KR100461715B1 - 질환과 관련된 핵산의 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개체로부터의 핵산 및 개체의 질환과 관련된 핵산에 대한 정보를 얻는 방법을 제공하며, 특히 질환이 개체 내에 존재하는 병원성 미생물과 관련된 경우의 핵산에 대한 정보를 얻는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 이러한 방법에 사용하기 위한 프로브-고정 칩과 같은 프로브-고정 기판을 제공한다. 특히, 본 발명은 개체 질환의 치료에 대한 반응도의 정보를 얻기 위한 프로브-고정 기판 및 그 방법을 제공한다.

Description

질환과 관련된 핵산의 검출 방법 {Detection of Nucleic Acid Associated with Disease}

DNA 칩을 이용한 유전자 검출 기술은 문헌[Beattie et al., Clin Chem 39: 719-22, Fodor et al., Science, 251, 767 (1991), Khrapko et al., FEBS Lett, 256, 118 (1989), 및 Southern et al., Nucleic Acids Res., 22, 1368 (1994)]에 개시되어 있다. DNA 칩은 표면 위에 서열이 다른 복수 개의 DNA 프로브가 고정되어 있는 몇 평방 센티미터의 유리 또는 규소 기판이다. 이런 칩 위에 고정되는 DNA 프로브를, 형광 안료 또는 방사성동위원소 (RI)와 같은 마커로 표지된 시험 핵산과, 또는 미표지 시험 핵산 및 표지된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 혼합물과 반응시킨다. 칩 위에 고정된 DNA 프로브와 상보적인 서열이 시료 중에 존재한다면, 칩의 특정 부위에 부착된 표지로부터 신호가 얻어진다. 따라서, 고정된 DNA 프로브의 서열 및 위치를 미리 알고 있다면, 시험 핵산에 존재하는 염기 서열을 확인할 수 있다. 문헌[Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5022 (1994), Parinov et al., Nucleic Acids Res., 24, 2998 (1996)].

환자로부터 혈액과 같은 시료를 얻고, 그 시료에서 핵산을 추출함으로써 그 환자에게 고유한 핵산을 얻을 수 있다. 환자에게 고유한 핵산을 더 유전자 분석하면, 환자가 그 질병에 걸릴 확률, 약물의 효능도 및(또는) 부작용의 발생과 같은 환자의 타고난 소인에 대한 정보를 얻을 수 있다. 그 결과, 그 환자에게 특이적인 정보를 얻을 수 있다. 개개의 환자에게 맞는 이러한 치료법은 "맞춤형 의료 관리 (Customized medical care)"라고 불린다.

환자에게 얻은 시료를 토대로 질병에 맞는 치료법을 보다 정확하고 쉽게 제시하는 방법을 개발하고자 하는 요구가 남아있다.

본원에 개시된 모든 참고문헌 및 특허 문헌은 거명을 통해 그 전문에 본 명세서에 참고문헌으로 포함되는 것이다.

본 발명은 개체로부터 질환과 관련된 핵산에 대한 정보를 얻는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 질환에 관해 얻은 핵산에 대한 정보뿐 아니라 개체의 핵산에 대한 정보를 얻는 방법, 특히 질환과 관련된 핵산에 대한 정보를 얻는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그런 방법에 사용하기 위한 프로브-고정 기판 (probe-immobilized substrate), 및 특히 프로브-고정 칩 (probe-immobilized chip)을 제공한다.

도 1은 한 실시태양에 따른 DNA 칩의 개략도이다.

도 2는 한 실시태양에 따른 PNA 칩의 개략도이다.

도 3은 한 실시태양에 따른 방법을 도시하는 흐름도이다.

<본 발명의 최상의 실시태양>

본 발명은 질환과 관련된 개체의 핵산에 대한 정보를 얻는 방법에 관한 것이다. 이 개체는 질환의 초기 단계이거나 말기 단계일 수 있다. 이 개체는 그 질환에 이미 걸린 경험이 있는 대상체이거나 앞으로 걸릴 수 있는 대상체일 수 있다.

본 발명은 개체 및 질환 모두로부터 얻은 핵산 정보의 상관성에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 실시태양에서, 개체는 바이러스, 세균, 효모 또는 미코플라스마 (mycoplasma)와 같은 병원성 미생물과 관련된 질환에 걸린 대상체이며, 본 발명은 개체로부터의 핵산 정보 및 개체에 존재하는 병원성 미생물로부터 얻은 핵산 정보의 상관성에 관한 것이다.

따라서 한 측면에서, 본 발명은 개체에서 특정 질환과 관련된 핵산, 및 특히 질환 치료에 대한 개체의 반응도 (responsiveness)와 관련이 있는 핵산, 및 개체에 존재하는 병원성 미생물로부터 유래한 특정 질환과 관련이 있는 핵산에 대한 정보를 얻는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 개체로부터 및 병원성 미생물로부터의 핵산을 확인하는 데 사용되는 특정 핵산 프로브에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 핵산 프로브는 칩과 같은 기판 위에 고정되어 있다. 또한, 본 발명은 그런 방법에 사용하기 위한 프로브-고정 칩과 같은 프로브-고정 기판에 관한 것이다. DNA 모세관 전기영동 장치, 몇몇 종의 비드, 막-기재의 어레이 (membrane-based array), 마이크로타이터 판, 전극, 몇몇 종의 반도체 기재의 장치, 몇몇 종의 도파관 (wave guide) 물질, 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 석영 결정 미량천칭 (QCM) 및 질량-분광계와 같은 다른 기판들도 본 발명에 사용될 수 있다. 또한, 대립유전자-특이적 올리고 혼성화, 제한 방법 (microtiterarray diagonal gel electrophoresis), 라이게이션 방법 (pedlock probe, oligonucreotide ligation assay, dye-labeled oligonucreoride ligation), 뉴클레오티드 혼입 (minisequencing, template-directed dye-termination assay) 및 침투 분석법 (invader assay)도 본 발명에 사용될 수 있다. 다른 일반적인 용액 중 혼성화 기술도 본 발명에 사용될 수 있으며, 그 예로는 개체 및 병원성 미생물의 핵산을 검출하는 데 사용될 수 있는 증폭 방법 (중합효소 연쇄반응 (PCR), 리가아제 연쇄반응 (LCR), 핵산 서열-기재 증폭 (NASBA), 가닥 치환 증폭 (SDA), 루프-매개 등온 증폭 (LAMP), 등온 및 키메라 프라이머-개시 핵산 증폭 (ICAN), 분지 DNA)이 있다.

핵산을 함유하는 개체로부터 얻는 시료에는 전혈, 혈액, 혈청, 백혈구, 오줌, 대변, 정액, 타액, 생검 시료, 배양 세포 및 담이 포함된다. 바람직한 시료는 혈액이다. 시료는 바람직하게는 질환의 치료에 대한 반응도와 관련이 있는 개체 유래의 핵산, 및 개체에 존재하는 질환 관련 병원성 미생물의 핵산을 모두 포함한다. 필요하다면, 이 시료를 균질화 및 추출과 같은 예비 처리를 할 수 있다. 예비 처리는 시료의 종류에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있을 것이다.

본 명세서에 개시된 한 예시적 실시태양에서는 인간에게서 전혈 시료를 먼저 얻은 다음, 인간 게놈 유래의 핵산과 바이러스 게놈 유래의 핵산을, 시판되는 인간 게놈 추출 킷트 (예, 전혈 시료로부터 QIAamp DNA 혈액 Midi 킷트 (상표명, QIAGEN사 제품, Tokyo, Japan))를 이용해 전혈 시료로부터 얻는다. 일부 실시태양에서, 표적 서열을 함유할 가능성이 있는 핵산을 증폭시킨다. 그 후, 이렇게 얻은 증폭 산물을 프로브-고정 칩에 혼성화시킨 후, 이 칩에 결합하는 핵산을 검출함으로써 분석한다. 이 방법으로 특정 질환과 관련된 핵산에 대한 정보가, 개체에 존재하는 병원성 미생물로부터 얻어지는 특정 질환과 관련된 핵산에 대한 정보와 함께 개체로부터 수득된다.

상기 방법에서, 이 개체의 예로는 인간이 이용된다. 그러나, 개체가 인간에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 한 측면에 따라, "개체"는 영장류와 같은 포유동물을 포함하며 인간, 개, 고양이, 소, 염소, 돼지, 양 및 원숭이를 포함하는 임의의 척추동물일 수 있다. 이 중에, 인간이 가장 적합한 개체이다. 본 발명의 한 측면으로는 개체는 건강한 생물체 또는 질병에 걸린 생물체일 수 있다. 그러나, 일반적으로 본 발명의 방법은 병원성 미생물로 인한 질환에 걸린 인간 및 그 개체중의 특정 핵산 서열에 적용하는 경우에 보다 효과적일 것이다. 본 명세서에 사용된 "특정 질환"이란 용어는 종양학적 질환뿐 아니라, 바이러스, 세균, 효모 및 미코플라즈마와 같은 병원성 미생물과 관련된 질환을 총칭하며, 바람직하기로는 병원성 미생물로 인한 질환을 의미하고, 보다 바람직하기로는 발병과 치료 효과가 그 질환에 걸린 개체가 지닌 핵산의 유형 및(또는) 그 핵산을 지닌 유전자의 발현의 존재 및 부재에 따라 달라지는 질환을 의미한다. 그러나, 이러한 질환은 특별히 한정되지 않는다.

본 명세서에 사용된 "표적 핵산"이란 용어는 검출 및(또는) 분석될 서열을 함유하는 핵산을 의미한다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 추출할 개체 유래의 핵산은 이 핵산이 특정 개체 유래이기만 하다면 어떤 것을 사용해도 무방하다. 보다 구체적으로, 핵산은 DNA, RNA 및 게놈 DNA 중 어느 하나일 수 있다. 추출할 병원성 미생물 유래의 핵산은 이 핵산이 표적 병원성 미생물 유래이기만 하다면 어떤 것을 사용해도 무방하며, 보다 구체적으로는 DNA 또는 RNA이다.

시료에서 핵산 성분을 추출하는 방법은 상기의 방법에 한정되지 않는다. 페놀-클로로포름을 이용한 액체-액체 추출 방법, 담체를 이용한 고체-액체 추출 방법 등을 사용할 수 있다. 또는, QiAamp라 불리는 시판되는 핵산 추출 킷트 (QIAGEN사 제품), 게놈 DNA 정제 킷트 (프로메가사 제품) 또는 SMAI 테스트 (스미또모 메탈사 제품)를 이용할 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 이렇게 추출된 핵산을 PCR과 같은 방법으로 증폭시킬 수도 시키지 않을 수도 있다.

추출된 핵산 성분이 RNA인 경우, 이 RNA를 시험 핵산으로 직접 사용할 수 있다. 또는, RNA로부터 역전사효소를 이용해 제조한 cDNA도 시험 핵산으로 사용할 수 있다. 이 경우, 개체 유래의 핵산 및 병원성 미생물 유래의 핵산을 단리없이 혼합하여 사용할 수도 있다. 보다 구체적으로, 이들 핵산은 QIAamp DNA 혈액 Midi 킷트를 이용하여 상기 방법에 따라 추출하고 역전사 효소로 처리하여 PCR 증폭시킨다.

본 발명의 한 측면에서는 그 수단이 일반적으로 핵산 증폭에 사용되는 것이라면 임의 공지된 증폭 수단을 이용하여 증폭을 수행할 수 있다. 중합효소 연쇄 반응 (이하, "PCR"로 언급)으로 증폭시키는 것이 바람직하다. 시료가 충분한 양의 핵산을 함유하고 있으면 증폭 단계를 생략해도 무방하다.

본 발명의 한 측면에서, 프로브-고정 칩과 같은 프로브-고정 기판은 서로 다른 염기 서열을 가지며 기판 위에 고정되어 있는 제1 프로브 및 제2 프로브를 포함한다. 제1 프로브는 특정 질환과 관련된 병원성 미생물 유래의 특정 핵산 서열의 존재를 검출하는 데 사용된다. 제2 프로브는 개체 유래의 특정 핵산의 존재를 검출하는 데 사용된다.

그러한 프로브-고정 기판은 개체 및 병원성 미생물과 같은 두 개의 다른 기원 유래의 핵산을 동일 기판을 이용해 동시에 분석할 수 있다는 점에서 특히 유리하다. 이 프로브-고정 칩은 본 발명에서 최초로 공개된 것이다. 본 발명은 본 발명의 한 측면으로서 이 프로브-고정 기판을 제공한다.

본 발명의 한 측면인 프로브-고정 칩에서, 제1 프로브는 인간 환자로부터의전혈 시료와 같은 시료 중에 함유된 병원성 미생물 유래의 핵산 서열 존재를 검출하는 데 사용된다. 이와 같이, 프로브로는 표적 생물체 (예를 들어, 인간 환자)를 감염시킬 수 있는 병원성 미생물 유래의 염색체 DNA 또는 유전자 (RNA)에 상응하는 염기 서열을 갖는 프로브를 포함한다. 이 외에도, cDNA, cRNA, 염색체 DNA, RNA, cDNA 및 cRNA 각각의 단편, 또는 이들 단편의 상보 서열이 제1 프로브로 사용될 수 있다.

또한, 시료 중에 함유된 병원성 미생물의 양은 제1 프로브, 즉 병원성 미생물 유래의 핵산 서열에 상응하는 염기 서열, 이 핵산 서열의 단편, 또는 이 핵산 서열이나 그 단편의 상보 서열을 갖는 프로브를 이용하여 측정할 수 있다.

바람직하기로는 제1 프로브를 시료 중에 함유된 병원성 미생물의 존재뿐 아니라 병원성 미생물의 유전자 돌연변이의 존재를 검출하는 데 사용한다.

시료 중의 병원성 미생물에 의해 발현된 핵산 (RNA)은 제1 프로브, 즉 병원성 미생물 유래의 핵산 서열에 상응하는 염기 서열, 이 핵산 서열의 단편, 또는 이 핵산 서열이나 그 단편의 상보 서열을 갖는 프로브에 의해 측정할 수 있다. 이 경우, 이 프로브는 RNA, cDNA 또는 cRNA를 정량 및 정성적으로 검출할 수 있다.

병원성 미생물이 바이러스인 한 실시태양에서, 바이러스는 증식기에 특정 유전자를 다량 발현하기 때문에 발현 패턴 (양, 질)을 측정할 수 있다면 약제의 효능 평가가 가능하다.

본 발명의 한 측면으로는, 프로브-고정 칩에 사용되는 제2 프로브가 개체 유래의 특정 질환과 관련된 염색체 DNA 서열 또는 유전자 (RNA)에 상응하는 염기 서열이다. 이 외에도, cDNA에 상응하는 염기서열, cRNA, 염색체 DNA, RNA, cDNA 및 cRNA 각각의 단편, 또는 이들 단편의 상보 서열이 제2 프로브로 사용될 수 있다. "특정 질환과 관련된" 개체의 핵산이란 개체의 세포 중의 염색체에 존재하며 치료에 대한 반응도의 전조가 되는 핵산 서열로 정의된다. 보다 구체적으로는, 개체의 이환 확률, 약물의 효능도 및 부작용 발생의 전조가 되는 핵산 서열이다.

제2 프로브의 존재 때문에 특정 핵산 서열의 존재, 특정 유전자의 발현량 및 개체에서 그 유전자의 발현 패턴을 검출할 수 있다.

본 발명에 따른 제1 프로브 및 제2 프로브는 11개 이상의 염기, 바람직하기로는 12개 이상의 염기, 보다 바람직하기로는 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 심지어 30개 이상의 염기 서열을 갖는다. 기판 위에 고정되는 염기 서열의 길이가 지나치게 길면, 단일 염기 변이를 감지하기 어렵다. 반면에 염기 기판에 고정되는 염기 서열이 지나치게 짧으면 시료 중에 함유된 염기 서열을 결정하기가 어렵다.

제1 또는 제2 프로브로는 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 펩티드 핵산 (PNA), 메틸포스포네이트 핵산 또는 S-올리고와 같은 올리뉴클레오티드, 또는 cDNA 및 cRNA와 같은 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있다.

본 발명의 한 측면으로는, 상기 염기 서열들을 포함하는 제1 프로브 및 제2 프로브를 기저판, 다공질 소재[Beattie et al., Clin, Chem, 41, 700 (1995)], 마이크로타이터 판[Kawai et al., Anal. Biochem., 209, 63 (1993)], 비드[Mirkin et al., Nature, 382, 607 (1996)], 구상 물질, 입상 물질, 자성 물질 또는 자성 비드[Miller et al., J. Magnet. Magn. Mater., 225, 138 (2001)], DNA 모세관 전기영동 칩[Chou et al., Proc. Natl. Acd. Sci., 96, 11 (1999)], 막-기재 어레이[Lemieux et al., Molecular Breeding, 4, 277 (1998)], 몇몇 종의 반도체 기재의 장치[Thewes et al., 2002, IEEE International Solid-State Circuits Conference, 350 (2002)], 몇몇 종의 도파관 물질[Piunno et al., Anal. Chim. Acta, 288, 205 (1994)], SPR[Nelson et al., Anal. Chem., 73, 1 (2001)], QCM[Ito et al., Anal. Chim. Acta, 327, 29 (1996)] 및 질량-분광계[Amexis et al., Proc. Natl. Acd. Sci., 98, 12097 (2001)]로 형성된 기판에 고정시킴으로써 프로브-고정 기판을 제조한다. 핵산을 고정하기 위한 기판 재료의 품질, 크기 및 형상은 특별히 한정되지 않는다. 기판이 핵산을 고정할 수 있다면 여하한 품질, 크기 및 형상을 갖는 물질을 기판으로 사용하여도 무방하다. 시료 중의 핵산 서열은 프로브-고정 기판을 이용하여, 예를 들어 개체로부터 채취한 시료에서 핵산을 추출하여 시험 핵산을 얻고, 이 시험 핵산을 프로브-고정 칩과 같은 프로브-고정 기판과 접촉시키고, 프로브-고정 기판 상의 프로브와 시험 핵산 사이의 혼성화 반응을 검출함으로써 검출한다.

프로브-고정 칩과 시료 중의 핵산 성분 사이의 혼성화 반응을 검출하기 위해, 본 발명은 (1) 마커 물질을 이용하는 방법 및 (2) 전기화학적 수단을 이용하는 방법을 포함한다.

(1) 마커 물질을 이용하는 방법에서는 시험 핵산을 미리 형광 안료 (예, FITC, Cy3, Cy5 또는 로다민), 효소 (예, 비오틴, 합텐, 옥시다제 또는 포스파타제) 또는 전기화학적 활성 물질 (예, 페로센 또는 퀴논)로 표지한다. 또는 상기 마커 물질로 표지된 다른 프로브를 혼성화 반응 검출에 사용한다. 수종의 마커 물질을 동시에 사용할 수도 있다.

(2) 전기화학적 수단을 이용하는 방법에서는 프로브를 고정하는 프로브-고정 칩의 기판 형성에 도전성 재료를 사용함으로써 프로브-고정 칩을 전극으로 사용한다. 이 경우, 상기 언급된 전극 외에 혼성화 반응을 검출하기 위한 상대 전극 및 기준 전극을 일반적인 전기화학적 검출 방법과 동일한 방식으로 사용한다. 기준 전극으로는 일반적인 기준 전극, 예를 들어 은과 염화은으로 형성된 전극 또는 수은과 염화수은으로 형성된 전극을 사용할 수 있다. 다른 염기 서열을 가지는 프로브들을 다른 도전성 기판들 상에 고정하고 이 도전성 기판들을 동일한 기저판 상에 배치하여 프로브-고정 칩을 형성할 수도 있다. 이러한 프로브-고정 칩을 사용하면 정밀 검출을 수행할 수 있다. 이 경우, 전기화학적 신호가 어느 프로브로부터 오는 지는 검출할 수 있다.

일부 실시태양에서, 시료로부터 추출된 핵산 성분과 프로브-고정 칩 상에 고정된 프로브 간의 혼성화 반응은 하기와 같이 수행된다. 혼성화 반응은 이온 강도 0.01 내지 5의 범위 및 pH 5 내지 10 범위의 완충액 중에서 수행한다. 혼성화 반응 용액은 혼성화 가속화제의 작용을 하는 덱스트란 술페이트, 연어 정자 DNA, 소 흉선 DNA, EDTA, 및 계면활성제와 같은 첨가제를 함유할 수 있다. 시료로부터 추출한 핵산 성분을 완충 용액에 첨가하고 90 ℃ 이상으로 가열하여 변성시킨다. 프로브-고정 칩을 변성 직후 또는 0 ℃로 고속 냉각한 직후에 삽입할 수 있다. 또는, 혼성화 반응 용액을 기판 상에 적가하여 혼성화 반응을 수행할 수도 있다. 반응 속도를 높이기 위해 반응 용액을 교반 또는 진탕하면서 반응을 수행할 수 있다. 반응은 10 내지 90 ℃ 범위의 온도에서 약 1분 내지 철야의 기간동안 수행할 수 있다. 혼성화 반응 후에, 전극을 꺼내고 이온 강도 0.01 내지 5 범위 및 pH 5 내지 10 범위의 완충 용액으로 세척한다.

(1) 마커 물질을 이용하는 방법에서는 표지된 염기 서열 또는 시료에 함유된 부차적 프로브의 마커를, 마커의 유형에 따라 적절히 선택된 검출 수단을 이용해 검출함으로써 혼성화 반응의 발생을 검출한다. 보다 구체적으로는 형광 표지의 경우 형광 검출기를 사용한다.

(2) 전기화학적 수단을 이용하는 방법에서는 하기와 같이 검출한다. 기판을 세척한 후, 이중가닥 부위에 선택적으로 결합할 수 있는 이중가닥 인식 물질을 전극 표면에 도포한다. 여기서 사용되는 이중가닥 인식 물질은 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들어 획스트 (Hoechst) 33258, 아크리딘 오렌지, 퀴나크린, 다우노미신, 메탈로 인터칼레이터 및 비스아크리딘과 같은 비스-인터칼레이터, 트리스인터칼레이터 및 폴리인터칼레이터 등이 포함된다. 또한, 이러한 인터칼레이터는 페로센 또는 비올로겐과 같은 전기화학적 활성 금속 착물을 이용해 미리 개질시킬 수도 있다. 이러한 DNA 결합 물질의 농도는 인터칼레이터의 유형에 따라 변하나, 일반적으로 1 ng/㎖ 내지 1 mg/㎖ 범위에 속한다. 이 경우, 0.001 내지 5 범위의 이온강도 및 5 내지 10 범위의 pH를 갖는 완충액을 사용한다. 전극을 이중가닥 인식 물질과 반응시키고, 세정하고, 전기화학적 측정을 수행한다.

전기화학적 측정은 이중가닥 인식 물질이 전기화학적으로 반응하는 전위 이상의 전위를 인가하고 이중가닥 인식 물질로부터의 전류를 측정함으로써 수행한다. 일정한 속도로 또는 펄스 방식으로 전위를 편향시켜 전위를 인가할 수 있다. 또는, 일정한 전위를 인가할 수 있다. 전위차 측정장치 (potention stat), 디지탈 멀티미터 또는 함수 발생기와 같은 장치를 이용해 전류 및 전압을 제어하면서 반응 전류를 측정한다. 표적 핵산의 농도는 상기 구한 전류값을 토대로 보정하여 산출할 수 있다.

전극을 이용하는 염기 서열 검출 장치는 핵산 추출부, 핵산 반응부, 이중가닥 인식 물질 반응부, 전기화학적 측정부 및 세정부를 포함한다.

전기화학적 방법에서 혼성화 반응을 측정하는 또다른 DNA 칩이 문헌[Hashimoto et al.]에 개시되어 있으며, 이 문헌에는 DNA 프로브와 전기화학적으로 활성인 염료로 개질된 금 전극으로 서열 특이적 유전자를 검출하는 방법이 기재되어 있다. 염료로부터 유래한 애노드 전류는 표적 DNA의 농도와 관련이 있다. 문헌[Wang et al.]에는 인디케이터가 없는 전기화학적 DNA 혼성화 바이오센서에 대해 기재되어 있다. 이 바이오센서 포맷은 이노신-치환 (구아닌이 없음) 프로브를 탄소 페이스트 전극에 고정시키고, 표적의 구아닌 산화 피크의 출현에 의한 이중체 형성을 크로노포텐시오미터로 직접 검출하는 것을 포함한다. 이들 문헌은 이 거명을 통해 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.

전기화학적 측정에서는 시료를 마커로 표지하는 것이 필수적이지는 않다. 전기 신호를 측정함으로써 검출이 가능하기 때문에, 형광 검출에 사용되는 것과 같은 복잡한 시스템이 필요치 않다. 따라서, 원한다면 전기화학적 측정 시스템의 크기를 줄일 수 있다.

본 발명의 한 측면으로는, 개별 환자의 핵산 서열에 대한 정보뿐 아니라 환자를 감염시키는 병원성 생물체의 핵산 서열에 대한 정보를 간단한 절차로, 예를 들어 환자로부터 채취한 혈액과 같은 시료로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 한 측면으로는, 병에 걸린 개체에게 적합한 치료법을 찾는 데 프로브-고정 기판을 사용한다. 이 프로브-고정 기판은 동일 기판에 고정된 제2 프로브 및 제1 프로브를 포함하며, 이 제2 프로브는 개체의 세포 중의 염색체 중에 존재하며 특정 질환과 연관성이 있는 핵산에 대한 정보를 얻는 데 사용되고, 제1 프로브는 그 질환과 관련된 병원성 미생물의 핵산 서열에 대한 정보를 얻는 데 사용된다. 이 프로브-고정 기판에 의해, 개체 및 개체에서 채취한 시료로부터의 병원성 미생물 둘 다로부터 유래한 특정 질환에 대한 정보 및(또는) 특정 질환의 치료에 대한 반응도의 예측을 간단한 방식으로 동시에 얻는 것이 가능하다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 방법 및 프로브-고정 기판은 C형 간염의 치료 효능을 평가하는 데 사용된다. 다른 실시태양은 본 발명의 방법 및 프로브-고정 기판이 AIDS의 치료를 평가 (HIV의 역가 및 돌연변이)하는 데 사용되는 것이다. 또다른 실시태양은 본 발명의 방법 및 프로브-고정 기판이 B형 간염의 치료를 평가 (HBV의 역가, 유형 및 돌연변이)하는 데 사용되는 것이다.

본 발명의 한 측면의 방법으로 C형 간염의 치료 효능을 평가하였다. 이 경우를 예를 들어 하기에 설명한다.

C형 간염은 예를 들어 간경변증으로 진행되고, 더 나아가 간암으로 발전한다고 알려져 있다. C형 간염 치료법의 하나로 인터페론(이하, "IFN"으로 언급) 투여가 알려져 있다. 치료를 위해 IFN-알파 및 IFN-베타가 사용된다. 그러나, IFN의 효능은 편차가 크다. 예를 들어, IFN은 일본 기원 환자의 약 20 내지 30 ％에게만 효과적으로 작용한다. IFN이 인간 환자에서 효과적으로 작용을 하더라도 IFN은 매우 강력한 부작용을 유도하는 문제를 가지고 있다. 이러한 IFN 효능의 편차는 환자를 감염시키는 C형 바이러스 (이하, "HCV"로 언급)의 유전자형 (참조, 문헌[J. Clin. Microbiol., 34, 2516 (1996)])과 바이러스의 양이 다르고 바이러스에 감염된 환자의 핵산 서열이 다르기 때문이라고 여겨진다. HCV 게놈에서 상이한 영역의 뉴클레오티드와 예상 아미노산 서열의 비교를 토대로, 적어도 6개의 주요 유전자형이 보고되었다. 문헌[Forns et al., J. Clin. Microbiol., 34, 2516 (1996), Andonov et al., J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995)].

본 발명의 한 측면으로는 C형 간염에 대항하는 IFN의 효능을 평가할 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "인터페론 (IFN)"은 인터페론 α, β, γ 및(또는) ω를 포괄한다. 예를 들어, 환자가 감염된 C형 간염 바이러스의 유형이 1b 형이면 (일본에서 주로 관찰되는 유형), IFN은 덜 효과적이다. 이는 혈청 중에 HCV-RNA, HCV-항체, GOP 및 GTP의 농도가 IFN 처리에 의해 감소하지 않음을 의미한다. 그러나 바이러스의 유형이 2a이면, IFN의 효능은 더 높다. 이는 혈청 중에 HCV-RNA, HCV-항체, GOP 및 GTP의 농도가 처리에 의해 감소함을 의미한다. 한편, 바이러스의 양이 10⁶카피/㎖ 이상의 다량이면, IFN의 효능이 낮다. 따라서, 환자가 감염된 바이러스의 유전자형과 양을 핵산 수준에서 검사하는 데 본 발명에 따른 제1 프로브를 사용한다.

예를 들어 시료 중 C형 간염 바이러스 (HCV)의 핵산 서열의 존재를 검출하는 프로브로서 HCV-RNA에 상응하는 염기 서열, HCV-RNA의 단편, HCV-RNA의 상보 서열, 또는 이들의 단편이 사용된다. 본 발명에 따른 프로브는 바람직하게는 HCV-RNA의 유전자형 또는 돌연변이를 검출하기 위해 11개 이상의 염기, 바람직하기로는 12개 이상의 염기, 보다 바람직하기로는 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 심지어 30개 이상의 염기 서열을 갖는다. 한편, 30개 염기 이상, 바람직하기로는 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500 및 1000개 염기 이상의 보다 긴 프로브도 HCV 게놈의 검출에 바람직하다. 11 내지 30개 염기의 길이가 칩 포맷에 적합하고, 30개 염기보다 더 긴 프로브가 일반적인 혼성화 포맷에 적합할 것이다. 예를 들어, 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4로 표시된 서열들에 상응하는 염기 서열 및 그의 상보 서열을 갖는 프로브를 사용할 수 있다. 이들 서열은 HCV 유전자형 모두에서 거의 보존적이다. 문헌[Andonov et al., J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995)].

본 발명의 제1 프로브로서는 시료 중의 병원성 미생물의 존재뿐 아니라 병원성 미생물의 유전 변이도 검출할 수 있는 프로브를 사용하는 것이 바람직하다. C형 간염의 경우는 IFN의 효능이 HCV 바이러스 핵산 서열의 부위-특이적 변이의 존재에 따라 변한다고 알려져 있다. 문헌[Nagayama et al., Hepatology, 31, 745 (2000)]. 시료 중에 함유된 HCV 바이러스 핵산 서열의 부위-특이적 돌연변이를 검출하기 위한 제1 프로브의 예로는 HCV 다단백질 (poly protein)의 434번째, 580번째, 938번째, 962번째, 1176번째 또는 2774번째 위치의 아미노산을 결정하는 염기 서열을 갖는 프로브를 사용할 수 있다 (문헌[Hepatology, 31, 745 (2000)]에 기재). 간암 (HCC) 환자로부터의 HCV-1b 게놈 서열은 무증후성 보균자 (ASC)로부터의 서열보다 돌연변이체-유형의 잔기가 더 많이 나타나는 경향이 있다. 이러한 프로브를 사용한다면 C형 간염에 대한 IFN의 효능을 정확하게 평가할 수 있다.

상기 기술된 바와 같이, IFN 처리의 효능은 HCV의 유전자형에 따라 변한다고 알려져 있다. 따라서, 제1 프로브는 HCV-RNA에 상응하는 염기서열, HCV-RNA의 단편, 또는 HCV-RNA의 상보 서열 또는 그 단편일 것이다. 보다 구체적으로는, 제1 프로브는 검출될 유전자형에 따라 HCV의 유형 1 (서열 5), 유형 2 (서열 6) 및 유형 3 (서열 7)의 유전자형을 특이적으로 검출하는 프로브로부터 선택될 수 있다. 달리 말하면 HCV 검출용 제1 프로브는 서열 5, 서열 6 및(또는) 서열 7로 표시되는 서열에 상응하는 서열, 및 이들의 상보 서열을 지닌 핵산 서열일 수 있다.

유전자형을 검출할 수 있는 프로브를 사용하는 경우, 상이한 유전자형에 상응하는 이 프로브들을 동일한 기판 상에 고정한다면 정확한 검출이 가능해진다.

시료 중의 병원성 미생물의 유전자형은 아래와 같이 검출할 수 있다. 한 실시태양에서, 병원성 미생물의 핵산 서열을 먼저 그 유전자형에 특이적인 프라이머를 이용해 PCR을 수행한 다음, 고정된 범용 프로브를 이용해 유전자형을 검출한다. 여기서 사용된 범용 프로브는 일반적으로 모든 C형 간염 바이러스를 그의 유전자형과 상관없이 검출할 수 있는 프로브로 정의할 수 있다. 문헌[Andonov et al., J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1999)].

C형 간염의 경우는, 센스 가닥으로는 서열 8 또는 서열 9로 표시되는 염기 서열을 이용하고, 안티센스 가닥으로는 유전자형 1a는 서열 10, 유전자형 1b는 서열 11, 유전자형 2a는 서열 12, 또는 유전자형 3a는 서열 13으로 표시되는 염기 서열을 이용하여 PCR을 수행한다. 그 후에 범용 프로브로서 서열 15로 표시되는 염기 서열을 이용하여 검출한다.

시료 중의 병원성 미생물의 양은 제1 프로브, 즉 병원성 미생물 유래의 핵산 서열에 상응하는 염기 서열 또는 이 핵산의 단편에 상응하는 염기 서열, 또는 이들의 상보 서열을 갖는 프로브를 이용하여 측정할 수 있다.

C형 간염의 경우 IFN 치료법의 효능은 혈중 HCV의 양에 따라 변한다고 알려져 있다. 문헌[J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995)]. IFN은 혈청에 10⁶카피/㎖이 넘는 HCV를 보균하는 환자에 효과가 없다. 문헌[Yeh et al., J. Med. Biol., 66, 481 (2002)]. 바이러스 양을 구하기 위한 프로브로는 HCV-RNA에 상응하는 염기 서열, HCV-RNA의 단편, 또는 HCV-RNA 및 그 단편의 상보 서열을 사용할 수 있다. 시료 중의 핵산을 형광 마커로 표지한 경우는 프로브-고정 칩 상의 프로브를 핵산과 혼성화한 다음 형광 마커의 형광 강도를 측정함으로써 바이러스의 양, 즉 바이러스의 농도를 측정한다. 전기화학적 방법의 경우는 프로브-고정 칩 상의 프로브를 핵산과 혼성화시킨 다음 그 칩으로부터의 전류 값을 측정함으로써 바이러스의 농도를 구한다.

본 발명의 프로브-고정 칩에서, 상기 프로브 (서열 5, 서열 6, 서열 7)를 제1 프로브로서 사용하면, 개체를 감염시킨 바이러스와 같은 병원성 미생물의 유전자형, 바이러스의 양, 부위-특이적 돌연변이의 존재, 및 발현된 유전자의 양 및 종류에 대한 정보를 얻을 수 있다. 그 결과, 바이러스의 유전자형이 일본 환자에서 주로 관찰되는 1b이면 IFN이 덜 효과적으로 작용하는 반면, 바이러스의 유전자형이 2a이면 IFN이 효과적으로 작용한다. 한편, 바이러스의 양이 10⁶카피/㎖ 또는 그 이상일 정도로 많으면 IFN 처리의 효능은 낮게 측정된다. 이 방법으로 개체에 대한 IFN 처리의 효능을 평가할 수 있다.

본 출원인은 일본 특허 출원 제2001-62371호 및 동 제2001-62372호에서 C형 간염에 대한 IFN 처리의 효능을 평가하는 다른 방법을 보고하였다. 이 방법에서, IFN 처리의 효능은 MxA 단백질을 코딩하는 인간 유전자의 프로모터 영역 (이하, "MxA 프로모터 영역"으로 언급)에 존재하는 특정 단일 뉴클레오티드 다형성 (이하, "SNP"로 언급)에 의해 측정하였다. IFN은 MxA 프로모터 영역에 특정 유형의 SNP를 지닌 환자에게 효과적이다. 따라서, IFN 처리의 효과는 SNP의 존재를 검사함으로써 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시태양에서는 개체의 핵산을 검출하기 위한 제2 프로브를 사용하여 MxA 프로모터 영역에서 SNP를 검출한다.

상기 발견에 따라, MxA 프로모터 영역의 -88번째 위치 (이하, "MxA-88"로 언급)가 G/G인 경우에는 IFN 처리의 효과가 낮은 반면, G/T 및 T/T인 경우에는 효과가 높다. 한편, MxA 프로모터 영역의 -123번째 위치 (이하, "MxA-123"으로 언급)가 C/C인 경우에는 IFN 처리의 효과가 낮은 반면, C/A 및 A/A인 경우에는 효과가 높다. 이러한 사실들을 토대로 IFN 처리의 효과를 평가하였다. "-88번째 위치" 및 "-123번째 위치"라는 용어는 MxA 유전자의 전사 개시 부위를 +1로 간주한 경우의 상대적인 위치를 나타낸다. WO 01/71007호의 도 1은 MxA 유전자의 프로모터 영역에 대한 뉴클레오티드 서열을 보여준다.

따라서 본 발명의 한 측면에 따라, C형 간염에 대한 IFN 처리의 효능은, 개체로부터 채취한 시료에서 HCV에 대한 유전자 분석을 수행하고, HCV 유전자의 존재를 검출하고 또한 HCV의 유전자형 또는 유전자 돌연변이를 검출하는 데 사용되는 제1 프로브와, 개체로부터 유래한 MxA 단백질 코딩 유전자의 프로모터 영역에 나타나는 SNP의 염기 유형을 검출하는 데 사용되는 제2 프로브가 고정된 프로브-고정 칩을 이용하여 개체로부터 유래한 MxA 단백질 코딩 유전자의 프로모터 영역에 대한 유전자 분석을 수행함으로써 평가할 수 있다. 그 결과, IFN 처리의 효능을 용이하게 예상할 수 있다.

또한, C형 간염에 대한 IFN 처리의 효능을 평가하는 방법으로서, 만노스-결합 렉틴 (이하, "MBL"로 언급)을 코딩하는 유전자의 2개의 SNP 위치를 검사함으로써 IFN 처리의 효능을 평가하는 방법이 알려져 있다. 문헌[M. Matsushita et al., J. Hepatology, 29:695-700, 1998]. MBL은 고유 면역계의 기본적인 인자이며, 유전자의 다형성을 지니고 있다. 일군의 MBL 유전자형인 "XB"는 IFN에 반응하지 않는다. 라우르센 (Laursen)은 문헌[Immunology, 93, 421 (1998)]에 MBL의 서열을 기재하였다. 상기 문헌은 이 거명을 통해 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 만노스-결합 렉틴을 코딩하는 유전자에 대한 유전자 분석은 단독으로 수행하거나, 또는 MxA 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터 영역에 대한 유전자 진단과 병행하여 수행할 수 있다.

IFN의 효능에 영향을 미치는 MBL 다형성은 MBL 유전자 프로모터 영역의 -221번째 위치 (이하, "MBL-221"로 언급)에 존재하며, MBL 유전자 중 엑손 1의 52번째, 54번째 및 57번째 코돈에 존재한다. "-221번째 위치"란 용어는 MBL 유전자의 전사 개시 부위를 +1로 간주한 경우의 상대적인 위치를 나타낸다.

MBL 유전자의 221번째 위치를 차지할 수 있는 염기는 C 및 G이다. C가 221번째 위치를 차지하는 경우에는 MBL 유전자의 유전자형이 "X"로 표시된다. G가 221번째 위치를 차지하는 경우에는 MBL 유전자의 유전자형이 "Y"로 표시된다. 명명법은 매드슨 (Madsen) 등의 문헌[Madsen HO, Garred P, Thiel S, Kurtzhals JAL, Lamm LU, Ryder LP, et al., "The interaction between promoter and structual gene controls the minimum serum level of a human mannan-binding protein", J. Immunol. 1995; 155:3013-20]을 기초로 한다. 이 문헌은 이 거명을 통해 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.

MBL 유전자 중 엑손 1의 52번째, 54번째 및 57번째 위치의 코돈은 구조 유전자, 즉 콜라겐-유사 도메인에 존재한다. 코돈 52의 가능한 서열 (유전자형)은 CGT 또는 TGT이다. 매드슨 명명법에 따라, 전자의 유전자형은 유형 A로 분류되며, 후자의 유전자형은 유형 D로 분류된다. 이와 유사하게, 코돈 54의 가능한 서열 (유전자형)은 GGC 또는 GAC이다. 전자는 유형 A이며, 후자는 유형 B이다. 또한, 코돈 57의 가능한 서열 (유전자형)은 GGA 또는 GAA이다. 전자는 유형 A이며, 후자는 유형 C이다. 모든 코돈에서, 유형 A는 야생형 대립유전자이며, 유형 B, C 및 D는 돌연변이형 대립유전자이다. 코돈 52, 54 및 57의 모든 대립유전자가 유형 A인 경우에는 코돈 52, 54 및 57의 대립유전자 중 하나 이상이 유형 A가 아닌 경우에 비해 IFN의 효능이 높다.

IFN은, MBL-221 위치가 유형 Y이고 코돈 52, 54 및 57의 대립유전자가 유형 A인 YA-YA 호모-접합자 유형의 환자인 경우에 다른 유형의 환자, 즉 MBL-221 위치가 유형 Y이고 코돈 52, 54 및 57이 유형 A가 아닌 YnonA-YA 헤테로-접합자 및 YnonA-YnonA 호모-접합자 유형에 비해 더 효과적으로 작용하는 경향이 있다. 바꾸어 말하면, IFN은 YA-YA 호모-접합자의 환자보다 YnonA-YA 헤테로-접합자 및 YnonA-YnonA 호모-접합자의 환자에 보다 덜 효과적으로 작용하는 경향이 있다.

상기 발견으로부터, 적합한 제2 프로브를 결정할 수 있다. 질환이 C형 간염이고 약물이 IFN인 실시태양에서, 프로브-고정 칩에 사용하는 것을 비롯하여 핵산에 대한 혼성화에 사용하기 위한 제2 프로브는 하기에 기재되는 바와 같이 MxA 프로모터의 SNP를 검출하는 프로브이다. 질환이 C형 간염이고 약물이 IFN인 다른 실시태양에서, 프로브-고정 칩에 사용하는 것을 포함하여 핵산에 대한 혼성화에 사용하기 위한 제2 프로브는 하기에 기재되는 바와 같이 IFN의 효능과 관련된 MBL 다형성을 검출하는 프로브이다.

각 염기 서열의 455번째 위치 및 420번째 위치에 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 지닌 인간 MxA 유전자의 프로모터 영역은 IFN 처리의 효능과 관련이 있다. 따라서, 서열 16, 17, 18, 19, 37, 38, 39 및 40으로 표시되는 염기 서열들은 각각 인간 MxA 유전자의 프로모터 영역을 포함한다.

다른 실시태양에서, 제2 프로브는

(at455) 서열목록의 서열 16으로 표시되는 염기 서열,

(bt455) (at455)로 표시되는 서열 중 455번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열 [MBL 다형성을 검출하기 위한 변형된 프로브는 MBL을 코딩하는 개체의 핵산에 혼성화되는 능력을 보유하고 있다. 변형된 프로브를 사용하는 혼성화 조건은 일반적인 프로브에 대한 것과 다르다. 본 발명에 따른 변형된 프로브는 HCV-RNA의 유전자형 또는 돌연변이를 검출하기 위해, 바람직하기로는 11개 염기 이상의 서열, 보다 바람직하기로는 12개 염기 이상, 보다 더 바람직하기로는 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 심지어 30개 염기 이상의 서열을 갖는다. 한편, 30개 염기 이상의 프로브, 바람직하기로는 약 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000개 염기 이상의 프로브가 HCV 게놈의 검출에 바람직하다. 11 내지 30개의 길이가 칩 포맷에 적합하며, 30 염기보다 더 긴 프로브는 일반적인 혼성화 포맷에 적합할 것이다.],

(ct455) 서열 16으로 표시되는 서열의 441 내지 455번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

(dt455) 서열 16으로 표시되는 서열의 449 내지 459번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

(et455) (at455) 내지 (dt455)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

(ag455) 서열목록의 서열 17로 표시되는 염기 서열,

(bg455) (ag455)로 표시되는 서열 중 455번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

(cg455) 서열 17로 표시되는 서열의 441 내지 455번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

(dg455) 서열 17로 표시되는 서열의 449 내지 459번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

(eg455) (ag455) 내지 (dg455)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

(aa455) 서열목록의 서열 18로 표시되는 염기 서열,

(ba455) (aa455)로 표시되는 서열 중 455번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

(ca455) 서열 18로 표시되는 서열의 441 내지 455번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

(da455) 서열 18로 표시되는 서열의 449 내지 459번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

(ea455) (aa455) 내지 (da455)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

(ac455) 서열목록의 서열 19로 표시되는 염기 서열,

(bc455) (ac455)로 표시되는 서열 중 455번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

(cc455) 서열 19로 표시되는 서열의 441 내지 455번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

(dc455) 서열 19로 표시되는 서열의 449 내지 459번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열, 및

(ec455) (ac455) 내지 (dc455)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.

서열 16, 17, 18, 19, 37, 38, 39 및 40으로 표시되는 염기 서열들은 각각 인간 MxA 유전자의 프로모터 영역을 포함한다. 각 염기 서열의 455번째 위치 및 420번째 위치에 나타나는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)은 IFN 처리의 효능과 관련이 있다.

서열 16 내지 19의 염기 서열들은 455번째 위치의 염기를 제외하고는 동일하다. 서열 16의 455번째 위치는 티민이다. 서열 17의 455번째 위치는 구아닌이다.서열 18의 455번째 위치는 아데닌이다. 서열 19의 455번째 위치는 시토신이다.

455번째 위치가 티민인 서열 16으로 표시되는 핵산 서열을 갖는 HCV 환자는 IFN에 의해 효과적으로 치료될 수 있는 한편, 그러한 서열이 결여된 HCV 환자는 IFN에 의한 치료 효과가 더 낮다. 보다 구체적으로 말하자면, 455번째 위치가 G인 서열 17의 핵산으로 이루어진 동종 접합자를 갖는 HCV 환자 (이하, "G/G 호모"로 언급)는, 455번째 위치가 티민인 서열 16의 핵산 및 455번째 위치가 구아닌인 서열 17의 핵산으로 이루어진 이종 접합자를 갖는 HCV 환자 (이하, "G/T 헤테로"로 언급), 또는 455번째 위치가 티민인 서열 17의 핵산으로 이루어진 동종 접합자를 갖는 HCV 환자 (이하, "T/T 호모"로 언급)보다 IFN에 의해 덜 효과적으로 치료된다.

또는, T/non-T 헤테로 또는 T/T 호모의 HCV 환자에 비해, 455번째 위치가 티민인 MxA 유전자의 프로모터 영역을 지닌 동종 접합자를 갖는 HCV 환자 (이하, "non-T/non-T 호모"로 언급)는 IFN에 의해 덜 효과적으로 치료된다. non-T/non-T 호모의 조합으로는 G/G, G/A, G/C, A/A, A/C 및 C/C를 예로 들 수 있다. T/non-T의 조합으로는 T/G, T/A 및 T/C를 예로 들 수 있다.

서열 37 내지 40의 염기 서열들은 425번째 위치의 염기를 제외하고는 동일하다. 서열 37의 425번째 위치는 아데닌이다. 서열 38의 425번째 위치는 시토신이다. 서열 39의 425번째 위치는 티민이다. 서열 40의 425번째 위치는 구아닌이다.

본 발명의 프로브-고정 칩에서, 티민을 갖는 SNP 부위를 함유하는 서열 16의 염기 서열, 염기 서열의 단편 또는 (at455) 내지 (et455)의 상보 서열 중 어느 하나가 (개체로부터 유래한 핵산의 서열을 검출하기 위한) 제2 프로브로 사용되는 경우, 염기 서열의 SNP 부위 (개체로부터 유래한 인간 MxA 유전자의 프로모터 영역 포함)가 티민인지 아닌지 처리 전에 알 수 있다. 이 방법으로 개체에 대한 IFN 처리의 효능을 평가할 수 있다.

HCV 환자의 인간 MxA 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 염기 서열 중 SNP 부위의 염기가 IFN 처리 전에 결정된다면, IFN이 HCV 환자에 효과적으로 작용하는지의 여부를 평가할 수 있다.

본 발명의 프로브-고정 칩에서, 구아닌의 SNP 부위를 함유하는 서열 17의 염기 서열, 염기 서열의 단편 또는 (ag455) 내지 (eg455)의 상보 서열 중 어느 하나; 아데닌의 SNP 부위를 함유하는 서열 18의 염기 서열, 염기 서열의 단편 또는 (aa455) 내지 (ea455)의 상보 서열 중 어느 하나; 및 아데닌 염기를 갖는 SNP 부위를 함유하는 서열 19의 염기 서열, 염기 서열의 단편 또는 (ac455) 내지 (ec455)의 상보 서열 중 어느 하나가 개체로부터 유래한 핵산의 서열을 검출하기 위한 제2 프로브로 사용되는 경우, 개체로부터 유래한 인간 MxA 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 염기 서열 중의 SNP 부위의 염기를 확인할 수 있다. 이 방법으로 개체에 대한 IFN 처리의 효능을 평가할 수 있다 (일본 특허 출원 제2001-62371호 및 동 제2001-62372호 참조).

질환이 C형 간염이고 약물이 IFN인 다른 실시태양에서, 프로브-고정 칩에 사용하는 것을 비롯하여 핵산에 대한 혼성화에 사용하기 위한 제2 프로브는

(aa420) 서열목록의 서열 37로 표시되는 염기 서열,

(ba420) (aa420)으로 표시되는 서열 중 420번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

(ca420) 서열 37로 표시되는 서열의 415 내지 425번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

(da420) (aa420) 내지 (ca420)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

(ac420) 서열목록의 서열 38로 표시되는 염기 서열,

(bc420) (ac420)으로 표시되는 서열 중 420번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

(cc420) 서열 38로 표시되는 서열의 415 내지 425번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

(dc420) (ac420) 내지 (cc420)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

(at420) 서열목록의 서열 39로 표시되는 염기 서열,

(bt420) (at420)으로 표시되는 서열 중 420번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

(ct420) 서열 39로 표시되는 서열의 415 내지 425번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

(dt420) (at420) 내지 (ct420)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

(ag420) 서열목록의 서열 40으로 표시되는 염기 서열,

(bg420) (ag420)으로 표시되는 서열 중 420번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

(cg420) 서열 40으로 표시되는 서열의 415 내지 425번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열, 및

(dg420) (ag420) 내지 (cg420)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로브이다.

425번째 위치가 아데닌인 서열 37의 핵산 서열을 갖는 HCV 환자는 IFN에 의해 효과적으로 치료되는 한편, 서열 37이 없는 HCV 환자는 IFN에 의해 효과적으로 치료되지 않는다. 이 서열과 IFN 효능 사이의 관계는, SNP 부위가 455번째 위치에 존재하는 경우와 거의 동일하다.

또한, IFN에 의해 효과적으로 치료되는 것으로 확인된 질환이 C형 간염인 경우, 본 발명의 제2 프로브는 하기 (i) 내지 (t)의 서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 (i) 내지 (t)의 서열은 MBL-221의 유형을 결정하고 코돈 52, 54 및 57의 다형성 존재를 측정하는 데 적합하다.

MBL-221을 함유하며 코돈 52, 54 및 57에서 다형성을 코딩하는 MBL 유전자의 서열은 서열 41 내지 서열 56에 나타나 있다. MBL-221은 이들 서열의 425번째 위치에 존재한다.

엑손 1은 이들 각 서열의 646번째 위치로부터 시작된다. 코돈 52는 868번째 위치 내지 870번째 위치에 존재한다. 코돈 54는 874번째 위치 내지 876번째 위치에 존재한다. 코돈 57은 883번째 위치 내지 885번째 위치에 존재한다. 코돈 52, 54 및 57의 SNP는 각각 868번째 위치, 875번째 위치 및 884번째 위치에 존재한다.

(i) 각각 MBL-221의 SNP 부위를 함유하며, 각각 418번째 위치 내지 432번째 위치에 상응하는 핵산 서열을 함유하는 서열 41 내지 서열 44의 핵산 단편.

(j) 각각 MBL-221의 SNP 부위를 함유하며, 각각 421번째 위치 내지 430번째 위치에 상응하는 핵산 서열을 함유하는 서열 41 내지 서열 44의 핵산 단편.

(k) 서열 (i) 및 (j)의 상보 서열들.

(l) 각각 코돈 52, 54 및 57의 SNP 부위를 함유하며, 각각 868번째 위치 내지 885번째 위치에 상응하는 핵산 서열을 함유하는 서열 45 내지 서열 56의 핵산 단편, 예를 들면 서열 45 내지 서열 56으로 표시되는 핵산들을 함유하는 단편.

(m) 각각 코돈 52 및 54의 SNP 부위를 함유하며, 각각 868번째 위치 내지 876번째 위치에 상응하는 핵산 서열을 함유하는 서열 45 내지 서열 56의 핵산 단편, 예를 들면 서열 45 내지 서열 56으로 표시되는 핵산들을 함유하는 단편.

(n) 각각 코돈 54 및 57의 SNP 부위를 함유하며, 각각 874번째 위치 내지 885번째 위치에 상응하는 핵산 서열을 함유하는 서열 45 내지 서열 56의 핵산 단편, 예를 들면 서열 45 내지 서열 56으로 표시되는 핵산들을 함유하는 단편.

(o) 각각 코돈 54의 SNP 부위를 함유하며, 각각 874번째 위치 내지 876번째위치에 상응하는 핵산 서열을 함유하는 서열 45 내지 서열 56의 핵산 단편, 예를 들면 서열 45 내지 서열 56으로 표시되는 핵산들을 함유하는 단편 및, 특히 이 서열들의 869번째 위치 내지 880번째 위치를 함유하는 단편.

(p) 각각 코돈 52의 SNP 부위를 함유하며, 각각 868번째 위치 내지 870번째 위치에 상응하는 핵산 서열을 함유하는 서열 45 내지 서열 56의 핵산 단편, 예를 들면 서열 45 내지 서열 56으로 표시되는 핵산들을 함유하는 단편 및, 특히 이 서열들의 864번째 위치 내지 873번째 위치를 함유하는 단편.

(q) 각각 코돈 57의 SNP 부위를 함유하며, 각각 883번째 위치 내지 885번째 위치에 상응하는 핵산 서열을 함유하는 서열 45 내지 서열 56의 핵산 단편, 예를 들면 서열 45 내지 서열 56으로 표시되는 핵산들을 함유하는 단편 및, 특히 이 서열들의 880번째 위치 내지 890번째 위치를 함유하는 단편.

(r) 각각 코돈 54의 SNP 부위를 함유하며, 각각 코돈 54의 SNP가 존재하는 875번째 위치를 함유하는 핵산을 함유하는 서열 45 내지 서열 56의 핵산 단편, 예를 들면 서열 45 내지 서열 56으로 표시되는 핵산들을 함유하는 단편.

(s) (i) 내지 (m)으로 표시되며, 11 내지 30개의 염기 길이를 갖는 핵산 단편. MBL 유전자의 경우에 바람직하게는, 프로브 서열이 적어도 420번째 위치 내지 430번째 위치, 864번째 위치 내지 874번째 위치, 870번째 위치 내지 880번째 위치 및 879번째 위치 내지 889번째 위치를 함유한다. MxA 유전자의 경우, 프로브 서열은 적어도 450번째 위치 내지 460번째 위치를 함유한다.

(t) (i) 내지 (m)으로 표시되며, SNP 부위를 제외한 곳에서 1개 내지 여러개의 뉴클레오티드를 결실, 치환 또는 부가시킴으로써 변형된 핵산들인 핵산 단편.

본원에 첨부된 서열목록의 각 서열에서, "N" 및 "n"은 아데닌, 티민, 구아닌 및 시토신 중 어느 한 염기를 나타낸다.

본 발명의 프로브-고정 칩에서, 개체에 의해 발현되는 핵산 (RNA)은 본 발명의 제2 프로브, 즉 개체로부터 유래한 핵산 서열에 상응하는 염기 서열을 갖는 프로브, 그의 단편, 또는 핵산 서열이나 단편의 상보 서열에 의해 측정할 수 있다. 이 경우, RNA, cDNA 또는 cRNA인 핵산 서열은 검출 또는 정량될 수 있다. 예를 들어, IFN의 효능은 개체의 체질적 소양에 따라 달라지기 때문에, 유전자의 발현 패턴, 즉 발현된 유전자의 양과 질을 측정할 수 있다면, IFN이 실제로 투여되었을 때 IFN의 효능을 평가할 수 있다.

본 발명의 한 측면에 따라, 표적 질환은 특별히 제한되지 않는다. 병원성 미생물에 의해 유도될 수만 있다면, 어떠한 질환도 표적화될 수 있다. 본 발명에는 병원성 미생물과 관련된 질환들이 포함된다. 또한, 본 발명에는 종양학적 질환들이 포함된다.

예를 들면, IFN에 의해 효과적으로 치료되는 것으로 알려진 C형 간염 이외의 다른 질환들에 대한 IFN 처리의 효능을 예상할 수 있는데, 그 예로는 C형 (A, B, C, D, E, F, G형) 간염 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 허피스 바이러스, 아데노바이러스, 인간 폴리오마바이러스, 인간 파필로마 바이러스, 인간 파르보바이러스, 멈프스 바이러스, 인간 로타바이러스, 엔테로바이러스, B형 일본 뇌염 바이러스, 뎅그열 바이러스, 풍진 바이러스 및 HTLV와 같은 바이러스의 감염에 의해 유발되는 감염성 질환들; 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 헤몰리틱 스트렙토코커스 (hemolytic streptococcus), 병원성 대장균 (Escherichia coli), 장염성 비브리오균 (enteritis vibrio), 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori), 캄필로박터 (Campylobacter), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 이질성 바실러스균 (dysentery bacilli), 살모넬라균 (salmonellae), 엘시니아균 (Yelsinia), 네이세리아 고노르호에아 (Neisseria gonorrhoeae), 리스테리아균 (Listeria), 렙토스피라균 (Leptospira), 레지오넬라균 (Legionella), 파상균 (spirochete), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 리케챠 (rickettsiae), 클라미디아균 (chlamydiae), 말라리아 원충 (malaria plasmodia), 이질성 아메바 (dysentery amoeba) 및 병원성 진균과 같은 세균의 감염에 의해 유발되는 감염성 질환들; 및 기생충 및 진정균류 (Eumycetes)에 의해 유발되는 질환들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

또한, 종양학적 질환들에 대한 IFN 처리의 효능을 평가할 수 있다. 종양학적 질환의 예로는 유전성 질환, 망막모세포종, 윌름 종양 (Wilm's tumor), 가족성 결장 폴립증, 유전성 비-폴립증 결장암, 신경섬유종증, 가족성 흉부암, 색소성 건피증, 농포암, 경구암, 식도암, 위암, 결장암, 간암, 췌장암, 폐암, 갑상선암, 유선암 (mammary gland tumor), 비뇨기 종양, 남성성기 종양 (virilia tumor), 여성생식기 종양 (muliebria tumor), 피부암, 골육종, 골연골육종, 백혈병, 림프종 및 충실성 종양이 포함된다.

본 발명에 따라 검출되는 병원성 미생물은 특별히 한정되지 않는다. 예를들어, HCV와 같은 병원성 미생물은 IFN 처리의 효능을 평가하는 데 이용할 수 있다. 그러나, IFN에 의해 효과적으로 치료될 수 있는 것으로 확인된 질환과 관련되어 있기만 하다면, 어떤 병원성 미생물이라도 이용할 수 있다. 미생물이 질환 또는 질환의 증상과 직접 또는 간접적으로 관련되어 있다면, 이 미생물은 질환과 관련된 병원성 미생물이다.

그러한 병원성 미생물의 예로는 C형 (A, B, C, D, E, F, G형) 간염 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 허피스 바이러스, 아데노바이러스, 인간 폴리오마바이러스, 인간 파필로마 바이러스, 인간 파르보바이러스, 멈프스 바이러스, 인간 로타바이러스, 엔테로바이러스, B형 일본 뇌염 바이러스, 뎅그열 바이러스, 풍진 바이러스 및 HTLV와 같은 바이러스; 스타필로코커스 아루레우스, 헤몰리틱 스트렙토코커스, 병원성 대장균, 장염성 비브리오균, 헬리코박터 파일로리, 캄필로박터, 비브리오 콜레라, 이질성 바실러스균, 살모넬라균, 엘시니아균, 네이세리아 고노르호에아, 리스테리아균, 렙토스피라균, 레지오넬라균, 파상균, 미코플라즈마 뉴모니아, 리케챠, 클라미디아균, 말라리아 원충, 이질성 아메바및 병원성 진균과 같은 세균; 기생충; 및 진정균류가 포함된다.

질환 및 개체에 고유한 유전자에 대한 IFN 처리 효능의 관계는 실시예에 설명하였다.

그러나, 본 발명은 이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

일부 실시태양에서, 후천성 면역결핍증 (AIDS)에 대한 개체의 이환도는 개체에 존재하는 인간 면역결핍 바이러스 (이하, "HIV"로 언급) 및 개체로부터 유래한유전자의 분석으로부터 예상할 수 있다. 또한, HIV 유전자 및(또는) 그의 복제본의 유전자형 (예를 들면, cDNA) 및 HIV 유전자의 특정 다형성을 분석한다. 그렇게 얻어진 정보를 토대로, 리트나빌 (RTV) 또는 사퀴나빌 (SQV)과 같은 프로테아제 억제제, 및 아디포티민 (AZT) 또는 디다노이신 (ddl)과 같은 역전사 억제제를 비롯한 약물들의 효능을 예상할 수 있다. 일부 실시태양에서, 수두 또는 조나 (zona)에 대한 개체의 이환도는 개체에 존재하는 수두대상포진바이러스 (Varicella Zoster Virus) 및 개체로부터 유래한 유전자의 분석으로부터 예상할 수 있다. 별법으로, 아시클로빌 (acyclovil)과 같은 항-바이러스제의 효능을 분석할 수 있다. 한편, 인플루엔자 바이러스의 유전자형, 인플루엔자 바이러스의 카피수, 및 개체의 유전자형이 결정되면, 인플루엔자에 대한 개체의 이환도 및 타미풀루 (Tamifulu)와 같은 항-바이러스제의 효능을 예상할 수 있다. 추출된 핵산 성분이 HCV-RNA인 경우, HCV-RNA는 시험 핵산으로서 사용될 수 있다. 또는, HCV-RNA는 역전사효소에 의해 cDNA로 전환된 후, 시험 핵산으로서 사용될 수 있다.

유전자형을 검출할 수 있는 프로브가 사용되는 경우, 상이한 유전자형들에 상응하는 다수의 프로브가 동일한 기판 상에 고정될 수 있다면, 정밀한 검출이 가능하다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지, 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.

본 발명은

(a) 특정 질환과 관련된 병원성 미생물의 특정 핵산이 존재하는지 검출하는 제1 프로브, 및 특정 개체의 특정 핵산 서열이 존재하는지 검출하는 제2 프로브를 포함하는 프로브-고정 기판과 상기 개체로부터의 핵산 추출물을 반응시키는 단계, 및

(b) 상기 반응 (a)로부터, 상기 제1 프로브에 결합된 핵산의 존재를 검출하여 특정 질환과 관련된 개체의 핵산에 대한 제1 정보를 얻고 상기 제2 프로브에 결합된 핵산의 존재를 검출하여 상기 개체에 존재하는 병원성 미생물의 핵산에 대한 제2 정보를 얻는 단계

를 포함하는, 특정 질환과 관련된 개체의 핵산에 대한 제1 정보 및 상기 개체에 존재하는 병원성 미생물의 핵산에 대한 제2 정보를 얻는 방법을 제공한다.

<실시예 1> 대상체인 인간으로부터 핵산을 추출하는 방법

1. 인간 환자로부터 인간 게놈 핵산 및 바이러스 게놈 핵산을 추출하는 방법

약 3 ㎖의 혈액을 각 HCV 환자로부터 채취하여 EDTA2K를 함유하는 진공 혈액 수집 튜브에 놓아 두었다. 그 후에, QIAamp DNA 혈액 Midi 킷트 (QIAGEN GmBH에서 제조 및 시판)에 의해 혈액 시료로부터 핵산을 추출하였다. 수득된 추출물에 함유된 HCV 게놈 RNA를 역전사 반응시켰다. 보다 구체적으로, 수득된 추출물로부터 분액을 취하여, 헥사데옥시리보뉴클레오티드 혼합물 (Takara K.K.에서 시판) 및 M-MLV 역전사효소 (Life Technologies Inc.에서 시판)를 이용하여 반응을 42 ℃에서 30분동안 진행시켰다.

2. HCV 게놈 RNA가 인간 게놈 핵산 추출 킷트에 의해 추출되는 경우의 추출률 연구

HCV 게놈 RNA가 추출되는 경우, 일반적으로 전혈 대신 혈청을 사용하였다. 단백질과 같은 오염물을 최대한 제거한 후, HCV 게놈 RNA를 구아니딘 완충액 등을 이용하여 추출하였다. 그러나, 본 발명의 방법에서, HCV 게놈 RNA는 인간 게놈 DNA와 동시에 추출되었다. 따라서, 본 발명자들은 HCV 게놈 RNA가 전혈에 대한 인간 게놈 핵산 추출 킷트에 의해 전혈로부터 인간 게놈 DNA와 동시에 추출되는 경우에, HCV 게놈 RNA의 추출률을 조사하였다.

2가지 방법을 비교하였다. 하나는 SepeGeneRV-R (Sanko Junyaku K. K.에서 시판)을 이용하여 혈청 (100 ㎕)으로부터 HCV 게놈 RNA를 추출하는 일반적인 방법이었다. 다른 하나는 QIAamp DNA 혈액 Midi 킷트 (QIAGEN GmbH)에 의해 전혈로부터 HCV 게놈 RNA를 추출하는 방법이었으며, 이 방법을 하기에 "QIAamp 방법"으로 언급할 것이다. QIAamp 방법에 의해 추출된 HCV 게놈 RNA를 그 상태 그대로 역전사 반응시키고, 에탄올 침전에 의해 정제한 후에 역전사 반응시켰다. 에탄올 침전을 거친 것과 거치지 않는 것의 QIAamp 방법에 의한 HCV 게놈 RNA의 추출률도 비교하였다.

추출률은 HCV 게놈 RNA의 5' URT 서열을 이용하는 경쟁적 PCR (참조, 문헌[K. Chayama et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 8, S40-44, 1993])에 의해 평가하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

추출 방법과 HCV 게놈 핵산의 추출률과의 비교

추출 방법	정제	정량 결과 (혈액 중 카피/㎖)
SepeGeneRV-R	수행함	1×105.5
QIAamp DNA 킷트	수행하지 않음	6×104.5
QIAamp DNA 킷트	수행함	6×104.5

상기 결과로부터, HCV 게놈 RNA의 추출률은 QIAamp 방법을 이용하는 경우가 일반적인 방법을 이용하는 경우보다 약 10배 정도 낮다는 것은 명백하다. 따라서, HCV RNA는 바이러스 농도가 매우 낮은 혈액 시료에서는 QIAamp 방법에 의해 추출되지 않으리라 가정하였다. 따라서, QIAamp 방법은 본 발명의 프로브-고정 칩에 의해 정량하기에는 부적합한 것으로 여겨졌다. 그러나, 일반적인 방법으로 측정시 10 카피/㎖ 이상 농도의 바이러스를 함유하는 전혈 시료가 사용되는 경우, 이론적으로는 DNA가 QIAamp 방법에 의해 RNA와 동시에 추출될 수 있다고 제안되었다. 즉, 바이러스는 QIAamp 방법에 의해 정량될 수 있음이 제안되었다.

상기와 같은 역전사 반응에 의해 수득된 시료를 증폭 반응시켜 인간 게놈 핵산과 그에 함유된 HCV 게놈 RNA를 동시에 증폭하였다.

프라이머 MxAF01 및 MxAR02를 사용하여 인간 게놈 핵산을 증폭하였다. 프라이머 nc2 (문헌[K. Chayama et al., J. Gastroenterol. Hapatol. 8, S40-44, 1993, nt27-45]) 및 프라이머 33 (문헌[Okamoto et al., Jpn. J. Exp. Med 60, 215-222, 1990])을 사용하여 HCV 게놈 RNA를 증폭하였다. 1개의 튜브에서 증폭을 수행하였다. 인간 게놈 핵산 및 HCV 게놈 RNA의 증폭은, 94 ℃에서 30초 반응, 55 ℃에서 30초 반응 및 2 ℃에서 1초 반응으로 이루어진 싸이클을 50회 반복함으로써 수행하였다. PCR 전에 94 ℃에서 4분동안 예비 처리를 수행하였고, PCR 후에 72 ℃에서 7분동안 후-처리를 수행하였다.

프라이머의 서열은 하기와 같다:

MxAFO1: 5'-ACACACCCGTTTCCACCCTGGAGAGGCCAG-3'

MxAR02: 5'-TGCGCAGTGCTGGAGTGCGGCCTCCGCTCT-3'

NC2: 5'-CCT GTG AGG AAC TAC TGT C-3'

33: 5'-GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC-3'

그 결과, 인간 게놈 DNA (크기: 610bp) 및 HCV 게놈 RNA (크기: 300bp)를 증폭하였다. 이로부터, 인간 게놈 DNA 및 바이러스 게놈 RNA의 추출 단계로부터 게놈 핵산의 특정 영역의 증폭 단계까지의 과정을 동일한 방식으로 동시에 수행할 수 있음이 입증되었다.

본 발명에 따라, 개체로부터 추출된 시료를 이용하여 간편하고 빠르게 질환의 치료를 평가하는 것이 가능하다.

또한 그러한 실시태양에 따라, 개체로부터 채취한 단일 시료로부터 많은 정보를 얻을 수 있다. 따라서, 시료 시험시 종종 나타나는 시료의 혼합을 방지할 수있다. 또한, 매우 위험한 시료를 다루는 경우, 통상적인 경우에 비해 그런 위험한 시료의 오염을 방지할 수 있다. 동시에, 위험한 시료에 의해 유발될 수 있는 사고의 위험을 최소화시킬 수 있다.

<실시예 2> IFN 처리의 효능을 평가하기 위한 DNA 칩

우선, 인간 염색체 DNA 및 HCV-RNA를 인간 환자의 혈액 시료로부터 채취하였다. 135bp의 인간 염색체 DNA 단편을, 서열 20 및 서열 21로 표시되는 프라이머를 사용하여 증폭하였다. HCV-RNA를 역전사효소로 처리하여 cDNA를 제조하였다.

상기 단계에서 얻은 핵산 시료를, 파마시아 (Pharmacia Inc.)에서 제조 및 시판하는 킷트를 이용하여 FITC로 표지하였다.

도 1은 실시예 2에 따른 DNA 칩의 개략도이다. 기판(6)은 폴리리신으로 코팅된 슬라이드글라스이다. 기판(6) 상에 제2 프로브 및 제1 프로브 각각 200 nL를 스팟팅하여 건조시켰다 (도 1에서, 제1 및 제2 프로브는 번호 1 내지 5로 표시). 이 경우, 서열 22, 23, 24, 25 및 26으로 표시되는 서열들을 제2 프로브로 사용하였다. 서열 5, 6 및 7로 표시되는 서열들을 제1 프로브로 사용하였다. 그 이후, DNA 칩에 UV를 조사하여 기판(6) 상에 프로브들을 고정시켰다. 서열 22 내지 25의 염기 서열들은 각각 서열 16 내지 19로 표시되는 염기 서열들의 단편이었으며, 모두 455번째 위치에 SNP 부위를 지니고 있었다. 서열 5 내지 7의 염기 서열들은 HCV 바이러스의 유전자형, 즉 1, 2 및 3 유형을 검출하기 위해 사용된 프로브였다.

FITC로 표지된 핵산을 2xSSC-1mmol/L EDTA 용액 중에 용해시켰다. 이와 같이 제조한 핵산을 20 ㎕ 부피의 반응 챔버에 놓고 프로브-고정 슬라이드글라스로덮었다. 50 ℃에서 12시간동안 반응을 수행한 후, 프로브-고정 칩을 2xSSC-1mmol/L EDTA 용액으로 2회 세척하였다. 그 후, 슬라이드글라스로부터 방출되는 형광의 강도를 측정하였다.

그 결과, 서열 22의 프로브 지점에서만 상당량의 형광이 방출되었다. 그 결과, 인간 핵산으로부터 유래하고 혈액 시료 중에 함유된 MxA-88의 유전자형이 T/T 호모 유형으로 결정되었다. 또한, 혈액 시료 중에 함유된 바이러스는 HCV 바이러스 유형 2로 결정되었다. 수득된 형광 강도로부터, 바이러스 농도가 10⁶카피/㎖ 또는 그 이하로 추정되었다. 이러한 사실들을 토대로, IFN은 시료를 채취한 환자에 효과적으로 작용할 수 있을 것으로 추정하였다.

<실시예 3> IFN 처리의 효능을 평가하기 위한 PNA 칩

인간 염색체 DNA 및 HCV-RNA를 인간 환자의 혈액 시료로부터 채취하였다. 135bp의 인간 염색체 DNA 단편을 서열 20 및 서열 21의 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 한편, HCV-RNA를 역전사효소로 처리하여 cDNA를 제조하였다. 이와 같이 얻은 cDNA를 주형으로 사용하고, 서열 10, 11, 12, 13 및 14로 표시되는 프라이머 (이들은 안티센스 프라이머임)을 사용하여 PCR을 수행하였다.

도 2는 실시예 3의 PNA 칩의 개략도이다. 프로브-고정 칩은 하기와 같이 제조하였다. 금 전극(13)을 커넥션(14)과 함께 유리 기판(12) 상에 패턴화시켰다. 칩 상에서, 제1 PNA 프로브 및 제2 PNA 프로브 각 200 nL (도면에서 번호 7 내지 11로 표시)를 기판에 스팟팅하고, 1시간동안 방치하였다. 이 경우, 서열 27, 28,29, 30 및 31로 표시되는 서열들을, N 말단이 시스테인으로 변형된 제2 PNA 프로브로 사용하였다. 서열 32, 33, 34, 35 및 36으로 표시되는 서열들을 제1 PNA 프로브로 사용하였다. 서열 27 내지 30의 염기 서열들은 각각 염기 서열의 455번째 위치에 SNP 부위를 지닌 서열 16 내지 19의 서열들을 포함하는 단편이었다. 서열 32 내지 36의 염기 서열들은 HCV 바이러스의 유전자형, 즉 1a, 1b, 2a, 2b 및 3a 유형을 검출하기 위해 사용된 프로브였다.

그 후, 시료를 2xSSC-1mmol/L EDTA 용액 중에 용해시켰다. 결과의 용액을 20 ㎕의 반응 챔버에 놓고 프로브-고정 칩으로 덮었다. 50 ℃에서 1시간동안 반응을 수행한 후, 프로브-고정 칩을 2xSSC-1mmol/L EDTA 용액으로 세척하였다. 칩에 10 μmol/L의 획스트 33258 용액을 적가하였다. 금 전극(13), 상대 전극 및 기준 전극을 프로브-고정 칩 상에 세팅하였다. 금 전극과 상대 전극 사이에 전압을 인가하여 획스트 33258로부터의 산화 전류를 측정하였다.

그 결과, 서열 27, 28 및 34로 표시되는 서열의 프로브가 고정된 금 전극(13)으로부터 수득된 전류가 상당량 변화하였다. 이로부터, 인간 핵산으로부터 유래하고 시료에 함유된 MxA-88의 유전자형이 G/T 헤테로로 결정되었다. 또한, 시료에 함유된 바이러스는 2a 유형으로 결정되었다. 따라서, IFN은 시료를 채취한 환자에 효과적으로 작용할 수 있을 것으로 추정하였다.

<실시예 4>

본 발명에 따라, C형 간염 환자를 감염시킨 HCV 바이러스의 유형, 및 MxA-88, MxA-123, MBL-221 및 MBL의 콜라겐 유사 도메인의 코돈 54에 대한 유전자형을토대로, C형 간염에 대한 IFN 처리의 효과를 평가할 수 있다.

바이러스의 유형 및 MBL과 MxA의 유전자형을 토대로 IFN 처리의 효능을 평가하는 방법은 도 3의 흐름도를 참고로 설명할 수 있다.

IFN의 효능을 평가하는 흐름도는, 혈액 시료와 같은 시료가 IFN으로 처리될 개체로부터 채취되는 단계 3a에서 시작한다. 필요한 경우, 이와 같이 얻은 시료를 추출 등에 의해 정제할 수 있다. 그 후, 바이러스 유형과, MxA-88, MxA-123, MBL-221 및 MBL 콜라겐 유사 도메인의 코돈 54의 유전자형을 결정하였다.

다음으로, 평가 과정은 단계 3b로 간다. 유형 1의 바이러스가 단계 3a에 나타나는 경우, 과정은 단계 3c로 간다. 단계 3b에 유형 2만 나타나는 경우에는 과정이 단계 3d로 간다.

단계 3c에서, IFN의 효능과 유전자형의 관계를 나타낸 데이타 표 2를 검색함으로써, 단계 3a에서 결정된 MBL과 MxA 유전자형에 상응하는 IFN의 효능을 결정한다. 그 결과, IFN 처리의 효능을 평가할 수 있다. 전체 평가 과정은 이와 같이 완료된다.

단계 3d에서, IFN의 효능과 유전자형의 관계를 나타낸 데이타 표 3을 검색함으로써, 단계 3a에서 결정된 MBL과 MxA 유전자형에 상응하는 IFN의 효능을 결정한다. 그 결과, IFN 처리의 효능을 평가할 수 있다. 전체 평가 과정은 이와 같이 완료된다.

본원에 사용된 데이타 표는 유전자형과 관련된 IFN에 대한 감도 데이타를 함유하고 있다.

데이타 표 2 및 3의 데이타는 각각 표 2 및 3에 기재되어 있다. 본원에 사용된 데이타 표 2, 3, 및 표 2, 3은 예시용이다. IFN의 효능과 유전자형 사이의 관계를 나타내기만 한다면, 어떤 데이타 표 및 표도 사용될 수 있다. 예를 들어, 표 2는 IFN의 효능과 유형 1의 HCV 바이러스에 감염된 환자의 유전자형 사이의 관계를 보여준다. 한편, 표 3은 IFN 효능과 바이러스들의 유전자형 사이의 관계를 보여준다. 사용되는 표는 데이타만의 요건을 나타낼 수 있다. 또는, 표는 데이타의 요건 항목과 함께 데이타의 다른 항목을 포함할 수도 있다. 실시예 4의 단계 3c 및 3d에서, 표 2 및 3은 데이타 표라고 지칭되는데, 이는 각각의 단계에 대한 요건 항목을 선택하여 미리 준비한 것이다. 그러나, 표 2 및 3은 하나로 합쳐질 수도 있다. 또한, 표는 데이타의 요건 항목이 아닌 항목들을 나타낼 수 있다. 보다 구체적으로 설명하기 위해, 표에 기재되는 항목들을 하기와 같이 선택할 수 있다. 예를 들어, 단계 3c에서 사용되는 표는, 이 표가 "HCV 유형 1로 감염된 환자의 유전자형" 항목, "효과가 있는 환자의 비율" 항목 및 "효과가 없는 환자의 비율" 항목을 포함하면 충분할 것이다. 단계 3d에서 사용되는 표는, 이 표가 "HCV 유형 2로 감염된 환자의 유전자형" 항목, "효과가 있는 환자의 비율" 항목 및 "효과가 없는 환자의 비율" 항목을 포함하면 충분할 것이다. 그러나, 표에 기재되는 항목들이 이에 한정되는 것은 아니다. 실시자가 표에 기재될 항목들을 임의로 선택할 수 있다.

표 2 및 3에 기재된 숫자 값들은 유전자형과 IFN 감도 또는 IFN 효능의 대응을 나타낸다. 그러나, 유전자형과 IFN 감도의 대응이 반드시 숫자 값으로 표현될필요는 없다. 유전자형과 IFN 효능 사이의 관계는, 사실상 그 관계를 표현할 수만 있다면, Ｏ, △ 및 Ｘ와 같은 기호, 및 1, 2, 3, 4 및 5와 같은 점수 (단순화된 숫자 값)와 같은 임의의 수단으로 표현할 수 있다.

바이러스 유형에 대한 IFN 처리의 효과

HCV 유형	효과 있음 (％)	효과 없음 (％)	계
유형 1(b)	18(17)	85(83)	103
유형 2(a/b)	34(62)	21(38)	55
유형 1 및 2	0	1	1
계	52	107	159

데이타의 많은 항목을 본 발명에 따라 조사한다면, IFN 처리의 효능을 보다 정밀하게 평가할 수 있다. 또한, 본 발명의 측면에 따른 방법 및 프로브-고정 칩을 사용한다면, 시료로부터 표적 핵산에 대한 정보를 간편하고 빠르며 정확하게 수집할 수 있다. 본 발명의 상기 측면은 예를 들어 설명한 것이므로, 본 발명을 제한하지 않을 것이다.

당업자에게는 부가의 이점 및 변형이 용이하게 발생할 것이다. 따라서, 더 넓은 범위를 갖는 본 발명은 본원에 기재 및 설명된 상세한 설명 및 대표적인 실시태양으로 한정되지는 않는다. 따라서, 첨부된 청구의 범위 및 그의 등가물에 정의된 바와 같이 포괄적인 발명의 정신 또는 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있다.

<110> KABUSHIKI KAISHA TOSHIBA HASHIMOTO, Koji HASHIMOTO, Michie MISHIRO, Shunji OOTA, Yasuhiko <120> DETECTION OF NUCLEIC ACID ASSOCIATED WITH DISEASE <130> 01S1691P <150> JP 2001-90053 <151> 2001-3-27 <150> JP 2001-284112 <151> 2001-9-18 <160> 72 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Hepatitis C Virus <400> 1 ccctgtgagg aactwctgtc t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Hepatitis C Virus <400> 2 ggtgcacggt ctacgagacc t 21 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Hepatitis C Virus <400> 3 tctagccatg gcgttagtry gagtgt 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Hepatitis C Virus <400> 4 cactcgcaag caccctatca ggcagt 26 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Hepatitis C Virus <400> 5 cgctcaatgc ctggagat 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Hepatitis C Virus <400> 6 cactctatgc ccggccat 18 <210> 7 <211> 18 <212> PNA <213> Hepatitis C Virus <400> 7 cgctcaatac ccagaaat 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Hepatitis C Virus <400> 8 cgcgcgacta ggaagacttc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Hepatitis C Virus <400> 9 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tccctgctgg tgctgggatc atcccagtga 180 gccctgggag ggaactgaag acccccaatt accaatgcat ctgttttcaa aaccgacggg 240 gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300 gagcctccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360 ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tcccgcgagg caagtgctgn 420 aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgcccccgg agccgccctc agcacagggt 480 ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg gcgcggggtg aaagaggcga 540 accgagagcg gaggccgcac tccagcactg cgcagggacc g 581 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 aggtgcgggg ccaggagcta gg 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 ggcctccgct ctcgcttcgc ct 22 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 tcgtttctgc tcccggagc 19 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 tcgtttctgc gcccggagc 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 tcgtttctgc ccccggagc 19 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 tcgtttctgc acccggagc 19 <210> 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300 gagcctccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360 ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tcccgcgagg caagtgctgg 420 aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgcncccgg agccgccctc agcacagggt 480 ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg gcgcggggtg aaagaggcga 540 accgagagcg gaggccgcac tccagcactg cgcagggacc g 581 <210> 39 <211> 581 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 atgagccaga ctccagggag gcctagaagt gggcaagggg aaacgggaaa ggaggaagat 60 ggtatgggtg tgcctggtta ggggtgggag tgctggacgg agttcgggac aagaggggct 120 ctgcagccat tggcacacaa tgcctgggag tccctgctgg tgctgggatc atcccagtga 180 gccctgggag ggaactgaag acccccaatt accaatgcat ctgttttcaa aaccgacggg 240 gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300 gagcctccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360 ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tcccgcgagg caagtgctga 420 aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgcncccgg agccgccctc agcacagggt 480 ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg 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aaagatggga ttcaggtggc agatggaccc 300 gaagaggaca tggagagaaa gaggaagctc ctacagacac ctgggtttcc actcattctc 360 attccctaag ctaacaggca taagccagct ggcaatgcac ggtcccattt gttctcactg 420 ccacngaaag catgtttata gtcttccagc agcaacgcca ggtgtctagg cacagatgaa 480 cccctcctta ggatccccac tgctcatcat agtgcctacc tttgttaaag tactagtcac 540 gcagtgtcac aaggaatgtt tacttttcca aatccccagc tagaggccag ggatgggtca 600 tctatttcta tatagcctgc acccagattg taggacagag ggcatgctng gtaaatatgt 660 gttcattaac tgagattaac cttccctgag ttttctcaca ccaaggtgag gaccatgtcc 720 ctgtttccat cactccctct ccttctcctg agtatggtgg cagcgtctta ctcagaaact 780 gtgacctgtg aggatgccca aaagacctgc cctgcagtga ttgcctgtag ctctccaggc 840 atcaacggct tcccaggcaa agatgggngt gatgncacca aggcagaaaa gggggaacca 900 ggtacgtgtt gggctgttct gtctctgcaa ttctttacct tccagaggaa actgcctggg 960 gatatgagga gactgatgtc ctatttgagt atatttttct caactatact gtaactcaaa 1020 acagagattc agctcgaatt ccacacagca gtttgtgact aatagttgtc ttgccagccc 1080 aggaaagtgg cccacaggtc aggccatccc gtgggacaca ggatgaattt ttcttctctg 1140 ggtcattgtc atgtcagacc cctattcact tcagtaggga tggcaccagg ttcaagaggc 1200 caaagaagag atggagtcag caaacaaaca taggttttac tgggggaatc tgtttacagg 1260 gagatccagc agcagtgggc tggacaggag aacaacaact actggtaaaa acaaatgcag 1320 ttaattttca ctttgcaccc tccctgcagc aacctccacg tggcaacttt atttcttaag 1380 ttattgctct caggtgcaca ccatacagtt attgagagca gtgctcagaa aggtcagtcc 1440 tgggtcaagg tctcccttct cctgagaagg gattgggcat caaactcttg aagagagaga 1500 gcaagaacat agatattaag tcacatttcc tttgtcttcc aacaggccaa gggctcagag 1560 gcttacaggg cccccctgga aagttggggc ctccaggaaa tccagggcct tctgggtcac 1620 caggaccaaa gggccaaaaa ggagaccctg gaaaaagtcc gggtaaggac cccagcaagg 1680 tctgagctga cttcacccag ggttctgaga ccttgagtat ctggtaagag gtgccccttc 1740 tcctgttcct tcaaaggaag atacccaaat ttgctttctg acccagtgcc ctcagccctc 1800 tc 1802 <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 ngtgatggca ccaaggna 18 <210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 ngtgatgaca ccaaggna 18 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 ngtgatgtca ccaaggna 18 <210> 60 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 ngtgatgcca ccaaggna 18 <210> 61 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 ggtgatgnca ccaaggna 18 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 agtgatgnca ccaaggna 18 <210> 63 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 tgtgatgnca ccaaggna 18 <210> 64 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 cgtgatgnca ccaaggna 18 <210> 65 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 ngtgatgnca ccaaggga 18 <210> 66 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 ngtgatgnca ccaaggaa 18 <210> 67 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 ngtgatgnca ccaaggta 18 <210> 68 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 ngtgatgnca ccaaggca 18 <210> 69 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 acacacccgt ttccaccctg gagaggccag 30 <210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 tgcgcagtgc tggagtgcgg cctccgctct 30 <210> 71 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 cctgtgagga actactgtc 19 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 ggtgcacggt ctacgagacc 20

Claims (33)

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18. 기판,

    기판 상에 고정되어 있는, 특정 질환과 관련된 병원성 미생물의 특정 핵산의 존재를 검출하기 위한 제1 프로브, 및

    상기 제1 프로브와는 다른 염기 서열을 가지며 기판상에 고정되어 있는, 특정 질환의 치료에 대한 반응도와 관련이 있는 개체의 특정 핵산의 존재를 검출하기 위한 제2 프로브

    를 포함하는 프로브-고정 기판 (probe-immobilized substrate).
19. 제18항에 있어서, 상기 병원성 미생물이 C형 간염 바이러스이고 상기 치료가 IFN 치료인 프로브-고정 기판.
20. 제18항에 있어서, 상기 개체의 핵산이 MxA의 프로모터 영역인 프로브-고정 기판.
21. 제18항에 있어서, 상기 개체의 핵산이 MBL를 코딩하는 유전자인 프로브-고정 기판.
22. 제18항에 있어서, 상기 제1 프로브가 C형 간염 바이러스의 유전자형을 검출하는 것인 프로브-고정 기판.
23. 기판;

    (a) 서열 1, 2, 3 및 5로 표시되는 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기 서열,

    (b) 서열 5, 6 및 7로 표시되는 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기 서열, 및

    (c) (a) 및 (b)로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 제1 프로브;

    (at455) 서열 16으로 표시되는 염기 서열,

    (bt455) (at455)로 표시되는 서열 중 455번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (ct455) 서열 16으로 표시되는 서열의 441 내지 455번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (dt455) 서열 16으로 표시되는 서열의 449 내지 459번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (et455) (at455) 내지 (dt455)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (ag455) 서열 17로 표시되는 염기 서열,

    (bg455) (ag455)로 표시되는 서열 중 455번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (cg455) 서열 17로 표시되는 서열의 441 내지 455번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (dg455) 서열 17로 표시되는 서열의 449 내지 459번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (eg455) (ag455) 내지 (dg455)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (aa455) 서열 18로 표시되는 염기 서열,

    (ba455) (aa455)로 표시되는 서열 중 455번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (ca455) 서열 18로 표시되는 서열의 441 내지 455번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (da455) 서열 18로 표시되는 서열의 449 내지 459번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (ea455) (aa455) 내지 (da455)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (ac455) 서열 19로 표시되는 염기 서열,

    (bc455) (ac455)로 표시되는 서열 중 455번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (cc455) 서열 19로 표시되는 서열의 441 내지 455번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (dc455) 서열 19로 표시되는 서열의 449 내지 459번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (ec455) (ac455) 내지 (dc455)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (aa420) 서열 37로 표시되는 염기 서열,

    (ba420) (aa420)으로 표시되는 서열 중 420번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (ca420) 서열 37로 표시되는 서열의 415 내지 425번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (da420) (aa420) 내지 (ca420)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (ac420) 서열 38로 표시되는 염기 서열,

    (bc420) (ac420)으로 표시되는 서열 중 420번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (cc420) 서열 38로 표시되는 서열의 415 내지 425번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (dc420) (ac420) 내지 (cc420)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (at420) 서열 39로 표시되는 염기 서열,

    (bt420) (at420)으로 표시되는 서열 중 420번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (ct420) 서열 39로 표시되는 서열의 415 내지 425번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (dt420) (at420) 내지 (ct420)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (ag420) 서열 40으로 표시되는 염기 서열,

    (bg420) (ag420)으로 표시되는 서열 중 420번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (cg420) 서열 40으로 표시되는 서열의 415 내지 425번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (dg420) (ag420) 내지 (cg420)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열 및

    (ag221) 서열목록의 서열 41로 표시되는 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하며 기판 상에 고정된 제2 프로브; 및

    (bg221) (ag221)로 표시되는 서열 중 425번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (cg221) 서열 41로 표시되는 서열의 418 내지 432번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (dg221) 서열 41로 표시되는 서열의 421 내지 430번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (eg221) (ag221) 내지 (dg221)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (ac221) 서열목록의 서열 42로 표시되는 염기 서열,

    (bc221) (ac221)로 표시되는 서열 중 425번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (cc221) 서열 42로 표시되는 서열의 418 내지 432번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (dc221) 서열 42로 표시되는 서열의 421 내지 430번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (ec221) (ac221) 내지 (dc221)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (aa221) 서열목록의 서열 43으로 표시되는 염기 서열,

    (ba221) (aa221)로 표시되는 서열 중 425번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (ca221) 서열 43으로 표시되는 서열의 418 내지 432번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (da221) 서열 43으로 표시되는 서열의 421 내지 430번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (ea221) (aa221) 내지 (da221)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (at221) 서열목록의 서열 44로 표시되는 염기 서열,

    (bt221) (at221)로 표시되는 서열 중 425번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (ct221) 서열 44로 표시되는 서열의 418 내지 432번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (dt221) 서열 44로 표시되는 서열의 421 내지 430번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (et221) (at221) 내지 (dt221)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (ag54) 서열목록의 서열 45로 표시되는 염기 서열,

    (bg54) (ag54)로 표시되는 서열 중 875번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (cg54) 서열 45로 표시되는 서열의 874 내지 876번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (dg54) 서열 45로 표시되는 서열의 869 내지 880번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (eg54) (ag54) 내지 (dg54)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (aa54) 서열목록의 서열 46으로 표시되는 염기 서열,

    (ba54) (aa54)로 표시되는 서열 중 875번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (ca54) 서열 46으로 표시되는 서열의 874 내지 876번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (da54) 서열 46으로 표시되는 서열의 869 내지 880번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (ea54) (aa54) 내지 (da54)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (ac54) 서열목록의 서열 47로 표시되는 염기 서열,

    (bc54) (ac54)로 표시되는 서열 중 875번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (cc54) 서열 47로 표시되는 서열의 874 내지 876번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (dc54) 서열 47로 표시되는 서열의 869 내지 880번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (ec54) (ac54) 내지 (dc54)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (at54) 서열목록의 서열 48로 표시되는 염기 서열,

    (bt54) (at54)로 표시되는 서열 중 875번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (ct54) 서열 48로 표시되는 서열의 874 내지 876번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (dt54) 서열 48로 표시되는 서열의 869 내지 880번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (et54) (at54) 내지 (dt54)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (ag52-57) 서열목록의 서열 45로 표시되는 염기 서열,

    (bg52-57) (ag52-57)로 표시되는 서열 중 875번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (cg52-57) 서열 45로 표시되는 서열의 868 내지 885번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (dg52-57) (ag52-57) 내지 (cg52-57)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (aa52-57) 서열목록의 서열 46으로 표시되는 염기 서열,

    (ba52-57) (aa52-57)로 표시되는 서열 중 875번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (ca52-57) 서열 46으로 표시되는 서열의 868 내지 885번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (da52-57) (aa52-57) 내지 (ca52-57)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (ac52-57) 서열목록의 서열 47로 표시되는 염기 서열,

    (bc52-57) (ac52-57)로 표시되는 서열 중 875번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (cc52-57) 서열 47로 표시되는 서열의 868 내지 885번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열,

    (dc52-57) (ac52-57) 내지 (cc52-57)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열,

    (at52-57) 서열목록의 서열 48로 표시되는 염기 서열,

    (bt52-57) (at52-57)로 표시되는 서열 중 875번째 위치의 염기를 제외한 몇개의 염기를 결실 또는 치환하거나, 또는 상기 서열에 1개 이상의 염기를 부가함으로써 변형시킨 변형된 염기 서열,

    (ct52-57) 서열 48로 표시되는 서열의 868 내지 885번째 위치의 염기들을 함유하는 염기 서열, 및

    (dt52-57) (at52-57) 내지 (ct52-57)의 염기 서열들로부터 선택되는 염기 서열에 상보적인 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하며 기판 상에 고정된 제3 프로브

    를 포함하는 프로브-고정 기판.
24. 제18항에 있어서, 특정 핵산의 존재 검출이 전기화학적으로 수행되는 것인 프로브-고정 기판.
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