JPH05192159A - ヒトヘルペスウィルス６検出用オリゴヌクレオチド、これを用いたヒトヘルペスウィルス６の検出法及び検出用キット - Google Patents
ヒトヘルペスウィルス６検出用オリゴヌクレオチド、これを用いたヒトヘルペスウィルス６の検出法及び検出用キットInfo
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- JPH05192159A JPH05192159A JP3017992A JP3017992A JPH05192159A JP H05192159 A JPH05192159 A JP H05192159A JP 3017992 A JP3017992 A JP 3017992A JP 3017992 A JP3017992 A JP 3017992A JP H05192159 A JPH05192159 A JP H05192159A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 次に示す核酸配列
GCCCATAATA AAGTGACCAT ATGAG、
AAACTTTGTG TAGGTGGTCG AATGC GAC、
TTCTAGCGGA TCGTTGACGT CTGTG、
GATACGAACA ACTACACTTC CAAAG、
ACAGCGCAGC AACATGTTTC AGAGC、
AGACGACCTA TATGGAGATG TACTGGGAGA GTATGTTGGT GAGT
、または ATAGAGCCGA TCGGTCCTAA T を有するか、またはそれらの相補的配列を有するヒトヘ
ルペスウィルス６検出用オリゴヌクレオチド。 【効果】 本発明のオリゴヌクレオチドは増幅反応のプ
ライマーとして、または直接検出用のプローブとして用
いることにより、ＨＨＶ６を迅速、簡便、特異的かつ高
感度に測定することが可能となる。
、または ATAGAGCCGA TCGGTCCTAA T を有するか、またはそれらの相補的配列を有するヒトヘ
ルペスウィルス６検出用オリゴヌクレオチド。 【効果】 本発明のオリゴヌクレオチドは増幅反応のプ
ライマーとして、または直接検出用のプローブとして用
いることにより、ＨＨＶ６を迅速、簡便、特異的かつ高
感度に測定することが可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒトヘルペスウィルス６
（Ｈｕｍａｎ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ６：ＨＨＶ６
と略すことがある）を簡便かつ迅速に検出することに関
する。
（Ｈｕｍａｎ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ６：ＨＨＶ６
と略すことがある）を簡便かつ迅速に検出することに関
する。
【０００２】
【従来技術】ＨＨＶ６は乳幼児に突発性発疹をおこすヘ
ルペスウィルスとして知られている。突発性発疹はほと
んど１００％の子供が感染するポピュラーな疾患である
が原因となるウィルスに関する情報は最近まで不明であ
った。現在、このＨＨＶ６はエイズウィルスと同様にリ
ンパ球のＴ細胞にとりつき、生体の免疫力が低下したと
きに活性化することから、エイズ発症との関連が注目さ
れている。また臓器移植、癌などで免疫抑制剤を投与し
た場合、高率に検出されることから免疫抑制状態の管理
の指標としても注目されている。ＨＨＶ６を検出する方
法としては、患者の血液中のリンパ球を培養した後、抗
血清で反応させて蛍光抗体法で抗原となるＨＨＶ６を検
出する方法が報告されている。しかしこの方法ではリン
パ球を培養するのに数日間を要し、迅速な診断はできな
い。また、患者血清中の抗体を測定する方法があるが、
この場合患者に抗体が産生される回復期まで少なくとも
１週間かかりやはり迅速診断はできない。
ルペスウィルスとして知られている。突発性発疹はほと
んど１００％の子供が感染するポピュラーな疾患である
が原因となるウィルスに関する情報は最近まで不明であ
った。現在、このＨＨＶ６はエイズウィルスと同様にリ
ンパ球のＴ細胞にとりつき、生体の免疫力が低下したと
きに活性化することから、エイズ発症との関連が注目さ
れている。また臓器移植、癌などで免疫抑制剤を投与し
た場合、高率に検出されることから免疫抑制状態の管理
の指標としても注目されている。ＨＨＶ６を検出する方
法としては、患者の血液中のリンパ球を培養した後、抗
血清で反応させて蛍光抗体法で抗原となるＨＨＶ６を検
出する方法が報告されている。しかしこの方法ではリン
パ球を培養するのに数日間を要し、迅速な診断はできな
い。また、患者血清中の抗体を測定する方法があるが、
この場合患者に抗体が産生される回復期まで少なくとも
１週間かかりやはり迅速診断はできない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、簡便、迅速、特異的かつ高感度なＨＨＶ６の検出に
用いるオリゴヌクレオチドを提供することである。
は、簡便、迅速、特異的かつ高感度なＨＨＶ６の検出に
用いるオリゴヌクレオチドを提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＨＨＶ６
遺伝子に関する種々の検討を重ねた結果、簡便、迅速、
特異的かつ高感度にＨＨＶ６を検出できる配列を有する
オリゴヌクレオチドを得、それを用いた検出方法を確立
し、本発明を完成させるに至った。
遺伝子に関する種々の検討を重ねた結果、簡便、迅速、
特異的かつ高感度にＨＨＶ６を検出できる配列を有する
オリゴヌクレオチドを得、それを用いた検出方法を確立
し、本発明を完成させるに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、ＨＨＶ６に特異的な
オリゴヌクレオチド、すなわち、配列表・配列番号１、
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配
列番号６、または配列番号７〔但し、Ａはアデニン、Ｃ
はシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また任
意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよ
い。〕に示す核酸配列を有するか、またはそれらに相補
的な配列を有するヒトヘルペスウィルス６検出用オリゴ
ヌクレオチドに関する。
オリゴヌクレオチド、すなわち、配列表・配列番号１、
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配
列番号６、または配列番号７〔但し、Ａはアデニン、Ｃ
はシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また任
意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよ
い。〕に示す核酸配列を有するか、またはそれらに相補
的な配列を有するヒトヘルペスウィルス６検出用オリゴ
ヌクレオチドに関する。
【０００６】本発明はまた、当該ヒトヘルペスウィルス
６検出用オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた標識
核酸プローブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑さ
せ、交雑した結合体の標識を測定することを特徴とする
試料中のヒトヘルペスウィルス６の検出法、または当該
ヒトヘルペスウィルス６検出用オリゴヌクレオチドをそ
のまま核酸プライマーとするか、または標識化して得ら
れた標識プライマーを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交
雑させ、プライマー伸長させ、得られたプライマー伸長
物を測定することを特徴とする試料中のヒトヘルペスウ
ィルス６の検出法に関する。
６検出用オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた標識
核酸プローブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑さ
せ、交雑した結合体の標識を測定することを特徴とする
試料中のヒトヘルペスウィルス６の検出法、または当該
ヒトヘルペスウィルス６検出用オリゴヌクレオチドをそ
のまま核酸プライマーとするか、または標識化して得ら
れた標識プライマーを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交
雑させ、プライマー伸長させ、得られたプライマー伸長
物を測定することを特徴とする試料中のヒトヘルペスウ
ィルス６の検出法に関する。
【０００７】以下、これを詳述する。本発明のオリゴヌ
クレオチドを用いてＨＨＶ６を検出する場合、(1) 本オ
リゴヌクレオチドをプローブとして検出する方法、また
は(2) 本オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＤＮＡ
ポリメラーゼ等により伸長し検出する方法がある。この
場合、本オリゴヌクレオチドに抗原、ハプテン、酵素、
蛍光物質、発光物質、酵素基質、放射性物質、不溶性担
体などの標識を導入することにより容易に検出が可能と
なる。
クレオチドを用いてＨＨＶ６を検出する場合、(1) 本オ
リゴヌクレオチドをプローブとして検出する方法、また
は(2) 本オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＤＮＡ
ポリメラーゼ等により伸長し検出する方法がある。この
場合、本オリゴヌクレオチドに抗原、ハプテン、酵素、
蛍光物質、発光物質、酵素基質、放射性物質、不溶性担
体などの標識を導入することにより容易に検出が可能と
なる。
【０００８】オリゴヌクレオチドをプローブとして用い
る場合、検体とのハイブリダイゼーション後に上記のよ
うな標識を適当な検出法で検出することで達成される。
る場合、検体とのハイブリダイゼーション後に上記のよ
うな標識を適当な検出法で検出することで達成される。
【０００９】一方、オリゴヌクレオチドをプライマーと
して用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼ等による遺伝子増
幅（ＰＣＲ；特開昭６２−２８１，シータス社）を行う
ことによりＨＨＶ６のみの遺伝子を特異的に増幅するこ
とができる。例えば増幅反応時に放射性標識ヌクレオチ
ドを取り込ませる方法や、増幅産物を電気泳動により分
画して特異なバンドを検出することで容易にＨＨＶ６を
検出することができる。また前述の標識オリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用いれば増幅産物を直接検出す
ることも可能である。
して用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼ等による遺伝子増
幅（ＰＣＲ；特開昭６２−２８１，シータス社）を行う
ことによりＨＨＶ６のみの遺伝子を特異的に増幅するこ
とができる。例えば増幅反応時に放射性標識ヌクレオチ
ドを取り込ませる方法や、増幅産物を電気泳動により分
画して特異なバンドを検出することで容易にＨＨＶ６を
検出することができる。また前述の標識オリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用いれば増幅産物を直接検出す
ることも可能である。
【００１０】オリゴヌクレオチドをプローブとして用い
るかプライマーとして用いるかはその手段が違うのみで
あって、ＨＨＶ６の検出に関して本質的には同じであ
る。一般にオリゴヌクレオチドは化学合成により調製で
きるので、クローン化したオリゴヌクレオチドまたはポ
リヌクレオチドに比べ、容易、大量かつ安価に一定品質
のオリゴヌクレオチドを得ることが可能である。
るかプライマーとして用いるかはその手段が違うのみで
あって、ＨＨＶ６の検出に関して本質的には同じであ
る。一般にオリゴヌクレオチドは化学合成により調製で
きるので、クローン化したオリゴヌクレオチドまたはポ
リヌクレオチドに比べ、容易、大量かつ安価に一定品質
のオリゴヌクレオチドを得ることが可能である。
【００１１】本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリ
ボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リ
ボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基
（Ｕ）と読み替えることは言うまでもない。また合成に
際して任意の位置のＴをＵに変えて合成を行い、ウリジ
ン残基を含むＤＮＡであってよい。同様に任意の位置の
ＵをＴに変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってよ
い。またオリゴヌクレオチド中に欠失、挿入あるいは置
換といった点突然変異や、修飾ヌクレオチドがあっても
よい。また標識物として前述のごとく放射性物質や酵
素、蛍光物質、発光物質など公知の標識を用いることが
できる。標識の仕方は末端標識でも、配列の途中に標識
してもよい。また、糖、リン酸基、塩基部分への標識で
あってもよい。
ボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リ
ボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基
（Ｕ）と読み替えることは言うまでもない。また合成に
際して任意の位置のＴをＵに変えて合成を行い、ウリジ
ン残基を含むＤＮＡであってよい。同様に任意の位置の
ＵをＴに変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってよ
い。またオリゴヌクレオチド中に欠失、挿入あるいは置
換といった点突然変異や、修飾ヌクレオチドがあっても
よい。また標識物として前述のごとく放射性物質や酵
素、蛍光物質、発光物質など公知の標識を用いることが
できる。標識の仕方は末端標識でも、配列の途中に標識
してもよい。また、糖、リン酸基、塩基部分への標識で
あってもよい。
【００１２】本発明のオリゴヌクレオチドを固相担体に
結合して、捕捉プローブとして用いることもできる。こ
の場合、捕捉プローブと標識プローブの組合せでサンド
イッチアッセイを行ってもよいし、標的核酸を標識して
捕捉する方法もある。また、オリゴヌクレオチドをビオ
チンで標識し、ハイブリダイゼーション後、アビジン結
合担体で捕捉する方法もある。サンドイッチアッセイに
おいてはどちらか一方に本発明のオリゴヌクレオチドを
用いれば、本オリゴヌクレオチドで特異的な測定が可能
となり、他方のオリゴヌクレオチドの特異性は若干低く
てもなんら問題はない。
結合して、捕捉プローブとして用いることもできる。こ
の場合、捕捉プローブと標識プローブの組合せでサンド
イッチアッセイを行ってもよいし、標的核酸を標識して
捕捉する方法もある。また、オリゴヌクレオチドをビオ
チンで標識し、ハイブリダイゼーション後、アビジン結
合担体で捕捉する方法もある。サンドイッチアッセイに
おいてはどちらか一方に本発明のオリゴヌクレオチドを
用いれば、本オリゴヌクレオチドで特異的な測定が可能
となり、他方のオリゴヌクレオチドの特異性は若干低く
てもなんら問題はない。
【００１３】
【実施例】以下に、本発明の実施例を例示することによ
って、本発明の効果をより一層明確なものとするが、こ
れらの実施例によって本発明の範囲は限定されない。
って、本発明の効果をより一層明確なものとするが、こ
れらの実施例によって本発明の範囲は限定されない。
【００１４】実施例１ 〔各種オリゴヌクレオチドの合
成〕 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いて、ホス
ホアミダイド法にて配列表・配列番号１、配列番号２、
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、ま
たは配列番号７に示される配列を有するオリゴヌクレオ
チドを各種合成した。以下、配列表・配列番号１〜７に
示される各種オリゴヌクレオチドをそれぞれオリゴヌク
レオチド〜と呼ぶ。
成〕 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いて、ホス
ホアミダイド法にて配列表・配列番号１、配列番号２、
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、ま
たは配列番号７に示される配列を有するオリゴヌクレオ
チドを各種合成した。以下、配列表・配列番号１〜７に
示される各種オリゴヌクレオチドをそれぞれオリゴヌク
レオチド〜と呼ぶ。
【００１５】手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、０．２
μＭスケールで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱
保護はアンモニア水で５５℃一夜実施した。精製はファ
ルマシア社製ＨＰＬＣで逆相カラムにて実施した。な
お、合成したオリゴヌクレオチドは必要により以下の方
法で５’末端に32Ｐ−リン酸基を結合させた。
μＭスケールで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱
保護はアンモニア水で５５℃一夜実施した。精製はファ
ルマシア社製ＨＰＬＣで逆相カラムにて実施した。な
お、合成したオリゴヌクレオチドは必要により以下の方
法で５’末端に32Ｐ−リン酸基を結合させた。
【００１６】 反応液組成 オリゴヌクレオチド ５〜２０ pmoles １０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液 １０μｌ １ｍＭ [γ-32P] ＡＴＰ（１０mCi/ml) １μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡製） １０単位 水 全量が１００μｌとなる量
【００１７】上記の如く調製した反応混合液を３７℃で
１時間反応させた。ここで１０×Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼ緩衝液とは、0.5M Tris-HCl, 0.1M MgCl2, 0.1
M ２−メルカプトエタノールを示す。
１時間反応させた。ここで１０×Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼ緩衝液とは、0.5M Tris-HCl, 0.1M MgCl2, 0.1
M ２−メルカプトエタノールを示す。
【００１８】実施例２ 〔ＨＨＶ６核酸の増幅〕 実施例１で合成したオリゴヌクレオチドを用いてＨＨＶ
６核酸の増幅を行った。ＨＨＶ６核酸は橋本株より調製
した。
６核酸の増幅を行った。ＨＨＶ６核酸は橋本株より調製
した。
【００１９】（１）ＰＣＲ 反応液１００μｌに前記核酸溶液５μｌ、実施例１のオ
リゴヌクレオチド〜を表１の組合せで５μｌずつプ
ライマーとして加え、ＨＨＶ６由来核酸の増幅を行っ
た。反応液組成 ＫＣｌ 50 mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ8.3) 10 mM ＭｇＣｌ2 1.5 mM ゼラチン 0.01 % (wt/vol) dATP, dGTP, dTTP, dCTP 各 0.2 mM TthDNAポリメラーゼ 40単位/ml 反応条件は次の通りである。初めに熱変性を９４℃、１
０分行った後、アニーリングを５６℃、２分、重合反応
を７２℃、３分、再び熱変性を９４℃、１分行う操作を
３０回行った。これらの操作はパーキン−エルマー／シ
ータス(Perkin-Elmer/Cetus)社のＤＮＡサーマルサイク
ラーを用いて行った。
リゴヌクレオチド〜を表１の組合せで５μｌずつプ
ライマーとして加え、ＨＨＶ６由来核酸の増幅を行っ
た。反応液組成 ＫＣｌ 50 mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ8.3) 10 mM ＭｇＣｌ2 1.5 mM ゼラチン 0.01 % (wt/vol) dATP, dGTP, dTTP, dCTP 各 0.2 mM TthDNAポリメラーゼ 40単位/ml 反応条件は次の通りである。初めに熱変性を９４℃、１
０分行った後、アニーリングを５６℃、２分、重合反応
を７２℃、３分、再び熱変性を９４℃、１分行う操作を
３０回行った。これらの操作はパーキン−エルマー／シ
ータス(Perkin-Elmer/Cetus)社のＤＮＡサーマルサイク
ラーを用いて行った。
【００２０】（２）検出 １０μｌの反応液を２％アガロースゲル電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色した後、紫外線での蛍光を検出
した（図１）。泳動の電気的条件は、定電圧１００Ｖ、
時間は３０分行った。操作方法並びに他の条件はManiat
isらのMolecular Cloning (1982)に記載の方法に従っ
た。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、相対
泳動度の比較により、検出されたヌクレオチド断片の長
さを算出した。
チジウムブロマイド染色した後、紫外線での蛍光を検出
した（図１）。泳動の電気的条件は、定電圧１００Ｖ、
時間は３０分行った。操作方法並びに他の条件はManiat
isらのMolecular Cloning (1982)に記載の方法に従っ
た。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、相対
泳動度の比較により、検出されたヌクレオチド断片の長
さを算出した。
【００２１】（３）結果 各組合せのＰＣＲ産物は、表１に示すように、計算され
るヌクレオチドの長さとよく一致した。
るヌクレオチドの長さとよく一致した。
【００２２】
【表１】
【００２３】実施例３ 〔検体からのＨＨＶ６核酸の増
幅〕 （１）キットＡ：ＨＨＶ６由来核酸を増幅するためのキ
ット （ａ）実施例１のオリゴヌクレオチド （ｂ）実施例１のオリゴヌクレオチド （ｃ）ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
幅〕 （１）キットＡ：ＨＨＶ６由来核酸を増幅するためのキ
ット （ａ）実施例１のオリゴヌクレオチド （ｂ）実施例１のオリゴヌクレオチド （ｃ）ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
【００２４】（２）検体の調製 １ｍｌの血液試料を突発性発疹と診断された患者から採
取し、単核球をフィコールパック（Ficoll-Paque: ファ
ルマシア) を用いた密度勾配遠心法により集めた。細胞
をＮＥＴ緩衝液（150mM NaCl, 15mM Tris HCl, 1mM EDT
A)、０．１％ＳＤＳ、1.0mg/mlプロティナーゼＫ（ベー
リンガー）に加えて細胞を溶解し、等量のフェノール−
クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：
１）で５回抽出した。抽出液をエタノール沈澱処理を行
い、沈澱した核酸を蒸留水に溶解し検体とした。ＨＨＶ
６の標準株として橋本株を培養し、検体として同時に用
いた。
取し、単核球をフィコールパック（Ficoll-Paque: ファ
ルマシア) を用いた密度勾配遠心法により集めた。細胞
をＮＥＴ緩衝液（150mM NaCl, 15mM Tris HCl, 1mM EDT
A)、０．１％ＳＤＳ、1.0mg/mlプロティナーゼＫ（ベー
リンガー）に加えて細胞を溶解し、等量のフェノール−
クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：
１）で５回抽出した。抽出液をエタノール沈澱処理を行
い、沈澱した核酸を蒸留水に溶解し検体とした。ＨＨＶ
６の標準株として橋本株を培養し、検体として同時に用
いた。
【００２５】（３）ＰＣＲによる増幅 反応液１００μｌに前記検体５μｌ、キットＡのオリゴ
ヌクレオチドとオリゴヌクレオチド５μｌをプライ
マーとして加えＨＨＶ６由来核酸の増幅を行った。反応
液組成、サイクル条件、電気泳動による検出法は実施例
２の方法に従った。
ヌクレオチドとオリゴヌクレオチド５μｌをプライ
マーとして加えＨＨＶ６由来核酸の増幅を行った。反応
液組成、サイクル条件、電気泳動による検出法は実施例
２の方法に従った。
【００２６】（４）結果 図２に電気泳動結果を示す。患者より得られた検体のＰ
ＣＲ産物は橋本株と同じ分子量にバンドを有し、分子量
マーカーより約１５０ｍｅｒと同定された。これは橋本
株の核酸配列から計算されるヌクレオチドの長さとよく
一致した（表２）。
ＣＲ産物は橋本株と同じ分子量にバンドを有し、分子量
マーカーより約１５０ｍｅｒと同定された。これは橋本
株の核酸配列から計算されるヌクレオチドの長さとよく
一致した（表２）。
【００２７】
【表２】
【００２８】実施例４ 〔キットＡの特異性の確認〕 実施例３の結果がＨＨＶ６に特異的であることを確認す
るために他のウィルスについても実施例３と同様の操作
を行った。他のウィルスには、水痘−帯状ほう疹ウィル
ス（ＶＺＶ；河口株）、ヒトサイトメガロウィルス（Ｃ
ＭＶ；ＡＤ１６９株）、単純ヘルペス１型（ＨＳＶ１；
シーバートSeibert 株) 、単純ヘルペスウィルス２型
（ＨＳＶ２；ＵＷ２６８株）を用いた。その結果、他種
ウィルス核酸のＰＣＲの結果はいずれもバンドは見られ
ず、本オリゴヌクレオチドがＨＨＶ６に特異的であるこ
と示していた。図３にその電気泳動結果を示す。
るために他のウィルスについても実施例３と同様の操作
を行った。他のウィルスには、水痘−帯状ほう疹ウィル
ス（ＶＺＶ；河口株）、ヒトサイトメガロウィルス（Ｃ
ＭＶ；ＡＤ１６９株）、単純ヘルペス１型（ＨＳＶ１；
シーバートSeibert 株) 、単純ヘルペスウィルス２型
（ＨＳＶ２；ＵＷ２６８株）を用いた。その結果、他種
ウィルス核酸のＰＣＲの結果はいずれもバンドは見られ
ず、本オリゴヌクレオチドがＨＨＶ６に特異的であるこ
と示していた。図３にその電気泳動結果を示す。
【００２９】実施例５ 〔キットＢを用いたＨＨＶ６核
酸の検出〕 （１）キットＢ：ＨＨＶ６由来核酸を検出するためのキ
ット 実施例１のオリゴヌクレオチドで、５’末端に、32P-
リン酸基を有している
酸の検出〕 （１）キットＢ：ＨＨＶ６由来核酸を検出するためのキ
ット 実施例１のオリゴヌクレオチドで、５’末端に、32P-
リン酸基を有している
【００３０】（２）検体の調製 単核球をＲＰＭＩ培地（武田薬品）にフィトヘムアグル
チニン（豊年油脂）５μｇ／ｍｌを加えた培養液で３７
℃で培養した。この培養液に、実施例３で患者から分離
した単核球を加え更に１〜２週間培養を続けた。細胞を
遠心分離で集め、実施例３と同様に核酸を抽出した。核
酸は、２６０ｎｍのＵＶ吸収により定量し、１００μｇ
／ｍｌの濃度でＴＥ緩衝液（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,
pH8.0)に溶解した。
チニン（豊年油脂）５μｇ／ｍｌを加えた培養液で３７
℃で培養した。この培養液に、実施例３で患者から分離
した単核球を加え更に１〜２週間培養を続けた。細胞を
遠心分離で集め、実施例３と同様に核酸を抽出した。核
酸は、２６０ｎｍのＵＶ吸収により定量し、１００μｇ
／ｍｌの濃度でＴＥ緩衝液（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,
pH8.0)に溶解した。
【００３１】（３）核酸ハイブリダイゼーションによる
ＨＨＶ６の検出 この核酸液１０μｌ（核酸１μｇ）に０．３Ｎ ＮａＯ
Ｈ １００μｌを加え室温で１５分間変性し、ドットブ
ロッター（ＢＲＬ社）を用いて５×ＳＳＣで湿潤したナ
イロン膜（ジーン・スクリーン・プラス，ＮＥＮ−デュ
ポン社）にブロットした。この膜を８０℃、３０分間加
熱処理して核酸を固定化した後、ハイブリダイゼーショ
ンを行った。まず、乾燥した膜（９×９ｃｍ）を５×Ｓ
ＳＣに５分間浸した。なおＳＳＣとは１５ｍＭ クエン
酸３ナトリウム、１５ｍＭ 塩化ナトリウム溶液を示
し、５×ＳＳＣとはＳＳＣの５倍濃厚液を示す。次にハ
イブリダイゼーションバック（ＢＲＬ社）の膜を移し、
ハイブリダイゼーションバッファー（５×ＳＳＣ，０．
５％ ウシ血清アルブミン，０．５％ ポリビニールピ
ロリドン，１％ ドデシル硫酸ナトリウム）５ｍｌを加
えてポリシーラーでシールし、５０℃、１５分間プレハ
イブリダイゼーションを行った。次にキットＢのオリゴ
ヌクレオチドプローブ１０μｌを含むハイブリダイゼ
ーションバッファー５ｍｌで５５℃、１５分間ハイブリ
ダイゼーションを行った。膜をポリバックから取り出
し、洗浄液−１（１×ＳＳＣ，１％ ドデシル硫酸ナト
リウム）で５５℃、５分間で２回、振盪洗浄した。洗浄
液−２（１×ＳＳＣ）で室温、５分間で２回振盪洗浄し
た後、膜を充分乾燥させた。
ＨＨＶ６の検出 この核酸液１０μｌ（核酸１μｇ）に０．３Ｎ ＮａＯ
Ｈ １００μｌを加え室温で１５分間変性し、ドットブ
ロッター（ＢＲＬ社）を用いて５×ＳＳＣで湿潤したナ
イロン膜（ジーン・スクリーン・プラス，ＮＥＮ−デュ
ポン社）にブロットした。この膜を８０℃、３０分間加
熱処理して核酸を固定化した後、ハイブリダイゼーショ
ンを行った。まず、乾燥した膜（９×９ｃｍ）を５×Ｓ
ＳＣに５分間浸した。なおＳＳＣとは１５ｍＭ クエン
酸３ナトリウム、１５ｍＭ 塩化ナトリウム溶液を示
し、５×ＳＳＣとはＳＳＣの５倍濃厚液を示す。次にハ
イブリダイゼーションバック（ＢＲＬ社）の膜を移し、
ハイブリダイゼーションバッファー（５×ＳＳＣ，０．
５％ ウシ血清アルブミン，０．５％ ポリビニールピ
ロリドン，１％ ドデシル硫酸ナトリウム）５ｍｌを加
えてポリシーラーでシールし、５０℃、１５分間プレハ
イブリダイゼーションを行った。次にキットＢのオリゴ
ヌクレオチドプローブ１０μｌを含むハイブリダイゼ
ーションバッファー５ｍｌで５５℃、１５分間ハイブリ
ダイゼーションを行った。膜をポリバックから取り出
し、洗浄液−１（１×ＳＳＣ，１％ ドデシル硫酸ナト
リウム）で５５℃、５分間で２回、振盪洗浄した。洗浄
液−２（１×ＳＳＣ）で室温、５分間で２回振盪洗浄し
た後、膜を充分乾燥させた。
【００３２】（４）検出 ナイロン膜にＸ線フィルム（New AIF RX 富士写真工業
製）を密着させ、−８０℃で一昼夜感光させた。フィル
ムの感光度からＨＨＶ６の検出を行った。
製）を密着させ、−８０℃で一昼夜感光させた。フィル
ムの感光度からＨＨＶ６の検出を行った。
【００３３】（５）結果 図４にそれらのＸ線フィルムを示す。結果はいずれの検
体とも放射活性が高く容易にＨＨＶ６であると判断され
た。
体とも放射活性が高く容易にＨＨＶ６であると判断され
た。
【００３４】実施例６ 〔キットＢの特異性の確認〕 実施例５の結果がＨＨＶ６に特異的であることを確認す
るために他のウィルスについても実施例５と同様の操作
を行った。検体は実施例４のウィルスを用い、実施例５
と同様の濃度で実施した。図５にそれらのＸ線フィルム
を示す。その結果、他種ウィルスはいずれも放射活性が
見られず、本オリゴヌクレオチドはＨＨＶ６に特異的で
あることを示していた。
るために他のウィルスについても実施例５と同様の操作
を行った。検体は実施例４のウィルスを用い、実施例５
と同様の濃度で実施した。図５にそれらのＸ線フィルム
を示す。その結果、他種ウィルスはいずれも放射活性が
見られず、本オリゴヌクレオチドはＨＨＶ６に特異的で
あることを示していた。
【００３５】
【発明の効果】本発明により従来培養や抗体によって検
出されていたＨＨＶ６を迅速、簡便、特異的かつ高感度
で測定することが可能となった。本発明のオリゴヌクレ
オチドは増幅反応のプライマーとしても、直接検出用の
プローブとしても用いることが可能である。特に増幅反
応では高い検出感度のため、少量の検体からでもＨＨＶ
６を検出することが可能で、その臨床的意義は大きい。
出されていたＨＨＶ６を迅速、簡便、特異的かつ高感度
で測定することが可能となった。本発明のオリゴヌクレ
オチドは増幅反応のプライマーとしても、直接検出用の
プローブとしても用いることが可能である。特に増幅反
応では高い検出感度のため、少量の検体からでもＨＨＶ
６を検出することが可能で、その臨床的意義は大きい。
【００３６】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..２５ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：突発性発疹ウィルス（ＨＨＶ６）の配列と相
補的な配列を有する。 配列 GCCCATAATA AAGTGACCAT ATGAG 25 配列番号：２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..２８ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：突発性発疹ウィルス（ＨＨＶ６）の配列と相
補的な配列を有する。 配列 AAACTTTGTG TAGGTGGTCG AATGCGAC 28 配列番号：３ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..２５ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：突発性発疹ウィルス（ＨＨＶ６）の配列と相
補的な配列を有する。 配列 TTCTAGCGGA TCGTTGACGT CTGTG 25 配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..２５ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：突発性発疹ウィルス（ＨＨＶ６）の配列と相
補的な配列を有する。 配列 GATACGAACA ACTACACTTC CAAAG 25 配列番号：５ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..２５ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：突発性発疹ウィルス（ＨＨＶ６）の配列と相
補的な配列を有する。 配列 ACAGCGCAGC AACATGTTTC AGAGC 25 配列番号：６ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..４４ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：突発性発疹ウィルス（ＨＨＶ６）の配列と相
補的な配列を有する。 配列 AGACGACCTA TATGGAGATG TACTGGGAGA GTATGTTGGT GAGT
44 配列番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..２１ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：突発性発疹ウィルス（ＨＨＶ６）の配列と相
補的な配列を有する。 配列 ATAGAGCCGA TCGGTCCTAA T 21
補的な配列を有する。 配列 GCCCATAATA AAGTGACCAT ATGAG 25 配列番号：２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..２８ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：突発性発疹ウィルス（ＨＨＶ６）の配列と相
補的な配列を有する。 配列 AAACTTTGTG TAGGTGGTCG AATGCGAC 28 配列番号：３ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..２５ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：突発性発疹ウィルス（ＨＨＶ６）の配列と相
補的な配列を有する。 配列 TTCTAGCGGA TCGTTGACGT CTGTG 25 配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..２５ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：突発性発疹ウィルス（ＨＨＶ６）の配列と相
補的な配列を有する。 配列 GATACGAACA ACTACACTTC CAAAG 25 配列番号：５ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..２５ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：突発性発疹ウィルス（ＨＨＶ６）の配列と相
補的な配列を有する。 配列 ACAGCGCAGC AACATGTTTC AGAGC 25 配列番号：６ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..４４ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：突発性発疹ウィルス（ＨＨＶ６）の配列と相
補的な配列を有する。 配列 AGACGACCTA TATGGAGATG TACTGGGAGA GTATGTTGGT GAGT
44 配列番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..２１ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：突発性発疹ウィルス（ＨＨＶ６）の配列と相
補的な配列を有する。 配列 ATAGAGCCGA TCGGTCCTAA T 21
【図１】実施例２の電気泳動結果を示す。レーン１〜６
はそれぞれオリゴヌクレオチド−、−、−
、−、−、−の組合せをプライマーとし
て用いた時の結果、レーン７は分子量マーカーを示す。
はそれぞれオリゴヌクレオチド−、−、−
、−、−、−の組合せをプライマーとし
て用いた時の結果、レーン７は分子量マーカーを示す。
【図２】実施例３の電気泳動結果を示す。レーン１０は
分子量マーカー、レーン１〜８は患者検体、レーン９は
橋本株を示す。
分子量マーカー、レーン１〜８は患者検体、レーン９は
橋本株を示す。
【図３】実施例４の電気泳動結果を示す。レーン６は分
子量マーカー、レーン１はＨＨＶ６、レーン２〜５はそ
れぞれＶＺＶ，ＣＭＶ，ＨＳＶ１，ＨＳＶ２を示す。
子量マーカー、レーン１はＨＨＶ６、レーン２〜５はそ
れぞれＶＺＶ，ＣＭＶ，ＨＳＶ１，ＨＳＶ２を示す。
【図４】実施例５のＸ線フィルムを示す。ドット１〜８
は患者検体、ドット９は橋本株を示す。
は患者検体、ドット９は橋本株を示す。
【図５】実施例６のＸ線フィルムを示す。ドット１〜５
はそれぞれＨＨＶ６，ＶＺＶ，ＣＭＶ，ＨＳＶ１，ＨＳ
Ｖ２を示す。
はそれぞれＨＨＶ６，ＶＺＶ，ＣＭＶ，ＨＳＶ１，ＨＳ
Ｖ２を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 近藤 俊夫 大阪府豊中市永楽荘２−13−20 (72)発明者 友森 チエリ 大阪府茨木市美穂ケ丘５−５−507
Claims (5)
- 【請求項１】 配列表・配列番号１、配列番号２、配列
番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または
配列番号７に示す核酸配列を有するか、またはそれらの
相補的配列を有するヒトヘルペスウィルス６検出用オリ
ゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 請求項１に記載されるヒトヘルペスウィ
ルス６検出用オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた
標識核酸プローブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑
させ、交雑した結合体の標識を測定することを特徴とす
る試料中のヒトヘルペスウィルス６の検出法。 - 【請求項３】 請求項１に記載されるヒトヘルペスウィ
ルス６検出用オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライ
マーとするか、または標識化して得られた標識プライマ
ーを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、プライマ
ー伸長させ、得られたプライマー伸長物を測定すること
を特徴とする試料中のヒトヘルペスウィルス６の検出
法。 - 【請求項４】 請求項１に記載されるヒトヘルペスウィ
ルス６検出用オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸
プローブを含むことを特徴とする試料中のヒトヘルペス
ウィルス６の検出用キット。 - 【請求項５】 請求項１に記載されるヒトヘルペスウィ
ルス６検出用オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライ
マーとするか、または標識化して得られた標識プライマ
ーを含むことを特徴とする試料中のヒトヘルペスウィル
ス６の検出用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3017992A JPH05192159A (ja) | 1992-01-20 | 1992-01-20 | ヒトヘルペスウィルス６検出用オリゴヌクレオチド、これを用いたヒトヘルペスウィルス６の検出法及び検出用キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3017992A JPH05192159A (ja) | 1992-01-20 | 1992-01-20 | ヒトヘルペスウィルス６検出用オリゴヌクレオチド、これを用いたヒトヘルペスウィルス６の検出法及び検出用キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05192159A true JPH05192159A (ja) | 1993-08-03 |
Family
ID=12296536
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3017992A Pending JPH05192159A (ja) | 1992-01-20 | 1992-01-20 | ヒトヘルペスウィルス６検出用オリゴヌクレオチド、これを用いたヒトヘルペスウィルス６の検出法及び検出用キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05192159A (ja) |
-
1992
- 1992-01-20 JP JP3017992A patent/JPH05192159A/ja active Pending
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