JP3016994B2 - Ｃ群ロタウイルス検出用ヌクレオチド、ｃ群ロタウイルス検出法およびｃ群ロタウイルス検出用試薬キット - Google Patents
Ｃ群ロタウイルス検出用ヌクレオチド、ｃ群ロタウイルス検出法およびｃ群ロタウイルス検出用試薬キットInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＣ群ロタウイルスを簡便
かつ迅速に検出することに関する。
かつ迅速に検出することに関する。
【０００２】
【従来の技術】Ａ群ロタウイルスは毎年、冬期に乳幼児
のほとんどが感染するなど、この群のロタウイルスの流
行疫学は明らかであり、高感度迅速検査法も確立されて
いる。一方、Ｃ群ロタウイルスは試験管内の培養が困難
であるために、ウイルスの性状の研究はあまり進展がな
く、またその検査法はもっぱら患者の糞便材料中のウイ
ルス粒子を電子顕微鏡法によって検出するか、ウイルス
核酸の電気泳動パターンの分析に頼っているのが現状で
ある。しかし、こういった検査法は、サンプルの調製に
多大の労力と費用を要し、そのうえ多検体の処理が困難
であるなど、日常の臨床検査に適していない。最近、本
群ウイルスを検出するためにＥＬＩＳＡ法、免疫凝集試
験法の開発が試みられているが、患者材料中のウイルス
含有量は概して微量であり、糞便検体中の非特異凝集物
質との偽反応など検出感度と特異性に解決すべき問題が
残されている。
のほとんどが感染するなど、この群のロタウイルスの流
行疫学は明らかであり、高感度迅速検査法も確立されて
いる。一方、Ｃ群ロタウイルスは試験管内の培養が困難
であるために、ウイルスの性状の研究はあまり進展がな
く、またその検査法はもっぱら患者の糞便材料中のウイ
ルス粒子を電子顕微鏡法によって検出するか、ウイルス
核酸の電気泳動パターンの分析に頼っているのが現状で
ある。しかし、こういった検査法は、サンプルの調製に
多大の労力と費用を要し、そのうえ多検体の処理が困難
であるなど、日常の臨床検査に適していない。最近、本
群ウイルスを検出するためにＥＬＩＳＡ法、免疫凝集試
験法の開発が試みられているが、患者材料中のウイルス
含有量は概して微量であり、糞便検体中の非特異凝集物
質との偽反応など検出感度と特異性に解決すべき問題が
残されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｃ群
ロタウイルスを検出するために用いられるヌクレオチド
を提供し、さらにそれを用いることによる簡便、迅速、
特異的かつ高感度なＣ群ロタウイルスの検出方法を提供
することである。また、本発明の他の目的は、Ｃ群ロタ
ウイルスを簡便に検出するための検出用キットを提供す
ることである。
ロタウイルスを検出するために用いられるヌクレオチド
を提供し、さらにそれを用いることによる簡便、迅速、
特異的かつ高感度なＣ群ロタウイルスの検出方法を提供
することである。また、本発明の他の目的は、Ｃ群ロタ
ウイルスを簡便に検出するための検出用キットを提供す
ることである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｃ群ロタ
ウイルスの遺伝子に関する種々の検討を重ねた結果、Ｃ
群ロタウイルスのＶＰ１の遺伝子の一部をクローン化
し、その配列を解読することに成功した。本発明者ら
は、その配列をもとにさらに研究を重ねた結果、簡便、
迅速、特異的かつ高感度にＣ群ロタウイルスを検出する
ためのヌクレオチドを取得し、更にそれを用いた検出法
を確立して本発明を完成するに至った。
ウイルスの遺伝子に関する種々の検討を重ねた結果、Ｃ
群ロタウイルスのＶＰ１の遺伝子の一部をクローン化
し、その配列を解読することに成功した。本発明者ら
は、その配列をもとにさらに研究を重ねた結果、簡便、
迅速、特異的かつ高感度にＣ群ロタウイルスを検出する
ためのヌクレオチドを取得し、更にそれを用いた検出法
を確立して本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明は配列表・配列番号１に
示す塩基配列〔ただし、任意の位置のチミン（Ｔ）はウ
ラシル（Ｕ）と置換されてもよい。〕もしくはその相補
的な塩基配列の中から選択される１０〜１００塩基から
なるＣ群ロタウイルス検出用ヌクレオチドである。
示す塩基配列〔ただし、任意の位置のチミン（Ｔ）はウ
ラシル（Ｕ）と置換されてもよい。〕もしくはその相補
的な塩基配列の中から選択される１０〜１００塩基から
なるＣ群ロタウイルス検出用ヌクレオチドである。
【０００６】さらに本発明は上記Ｃ群ロタウイルス検出
用ヌクレオチドを標識化して得られる標識ヌクレオチド
をプローブとして、被験試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと
交雑させ、交雑した結合体または非結合のプローブを測
定することを特徴とするＣ群ロタウイルスの検出方法で
ある。
用ヌクレオチドを標識化して得られる標識ヌクレオチド
をプローブとして、被験試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと
交雑させ、交雑した結合体または非結合のプローブを測
定することを特徴とするＣ群ロタウイルスの検出方法で
ある。
【０００７】また本発明は上記Ｃ群ロタウイルス検出用
ヌクレオチドもしくはそれらを標識化してなるヌクレオ
チドをプライマーとして、被験試料中のＤＮＡもしくは
