JP3016994B2 - C群ロタウイルス検出用ヌクレオチド、c群ロタウイルス検出法およびc群ロタウイルス検出用試薬キット - Google Patents
C群ロタウイルス検出用ヌクレオチド、c群ロタウイルス検出法およびc群ロタウイルス検出用試薬キットInfo
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はC群ロタウイルスを簡便
かつ迅速に検出することに関する。
かつ迅速に検出することに関する。
【0002】
【従来の技術】A群ロタウイルスは毎年、冬期に乳幼児
のほとんどが感染するなど、この群のロタウイルスの流
行疫学は明らかであり、高感度迅速検査法も確立されて
いる。一方、C群ロタウイルスは試験管内の培養が困難
であるために、ウイルスの性状の研究はあまり進展がな
く、またその検査法はもっぱら患者の糞便材料中のウイ
ルス粒子を電子顕微鏡法によって検出するか、ウイルス
核酸の電気泳動パターンの分析に頼っているのが現状で
ある。しかし、こういった検査法は、サンプルの調製に
多大の労力と費用を要し、そのうえ多検体の処理が困難
であるなど、日常の臨床検査に適していない。最近、本
群ウイルスを検出するためにELISA法、免疫凝集試
験法の開発が試みられているが、患者材料中のウイルス
含有量は概して微量であり、糞便検体中の非特異凝集物
質との偽反応など検出感度と特異性に解決すべき問題が
残されている。
のほとんどが感染するなど、この群のロタウイルスの流
行疫学は明らかであり、高感度迅速検査法も確立されて
いる。一方、C群ロタウイルスは試験管内の培養が困難
であるために、ウイルスの性状の研究はあまり進展がな
く、またその検査法はもっぱら患者の糞便材料中のウイ
ルス粒子を電子顕微鏡法によって検出するか、ウイルス
核酸の電気泳動パターンの分析に頼っているのが現状で
ある。しかし、こういった検査法は、サンプルの調製に
多大の労力と費用を要し、そのうえ多検体の処理が困難
であるなど、日常の臨床検査に適していない。最近、本
群ウイルスを検出するためにELISA法、免疫凝集試
験法の開発が試みられているが、患者材料中のウイルス
含有量は概して微量であり、糞便検体中の非特異凝集物
質との偽反応など検出感度と特異性に解決すべき問題が
残されている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、C群
ロタウイルスを検出するために用いられるヌクレオチド
を提供し、さらにそれを用いることによる簡便、迅速、
特異的かつ高感度なC群ロタウイルスの検出方法を提供
することである。また、本発明の他の目的は、C群ロタ
ウイルスを簡便に検出するための検出用キットを提供す
ることである。
ロタウイルスを検出するために用いられるヌクレオチド
を提供し、さらにそれを用いることによる簡便、迅速、
特異的かつ高感度なC群ロタウイルスの検出方法を提供
することである。また、本発明の他の目的は、C群ロタ
ウイルスを簡便に検出するための検出用キットを提供す
ることである。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、C群ロタ
ウイルスの遺伝子に関する種々の検討を重ねた結果、C
群ロタウイルスのVP1の遺伝子の一部をクローン化
し、その配列を解読することに成功した。本発明者ら
は、その配列をもとにさらに研究を重ねた結果、簡便、
迅速、特異的かつ高感度にC群ロタウイルスを検出する
ためのヌクレオチドを取得し、更にそれを用いた検出法
を確立して本発明を完成するに至った。
ウイルスの遺伝子に関する種々の検討を重ねた結果、C
群ロタウイルスのVP1の遺伝子の一部をクローン化
し、その配列を解読することに成功した。本発明者ら
は、その配列をもとにさらに研究を重ねた結果、簡便、
迅速、特異的かつ高感度にC群ロタウイルスを検出する
ためのヌクレオチドを取得し、更にそれを用いた検出法
を確立して本発明を完成するに至った。
【0005】すなわち、本発明は配列表・配列番号1に
示す塩基配列〔ただし、任意の位置のチミン(T)はウ
ラシル(U)と置換されてもよい。〕もしくはその相補
的な塩基配列の中から選択される10〜100塩基から
なるC群ロタウイルス検出用ヌクレオチドである。
示す塩基配列〔ただし、任意の位置のチミン(T)はウ
ラシル(U)と置換されてもよい。〕もしくはその相補
的な塩基配列の中から選択される10〜100塩基から
なるC群ロタウイルス検出用ヌクレオチドである。
【0006】さらに本発明は上記C群ロタウイルス検出
用ヌクレオチドを標識化して得られる標識ヌクレオチド
をプローブとして、被験試料中のDNAまたはRNAと
交雑させ、交雑した結合体または非結合のプローブを測
定することを特徴とするC群ロタウイルスの検出方法で
ある。
用ヌクレオチドを標識化して得られる標識ヌクレオチド
をプローブとして、被験試料中のDNAまたはRNAと
交雑させ、交雑した結合体または非結合のプローブを測
定することを特徴とするC群ロタウイルスの検出方法で
ある。
【0007】また本発明は上記C群ロタウイルス検出用
ヌクレオチドもしくはそれらを標識化してなるヌクレオ
チドをプライマーとして、被験試料中のDNAもしくは
RNAと交雑させ、プライマー伸長反応を行い、得られ
るプライマー伸長物を測定することを特徴とするC群ロ
タウイルスの検出法である。
ヌクレオチドもしくはそれらを標識化してなるヌクレオ
チドをプライマーとして、被験試料中のDNAもしくは
RNAと交雑させ、プライマー伸長反応を行い、得られ
るプライマー伸長物を測定することを特徴とするC群ロ
タウイルスの検出法である。
【0008】さらに本発明は上記C群ロタウイルス検出
用ヌクレオチドをまたはそれらを標識化してなるヌクレ
オチドを含むことを特徴とするC群ロタウイルス検出用
試薬キットである。
用ヌクレオチドをまたはそれらを標識化してなるヌクレ
オチドを含むことを特徴とするC群ロタウイルス検出用
試薬キットである。
【0009】本発明のC群ロタウイルス検出用ヌクレオ
チドとは、配列表・配列番号1に示す塩基配列、もしく
はその相補的な塩基配列の中から任意に選択される10
〜100塩基からなるヌクレオチドである。好ましくは
配列表・配列番号2〜5に示す塩基配列を有するヌクレ
オチドか、またはそれらに相補的な塩基配列を有するヌ
クレオチドである。
チドとは、配列表・配列番号1に示す塩基配列、もしく
はその相補的な塩基配列の中から任意に選択される10
〜100塩基からなるヌクレオチドである。好ましくは
配列表・配列番号2〜5に示す塩基配列を有するヌクレ
オチドか、またはそれらに相補的な塩基配列を有するヌ
クレオチドである。
【0010】配列表・配列番号1〜5に示す塩基配列中
のチミン(T)は、ウラシル(U)をも意味する。すな
わち、本発明のヌクレオチドはデオキシリボ核酸(DN
A)およびリボ核酸(RNA)の双方を包含するもので
ある。また、本発明のヌクレオチドは、配列番号1〜5
に示す塩基配列中、任意の位置のTがUであるようなウ
リジン残基を含むDNAであってもよいし、同様に任意
の位置のUがTであるようなチミジン残基を含むRNA
であってもよい。またヌクレオチド中に欠失、挿入ある
いは置換といった点突然変異や、修飾ヌクレオチドが存
在していてもよい。
のチミン(T)は、ウラシル(U)をも意味する。すな
わち、本発明のヌクレオチドはデオキシリボ核酸(DN
A)およびリボ核酸(RNA)の双方を包含するもので
ある。また、本発明のヌクレオチドは、配列番号1〜5
に示す塩基配列中、任意の位置のTがUであるようなウ
リジン残基を含むDNAであってもよいし、同様に任意
の位置のUがTであるようなチミジン残基を含むRNA
であってもよい。またヌクレオチド中に欠失、挿入ある
いは置換といった点突然変異や、修飾ヌクレオチドが存
在していてもよい。
【0011】本発明のヌクレオチドの取得方法は、特に
限定されない。好ましくは、化学合成であり、これによ
り容易、大量かつ安価に一定品質のヌクレオチドを得る
ことができる。かかる化学合成は、常法に従って行うこ
とができる。
限定されない。好ましくは、化学合成であり、これによ
り容易、大量かつ安価に一定品質のヌクレオチドを得る
ことができる。かかる化学合成は、常法に従って行うこ
とができる。
【0012】本発明のC群ロタウイルスの検出法は、上
記のヌクレオチドを用いることを特徴とする検出法であ
る。この方法として、(1)該ヌクレオチドをプローブ
としてC群ロタウイルスを検出する方法、または(2)
該ヌクレオチドをプライマーとして伸長反応を行い増幅
されたプライマー伸長物を測定することによってC群ロ
タウイルスを検出する方法が挙げられる。
記のヌクレオチドを用いることを特徴とする検出法であ
る。この方法として、(1)該ヌクレオチドをプローブ
としてC群ロタウイルスを検出する方法、または(2)
該ヌクレオチドをプライマーとして伸長反応を行い増幅
されたプライマー伸長物を測定することによってC群ロ
タウイルスを検出する方法が挙げられる。
【0013】これらの検出方法で使用されるヌクレオチ
ドは、標識剤が導入されたいわゆる標識ヌクレオチドで
あってもよい。好ましくは、標識ヌクレオチドであり、
これを用いることによりC群ロタウイルスはより一層検
出が容易となる。標識剤としては、具体的には抗原、ハ
プテン、酵素、蛍光物質、発光物質、酵素基質、放射性
物質、不溶性担体などが例示される。また標識化はヌク
レオチドの末端でも、またヌクレオチド配列の途中に行
ってもよい。また、標識剤はヌクレオチドの糖、リン酸
基、塩基部分のいずれに結合していてもよい。
ドは、標識剤が導入されたいわゆる標識ヌクレオチドで
あってもよい。好ましくは、標識ヌクレオチドであり、
これを用いることによりC群ロタウイルスはより一層検
出が容易となる。標識剤としては、具体的には抗原、ハ
プテン、酵素、蛍光物質、発光物質、酵素基質、放射性
物質、不溶性担体などが例示される。また標識化はヌク
レオチドの末端でも、またヌクレオチド配列の途中に行
ってもよい。また、標識剤はヌクレオチドの糖、リン酸
基、塩基部分のいずれに結合していてもよい。
【0014】(1)本発明C群ロタウイルス検出用ヌク
レオチドをプローブとしてC群ロタウイルスを検出する
方法 この方法は、本発明のC群ロタウイルス検出用ヌクレオ
チドをプローブとして用い、該ヌクレオチドプローブと
検体とをハイブリダイズさせた後、プローブを指標とし
て試料中の検体を検出するものである。この方法におい
ては、プローブとして、本発明のC群ロタウイルス検出
用ヌクレオチドを前述した標識剤で標識した標識ヌクレ
オチドを用いることが好ましい。この検出法は、該標識
ヌクレオチドをプローブとし、被験試料中のC群ロタウ
イルス遺伝子と該標識プローブをハイブリダイズさせた
後に、C群ロタウイルス遺伝子と標識プローブとの結合
物もしくは非結合の標識プローブを、標識剤に適した適
当な検出法で検出することによって実施することができ
る。
レオチドをプローブとしてC群ロタウイルスを検出する
方法 この方法は、本発明のC群ロタウイルス検出用ヌクレオ
チドをプローブとして用い、該ヌクレオチドプローブと
検体とをハイブリダイズさせた後、プローブを指標とし
て試料中の検体を検出するものである。この方法におい
ては、プローブとして、本発明のC群ロタウイルス検出
用ヌクレオチドを前述した標識剤で標識した標識ヌクレ
オチドを用いることが好ましい。この検出法は、該標識
ヌクレオチドをプローブとし、被験試料中のC群ロタウ
イルス遺伝子と該標識プローブをハイブリダイズさせた
後に、C群ロタウイルス遺伝子と標識プローブとの結合
物もしくは非結合の標識プローブを、標識剤に適した適
当な検出法で検出することによって実施することができ
る。
【0015】検体、すなわち被験試料中のC群ロタウイ
ルス遺伝子とプローブとのハイブリダイゼーションは、
具体的には糞便を通常の方法で前処理、精製したものを
被験試料とし、それとプローブとしての標識ヌクレオチ
ドとを混合し、室温〜70℃で10分〜48時間処理す
ることにより実施できる。また、検体はあらかじめ本発
明のヌクレオチドをプライマーとして増幅反応を行って
おいてもよい。
ルス遺伝子とプローブとのハイブリダイゼーションは、
具体的には糞便を通常の方法で前処理、精製したものを
被験試料とし、それとプローブとしての標識ヌクレオチ
ドとを混合し、室温〜70℃で10分〜48時間処理す
ることにより実施できる。また、検体はあらかじめ本発
明のヌクレオチドをプライマーとして増幅反応を行って
おいてもよい。
【0016】(2)本発明C群ロタウイルス検出用ヌク
レオチドをプライマーとして用いるC群ロタウイルス検
出法。 この方法は、本発明のC群ロタウイルス検出用ヌクレオ
チドをプライマーとして、DNAポリメラーゼ等による
伸長反応を行い遺伝子増幅することによりC群ロタウイ
ルスのVP1遺伝子のみを特異的に増幅させ、この増幅
産物を測定することによってC群ロタウイルスを検出す
る方法である。またこの場合、プライマーとして本発明
のヌクレオチドを前述したごとく標識剤で標識化して得
られる標識ヌクレオチドを用いてもよい。
レオチドをプライマーとして用いるC群ロタウイルス検
出法。 この方法は、本発明のC群ロタウイルス検出用ヌクレオ
チドをプライマーとして、DNAポリメラーゼ等による
伸長反応を行い遺伝子増幅することによりC群ロタウイ
ルスのVP1遺伝子のみを特異的に増幅させ、この増幅
産物を測定することによってC群ロタウイルスを検出す
る方法である。またこの場合、プライマーとして本発明
のヌクレオチドを前述したごとく標識剤で標識化して得
られる標識ヌクレオチドを用いてもよい。
【0017】ここで用いられる遺伝子増幅法としては、
具体的にはPCR法が例示されるが、特にこの方法に限
定されるものではなく、短鎖のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして遺伝子合成の開始のために用いるいずれ
の遺伝子増幅法をも用いることができる。
具体的にはPCR法が例示されるが、特にこの方法に限
定されるものではなく、短鎖のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして遺伝子合成の開始のために用いるいずれ
の遺伝子増幅法をも用いることができる。
【0018】本発明のC群ロタウイルスの検出法は、上
記方法により増幅された増幅産物すなわちVP1遺伝子
を検出することにより行われる。増幅されたVP1遺伝
子の検出手段は特に限定されることはなく、通常の遺伝
子の検出方法(例えば、電気泳動法など)が使用でき
る。増幅産物は、例えば電気泳動により分画され、特異
的かつ検出に十分な程度に鮮明なバンドとして容易に検
出できる。
記方法により増幅された増幅産物すなわちVP1遺伝子
を検出することにより行われる。増幅されたVP1遺伝
子の検出手段は特に限定されることはなく、通常の遺伝
子の検出方法(例えば、電気泳動法など)が使用でき
る。増幅産物は、例えば電気泳動により分画され、特異
的かつ検出に十分な程度に鮮明なバンドとして容易に検
出できる。
【0019】また増幅反応時に、適当な標識剤で標識化
されたデオキシリボヌクレオチド(dATP,dTT
P,dGTP,dCTP)もしくはリボヌクレオチド
(dATP,dUTP,dGTP,dCTP)をDNA
もしくはRNA合成の原料として使用することにより、
増幅産物を高感度に直接検出することが可能である。も
しくは、プライマーとして本発明のC群ロタウイルス検
出用ヌクレオチドを標識化して得られる標識ヌクレオチ
ドを用いることにより、増幅産物を同様に高感度に直接
検出することができる。かかる場合、標識化に用いられ
る標識剤として、好ましくは放射性物質、蛍光物質など
である。
されたデオキシリボヌクレオチド(dATP,dTT
P,dGTP,dCTP)もしくはリボヌクレオチド
(dATP,dUTP,dGTP,dCTP)をDNA
もしくはRNA合成の原料として使用することにより、
増幅産物を高感度に直接検出することが可能である。も
しくは、プライマーとして本発明のC群ロタウイルス検
出用ヌクレオチドを標識化して得られる標識ヌクレオチ
ドを用いることにより、増幅産物を同様に高感度に直接
検出することができる。かかる場合、標識化に用いられ
る標識剤として、好ましくは放射性物質、蛍光物質など
である。
【0020】本発明のC群ロタウイルス検出用の試薬キ
ットは、本発明のC群ロタウイルス検出用ヌクレオチド
もしくはこのヌクレオチドを適当な標識剤で標識化して
なる標識ヌクレオチドを含むことを特徴とするものであ
る。本発明の試薬キットは上記ヌクレオチドを含んでい
ればよく、他の成分として標識検出用試薬や緩衝液など
を含んでいてもよい。
ットは、本発明のC群ロタウイルス検出用ヌクレオチド
もしくはこのヌクレオチドを適当な標識剤で標識化して
なる標識ヌクレオチドを含むことを特徴とするものであ
る。本発明の試薬キットは上記ヌクレオチドを含んでい
ればよく、他の成分として標識検出用試薬や緩衝液など
を含んでいてもよい。
【0021】本発明の試薬キット中のヌクレオチドは、
プライマーとして用いることもできるし、またプローブ
として用いることもできる。ヌクレオチドをプライマー
として用いるかプローブとして用いるかは、その手段が
異なるのみであって、C群ロタウイルスの検出に関して
は本質的には同じである。当該試薬キットは、ヌクレオ
チドをプローブとして使用する場合は、上述の(1)の
方法によるC群ロタウイルス検出のための試薬キットと
して、またプライマーとして使用する場合は、上述の
(2)の方法によるC群ロタウイルス検出のための試薬
キットとして用いることができる。
プライマーとして用いることもできるし、またプローブ
として用いることもできる。ヌクレオチドをプライマー
として用いるかプローブとして用いるかは、その手段が
異なるのみであって、C群ロタウイルスの検出に関して
は本質的には同じである。当該試薬キットは、ヌクレオ
チドをプローブとして使用する場合は、上述の(1)の
方法によるC群ロタウイルス検出のための試薬キットと
して、またプライマーとして使用する場合は、上述の
(2)の方法によるC群ロタウイルス検出のための試薬
キットとして用いることができる。
【0022】試薬キット中のヌクレオチドをプローブと
して用いる場合の本発明の試薬キットは、本発明のC群
ロタウイルス検出用ヌクレオチドもしくは標識化された
C群ロタウイルス検出用ヌクレオチド以外に、標識検出
用試薬、緩衝液などを含んでいてもよい。
して用いる場合の本発明の試薬キットは、本発明のC群
ロタウイルス検出用ヌクレオチドもしくは標識化された
C群ロタウイルス検出用ヌクレオチド以外に、標識検出
用試薬、緩衝液などを含んでいてもよい。
【0023】試薬キット中のヌクレオチドをプライマー
として用いる場合の本発明の試薬キットは、本発明のC
群ロタウイルス検出用ヌクレオチドもしくは標識化され
たC群ロタウイルス検出用ヌクレオチド以外に、核酸合
成酵素(例えば、DNAポリメラーゼ,RNAポリメラ
ーゼ,逆転写酵素など)、デオキシリボヌクレオチド
(dATP,dTTP,dGTP,dCTP),リボヌ
クレオチド(rATP,rUTP,rGTP,rCT
P),緩衝液などを含んでいてもよい。
として用いる場合の本発明の試薬キットは、本発明のC
群ロタウイルス検出用ヌクレオチドもしくは標識化され
たC群ロタウイルス検出用ヌクレオチド以外に、核酸合
成酵素(例えば、DNAポリメラーゼ,RNAポリメラ
ーゼ,逆転写酵素など)、デオキシリボヌクレオチド
(dATP,dTTP,dGTP,dCTP),リボヌ
クレオチド(rATP,rUTP,rGTP,rCT
P),緩衝液などを含んでいてもよい。
【0024】また、本発明のヌクレオチドは固相担体に
結合して、捕捉プローブとして用いることもできる。こ
の場合、捕捉プローブと標識プローブの2つを組合せて
サンドイッチアッセイを行ってもよい。また標的核酸を
標識して捕捉する方法もある。さらにヌクレオチドをビ
オチンで標識し、ハイブリダイゼーション後、アビジン
結合担体で捕捉する方法もある。サンドイッチアッセイ
においてはどちらか一方に本発明のヌクレオチドを用い
れば、本発明のヌクレオチドで特異的な測定が可能とな
り、他方のヌクレオチドの特異性は若干低くてもなんら
問題はない。
結合して、捕捉プローブとして用いることもできる。こ
の場合、捕捉プローブと標識プローブの2つを組合せて
サンドイッチアッセイを行ってもよい。また標的核酸を
標識して捕捉する方法もある。さらにヌクレオチドをビ
オチンで標識し、ハイブリダイゼーション後、アビジン
結合担体で捕捉する方法もある。サンドイッチアッセイ
においてはどちらか一方に本発明のヌクレオチドを用い
れば、本発明のヌクレオチドで特異的な測定が可能とな
り、他方のヌクレオチドの特異性は若干低くてもなんら
問題はない。
【0025】
【実施例】次に実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例1 (各種ヌクレオチドの合成) ABI社DNAシンセサイザー391型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列表・配列番号2〜5で表される
配列を有するヌクレオチドを各種合成した。以下、配列
表・配列番号1〜5に示される各種ヌクレオチドを、そ
れぞれヌクレオチド1〜5と呼ぶ。手法はABI社マニ
ュアルに従い、0.2μMスケールで実施した。各種ヌ
クレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃一夜実施し
た。精製はファルマシア社製FPLCで逆相カラムにて
実施した。なお合成したヌクレオチドは必要により以下
の方法でその5’末端に32P−リン酸基を結合させた。
る。 実施例1 (各種ヌクレオチドの合成) ABI社DNAシンセサイザー391型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列表・配列番号2〜5で表される
配列を有するヌクレオチドを各種合成した。以下、配列
表・配列番号1〜5に示される各種ヌクレオチドを、そ
れぞれヌクレオチド1〜5と呼ぶ。手法はABI社マニ
ュアルに従い、0.2μMスケールで実施した。各種ヌ
クレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃一夜実施し
た。精製はファルマシア社製FPLCで逆相カラムにて
実施した。なお合成したヌクレオチドは必要により以下
の方法でその5’末端に32P−リン酸基を結合させた。
【0026】 反応液 ヌクレオチド 5〜20pmoles 10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液 10μl 1mM [γ- 32PATP(10mCi/ml) 1μl T4ポリヌクレオチドキナーゼ(東洋紡製) 10単位 水 全量100μl 上記のように調製した反応液を37℃で1時間反応させ
た。ここで10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液
とは、0.5 M Tris-HCl(pH8.0) 、0.1 M MgCl2、0.1 M 2
-メルカプトエタノールを示す。
た。ここで10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液
とは、0.5 M Tris-HCl(pH8.0) 、0.1 M MgCl2、0.1 M 2
-メルカプトエタノールを示す。
【0027】 実施例2 (C群ロタウイルスの増幅反応) (1)キットA:C群ロタウイルス由来核酸を増幅する
ためのキット (a)実施例1のヌクレオチド2 (b)実施例1のヌクレオチド3 (c)Tth DNAポリメラーゼ(東洋紡製),dA
TP、dCTP,dGTP,dTTP (2)ウイルス核酸の調製 ウイルス核酸はフェノール抽出法により行った。
ためのキット (a)実施例1のヌクレオチド2 (b)実施例1のヌクレオチド3 (c)Tth DNAポリメラーゼ(東洋紡製),dA
TP、dCTP,dGTP,dTTP (2)ウイルス核酸の調製 ウイルス核酸はフェノール抽出法により行った。
【0028】PCR 反応液93μlに前記核酸溶液5μl、実施例1のヌク
レオチド2と3を各1μlずつをプライマーとして加
え、C群ロタウイルス由来核酸の増幅を行った。対照と
して、A群、B群ロタウイルス由来核酸を用いた。反応
液組成は次の通りである。 反応液組成 KCl 50 mM Tris−HCl(pH8.3) 10 mM MgCl2 1.5 mM ゼラチン 0.01 % dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各 0.2 mM Tth DNAポリメラーゼ 40 単位/ml
レオチド2と3を各1μlずつをプライマーとして加
え、C群ロタウイルス由来核酸の増幅を行った。対照と
して、A群、B群ロタウイルス由来核酸を用いた。反応
液組成は次の通りである。 反応液組成 KCl 50 mM Tris−HCl(pH8.3) 10 mM MgCl2 1.5 mM ゼラチン 0.01 % dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各 0.2 mM Tth DNAポリメラーゼ 40 単位/ml
【0029】反応条件は次の通りである。 熱変性: 94℃、1分 アニーリング: 50℃、2分 重合反応: 75℃、1.5分 この反応を30回繰り返した。これらの操作はパーキン
−エルマー/シータス(Perkin-Elmer/Cetus)社のDNA
サーマルサイクラーを用いて行った。
−エルマー/シータス(Perkin-Elmer/Cetus)社のDNA
サーマルサイクラーを用いて行った。
【0030】検出 10μlの反応液を2%アガロースゲル電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色した後、紫外線照射による蛍光
を検出した(図1)。泳動の電気的条件は、定電圧10
0V、時間は30分間行った。操作方法並びに他の条件
はManiatisらのMolecular Cloning(1982)に記載の方法
に従った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動
し、相対泳動度の比較により、検出されたヌクレオチド
断片の長さを算出した。
チジウムブロマイド染色した後、紫外線照射による蛍光
を検出した(図1)。泳動の電気的条件は、定電圧10
0V、時間は30分間行った。操作方法並びに他の条件
はManiatisらのMolecular Cloning(1982)に記載の方法
に従った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動
し、相対泳動度の比較により、検出されたヌクレオチド
断片の長さを算出した。
【0031】結果 PCR産物はC群ロタウイルス由来核酸を用いたときの
みバンドが観察された(レーン1ー3)。分子量マーカ
ーより164塩基対と同定された。これは核酸配列から
計算されるヌクレオチドの長さとよく一致した。
みバンドが観察された(レーン1ー3)。分子量マーカ
ーより164塩基対と同定された。これは核酸配列から
計算されるヌクレオチドの長さとよく一致した。
【0032】 実施例3 (C群ロタウイルスの特異検出) C群ロタウイルス特異検出プローブの性能を評価するた
めにドット・ブロット・ハイブリダイゼーションを行っ
た。 (1)キットB:C群ロタウイルス由来核酸を検出する
ためのキット 実施例1のヌクレオチド4、5で、5’末端に、32P−
リン酸基を有している。
めにドット・ブロット・ハイブリダイゼーションを行っ
た。 (1)キットB:C群ロタウイルス由来核酸を検出する
ためのキット 実施例1のヌクレオチド4、5で、5’末端に、32P−
リン酸基を有している。
【0033】 (2)ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション C群ロタウイルス、及び、対照として、A群、B群ロタ
ウイルスの核酸1μlに0.3規定のNaOHを100
μl加え、室温で15分間変性し、ドットブロッター
(BRL社製)を用いて5×SSCで湿潤したナイロン
膜(ハイボンドNプラス,アマシャム社製)にブロット
した。なおSSCとは15mMクエン酸三ナトリウム、
15mM塩化ナトリウム溶液を示し、5×SSCとはS
SCの5倍濃厚液を示す。この膜を80℃、30分間加
熱処理して核酸を固定化した後、ハイブリダイゼーショ
ンを行った。まず、乾燥した膜(8×12cm)を5×
SSCに5分間浸した。次にハイブリダイゼーションバ
ック(BRL社製)に膜を移し、ハイブリダイゼーショ
ンバッファー(5×SSC、0.5%ウシ血清アルブミ
ン、0.5%ポリビニールピロリドン、1%ドデシル硫
酸ナトリウム)5mlを加えてポリシーラーでシール
し、50℃、15分間プレハイブリダイゼーションを行
った。次にキットBのヌクレオチドプローブ4または5
のいずれか5μlを含むハイブリダイゼーションバッフ
ァー5mlで55℃、15分間ハイブリダイゼーション
を行った。
ウイルスの核酸1μlに0.3規定のNaOHを100
μl加え、室温で15分間変性し、ドットブロッター
(BRL社製)を用いて5×SSCで湿潤したナイロン
膜(ハイボンドNプラス,アマシャム社製)にブロット
した。なおSSCとは15mMクエン酸三ナトリウム、
15mM塩化ナトリウム溶液を示し、5×SSCとはS
SCの5倍濃厚液を示す。この膜を80℃、30分間加
熱処理して核酸を固定化した後、ハイブリダイゼーショ
ンを行った。まず、乾燥した膜(8×12cm)を5×
SSCに5分間浸した。次にハイブリダイゼーションバ
ック(BRL社製)に膜を移し、ハイブリダイゼーショ
ンバッファー(5×SSC、0.5%ウシ血清アルブミ
ン、0.5%ポリビニールピロリドン、1%ドデシル硫
酸ナトリウム)5mlを加えてポリシーラーでシール
し、50℃、15分間プレハイブリダイゼーションを行
った。次にキットBのヌクレオチドプローブ4または5
のいずれか5μlを含むハイブリダイゼーションバッフ
ァー5mlで55℃、15分間ハイブリダイゼーション
を行った。
【0034】膜をポリバックから取り出し、洗浄液ー1
(1×SSC、1%ドデシル硫酸ナトリウム)で55
℃、5分間で2回、振盪洗浄した。洗浄液ー2(1×S
SC)で室温、5分間で2回、振盪洗浄した後、膜を充
分乾燥させた。
(1×SSC、1%ドデシル硫酸ナトリウム)で55
℃、5分間で2回、振盪洗浄した。洗浄液ー2(1×S
SC)で室温、5分間で2回、振盪洗浄した後、膜を充
分乾燥させた。
【0035】(3)検出 ナイロン膜にX線フィルム(New AIF RX 富士写真工業
製)を密着させ、−80℃で一昼夜感光させた。フィル
ムの感光度からC群ロタウイルスの検出を行った。
製)を密着させ、−80℃で一昼夜感光させた。フィル
ムの感光度からC群ロタウイルスの検出を行った。
【0036】結果 4、5のプローブはともにC群ロタウイルス核酸とのみ
特異的に反応し、A群、B群ロタウイルス核酸との交差
反応は認められなかった。
特異的に反応し、A群、B群ロタウイルス核酸との交差
反応は認められなかった。
【0037】
【発明の効果】本発明により従来培養に時間のかかって
いたC群ロタウイルスを迅速、簡便に特異的且つ高感度
で測定することが可能となった。本発明のヌクレオチド
は増幅反応のプライマーとしても、直接検出用のプロー
ブとしても用いることが可能である。また、プライマー
により増幅した産物をプローブで検出することにより、
感度、特異性をさらに高くすることも可能であり、その
臨床的意義は大きい。
いたC群ロタウイルスを迅速、簡便に特異的且つ高感度
で測定することが可能となった。本発明のヌクレオチド
は増幅反応のプライマーとしても、直接検出用のプロー
ブとしても用いることが可能である。また、プライマー
により増幅した産物をプローブで検出することにより、
感度、特異性をさらに高くすることも可能であり、その
臨床的意義は大きい。
【0038】
配列番号:1 配列の長さ:221 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA ハイポセティカル配列:No 起源: (A) 生物名: Reoviridae rotavirus ゲノム内での位置: 染色体/セグメント名:第一セグメント 配列の特徴 存在位置:1..221 特徴を決定した方法:S 他の特徴:C群ロタウイルスのVP1遺伝子の配列の1
部。 配列 TTGACGTTAA AATGATACGT GTTGATGGAG ATGACAATTA TGTGCTATAG TACGTTTTCC 60 TACTGCAATA ACTGAAAAAT TACGTTCAGA ATTCACATTA AAATTAAGAT CATATTATTC 120 AGAAATGAAT GTAAAAGTCA AAGCATTAGA CATCACTCAC AGGATGTGAA ATCGCAAAAA 180 GATATGTAGC TGGTGGAATG TTGTTTTTTA GAGCTGGAGT G 221
部。 配列 TTGACGTTAA AATGATACGT GTTGATGGAG ATGACAATTA TGTGCTATAG TACGTTTTCC 60 TACTGCAATA ACTGAAAAAT TACGTTCAGA ATTCACATTA AAATTAAGAT CATATTATTC 120 AGAAATGAAT GTAAAAGTCA AAGCATTAGA CATCACTCAC AGGATGTGAA ATCGCAAAAA 180 GATATGTAGC TGGTGGAATG TTGTTTTTTA GAGCTGGAGT G 221
【0039】配列番号:2 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA ハイポセティカル配列:No 起源: (A) 生物名:Reoviridae rotavirus ゲノム内での位置: 染色体/セグメント名:第一セグメント 配列の特徴 存在位置:1..20 特徴を決定した方法:S 他の特徴:C群ロタウイルスのVP1遺伝子の配列の1
部。 配列 AATGATACGT GTTGATGGAG 20
部。 配列 AATGATACGT GTTGATGGAG 20
【0040】配列番号:3 配列の長さ:18 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA ハイポセティカル配列:No 起源: (A) 生物名:Reoviridae rotavirus ゲノム内での位置: 染色体/セグメント名:第一セグメント 配列の特徴 存在位置:1..18 特徴を決定した方法:S 他の特徴:C群ロタウイルスのVP1遺伝子の配列の1
部。 配列 TTGCGATTTC ACATCCTG 18
部。 配列 TTGCGATTTC ACATCCTG 18
【0041】配列番号:4 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA ハイポセティカル配列:No 起源: (A) 生物名:Reoviridae rotavirus ゲノム内での位置: 染色体/セグメント名:第一セグメント 配列の特徴 存在位置:1..30 特徴を決定した方法:S 他の特徴:C群ロタウイルスのVP1遺伝子の配列の1
部。 配列 CAATTATGCT ATAGTACGTT TTCCTACTGC 30
部。 配列 CAATTATGCT ATAGTACGTT TTCCTACTGC 30
【0042】配列番号:5 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA ハイポセティカル配列:No 起源: (A) 生物名:Reoviridae rotavirus ゲノム内での位置: 染色体/セグメント名:第一セグメント 配列の特徴 存在位置:1..30 特徴を決定した方法:S 他の特徴:C群ロタウイルスのVP1遺伝子の配列の1
部。 配列 CTGAAAAATT ACTGTCAGAA TTCACATTAA 30
部。 配列 CTGAAAAATT ACTGTCAGAA TTCACATTAA 30
【図1】実施例2の電気泳動結果を示す図である。レー
ン1〜3はC群ロタウイルス由来核酸を、レーン4、5
はそれぞれA群、B群ロタウイルス由来核酸を鋳型とし
た場合を示す。また、レーン6は分子量マーカーを示
す。
ン1〜3はC群ロタウイルス由来核酸を、レーン4、5
はそれぞれA群、B群ロタウイルス由来核酸を鋳型とし
た場合を示す。また、レーン6は分子量マーカーを示
す。
【図2】実施例3のX線フイルムを示す図である。A、
Bはそれぞれ、ヌクレオチド4、5をプローブとして使
用した結果を示す。また、1〜5は実施例2の1〜5に
対応する。
Bはそれぞれ、ヌクレオチド4、5をプローブとして使
用した結果を示す。また、1〜5は実施例2の1〜5に
対応する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI C12R 1:92) (56)参考文献 特開 平4−311400(JP,A) 特開 平3−65200(JP,A) 特開 平4−84887(JP,A) Virology,Vol.186,N o.2,(1992),p.684−692 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/00 - 1/70 G01N 33/50 BIOSIS(DIALOG) GenBank/EMBL/DDBJ(G ENETYX) WPI(DIALOG)
Claims (4)
- 【請求項1】 配列表・配列番号2〜5のいずれかに記
載される塩基配列〔ただし、任意の位置のチミン(T)
はウラシル(U)と置換されてもよい。〕もしくはそれ
らの相補的な塩基配列を有することを特徴とするC群ロ
タウイルス検出用ヌクレオチド。 - 【請求項2】 標識化された請求項1記載のC群ロタウ
イルス検出用ヌクレオチドをプローブとして、被験試料
中のDNAまたはRNAと交雑させ、交雑した結合体ま
たは非結合のプローブを測定することを特徴とするC群
ロタウイルスの検出法。 - 【請求項3】 請求項1記載のC群ロタウイルス検出用
ヌクレオチド、またはそれらを標識化してなるヌクレオ
チドをプライマーとして被験試料中のDNAもしくはR
NAと交雑させ、プライマー伸長反応を行い、得られる
プライマー伸長物を測定することを特徴とするC群ロタ
ウイルスの検出法。 - 【請求項4】 請求項1記載のC群ロタウイルス検出用
ヌクレオチド、もしくはそれらを標識化してなるヌクレ
オチドを含むことを特徴とするC群ロタウイルスの検出
用試薬キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5167107A JP3016994B2 (ja) | 1993-07-06 | 1993-07-06 | C群ロタウイルス検出用ヌクレオチド、c群ロタウイルス検出法およびc群ロタウイルス検出用試薬キット |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5167107A JP3016994B2 (ja) | 1993-07-06 | 1993-07-06 | C群ロタウイルス検出用ヌクレオチド、c群ロタウイルス検出法およびc群ロタウイルス検出用試薬キット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0723786A JPH0723786A (ja) | 1995-01-27 |
JP3016994B2 true JP3016994B2 (ja) | 2000-03-06 |
Family
ID=15843564
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5167107A Expired - Fee Related JP3016994B2 (ja) | 1993-07-06 | 1993-07-06 | C群ロタウイルス検出用ヌクレオチド、c群ロタウイルス検出法およびc群ロタウイルス検出用試薬キット |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3016994B2 (ja) |
-
1993
- 1993-07-06 JP JP5167107A patent/JP3016994B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Virology,Vol.186,No.2,(1992),p.684−692 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0723786A (ja) | 1995-01-27 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
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LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |