JPH07115975A - ヒトヘルペスウイルス７検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 - Google Patents
ヒトヘルペスウイルス７検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途Info
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- JPH07115975A JPH07115975A JP5247025A JP24702593A JPH07115975A JP H07115975 A JPH07115975 A JP H07115975A JP 5247025 A JP5247025 A JP 5247025A JP 24702593 A JP24702593 A JP 24702593A JP H07115975 A JPH07115975 A JP H07115975A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 簡便、迅速、特異的且つ高感度にヒトヘルペ
スウイルス７を検出可能なオリゴヌクレオチドを提供す
る。 【構成】 配列表・配列番号１〜６（但し、Ａはアデニ
ン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。
また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されても
よい。）に示す核酸配列を有するか、またはそれらの相
補的配列を有するヒトヘルペスウイルス７検出用オリゴ
ヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを標識化した標識
核酸プローブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑さ
せ、交雑した結合体の標識を測定する試料中のヒトヘル
ペスウイルス７の検出法および該オリゴヌクレオチドで
ある核酸プライマー、または該オリゴヌクレオチドを標
識化した標識核酸プライマーを試料中のＤＮＡまたはＲ
ＮＡと交雑させ、プライマー伸長させ、得られたプライ
マー伸長物を測定する試料中のヒトヘルペスウイルス７
の検出法ならびにそれらに使用する試薬キット。
スウイルス７を検出可能なオリゴヌクレオチドを提供す
る。 【構成】 配列表・配列番号１〜６（但し、Ａはアデニ
ン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。
また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されても
よい。）に示す核酸配列を有するか、またはそれらの相
補的配列を有するヒトヘルペスウイルス７検出用オリゴ
ヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを標識化した標識
核酸プローブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑さ
せ、交雑した結合体の標識を測定する試料中のヒトヘル
ペスウイルス７の検出法および該オリゴヌクレオチドで
ある核酸プライマー、または該オリゴヌクレオチドを標
識化した標識核酸プライマーを試料中のＤＮＡまたはＲ
ＮＡと交雑させ、プライマー伸長させ、得られたプライ
マー伸長物を測定する試料中のヒトヘルペスウイルス７
の検出法ならびにそれらに使用する試薬キット。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒトヘルペスウイルス７
(Human Herpesvirus 7、以下、ＨＨＶ−７と略すことが
ある）を簡便かつ迅速に検出することに関する。
(Human Herpesvirus 7、以下、ＨＨＶ−７と略すことが
ある）を簡便かつ迅速に検出することに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＨＨＶ−７は１９９０年に初めて分離さ
れた新しいヒトヘルペスウイルスである。ＨＨＶ−７は
乳幼児に突発性発疹をおこすＨＨＶ−６と近縁関係にあ
り、ＨＨＶ−７自身も乳幼児に発疹をおこすことが明ら
かにされている。最近、ＨＨＶ−６はエイズウイルスと
密接な関連を有することが報告された。また臓器移植、
癌などで免疫抑制剤を投与した場合、高頻度に検出され
ることから免疫抑制状態の管理の指標としても注目され
ている。ＨＨＶ−７もまた、エイズ患者や臓器移植後の
免疫抑制状態の患者より高頻度に分離されることから、
ＨＨＶ−６と同様にその診断意義が注目されている。
れた新しいヒトヘルペスウイルスである。ＨＨＶ−７は
乳幼児に突発性発疹をおこすＨＨＶ−６と近縁関係にあ
り、ＨＨＶ−７自身も乳幼児に発疹をおこすことが明ら
かにされている。最近、ＨＨＶ−６はエイズウイルスと
密接な関連を有することが報告された。また臓器移植、
癌などで免疫抑制剤を投与した場合、高頻度に検出され
ることから免疫抑制状態の管理の指標としても注目され
ている。ＨＨＶ−７もまた、エイズ患者や臓器移植後の
免疫抑制状態の患者より高頻度に分離されることから、
ＨＨＶ−６と同様にその診断意義が注目されている。
【０００３】ＨＨＶ−７を検出する方法としては、患者
の血液中のリンパ球を培養した後、抗血清で反応させて
蛍光抗体法で抗原となるＨＨＶ−７を検出する方法が報
告されている。しかしこの方法ではリンパ球を培養する
のに数日間を要し、迅速な診断はできない。また、患者
血清中の抗体を測定する方法もあるが、この場合、患者
に抗体が産生される回復期まで少なくとも１週間かか
り、やはり迅速診断はできない。
の血液中のリンパ球を培養した後、抗血清で反応させて
蛍光抗体法で抗原となるＨＨＶ−７を検出する方法が報
告されている。しかしこの方法ではリンパ球を培養する
のに数日間を要し、迅速な診断はできない。また、患者
血清中の抗体を測定する方法もあるが、この場合、患者
に抗体が産生される回復期まで少なくとも１週間かか
り、やはり迅速診断はできない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、簡便、迅速、特異的且つ高感度にヒトヘルペスウイ
ルス７を検出可能なオリゴヌクレオチドを提供すること
である。
は、簡便、迅速、特異的且つ高感度にヒトヘルペスウイ
ルス７を検出可能なオリゴヌクレオチドを提供すること
である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らはＨＨＶ−７
の遺伝子に関する種々の検討を重ねた結果、簡便、迅
速、特異的かつ高感度にＨＨＶ−７を検出できる配列を
有するオリゴヌクレオチドを得、それを用いた検出方法
を確立し、本発明を完成させるに至った。
の遺伝子に関する種々の検討を重ねた結果、簡便、迅
速、特異的かつ高感度にＨＨＶ−７を検出できる配列を
有するオリゴヌクレオチドを得、それを用いた検出方法
を確立し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】すなわち本発明は配列表・配列番号１〜６
（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、
Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル
（Ｕ）と置換されてもよい。）に示す核酸配列を有する
か、またはそれらの相補的配列を有することを特徴とす
るヒトヘルペスウイルス７検出用オリゴヌクレオチドで
ある。
（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、
Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル
（Ｕ）と置換されてもよい。）に示す核酸配列を有する
か、またはそれらの相補的配列を有することを特徴とす
るヒトヘルペスウイルス７検出用オリゴヌクレオチドで
ある。
【０００７】また本発明は上記ヒトヘルペスウイルス７
検出用オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プロー
ブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交雑した
結合体の標識を測定することを特徴とする試料中のヒト
ヘルペスウイルス７の検出法である。
検出用オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プロー
ブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交雑した
結合体の標識を測定することを特徴とする試料中のヒト
ヘルペスウイルス７の検出法である。
【０００８】さらに本発明は上記ヒトヘルペスウイルス
７検出用オリゴヌクレオチドである核酸プライマー、ま
たは該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライ
マーを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、プライ
マー伸長させ、得られたプライマー伸長物を測定するこ
とを特徴とする試料中のヒトヘルペスウイルス７の検出
法である。
７検出用オリゴヌクレオチドである核酸プライマー、ま
たは該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライ
マーを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、プライ
マー伸長させ、得られたプライマー伸長物を測定するこ
とを特徴とする試料中のヒトヘルペスウイルス７の検出
法である。
【０００９】また本発明は上記ヒトヘルペスウイルス７
検出用オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プロー
ブを含むことを特徴とする試料中のヒトヘルペスウイル
ス７の検出用試薬キットである。
検出用オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プロー
ブを含むことを特徴とする試料中のヒトヘルペスウイル
ス７の検出用試薬キットである。
【００１０】さらに本発明は上記ヒトヘルペスウイルス
７検出用オリゴヌクレオチドである核酸プライマー、ま
たは該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライ
マーを含むことを特徴とする試料中のヒトヘルペスウイ
ルス７の検出用試薬キットである。
７検出用オリゴヌクレオチドである核酸プライマー、ま
たは該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライ
マーを含むことを特徴とする試料中のヒトヘルペスウイ
ルス７の検出用試薬キットである。
【００１１】本発明のヒトヘルペスウイルス７検出用オ
リゴヌクレオチドは、配列表・配列番号１〜６（但し、
Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミ
ンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置
換されてもよい。）に示す核酸配列を有するか、または
それらの相補的配列を有するものであり、ヘルペスウイ
ルスに特異的に反応する。一般にオリゴヌクレオチドは
化学合成により調製できるので、クローン化したオリゴ
ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに比べ容易、大量
且つ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得ることが
可能である。本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリ
ボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リ
ボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基
（Ｕ）と読み替えることは言うまでもない。また合成に
際して任意の位置のＴをＵに変えて合成を行ない、ウリ
ジン残基を含むＤＮＡであってもよい。同様に任意のＵ
をＴに変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってもよ
い。またオリゴヌクレオチド中に欠失、挿入あるいは置
換といった点突然変異や、修飾ヌクレオチドがあっても
よい。
リゴヌクレオチドは、配列表・配列番号１〜６（但し、
Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミ
ンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置
換されてもよい。）に示す核酸配列を有するか、または
それらの相補的配列を有するものであり、ヘルペスウイ
ルスに特異的に反応する。一般にオリゴヌクレオチドは
化学合成により調製できるので、クローン化したオリゴ
ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに比べ容易、大量
且つ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得ることが
可能である。本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリ
ボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リ
ボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基
（Ｕ）と読み替えることは言うまでもない。また合成に
際して任意の位置のＴをＵに変えて合成を行ない、ウリ
ジン残基を含むＤＮＡであってもよい。同様に任意のＵ
をＴに変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってもよ
い。またオリゴヌクレオチド中に欠失、挿入あるいは置
換といった点突然変異や、修飾ヌクレオチドがあっても
よい。
【００１２】本発明の標識核酸プローブは、上記ヒトヘ
ルペスウイルス７検出用オリゴヌクレオチドに標識を結
合したものであり、標識物としては放射性物質や酵素、
蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶
性担体などの公知の標識を用いることができる。標識の
仕方は末端標識でも、配列の途中に標識してもよい。ま
た糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。
ルペスウイルス７検出用オリゴヌクレオチドに標識を結
合したものであり、標識物としては放射性物質や酵素、
蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶
性担体などの公知の標識を用いることができる。標識の
仕方は末端標識でも、配列の途中に標識してもよい。ま
た糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。
【００１３】本発明の核酸プライマーは、上記ヒトヘル
ペスウイルス７検出用オリゴヌクレオチドをそのまま使
用するか、あるいは該オリゴヌクレオチドを標識化した
ものを使用する。
ペスウイルス７検出用オリゴヌクレオチドをそのまま使
用するか、あるいは該オリゴヌクレオチドを標識化した
ものを使用する。
【００１４】本発明のヒトヘルペスウイルス７検出用オ
リゴヌクレオチドを用いてＨＨＶ−７を検出する場合、
（１）本発明オリゴヌクレオチドをプローブとして検出
する方法、（２）本発明オリゴヌクレオチドをプライマ
ーとしてＤＮＡポリメラーゼ等により伸長反応させて、
検出する方法がある。上記（２）の場合、上記オリゴヌ
クレオチドに標識を導入することにより検出が容易に可
能となる。プライマーに標識を導入しない場合は、標識
プローブを用いて検出する。
リゴヌクレオチドを用いてＨＨＶ−７を検出する場合、
（１）本発明オリゴヌクレオチドをプローブとして検出
する方法、（２）本発明オリゴヌクレオチドをプライマ
ーとしてＤＮＡポリメラーゼ等により伸長反応させて、
検出する方法がある。上記（２）の場合、上記オリゴヌ
クレオチドに標識を導入することにより検出が容易に可
能となる。プライマーに標識を導入しない場合は、標識
プローブを用いて検出する。
【００１５】上記（１）の場合、本発明のオリゴヌクレ
オチドを標識化した標識核酸プローブを試料中のＤＮＡ
またはＲＮＡと交雑させ、交雑した結合体の標識を適当
な検出法で検出することで達成される。
オチドを標識化した標識核酸プローブを試料中のＤＮＡ
またはＲＮＡと交雑させ、交雑した結合体の標識を適当
な検出法で検出することで達成される。
【００１６】一方、上記（２）の場合、本発明のオリゴ
ヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとするか、また
は該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライマ
ーを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、ＤＮＡポ
リメラーゼ等によりプライマーを伸長させ、得られたプ
ライマー伸長物を直接、測定するか、標識プローブを用
いて測定する。本発明のオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼ等を使用する
遺伝子増幅（ＰＣＲ等）を行なうことにより、ＨＨＶ−
７の遺伝子のみを特異的に増幅することができる。増幅
反応に際しては反応時に放射性物質などの標識結合した
ヌクレオチドを取り込ませる方法や、増幅産物を電気泳
動により分画して特異なバンドを検出することにより、
容易にＨＨＶ−７を検出することができる。また前述の
標識オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いれば増
幅産物を直接検出することも可能である。
ヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとするか、また
は該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライマ
ーを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、ＤＮＡポ
リメラーゼ等によりプライマーを伸長させ、得られたプ
ライマー伸長物を直接、測定するか、標識プローブを用
いて測定する。本発明のオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼ等を使用する
遺伝子増幅（ＰＣＲ等）を行なうことにより、ＨＨＶ−
７の遺伝子のみを特異的に増幅することができる。増幅
反応に際しては反応時に放射性物質などの標識結合した
ヌクレオチドを取り込ませる方法や、増幅産物を電気泳
動により分画して特異なバンドを検出することにより、
容易にＨＨＶ−７を検出することができる。また前述の
標識オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いれば増
幅産物を直接検出することも可能である。
【００１７】本発明のヒトヘルペスウイルス７検出用の
試薬キットは、本発明のヒトヘルペスウイルス７検出用
オリゴヌクレオチドもしくはこのオリゴヌクレオチドを
適当な標識剤で標識化してなる標識オリゴヌクレオチド
を含むものである。核酸プライマーを含む試薬キットに
は標識プローブを含んでいてもよい。またその他の成分
としては、標識検出物質や緩衝液などを含む。さらに核
酸プライマーまたは標識核酸プライマーを含む本発明の
試薬キットには、他の成分として、核酸合成酵素（ＤＮ
Ａポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素な
ど）、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチ
ド）、標識検出物質や緩衝液などを含む。
試薬キットは、本発明のヒトヘルペスウイルス７検出用
オリゴヌクレオチドもしくはこのオリゴヌクレオチドを
適当な標識剤で標識化してなる標識オリゴヌクレオチド
を含むものである。核酸プライマーを含む試薬キットに
は標識プローブを含んでいてもよい。またその他の成分
としては、標識検出物質や緩衝液などを含む。さらに核
酸プライマーまたは標識核酸プライマーを含む本発明の
試薬キットには、他の成分として、核酸合成酵素（ＤＮ
Ａポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素な
ど）、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチ
ド）、標識検出物質や緩衝液などを含む。
【００１８】また、本発明のオリゴヌクレオチドを固相
担体に結合して、捕捉プローブとして用いることもでき
る。この場合、捕捉プローブと標識（核酸）プローブの
組合せでサンドイッチアッセイを行ってもよいし、標的
核酸を標識して捕捉する方法もある。また、オリゴヌク
レオチドをビオチンで標識し、ハイブリダイゼーション
後、アビジン結合担体で捕捉する方法もある。サンドイ
ッチアッセイにおいてはどちらか一方に本発明のオリゴ
ヌクレオチドを用いれば、該オリゴヌクレオチドで特異
的な測定が可能となり、他方のオリゴヌクレオチドの特
異性は若干低くてもなんら問題はない。
担体に結合して、捕捉プローブとして用いることもでき
る。この場合、捕捉プローブと標識（核酸）プローブの
組合せでサンドイッチアッセイを行ってもよいし、標的
核酸を標識して捕捉する方法もある。また、オリゴヌク
レオチドをビオチンで標識し、ハイブリダイゼーション
後、アビジン結合担体で捕捉する方法もある。サンドイ
ッチアッセイにおいてはどちらか一方に本発明のオリゴ
ヌクレオチドを用いれば、該オリゴヌクレオチドで特異
的な測定が可能となり、他方のオリゴヌクレオチドの特
異性は若干低くてもなんら問題はない。
【００１９】
【実施例】以下に、本発明の実施例を例示することによ
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。 実施例１ （各種オリゴヌクレオチドの合成） ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列表・配列番号１〜６に示される
配列を有するオリゴヌクレオチドを各種合成した。以
下、配列表・配列番号１〜６に示される各種オリゴヌク
レオチドを、それぞれオリゴヌクレオチド (1)〜(6) と
呼ぶ。手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、０．２μＭス
ケールで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護は
アンモニア水で５５℃一夜実施した。精製はファルマシ
ア社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施した。なお合成し
たオリゴヌクレオチドは必要により以下の方法で５’末
端に32Ｐ−リン酸基を結合させた。
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。 実施例１ （各種オリゴヌクレオチドの合成） ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列表・配列番号１〜６に示される
配列を有するオリゴヌクレオチドを各種合成した。以
下、配列表・配列番号１〜６に示される各種オリゴヌク
レオチドを、それぞれオリゴヌクレオチド (1)〜(6) と
呼ぶ。手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、０．２μＭス
ケールで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護は
アンモニア水で５５℃一夜実施した。精製はファルマシ
ア社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施した。なお合成し
たオリゴヌクレオチドは必要により以下の方法で５’末
端に32Ｐ−リン酸基を結合させた。
【００２０】 反応液組成 オリゴヌクレオチド ５〜２０pmoles １０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液 １０μｌ １mM [γ-32PＡＴＰ(10mCi/ml) １μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡製） １０単位 水 全量が１００μｌとなる量 上記のように調製した反応混合液を３７℃で１時間反応
させた。ここで１０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩
衝液とは、0.5M Tris-HCl(pH8.0)、0.1M MgCl2、 0.1M
2-メルカプトエタノールを示す。
させた。ここで１０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩
衝液とは、0.5M Tris-HCl(pH8.0)、0.1M MgCl2、 0.1M
2-メルカプトエタノールを示す。
【００２１】実施例２ （ヒトヘルペスウイルス７核酸
の増幅） （１）キットＡ：ヒトヘルペスウイルス７由来核酸を増
幅するためのキット （ａ）実施例１のオリゴヌクレオチド(1) （ｂ）実施例１のオリゴヌクレオチド(2) （ｃ）実施例１のオリゴヌクレオチド(3) （ｄ）実施例１のオリゴヌクレオチド(4) （ｅ）ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）， ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
の増幅） （１）キットＡ：ヒトヘルペスウイルス７由来核酸を増
幅するためのキット （ａ）実施例１のオリゴヌクレオチド(1) （ｂ）実施例１のオリゴヌクレオチド(2) （ｃ）実施例１のオリゴヌクレオチド(3) （ｄ）実施例１のオリゴヌクレオチド(4) （ｅ）ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）， ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
【００２２】（２）ウイルス核酸の調製 ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）の標準株として
ＲＫ株を培養して用いた。また、特異性を確認するため
に、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１；Ｈｕｍａ
ｎ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １）Ｓｅ
ｉｂｅｒｔ株、同２型（ＨＳＶ−２）ＵＷ２６８株、水
痘ー帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）河口株、ＥＢウイルス
（ＥＢＶ；Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）Ｂ
９５−８株、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ；ｃｙ
ｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）ＡＤ１６９株、ヒトヘル
ペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）Ａ型（Ｕ１１０２）
株、Ｂ型（橋本株）、およびヒト胎盤ＤＮＡ（シグマ社
製）を用いた。ウイルス核酸は常法により調製した。
ＲＫ株を培養して用いた。また、特異性を確認するため
に、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１；Ｈｕｍａ
ｎ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １）Ｓｅ
ｉｂｅｒｔ株、同２型（ＨＳＶ−２）ＵＷ２６８株、水
痘ー帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）河口株、ＥＢウイルス
（ＥＢＶ；Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）Ｂ
９５−８株、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ；ｃｙ
ｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）ＡＤ１６９株、ヒトヘル
ペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）Ａ型（Ｕ１１０２）
株、Ｂ型（橋本株）、およびヒト胎盤ＤＮＡ（シグマ社
製）を用いた。ウイルス核酸は常法により調製した。
【００２３】ＰＣＲ 反応液９３μｌに前記核酸溶液５μｌ、実施例１のオリ
ゴヌクレオチド(1) と(4) 、または同オリゴヌクレオチ
ド(2) と(3) １μｌずつをプライマーとして加え、ヒト
ヘルペスウイルス７由来核酸の増幅を行った。反応液組
成は次の通りである。 ＫＣｌ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ ゼラチン ０．０１％ dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各０．２ｍＭ Tth DNA ポリメラーゼ ４０単位／ｍｌ 反応条件は次の通りである。 熱変性： ９４℃、１分、 アニーリング：５０℃、２分 重合反応： ７５℃、１．５分 これらの操作はパーキン−エルマー／シータス(Perkin-
Elmer/Cetus)社のＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、
３０回繰り返した。
ゴヌクレオチド(1) と(4) 、または同オリゴヌクレオチ
ド(2) と(3) １μｌずつをプライマーとして加え、ヒト
ヘルペスウイルス７由来核酸の増幅を行った。反応液組
成は次の通りである。 ＫＣｌ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ ゼラチン ０．０１％ dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各０．２ｍＭ Tth DNA ポリメラーゼ ４０単位／ｍｌ 反応条件は次の通りである。 熱変性： ９４℃、１分、 アニーリング：５０℃、２分 重合反応： ７５℃、１．５分 これらの操作はパーキン−エルマー／シータス(Perkin-
Elmer/Cetus)社のＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、
３０回繰り返した。
【００２４】検出 １０μｌの反応液を２％アガロースゲル電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色した後、紫外線での蛍光を検出
した（図１および図２）。泳動の電気的条件は、定電圧
１００Ｖ、時間は３０分行った。操作方法並びに他の条
件はManiatisらのMolecular Cloning(1982) に記載の方
法に従った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動
し、相対泳動度の比較により、検出されたヌクレオチド
断片の長さを算出した。
チジウムブロマイド染色した後、紫外線での蛍光を検出
した（図１および図２）。泳動の電気的条件は、定電圧
１００Ｖ、時間は３０分行った。操作方法並びに他の条
件はManiatisらのMolecular Cloning(1982) に記載の方
法に従った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動
し、相対泳動度の比較により、検出されたヌクレオチド
断片の長さを算出した。
【００２５】結果 ＰＣＲ産物はヒトヘルペスウイルス７を用いたときのみ
バンドが観察された（レーン９）。分子量マーカーよ
り、そのサイズはオリゴヌクレオチド(1) と(4)を用い
た時、３７０塩基対（図１）、また、同オリゴヌクレオ
チド(2) と(3) を用いた時、２６５塩基対（図２）と同
定された。これは核酸配列から計算されるヌクレオチド
の長さとよく一致した。
バンドが観察された（レーン９）。分子量マーカーよ
り、そのサイズはオリゴヌクレオチド(1) と(4)を用い
た時、３７０塩基対（図１）、また、同オリゴヌクレオ
チド(2) と(3) を用いた時、２６５塩基対（図２）と同
定された。これは核酸配列から計算されるヌクレオチド
の長さとよく一致した。
【００２６】実施例３ （ヒトヘルペスウイルス７の特
異検出） 実施例２の増幅産物がヒトヘルペスウイルス７に由来す
るものか特定するためにドット・ブロット・ハイブリダ
イゼーションを行った。 （１）キットＢ：ヒトヘルペスウイルス７由来核酸を検
出するためのキット 実施例１のオリゴヌクレオチド(5) 、(6) で、５’末端
に、32Ｐ−リン酸基を有している。 （２）ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション 実施例２のＰＣＲ産物１μｌに０．３規定のＮａＯＨを
１００μｌ加え、室温で１５分間変性し、ドットブロッ
ター（ＢＲＬ社製）を用いて５×ＳＳＣで湿潤したナイ
ロン膜（ハイボンドＮプラス、アマシャム社製）にブロ
ットした。なおＳＳＣとは１５ｍＭクエン酸三ナトリウ
ム、１５ｍＭ塩化ナトリウム溶液を示し、５×ＳＳＣと
はＳＳＣの５倍濃厚液を示す。この膜を８０℃、３０分
間加熱処理して核酸を固定化した後、ハイブリダイゼー
ションを行った。まず、乾燥した膜（８×１２ｃｍ）を
５×ＳＳＣに５分間浸した。次にハイブリダイゼーショ
ンバック（ＢＲＬ社製）に膜を移し、ハイブリダイゼー
ションバッファー（５×ＳＳＣ、０．５％ウシ血清アル
ブミン、０．５％ポリビニールピロリドン、１％ドデシ
ル硫酸ナトリウム）５ｍｌを加えてポリシーラーでシー
ルし、５０℃、１５分間プレハイブリダイゼーションを
行った。次にキットＢのオリゴヌクレオチドプローブ
(5) 、(6) の中のいずれか５μｌを含むハイブリダイゼ
ーションバッファー５ｍｌで５５℃、１５分間ハイブリ
ダイゼーションを行った。膜をポリバックから取り出
し、洗浄液−１（１×ＳＳＣ、１％ドデシル硫酸ナトリ
ウム）で５５℃、５分間で２回、振とう洗浄した。洗浄
液−２（１×ＳＳＣ）で室温、５分間で２回、振とう洗
浄した後、膜を充分乾燥させた。
異検出） 実施例２の増幅産物がヒトヘルペスウイルス７に由来す
るものか特定するためにドット・ブロット・ハイブリダ
イゼーションを行った。 （１）キットＢ：ヒトヘルペスウイルス７由来核酸を検
出するためのキット 実施例１のオリゴヌクレオチド(5) 、(6) で、５’末端
に、32Ｐ−リン酸基を有している。 （２）ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション 実施例２のＰＣＲ産物１μｌに０．３規定のＮａＯＨを
１００μｌ加え、室温で１５分間変性し、ドットブロッ
ター（ＢＲＬ社製）を用いて５×ＳＳＣで湿潤したナイ
ロン膜（ハイボンドＮプラス、アマシャム社製）にブロ
ットした。なおＳＳＣとは１５ｍＭクエン酸三ナトリウ
ム、１５ｍＭ塩化ナトリウム溶液を示し、５×ＳＳＣと
はＳＳＣの５倍濃厚液を示す。この膜を８０℃、３０分
間加熱処理して核酸を固定化した後、ハイブリダイゼー
ションを行った。まず、乾燥した膜（８×１２ｃｍ）を
５×ＳＳＣに５分間浸した。次にハイブリダイゼーショ
ンバック（ＢＲＬ社製）に膜を移し、ハイブリダイゼー
ションバッファー（５×ＳＳＣ、０．５％ウシ血清アル
ブミン、０．５％ポリビニールピロリドン、１％ドデシ
ル硫酸ナトリウム）５ｍｌを加えてポリシーラーでシー
ルし、５０℃、１５分間プレハイブリダイゼーションを
行った。次にキットＢのオリゴヌクレオチドプローブ
(5) 、(6) の中のいずれか５μｌを含むハイブリダイゼ
ーションバッファー５ｍｌで５５℃、１５分間ハイブリ
ダイゼーションを行った。膜をポリバックから取り出
し、洗浄液−１（１×ＳＳＣ、１％ドデシル硫酸ナトリ
ウム）で５５℃、５分間で２回、振とう洗浄した。洗浄
液−２（１×ＳＳＣ）で室温、５分間で２回、振とう洗
浄した後、膜を充分乾燥させた。
【００２７】（３）検出 ナイロン膜にＸ線フィルム（New AIF RX 富士写真工業
製）を密着させ、−８０℃で一昼夜感光させた。フィル
ムの感光度からヒトヘルペスウイルス７の検出を行っ
た。 結果 それぞれのウイルスに特異的なオリゴヌクレオチド・プ
ローブはそれぞれのウイルス由来の増幅産物のみと特異
的に反応し、他のウイルス由来や、ヒトＤＮＡ由来の増
幅産物との反応は観察されなかった（表１）。
製）を密着させ、−８０℃で一昼夜感光させた。フィル
ムの感光度からヒトヘルペスウイルス７の検出を行っ
た。 結果 それぞれのウイルスに特異的なオリゴヌクレオチド・プ
ローブはそれぞれのウイルス由来の増幅産物のみと特異
的に反応し、他のウイルス由来や、ヒトＤＮＡ由来の増
幅産物との反応は観察されなかった（表１）。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【発明の効果】本発明により従来は培養に時間のかかっ
たヒトヘルペスウイルス７を迅速、簡便に特異的且つ高
感度で測定することが可能となった。本発明のオリゴヌ
クレオチドは増幅反応のプライマーとしても、直接検出
用のプローブとしても用いることが可能である。またプ
ライマーにより増幅した増幅産物をプローブで検出する
ことにより、感度、特異性をさらに高くすることも可能
で、その臨床的意義は大きい。
たヒトヘルペスウイルス７を迅速、簡便に特異的且つ高
感度で測定することが可能となった。本発明のオリゴヌ
クレオチドは増幅反応のプライマーとしても、直接検出
用のプローブとしても用いることが可能である。またプ
ライマーにより増幅した増幅産物をプローブで検出する
ことにより、感度、特異性をさらに高くすることも可能
で、その臨床的意義は大きい。
【００３０】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..21 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒトヘルペスウイルス７に特異的な配列。 配列 ATGGGAAGTA AAGTGCAAG AT 21
【００３１】配列番号：２ 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..22 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒトヘルペスウイルス７に特異的な配列。 配列 CCAACCCTAC TGTAAATAGT TG 22
【００３２】配列番号：３ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..21 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒトヘルペスウイルス７に特異的な配列。 配列 CTAGCTTCTG ACTCATTATG G 21
【００３３】配列番号：４ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..18 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒトヘルペスウイルス７に特異的な配列。 配列 TTGCCACAAA AGCGTCGC 18
【００３４】配列番号：５ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..30 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒトヘルペスウイルス７に特異的な配列。 配列 CATTACTCCA GTGACTTCCG ATATTAATTT 30
【００３５】配列番号：６ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..30 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒトヘルペスウイルス７に特異的な配列。 配列 CTTTCGGTAA GATAAATAAG CAATCACAAT 30
【図１】オリゴヌクレオチド(1) と(4) をプライマーと
して用いた場合の電気泳動結果を示す。
して用いた場合の電気泳動結果を示す。
【図２】オリゴヌクレオチド(2) と(3) をプライマーと
して用いた場合の電気泳動結果を示す。
して用いた場合の電気泳動結果を示す。
レーン２〜１０は、それぞれＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、
ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６（Ａ）、ＨＨＶ−
６（Ｂ）、ＨＨＶ−７およびヒト胎盤ＤＮＡを示す。ま
たレーン１、１１は分子量マーカーを示す。
ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６（Ａ）、ＨＨＶ−
６（Ｂ）、ＨＨＶ−７およびヒト胎盤ＤＮＡを示す。ま
たレーン１、１１は分子量マーカーを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 近藤 元宏 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内 (72)発明者 宝田 裕 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内 (72)発明者 瀬川 昌也 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内
Claims (5)
- 【請求項１】 配列表・配列番号１〜６（但し、Ａはア
デニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
てもよい。）に示す核酸配列を有するか、またはそれら
の相補的配列を有することを特徴とするヒトヘルペスウ
イルス７検出用オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 請求項１に記載されるヒトヘルペスウイ
ルス７検出用オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸
プローブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交
雑した結合体の標識を測定することを特徴とする試料中
のヒトヘルペスウイルス７の検出法。 - 【請求項３】 請求項１に記載されるヒトヘルペスウイ
ルス７検出用オリゴヌクレオチドである核酸プライマ
ー、または該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸
プライマーを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、
プライマー伸長させ、得られたプライマー伸長物を測定
することを特徴とする試料中のヒトヘルペスウイルス７
の検出法。 - 【請求項４】 請求項１に記載されるヒトヘルペスウイ
ルス７検出用オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸
プローブを含むことを特徴とする試料中のヒトヘルペス
ウイルス７の検出用試薬キット。 - 【請求項５】 請求項１に記載されるヒトヘルペスウイ
ルス７検出用オリゴヌクレオチドである核酸プライマ
ー、または該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸
プライマーを含むことを特徴とする試料中のヒトヘルペ
スウイルス７の検出用試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5247025A JPH07115975A (ja) | 1993-10-01 | 1993-10-01 | ヒトヘルペスウイルス７検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5247025A JPH07115975A (ja) | 1993-10-01 | 1993-10-01 | ヒトヘルペスウイルス７検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07115975A true JPH07115975A (ja) | 1995-05-09 |
Family
ID=17157292
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5247025A Pending JPH07115975A (ja) | 1993-10-01 | 1993-10-01 | ヒトヘルペスウイルス７検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07115975A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112322795A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-02-05 | 苏州药明检测检验有限责任公司 | 实时荧光定量pcr检测hhv7病毒的方法及试剂盒 |
-
1993
- 1993-10-01 JP JP5247025A patent/JPH07115975A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112322795A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-02-05 | 苏州药明检测检验有限责任公司 | 实时荧光定量pcr检测hhv7病毒的方法及试剂盒 |
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