ＲＮＡと交雑させ、プライマー伸長反応を行い、得られ
るプライマー伸長物を測定することを特徴とするＣ群ロ
タウイルスの検出法である。
ヌクレオチドもしくはそれらを標識化してなるヌクレオ
チドをプライマーとして、被験試料中のＤＮＡもしくは
ＲＮＡと交雑させ、プライマー伸長反応を行い、得られ
るプライマー伸長物を測定することを特徴とするＣ群ロ
タウイルスの検出法である。
【０００８】さらに本発明は上記Ｃ群ロタウイルス検出
用ヌクレオチドをまたはそれらを標識化してなるヌクレ
オチドを含むことを特徴とするＣ群ロタウイルス検出用
試薬キットである。
用ヌクレオチドをまたはそれらを標識化してなるヌクレ
オチドを含むことを特徴とするＣ群ロタウイルス検出用
試薬キットである。
【０００９】本発明のＣ群ロタウイルス検出用ヌクレオ
チドとは、配列表・配列番号１に示す塩基配列、もしく
はその相補的な塩基配列の中から任意に選択される１０
〜１００塩基からなるヌクレオチドである。好ましくは
配列表・配列番号２〜５に示す塩基配列を有するヌクレ
オチドか、またはそれらに相補的な塩基配列を有するヌ
クレオチドである。
チドとは、配列表・配列番号１に示す塩基配列、もしく
はその相補的な塩基配列の中から任意に選択される１０
〜１００塩基からなるヌクレオチドである。好ましくは
配列表・配列番号２〜５に示す塩基配列を有するヌクレ
オチドか、またはそれらに相補的な塩基配列を有するヌ
クレオチドである。
【００１０】配列表・配列番号１〜５に示す塩基配列中
のチミン（Ｔ）は、ウラシル（Ｕ）をも意味する。すな
わち、本発明のヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）の双方を包含するもので
ある。また、本発明のヌクレオチドは、配列番号１〜５
に示す塩基配列中、任意の位置のＴがＵであるようなウ
リジン残基を含むＤＮＡであってもよいし、同様に任意
の位置のＵがＴであるようなチミジン残基を含むＲＮＡ
であってもよい。またヌクレオチド中に欠失、挿入ある
いは置換といった点突然変異や、修飾ヌクレオチドが存
在していてもよい。
のチミン（Ｔ）は、ウラシル（Ｕ）をも意味する。すな
わち、本発明のヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）の双方を包含するもので
ある。また、本発明のヌクレオチドは、配列番号１〜５
に示す塩基配列中、任意の位置のＴがＵであるようなウ
リジン残基を含むＤＮＡであってもよいし、同様に任意
の位置のＵがＴであるようなチミジン残基を含むＲＮＡ
であってもよい。またヌクレオチド中に欠失、挿入ある
いは置換といった点突然変異や、修飾ヌクレオチドが存
在していてもよい。
【００１１】本発明のヌクレオチドの取得方法は、特に
限定されない。好ましくは、化学合成であり、これによ
り容易、大量かつ安価に一定品質のヌクレオチドを得る
ことができる。かかる化学合成は、常法に従って行うこ
とができる。
限定されない。好ましくは、化学合成であり、これによ
り容易、大量かつ安価に一定品質のヌクレオチドを得る
ことができる。かかる化学合成は、常法に従って行うこ
とができる。
【００１２】本発明のＣ群ロタウイルスの検出法は、上
記のヌクレオチドを用いることを特徴とする検出法であ
る。この方法として、（１）該ヌクレオチドをプローブ
としてＣ群ロタウイルスを検出する方法、または（２）
該ヌクレオチドをプライマーとして伸長反応を行い増幅
されたプライマー伸長物を測定することによってＣ群ロ
タウイルスを検出する方法が挙げられる。
記のヌクレオチドを用いることを特徴とする検出法であ
る。この方法として、（１）該ヌクレオチドをプローブ
としてＣ群ロタウイルスを検出する方法、または（２）
該ヌクレオチドをプライマーとして伸長反応を行い増幅
されたプライマー伸長物を測定することによってＣ群ロ
タウイルスを検出する方法が挙げられる。
【００１３】これらの検出方法で使用されるヌクレオチ
ドは、標識剤が導入されたいわゆる標識ヌクレオチドで
あってもよい。好ましくは、標識ヌクレオチドであり、
これを用いることによりＣ群ロタウイルスはより一層検
出が容易となる。標識剤としては、具体的には抗原、ハ
プテン、酵素、蛍光物質、発光物質、酵素基質、放射性
物質、不溶性担体などが例示される。また標識化はヌク
レオチドの末端でも、またヌクレオチド配列の途中に行
ってもよい。また、標識剤はヌクレオチドの糖、リン酸
基、塩基部分のいずれに結合していてもよい。
ドは、標識剤が導入されたいわゆる標識ヌクレオチドで
あってもよい。好ましくは、標識ヌクレオチドであり、
これを用いることによりＣ群ロタウイルスはより一層検
出が容易となる。標識剤としては、具体的には抗原、ハ
プテン、酵素、蛍光物質、発光物質、酵素基質、放射性
物質、不溶性担体などが例示される。また標識化はヌク
レオチドの末端でも、またヌクレオチド配列の途中に行
ってもよい。また、標識剤はヌクレオチドの糖、リン酸
基、塩基部分のいずれに結合していてもよい。
【００１４】（１）本発明Ｃ群ロタウイルス検出用ヌク
レオチドをプローブとしてＣ群ロタウイルスを検出する
方法 この方法は、本発明のＣ群ロタウイルス検出用ヌクレオ
チドをプローブとして用い、該ヌクレオチドプローブと
検体とをハイブリダイズさせた後、プローブを指標とし
て試料中の検体を検出するものである。この方法におい
ては、プローブとして、本発明のＣ群ロタウイルス検出
用ヌクレオチドを前述した標識剤で標識した標識ヌクレ
オチドを用いることが好ましい。この検出法は、該標識
ヌクレオチドをプローブとし、被験試料中のＣ群ロタウ
イルス遺伝子と該標識プローブをハイブリダイズさせた
後に、Ｃ群ロタウイルス遺伝子と標識プローブとの結合
物もしくは非結合の標識プローブを、標識剤に適した適
当な検出法で検出することによって実施することができ
る。
レオチドをプローブとしてＣ群ロタウイルスを検出する
方法 この方法は、本発明のＣ群ロタウイルス検出用ヌクレオ
チドをプローブとして用い、該ヌクレオチドプローブと
検体とをハイブリダイズさせた後、プローブを指標とし
て試料中の検体を検出するものである。この方法におい
ては、プローブとして、本発明のＣ群ロタウイルス検出
用ヌクレオチドを前述した標識剤で標識した標識ヌクレ
オチドを用いることが好ましい。この検出法は、該標識
ヌクレオチドをプローブとし、被験試料中のＣ群ロタウ
イルス遺伝子と該標識プローブをハイブリダイズさせた
後に、Ｃ群ロタウイルス遺伝子と標識プローブとの結合
物もしくは非結合の標識プローブを、標識剤に適した適
当な検出法で検出することによって実施することができ
る。
【００１５】検体、すなわち被験試料中のＣ群ロタウイ
ルス遺伝子とプローブとのハイブリダイゼーションは、
具体的には糞便を通常の方法で前処理、精製したものを
被験試料とし、それとプローブとしての標識ヌクレオチ
ドとを混合し、室温〜７０℃で１０分〜４８時間処理す
ることにより実施できる。また、検体はあらかじめ本発
明のヌクレオチドをプライマーとして増幅反応を行って
おいてもよい。
ルス遺伝子とプローブとのハイブリダイゼーションは、
具体的には糞便を通常の方法で前処理、精製したものを
被験試料とし、それとプローブとしての標識ヌクレオチ
ドとを混合し、室温〜７０℃で１０分〜４８時間処理す
ることにより実施できる。また、検体はあらかじめ本発
明のヌクレオチドをプライマーとして増幅反応を行って
おいてもよい。
【００１６】（２）本発明Ｃ群ロタウイルス検出用ヌク
レオチドをプライマーとして用いるＣ群ロタウイルス検
出法。 この方法は、本発明のＣ群ロタウイルス検出用ヌクレオ
チドをプライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼ等による
伸長反応を行い遺伝子増幅することによりＣ群ロタウイ
ルスのＶＰ１遺伝子のみを特異的に増幅させ、この増幅
産物を測定することによってＣ群ロタウイルスを検出す
る方法である。またこの場合、プライマーとして本発明
のヌクレオチドを前述したごとく標識剤で標識化して得
られる標識ヌクレオチドを用いてもよい。
レオチドをプライマーとして用いるＣ群ロタウイルス検
出法。 この方法は、本発明のＣ群ロタウイルス検出用ヌクレオ
チドをプライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼ等による
伸長反応を行い遺伝子増幅することによりＣ群ロタウイ
ルスのＶＰ１遺伝子のみを特異的に増幅させ、この増幅
産物を測定することによってＣ群ロタウイルスを検出す
る方法である。またこの場合、プライマーとして本発明
のヌクレオチドを前述したごとく標識剤で標識化して得
られる標識ヌクレオチドを用いてもよい。
【００１７】ここで用いられる遺伝子増幅法としては、
具体的にはＰＣＲ法が例示されるが、特にこの方法に限
定されるものではなく、短鎖のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして遺伝子合成の開始のために用いるいずれ
の遺伝子増幅法をも用いることができる。
具体的にはＰＣＲ法が例示されるが、特にこの方法に限
定されるものではなく、短鎖のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして遺伝子合成の開始のために用いるいずれ
の遺伝子増幅法をも用いることができる。
【００１８】本発明のＣ群ロタウイルスの検出法は、上
記方法により増幅された増幅産物すなわちＶＰ１遺伝子
を検出することにより行われる。増幅されたＶＰ１遺伝
子の検出手段は特に限定されることはなく、通常の遺伝
子の検出方法（例えば、電気泳動法など）が使用でき
る。増幅産物は、例えば電気泳動により分画され、特異
的かつ検出に十分な程度に鮮明なバンドとして容易に検
出できる。
記方法により増幅された増幅産物すなわちＶＰ１遺伝子
を検出することにより行われる。増幅されたＶＰ１遺伝
子の検出手段は特に限定されることはなく、通常の遺伝
子の検出方法（例えば、電気泳動法など）が使用でき
る。増幅産物は、例えば電気泳動により分画され、特異
的かつ検出に十分な程度に鮮明なバンドとして容易に検
出できる。
【００１９】また増幅反応時に、適当な標識剤で標識化
されたデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ）もしくはリボヌクレオチド
（ｄＡＴＰ，ｄＵＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ）をＤＮＡ
もしくはＲＮＡ合成の原料として使用することにより、
増幅産物を高感度に直接検出することが可能である。も
しくは、プライマーとして本発明のＣ群ロタウイルス検
出用ヌクレオチドを標識化して得られる標識ヌクレオチ
ドを用いることにより、増幅産物を同様に高感度に直接
検出することができる。かかる場合、標識化に用いられ
る標識剤として、好ましくは放射性物質、蛍光物質など
である。
されたデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ）もしくはリボヌクレオチド
（ｄＡＴＰ，ｄＵＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ）をＤＮＡ
もしくはＲＮＡ合成の原料として使用することにより、
増幅産物を高感度に直接検出することが可能である。も
しくは、プライマーとして本発明のＣ群ロタウイルス検
出用ヌクレオチドを標識化して得られる標識ヌクレオチ
ドを用いることにより、増幅産物を同様に高感度に直接
検出することができる。かかる場合、標識化に用いられ
る標識剤として、好ましくは放射性物質、蛍光物質など
である。
【００２０】本発明のＣ群ロタウイルス検出用の試薬キ
ットは、本発明のＣ群ロタウイルス検出用ヌクレオチド
もしくはこのヌクレオチドを適当な標識剤で標識化して
なる標識ヌクレオチドを含むことを特徴とするものであ
る。本発明の試薬キットは上記ヌクレオチドを含んでい
ればよく、他の成分として標識検出用試薬や緩衝液など
を含んでいてもよい。
ットは、本発明のＣ群ロタウイルス検出用ヌクレオチド
もしくはこのヌクレオチドを適当な標識剤で標識化して
なる標識ヌクレオチドを含むことを特徴とするものであ
る。本発明の試薬キットは上記ヌクレオチドを含んでい
ればよく、他の成分として標識検出用試薬や緩衝液など
を含んでいてもよい。
【００２１】本発明の試薬キット中のヌクレオチドは、
プライマーとして用いることもできるし、またプローブ
として用いることもできる。ヌクレオチドをプライマー
として用いるかプローブとして用いるかは、その手段が
異なるのみであって、Ｃ群ロタウイルスの検出に関して
は本質的には同じである。当該試薬キットは、ヌクレオ
チドをプローブとして使用する場合は、上述の（１）の
方法によるＣ群ロタウイルス検出のための試薬キットと
して、またプライマーとして使用する場合は、上述の
（２）の方法によるＣ群ロタウイルス検出のための試薬
キットとして用いることができる。
プライマーとして用いることもできるし、またプローブ
として用いることもできる。ヌクレオチドをプライマー
として用いるかプローブとして用いるかは、その手段が
異なるのみであって、Ｃ群ロタウイルスの検出に関して
は本質的には同じである。当該試薬キットは、ヌクレオ
チドをプローブとして使用する場合は、上述の（１）の
方法によるＣ群ロタウイルス検出のための試薬キットと
して、またプライマーとして使用する場合は、上述の
（２）の方法によるＣ群ロタウイルス検出のための試薬
キットとして用いることができる。
【００２２】試薬キット中のヌクレオチドをプローブと
して用いる場合の本発明の試薬キットは、本発明のＣ群
ロタウイルス検出用ヌクレオチドもしくは標識化された
Ｃ群ロタウイルス検出用ヌクレオチド以外に、標識検出
用試薬、緩衝液などを含んでいてもよい。
して用いる場合の本発明の試薬キットは、本発明のＣ群
ロタウイルス検出用ヌクレオチドもしくは標識化された
Ｃ群ロタウイルス検出用ヌクレオチド以外に、標識検出
用試薬、緩衝液などを含んでいてもよい。
【００２３】試薬キット中のヌクレオチドをプライマー
として用いる場合の本発明の試薬キットは、本発明のＣ
群ロタウイルス検出用ヌクレオチドもしくは標識化され
たＣ群ロタウイルス検出用ヌクレオチド以外に、核酸合
成酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ，ＲＮＡポリメラ
ーゼ，逆転写酵素など）、デオキシリボヌクレオチド
（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ），リボヌ
クレオチド（ｒＡＴＰ，ｒＵＴＰ，ｒＧＴＰ，ｒＣＴ
Ｐ），緩衝液などを含んでいてもよい。
として用いる場合の本発明の試薬キットは、本発明のＣ
群ロタウイルス検出用ヌクレオチドもしくは標識化され
たＣ群ロタウイルス検出用ヌクレオチド以外に、核酸合
成酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ，ＲＮＡポリメラ
ーゼ，逆転写酵素など）、デオキシリボヌクレオチド
（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ），リボヌ
クレオチド（ｒＡＴＰ，ｒＵＴＰ，ｒＧＴＰ，ｒＣＴ
Ｐ），緩衝液などを含んでいてもよい。
【００２４】また、本発明のヌクレオチドは固相担体に
結合して、捕捉プローブとして用いることもできる。こ
の場合、捕捉プローブと標識プローブの２つを組合せて
サンドイッチアッセイを行ってもよい。また標的核酸を
標識して捕捉する方法もある。さらにヌクレオチドをビ
オチンで標識し、ハイブリダイゼーション後、アビジン
結合担体で捕捉する方法もある。サンドイッチアッセイ
においてはどちらか一方に本発明のヌクレオチドを用い
れば、本発明のヌクレオチドで特異的な測定が可能とな
り、他方のヌクレオチドの特異性は若干低くてもなんら
問題はない。
結合して、捕捉プローブとして用いることもできる。こ
の場合、捕捉プローブと標識プローブの２つを組合せて
サンドイッチアッセイを行ってもよい。また標的核酸を
標識して捕捉する方法もある。さらにヌクレオチドをビ
オチンで標識し、ハイブリダイゼーション後、アビジン
結合担体で捕捉する方法もある。サンドイッチアッセイ
においてはどちらか一方に本発明のヌクレオチドを用い
れば、本発明のヌクレオチドで特異的な測定が可能とな
り、他方のヌクレオチドの特異性は若干低くてもなんら
問題はない。
【００２５】
【実施例】次に実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例１ （各種ヌクレオチドの合成） ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列表・配列番号２〜５で表される
配列を有するヌクレオチドを各種合成した。以下、配列
表・配列番号１〜５に示される各種ヌクレオチドを、そ
れぞれヌクレオチド１〜５と呼ぶ。手法はＡＢＩ社マニ
ュアルに従い、０．２μＭスケールで実施した。各種ヌ
クレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃一夜実施し
た。精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて
実施した。なお合成したヌクレオチドは必要により以下
の方法でその５’末端に32Ｐ−リン酸基を結合させた。
る。 実施例１ （各種ヌクレオチドの合成） ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列表・配列番号２〜５で表される
配列を有するヌクレオチドを各種合成した。以下、配列
表・配列番号１〜５に示される各種ヌクレオチドを、そ
れぞれヌクレオチド１〜５と呼ぶ。手法はＡＢＩ社マニ
ュアルに従い、０．２μＭスケールで実施した。各種ヌ
クレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃一夜実施し
た。精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて
実施した。なお合成したヌクレオチドは必要により以下
の方法でその５’末端に32Ｐ−リン酸基を結合させた。
【００２６】 反応液 ヌクレオチド ５〜２０pmoles １０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液 １０μｌ １mM [γ- 32ＰＡＴＰ(10mCi/ml) １μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡製） １０単位 水 全量１００μｌ 上記のように調製した反応液を３７℃で１時間反応させ
た。ここで１０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液
とは、0.5 M Tris-HCl(pH8.0) 、0.1 M MgCl2、0.1 M 2
-メルカプトエタノールを示す。
た。ここで１０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液
とは、0.5 M Tris-HCl(pH8.0) 、0.1 M MgCl2、0.1 M 2
-メルカプトエタノールを示す。
【００２７】 実施例２ （Ｃ群ロタウイルスの増幅反応） （１）キットＡ：Ｃ群ロタウイルス由来核酸を増幅する
ためのキット （ａ）実施例１のヌクレオチド２ （ｂ）実施例１のヌクレオチド３ （ｃ）Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製），ｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ （２）ウイルス核酸の調製 ウイルス核酸はフェノール抽出法により行った。
ためのキット （ａ）実施例１のヌクレオチド２ （ｂ）実施例１のヌクレオチド３ （ｃ）Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製），ｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ （２）ウイルス核酸の調製 ウイルス核酸はフェノール抽出法により行った。
【００２８】ＰＣＲ 反応液９３μｌに前記核酸溶液５μｌ、実施例１のヌク
レオチド２と３を各１μｌずつをプライマーとして加
え、Ｃ群ロタウイルス由来核酸の増幅を行った。対照と
して、Ａ群、Ｂ群ロタウイルス由来核酸を用いた。反応
液組成は次の通りである。 反応液組成 ＫＣｌ 50 mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） 10 mM ＭｇＣｌ2 1.5 mM ゼラチン 0.01 % dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各 0.2 mM Tth DNAポリメラーゼ 40 単位/ml
レオチド２と３を各１μｌずつをプライマーとして加
え、Ｃ群ロタウイルス由来核酸の増幅を行った。対照と
して、Ａ群、Ｂ群ロタウイルス由来核酸を用いた。反応
液組成は次の通りである。 反応液組成 ＫＣｌ 50 mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） 10 mM ＭｇＣｌ2 1.5 mM ゼラチン 0.01 % dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各 0.2 mM Tth DNAポリメラーゼ 40 単位/ml
【００２９】反応条件は次の通りである。 熱変性： ９４℃、１分 アニーリング： ５０℃、２分 重合反応： ７５℃、１．５分 この反応を３０回繰り返した。これらの操作はパーキン
−エルマー／シータス(Perkin-Elmer/Cetus)社のＤＮＡ
サーマルサイクラーを用いて行った。
−エルマー／シータス(Perkin-Elmer/Cetus)社のＤＮＡ
サーマルサイクラーを用いて行った。
【００３０】検出 １０μｌの反応液を２％アガロースゲル電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色した後、紫外線照射による蛍光
を検出した（図１）。泳動の電気的条件は、定電圧１０
０Ｖ、時間は３０分間行った。操作方法並びに他の条件
はManiatisらのMolecular Cloning(1982)に記載の方法
に従った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動
し、相対泳動度の比較により、検出されたヌクレオチド
断片の長さを算出した。
チジウムブロマイド染色した後、紫外線照射による蛍光
を検出した（図１）。泳動の電気的条件は、定電圧１０
０Ｖ、時間は３０分間行った。操作方法並びに他の条件
はManiatisらのMolecular Cloning(1982)に記載の方法
に従った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動
し、相対泳動度の比較により、検出されたヌクレオチド
断片の長さを算出した。
【００３１】結果 ＰＣＲ産物はＣ群ロタウイルス由来核酸を用いたときの
みバンドが観察された（レーン１ー３）。分子量マーカ
ーより１６４塩基対と同定された。これは核酸配列から
計算されるヌクレオチドの長さとよく一致した。
みバンドが観察された（レーン１ー３）。分子量マーカ
ーより１６４塩基対と同定された。これは核酸配列から
計算されるヌクレオチドの長さとよく一致した。
【００３２】 実施例３ （Ｃ群ロタウイルスの特異検出） Ｃ群ロタウイルス特異検出プローブの性能を評価するた
めにドット・ブロット・ハイブリダイゼーションを行っ
た。 （１）キットＢ：Ｃ群ロタウイルス由来核酸を検出する
ためのキット 実施例１のヌクレオチド４、５で、５’末端に、32Ｐ−
リン酸基を有している。
めにドット・ブロット・ハイブリダイゼーションを行っ
た。 （１）キットＢ：Ｃ群ロタウイルス由来核酸を検出する
ためのキット 実施例１のヌクレオチド４、５で、５’末端に、32Ｐ−
リン酸基を有している。
【００３３】 （２）ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション Ｃ群ロタウイルス、及び、対照として、Ａ群、Ｂ群ロタ
ウイルスの核酸１μｌに０．３規定のＮａＯＨを１００
μｌ加え、室温で１５分間変性し、ドットブロッター
（ＢＲＬ社製）を用いて５×ＳＳＣで湿潤したナイロン
膜（ハイボンドＮプラス，アマシャム社製）にブロット
した。なおＳＳＣとは１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、
１５ｍＭ塩化ナトリウム溶液を示し、５×ＳＳＣとはＳ
ＳＣの５倍濃厚液を示す。この膜を８０℃、３０分間加
熱処理して核酸を固定化した後、ハイブリダイゼーショ
ンを行った。まず、乾燥した膜（８×１２ｃｍ）を５×
ＳＳＣに５分間浸した。次にハイブリダイゼーションバ
ック（ＢＲＬ社製）に膜を移し、ハイブリダイゼーショ
ンバッファー（５×ＳＳＣ、０．５％ウシ血清アルブミ
ン、０．５％ポリビニールピロリドン、１％ドデシル硫
酸ナトリウム）５ｍｌを加えてポリシーラーでシール
し、５０℃、１５分間プレハイブリダイゼーションを行
った。次にキットＢのヌクレオチドプローブ４または５
のいずれか５μｌを含むハイブリダイゼーションバッフ
ァー５ｍｌで５５℃、１５分間ハイブリダイゼーション
を行った。
ウイルスの核酸１μｌに０．３規定のＮａＯＨを１００
μｌ加え、室温で１５分間変性し、ドットブロッター
（ＢＲＬ社製）を用いて５×ＳＳＣで湿潤したナイロン
膜（ハイボンドＮプラス，アマシャム社製）にブロット
した。なおＳＳＣとは１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、
１５ｍＭ塩化ナトリウム溶液を示し、５×ＳＳＣとはＳ
ＳＣの５倍濃厚液を示す。この膜を８０℃、３０分間加
熱処理して核酸を固定化した後、ハイブリダイゼーショ
ンを行った。まず、乾燥した膜（８×１２ｃｍ）を５×
ＳＳＣに５分間浸した。次にハイブリダイゼーションバ
ック（ＢＲＬ社製）に膜を移し、ハイブリダイゼーショ
ンバッファー（５×ＳＳＣ、０．５％ウシ血清アルブミ
ン、０．５％ポリビニールピロリドン、１％ドデシル硫
酸ナトリウム）５ｍｌを加えてポリシーラーでシール
し、５０℃、１５分間プレハイブリダイゼーションを行
った。次にキットＢのヌクレオチドプローブ４または５
のいずれか５μｌを含むハイブリダイゼーションバッフ
ァー５ｍｌで５５℃、１５分間ハイブリダイゼーション
を行った。
【００３４】膜をポリバックから取り出し、洗浄液ー１
（１×ＳＳＣ、１％ドデシル硫酸ナトリウム）で５５
℃、５分間で２回、振盪洗浄した。洗浄液ー２（１×Ｓ
ＳＣ）で室温、５分間で２回、振盪洗浄した後、膜を充
分乾燥させた。
（１×ＳＳＣ、１％ドデシル硫酸ナトリウム）で５５
℃、５分間で２回、振盪洗浄した。洗浄液ー２（１×Ｓ
ＳＣ）で室温、５分間で２回、振盪洗浄した後、膜を充
分乾燥させた。
【００３５】（３）検出 ナイロン膜にＸ線フィルム（New AIF RX 富士写真工業
製）を密着させ、−８０℃で一昼夜感光させた。フィル
ムの感光度からＣ群ロタウイルスの検出を行った。
製）を密着させ、−８０℃で一昼夜感光させた。フィル
ムの感光度からＣ群ロタウイルスの検出を行った。
【００３６】結果 ４、５のプローブはともにＣ群ロタウイルス核酸とのみ
特異的に反応し、Ａ群、Ｂ群ロタウイルス核酸との交差
反応は認められなかった。
特異的に反応し、Ａ群、Ｂ群ロタウイルス核酸との交差
反応は認められなかった。
【００３７】
【発明の効果】本発明により従来培養に時間のかかって
いたＣ群ロタウイルスを迅速、簡便に特異的且つ高感度
で測定することが可能となった。本発明のヌクレオチド
は増幅反応のプライマーとしても、直接検出用のプロー
ブとしても用いることが可能である。また、プライマー
により増幅した産物をプローブで検出することにより、
感度、特異性をさらに高くすることも可能であり、その
臨床的意義は大きい。
いたＣ群ロタウイルスを迅速、簡便に特異的且つ高感度
で測定することが可能となった。本発明のヌクレオチド
は増幅反応のプライマーとしても、直接検出用のプロー
ブとしても用いることが可能である。また、プライマー
により増幅した産物をプローブで検出することにより、
感度、特異性をさらに高くすることも可能であり、その
臨床的意義は大きい。
【００３８】
配列番号：１ 配列の長さ：２２１ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA ハイポセティカル配列：No 起源： (A) 生物名： Reoviridae rotavirus ゲノム内での位置： 染色体／セグメント名：第一セグメント 配列の特徴 存在位置：1..221 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：Ｃ群ロタウイルスのＶＰ１遺伝子の配列の１
部。 配列 TTGACGTTAA AATGATACGT GTTGATGGAG ATGACAATTA TGTGCTATAG TACGTTTTCC 60 TACTGCAATA ACTGAAAAAT TACGTTCAGA ATTCACATTA AAATTAAGAT CATATTATTC 120 AGAAATGAAT GTAAAAGTCA AAGCATTAGA CATCACTCAC AGGATGTGAA ATCGCAAAAA 180 GATATGTAGC TGGTGGAATG TTGTTTTTTA GAGCTGGAGT G 221
部。 配列 TTGACGTTAA AATGATACGT GTTGATGGAG ATGACAATTA TGTGCTATAG TACGTTTTCC 60 TACTGCAATA ACTGAAAAAT TACGTTCAGA ATTCACATTA AAATTAAGAT CATATTATTC 120 AGAAATGAAT GTAAAAGTCA AAGCATTAGA CATCACTCAC AGGATGTGAA ATCGCAAAAA 180 GATATGTAGC TGGTGGAATG TTGTTTTTTA GAGCTGGAGT G 221
【００３９】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA ハイポセティカル配列：No 起源： (A) 生物名：Reoviridae rotavirus ゲノム内での位置： 染色体／セグメント名：第一セグメント 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：Ｃ群ロタウイルスのＶＰ１遺伝子の配列の１
部。 配列 AATGATACGT GTTGATGGAG 20
部。 配列 AATGATACGT GTTGATGGAG 20
【００４０】配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA ハイポセティカル配列：No 起源： (A) 生物名：Reoviridae rotavirus ゲノム内での位置： 染色体／セグメント名：第一セグメント 配列の特徴 存在位置：1..18 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：Ｃ群ロタウイルスのＶＰ１遺伝子の配列の１
部。 配列 TTGCGATTTC ACATCCTG 18
部。 配列 TTGCGATTTC ACATCCTG 18
【００４１】配列番号：４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA ハイポセティカル配列：No 起源： (A) 生物名：Reoviridae rotavirus ゲノム内での位置： 染色体／セグメント名：第一セグメント 配列の特徴 存在位置：1..30 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：Ｃ群ロタウイルスのＶＰ１遺伝子の配列の１
部。 配列 CAATTATGCT ATAGTACGTT TTCCTACTGC 30
部。 配列 CAATTATGCT ATAGTACGTT TTCCTACTGC 30
【００４２】配列番号：５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA ハイポセティカル配列：No 起源： (A) 生物名：Reoviridae rotavirus ゲノム内での位置： 染色体／セグメント名：第一セグメント 配列の特徴 存在位置：1..30 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：Ｃ群ロタウイルスのＶＰ１遺伝子の配列の１
部。 配列 CTGAAAAATT ACTGTCAGAA TTCACATTAA 30
部。 配列 CTGAAAAATT ACTGTCAGAA TTCACATTAA 30
【図１】実施例２の電気泳動結果を示す図である。レー
ン１〜３はＣ群ロタウイルス由来核酸を、レーン４、５
はそれぞれＡ群、Ｂ群ロタウイルス由来核酸を鋳型とし
た場合を示す。また、レーン６は分子量マーカーを示
す。
ン１〜３はＣ群ロタウイルス由来核酸を、レーン４、５
はそれぞれＡ群、Ｂ群ロタウイルス由来核酸を鋳型とし
た場合を示す。また、レーン６は分子量マーカーを示
す。
【図２】実施例３のＸ線フイルムを示す図である。Ａ、
Ｂはそれぞれ、ヌクレオチド４、５をプローブとして使
用した結果を示す。また、１〜５は実施例２の１〜５に
対応する。
Ｂはそれぞれ、ヌクレオチド４、５をプローブとして使
用した結果を示す。また、１〜５は実施例２の１〜５に
対応する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:92） (56)参考文献 特開 平４−311400（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−65200（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−84887（ＪＰ，Ａ) Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．186，Ｎ ｏ．２，（1992），ｐ．684−692 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/00 - 1/70 G01N 33/50 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】 配列表・配列番号２〜５のいずれかに記
載される塩基配列〔ただし、任意の位置のチミン（Ｔ）
はウラシル（Ｕ）と置換されてもよい。〕もしくはそれ
らの相補的な塩基配列を有することを特徴とするＣ群ロ
タウイルス検出用ヌクレオチド。 - 【請求項２】 標識化された請求項１記載のＣ群ロタウ
イルス検出用ヌクレオチドをプローブとして、被験試料
中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交雑した結合体ま
たは非結合のプローブを測定することを特徴とするＣ群
ロタウイルスの検出法。 - 【請求項３】 請求項１記載のＣ群ロタウイルス検出用
ヌクレオチド、またはそれらを標識化してなるヌクレオ
チドをプライマーとして被験試料中のＤＮＡもしくはＲ
ＮＡと交雑させ、プライマー伸長反応を行い、得られる
プライマー伸長物を測定することを特徴とするＣ群ロタ
ウイルスの検出法。 - 【請求項４】 請求項１記載のＣ群ロタウイルス検出用
ヌクレオチド、もしくはそれらを標識化してなるヌクレ
オチドを含むことを特徴とするＣ群ロタウイルスの検出
用試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5167107A JP3016994B2 (ja) | 1993-07-06 | 1993-07-06 | Ｃ群ロタウイルス検出用ヌクレオチド、ｃ群ロタウイルス検出法およびｃ群ロタウイルス検出用試薬キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5167107A JP3016994B2 (ja) | 1993-07-06 | 1993-07-06 | Ｃ群ロタウイルス検出用ヌクレオチド、ｃ群ロタウイルス検出法およびｃ群ロタウイルス検出用試薬キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0723786A JPH0723786A (ja) | 1995-01-27 |
| JP3016994B2 true JP3016994B2 (ja) | 2000-03-06 |
Family
ID=15843564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5167107A Expired - Fee Related JP3016994B2 (ja) | 1993-07-06 | 1993-07-06 | Ｃ群ロタウイルス検出用ヌクレオチド、ｃ群ロタウイルス検出法およびｃ群ロタウイルス検出用試薬キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3016994B2 (ja) |
-
1993
- 1993-07-06 JP JP5167107A patent/JP3016994B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８６，Ｎｏ．２，（１９９２），ｐ．６８４−６９２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0723786A (ja) | 1995-01-27 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |