３分間洗浄した。

【００３９】１０％デキストラン硫酸ナトリウム塩、３
０％ホルムアミド、０．０２５％鮭精子ＤＮＡ、及び１
×デンハルト溶液を含む２×ＳＳＣ１００μｌに、実施
例２で調製したＡＰ標識プローブ（プローブＡ’又はプ
ローブＢ’）２ｐモルを溶解してスライドグラス上に広
げ、湿箱中で３７℃で約１６時間静置した。次に、２×
ＳＳＣで室温で１０分間洗浄し、０．１mM−ＺｎＣｌ₂
を含む１×ＳＳＣで４５℃で１．５〜２時間静置した。
３０分毎に新鮮な洗浄液に交換した。０．１mM−ＺｎＣ
ｌ₂ を含む１×ＳＳＣで室温で１０分間浸漬した後、
０．１mM−ＺｎＣｌ₂ と１０mM−ＭｇＣｌ₂ とを含む
０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH９．５）（以下、ＡＰ緩
衝液と称す）に３分間浸漬した。

【００４０】ＡＰ緩衝液１mlにＮＴＢ溶液４μｌ及びＢ
ＣＩＰ溶液４μｌを加えて混合し、その混合溶液約２０
０μｌを前記のスライドグラス上に広げ、湿箱中で２５
℃〜３０℃で約２４時間反応させた。発色は１０mM−Ｅ
ＤＴＡを含む１０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．５）で５
分間処理して停止し、１０mM−ＥＤＴＡ、１０mMトリス
塩酸緩衝液（pH７．５）を含む９０％グリセロール溶液
で封入して顕微鏡で観察した。これらの結果を図４に示
す。Ｂ９５−８細胞株はＥＢＶ−ＤＮＡを含んでおり、
プローブＡ’あるいはプローブＢ’のどちらを使用して
もＥＢＶ−ＤＮＡが検出されることが示された。

【００４１】

【発明の効果】本発明方法によれば、ＥＢＶ−ＤＮＡに
特異的なプライマーやプローブを用いるので、ＥＢＶの
迅速かつ正確な測定が可能である。

【００４２】

【配列表】

【００４３】配列番号：１ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： GTGCAGTAAC AGGTAATCTC TGGTA

【００４４】配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： ATAGCAGCAG CGCAGCCAAC CATAG

【００４５】配列番号：３ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： CAAGAACCCA GACGAGTCCG TAGAA

【００４６】配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： AAGAAGCATG TATACTAAGC CTCCC

【００４７】配列番号：５ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： CTACGCTGCC CTAGAGGTTT TGCTA

【００４８】配列番号：６ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： ATGCGGACCA CCAGCTGGTA CTTGA

【００４９】配列番号：７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： TTATGAGTGA CTGGACTGGA GGA

【００５０】配列番号：８ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： GTTAGATCTT ACCAAGTAAG CA

【００５１】配列番号：９ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： AAAGTCCTCC AGAGCTCTAA AGTGTCAGAT TTCGGGTCCA

【００５２】配列番号：１０ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： GAGGTCAGGT TACTTACCCC TGAAGGTGAA CCGCTTACCA

【００５３】配列番号：１１ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： AGCAGAGTCT GGGAAGACAA CCACAGACAC CGTCCTCACC

【００５４】配列番号：１２ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： AATTCCAAGG AACAATGCCT GTCCGTGCAA ATTCCAGAGA

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＣＲ法によるＥＢＶ−ＤＮＡの検出感度を調
べた電気泳動及びそのサザンブロットハイブリッドの結
果を示す図面に代わる写真である。レーン１はＥＢＶ−
ＤＮＡ５ｐｇ、レーン２はＥＢＶ−ＤＮＡ０．５ｐｇ、
レーン３はＥＢＶ−ＤＮＡ０．０５ｐｇ、レーン４はＥ
ＢＶ−ＤＮＡ０．００５ｐｇ、レーン５はＥＢＶ−ＤＮ
Ａ０．０００５ｐｇ、レーン６はＥＢＶ−ＤＮＡ０．０
０００５ｐｇ、ＭはＰＨＹＤＮＡ分子量マーカーであ
る。

【図２】ＥＢＶ及びその他のウイルスのＤＮＡを用いて
プライマーの特異性を調べた電気泳動の結果を示す図面
に代わる写真である。レーン１はＥＢＶ−ＤＮＡ、レー
ン２はＨＳＶ−Ｉ−ＤＮＡ、レーン３はＨＳＶ−II−Ｄ
ＮＡ、レーン４はＨＣＭＶ−ＤＮＡ、レーン５はＶＺＶ
−ＤＮＡ、レーン６はＨＨＶ−６−ＤＮＡ、ＭはＰＨＹ
ＤＮＡ分子量マーカーである。

【図３】ＥＢＶ非感染細胞株及びＥＢＶ感染細胞株のＤ
ＮＡを用いてプライマーの特異性を調べた電気泳動の結
果を示す図面に代わる写真である。レーン１はＢＪＡＢ
細胞株、レーン２はＭｏｌｔ４細胞株、レーン３はＲａ
ｊｉ細胞株、レーン４はＢ９５−８細胞株、レーン５は
Ｐ３ＨＲ−１細胞株、レーン６はＡＫＡＴＡ細胞株、Ｍ
はＰＨＹＤＮＡ分子量マーカーである。

【図４】プローブＡ’及びＢ’でＥＢＶ−ＤＮＡを検出
した結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はプロ
ーブＡ’、（Ｂ）はプローブＢ’を用いたｉｎ ｓｉｔ
ｕハイブリダイゼーションによるＢ９５−８細胞株中の
ＥＢＶ−ＤＮＡの検出である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 喜多 寛 東京都千代田区東神田１丁目11番４号 株式会社ヤトロン内 (56)参考文献 特開 昭61−257188（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/09 C12Q 1/68 - 1/70 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列表における配列番号１の配列
   で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含有
   する第１のＤＮＡプライマーと配列表における配列番号
   ２の配列で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチ
   ドを含有する第２のＤＮＡプライマーとの組合せ、及び （ｂ）配列表における配列番号３の配列で表される塩基
   配列からなるオリゴヌクレオチドを含有する第１のＤＮ
   Ａプライマーと配列表における配列番号４の配列で表さ
   れる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含有する第
   ２のＤＮＡプライマーとの組合せからなる群から選ん
   だ、第１のプライマーと第２のプライマーとの組合せ少
   なくとも１種とＤＮＡポリメラーゼと水性液体被検試料
   とを含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけ、 続いて得られた反応液を、配列表における配列番号９又
   は配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌク
   レオチドを含有し、標識を担持するプローブを用いるＤ
   ＮＡ検査工程にかけることを特徴とする、エプスタイン
   −バールウイルスの検出方法。