JP2005095043A - 感染による病変の程度を予測するためのデータを収集する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 本発明の課題は、各個体に感染したウイルスが、その個体に対してどの程度の障害をもたらし得るかを予め予測する方法を提供することである。
【解決手段】 本発明は、ウイルスまたは細菌の感染により、被験者がどの程度の病変を惹起しうるかを予測するためのデータを収集する方法であって、(1)被験者に由来する試料からゲノムDNAを調製する工程と、(2)オステオポンチン遺伝子のプロモーター領域に存在する多型を決定する工程とを具備する方法を提供する。
【選択図】 図1
【解決手段】 本発明は、ウイルスまたは細菌の感染により、被験者がどの程度の病変を惹起しうるかを予測するためのデータを収集する方法であって、(1)被験者に由来する試料からゲノムDNAを調製する工程と、(2)オステオポンチン遺伝子のプロモーター領域に存在する多型を決定する工程とを具備する方法を提供する。
【選択図】 図1
Description
本発明は、ウイルスまたは細菌の感染により、被験者がどの程度の病変を惹起しうるかを予測するためのデータを収集する方法に関する。また、該方法を実施するためのプローブ、プライマーに関する。
ウイルスや細菌による種々の感染症においては、感染病原体による直接の細胞障害性によって発病する場合のほかに、感染感染病原体そのものの障害性は軽度であるが感染した細胞を排除しようとする細胞障害性T細胞(CTL)の働きにより発病する場合がある。このCTLの活性化には、ヘルパーT細胞(Th細胞)の制御が必要とされるが、未感作のTh細胞にはその能力がない。Th細胞にCTLの活性化能を与えるには、まずウイルス抗原を取り込んだ樹上細胞によって感作される必要がある。次いで、同じく樹上細胞が産生するインターロイキン12(IL−12)やインターフェロンα(IFN−α)等のサイトカインの作用によって、活性化能をもつTh細胞へと分化できる(肝臓、2001、42(4)、175−184)。このうち、IL−12の発現を誘導している物質のひとつにオステオポンチン(OPN)が報告されている(非特許文献1)
オステオポンチンは、RGD配列(arginine-glycine-aspartate acid cell-binding sequence)を有する細胞外マトリクスであり、同時にサイトカインの一種でもある。また、マクロファージや樹上細胞を炎症が起こっている部所に導くなどのケモタクシスにも役割を果たしている(非特許文献2)。オステオポンチンは、主に腎臓や骨で産生されているが(非特許文献3)、培養系においては腫瘍細胞株においても分泌されていることが確認されている(非特許文献4)。また、ラットの障害肝では、活性化したKupffer細胞や星細胞及び肝細胞がオステオポンチンを発現していることが明らかとなっている(非特許文献5)。
オステオポンチンは、RGD配列(arginine-glycine-aspartate acid cell-binding sequence)を有する細胞外マトリクスであり、同時にサイトカインの一種でもある。また、マクロファージや樹上細胞を炎症が起こっている部所に導くなどのケモタクシスにも役割を果たしている(非特許文献2)。オステオポンチンは、主に腎臓や骨で産生されているが(非特許文献3)、培養系においては腫瘍細胞株においても分泌されていることが確認されている(非特許文献4)。また、ラットの障害肝では、活性化したKupffer細胞や星細胞及び肝細胞がオステオポンチンを発現していることが明らかとなっている(非特許文献5)。
マウスでは、このオステオポンチンの遺伝子に多型があることが知られており、多型のどのタイプを持つかによって細菌に感染した場合の免疫応答の反応性に差が現れることが確認されている(非特許文献6)。
一方、ヒトがC型肝炎ウイルス(HCV)に感染すると、70%近くの感染者が慢性肝炎を発症することが知られている。そのうちの一部は10年から20年を経た後に肝癌を発症すると考えられている。すなわち、HCVに感染しても、その後に肝炎や肝癌を発症する患者と発症しない患者が存在し、HCV感染による肝障害の程度も患者により異なることが明らかとなっている。
このようにHCVに感染した患者にどの程度の肝障害が引き起こされるのか、予め予測することができれば、治療法の選択などに有効な情報となる。
したがって、HCV感染のみならず、種々のウイルスまたは細菌によってひきおこされる肝障害の程度が予め予測できる方法が望まれている。このような予測のためのデータを容易に収集することができる方法が望まれている。
Ashkar S. et.al.、Eta-1(osteopontin):an early component of type-1 (cell-mediated) immunity、"Science"、(USA)、2000年、287巻、p.860-864 Gravallese EM., Osteopontin: a bridge between bone and the immune system, J. Clin. Invest. (USA), 2003, 112, 147-149 Ueda T., et al., Osteopontin, a coodinator of host defense system: a cytokine or anextracellular adhesive protein?, Microbiol. Immunol., (日本), 1997, 41, 641-648 Chambers AF., et al., Osteopontin expression in lung cancer, Lung Cancer, (USA), 1996, 15(3), 311-323 Kawashima R., et al., Expression of osteopontin in Kupffer cells and hepatic macrophages and Stellate cells in rat liver after carbon tetrachloride intoxication: A possible factor for macrophage migration into hepatic necrotic areas, Biochem Biophys Res Commun, (USA), 1999, 256, 527-531 Patarca R., et al., Molecular and cellular basis of genetic resistance to bacterial infection: the role of the early T-lymphocyte activation-1/osteopontin gene, Critical. Rev. Immunol., (USA), 1993, 13(3-4), 225-246
Ashkar S. et.al.、Eta-1(osteopontin):an early component of type-1 (cell-mediated) immunity、"Science"、(USA)、2000年、287巻、p.860-864 Gravallese EM., Osteopontin: a bridge between bone and the immune system, J. Clin. Invest. (USA), 2003, 112, 147-149 Ueda T., et al., Osteopontin, a coodinator of host defense system: a cytokine or anextracellular adhesive protein?, Microbiol. Immunol., (日本), 1997, 41, 641-648 Chambers AF., et al., Osteopontin expression in lung cancer, Lung Cancer, (USA), 1996, 15(3), 311-323 Kawashima R., et al., Expression of osteopontin in Kupffer cells and hepatic macrophages and Stellate cells in rat liver after carbon tetrachloride intoxication: A possible factor for macrophage migration into hepatic necrotic areas, Biochem Biophys Res Commun, (USA), 1999, 256, 527-531 Patarca R., et al., Molecular and cellular basis of genetic resistance to bacterial infection: the role of the early T-lymphocyte activation-1/osteopontin gene, Critical. Rev. Immunol., (USA), 1993, 13(3-4), 225-246
上記の状況に鑑み、本発明の課題は、各個体に感染したウイルスが、その個体に対してどの程度の障害をもたらし得るかを予め予測する方法を提供することである。
上記課題を解決するために、本発明者らは、オステオポンチン遺伝子に注目した。
オステオポンチンは、RGD配列(arginine-glycine-aspartate acid cell-binding sequence)を有する細胞外マトリクスであり、同時にサイトカインの一種でもある。ウイルスや細菌が感染した個体においては、比較的早い段階で発現が誘導されており、その後の細胞性免疫の活性化に必須のタンパク質である。
ヒトのC型慢性肝炎の場合は、HCV感染肝細胞に対するTh1細胞系免疫応答により発症することが明らかとなっているが、その応答の開始にはやはりオステオポンチンが関与していると考えられている。実際に肝組織での障害の度合いが重度になるにしたがって、肝組織においてオステオポンチンのmRNAの発現量が多くなっていることも確認されている。よって、オステオポンチン遺伝子にその発現量に関連する多型が存在すれば、その患者の炎症の活動性を規定している可能性がある。
上記知見に基づいてオステオポンチン遺伝子のプロモーター領域に存在する多型とウイルス及び細菌が感染した個体における炎症の度合いとの関係を解析した。その結果、転写開始点から443塩基上流にさかのぼった位置に変異を持つ個体が存在することを発見し、ある個体が感染する様々なウイルス及び細菌等の病原体に起因する感染症が、引き起こす炎症反応の程度を規定すると思われる遺伝子の変異を発見した。具体的には、オステオポンチンタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域に発見したいくつかのSNPsやその他の多型のうち、転写開始点から443塩基上流にさかのぼった箇所(−443位)のSNPが、ウイルス及び細菌に感染した場合の炎症の度合いとの間に統計的に有意な関係があることを見出した。このオステオポンチン遺伝子のプロモーター領域に存在するSNPが感染症患者の炎症反応の程度の差に影響しているという知見に基づき、本発明を完成するに至った。
本発明は、ウイルスまたは細菌の感染により、被験者がどの程度の病変を惹起しうるかを予測するためのデータを収集する方法であって、(1)被験者に由来する試料からゲノムDNAを調製する工程と、(2)オステオポンチン遺伝子の転写開始点から443塩基上流にさかのぼったプロモーター領域に存在する多型を決定する工程とを具備する方法を提供する。
さらに、上記方法であって、上記試料は被験者から採取された血液である方法を提供する。
さらに、上記方法であって、上記工程(1)における多型の決定はマイクロアレイを使用して行われることを特徴とする方法を提供する。
さらに、上記方法であって、上記マイクロアレイは電気化学的にハイブリダイゼーションを検知することを特徴とする方法を提供する。
また、本発明は、オステオポンチン遺伝子のプロモーター領域の配列を有する断片核酸であって、該遺伝子の転写開始点から443塩基上流にさかのぼった位置の塩基がCである断片核酸を提供する。
また、本発明は、 オステオポンチン遺伝子の転写開始点から443塩基さかのぼったプロモーター領域に存在する多型を検出することが可能なプローブであって、該多型と相補的な配列を含むことを特徴とするプローブを提供する。
また、オステオポンチン遺伝子の転写開始点から443塩基上流にさかのぼったプロモーター領域に存在する多型を増幅することが可能なプライマー対であって、該多型の上流に相補的な配列および下流の配列に相補的な配列を含むことを特徴とするプライマー対を提供する。
さらに、本発明は、上記プローブが固定化されたアレイを提供する。
さらに、本発明は、ウイルスまたは細菌の感染により、被験者がどの程度の病変を惹起しうるかを予測するためのデータを収集するためのキットであって、上記プローブ、プライマー、またはアレイを含むことを特徴とするキットを提供する。
本発明の核酸、プローブ、およびプライマーを使用して、本発明の方法を実施することにより、ウイルスまたは細菌の感染により、被験者がどの程度の病変を惹起しうるかを予測するためのデータを得ることができる。医師等は、このデータから容易に判断することができる。
本発明の方法に使用するための試料は、本発明の方法を適用すべき被験者から採取された任意の生体成分、例えば血液である。
なお、本発明に使用する「試料」としては、医師等によってあらかじめ被験者から採取され、または調製された試料を使用すればよい。また、本発明の方法を適用すべき「被験者」は、ヒトである。
本発明の方法は、まず、上記試料から核酸試料を調製する。生体成分から核酸を抽出する方法は、当業者に周知であり、いずれの方法を使用してもよいが、たとえばフェノール抽出、エタノール沈殿等によって行うことができる。具体的には、たとえば、QIAamp DNA Blood Midi Kid(登録商標、QIAGEN、東京、日本)などの市販のヒトゲノム抽出用キットを用いて、全血試料からヒトのゲノムDNAを抽出することができる。抽出したゲノムDNAは、適切な溶液として保存しておけばよい。
ゲノムDNAを準備した後、オステオポンチンの遺伝子のプロモーター領域に存在する多型配列を決定するする工程を実施する。任意の配列を測定する方法は周知であるから、当業者であれば、オステオポンチンの遺伝子のプロモーター領域の配列に存在する多型を容易に決定することができる。
たとえば、まず目的とする、オステオポンチン遺伝子の転写開始点から443塩基上流にさかのぼった位置の塩基を含む配列を含む核酸(以下、ターゲットと称する)を増幅する。続いて、得られた増幅産物を、その相補鎖をプローブとして配置したアレイに対してハイブリダイズさせる。その際、1塩基のミスマッチによりハイブリダイズが維持されないような条件下で行う。さらに、そのプローブ固定化アレイに対して結合した核酸を検出することによって、得られた増幅産物を解析することができる。
ターゲットとなる核酸は、たとえば以下のように設計することができる。
1.ターゲットは、基板にぶつかる塩基を極力少なくするために、プローブ鎖に合わせて検出したいSNPをどちらの端に寄せることが好ましい。このとき、3'固定プローブを第1候補とし、5'固定を第2候補としてターゲットを設計する。
2.SNP近接プライマーを設計する。このとき、プライマーは18〜28塩基程度の長さとし、Tm=55から70℃、好ましくは60℃〜65℃になるように設計する。ターゲット配列は、ヘアピン、ダイマー構造を避けることが好ましい。
3.同様に、SNP近接プライマーに合わせて逆側のプライマーを設計する。
4.プライマー候補の組合せから、高次構造を予測する。たとえば、
http://www.bioinfo.rpi/edu/applications/mfold/old/dna/
に従って予測することができる。
http://www.bioinfo.rpi/edu/applications/mfold/old/dna/
に従って予測することができる。
5.ターゲット構造が複雑であると予測された場合は、鎖を短く切るか、またはプローブ固定方向を逆にするなどの変更を行う。増幅するターゲットの長さは、好ましくは100塩基以上〜350塩基以下であるが、特に限定されない。
次に、プローブは、たとえば以下のように設計することができる。
本発明に使用するプローブは、オステオポンチン遺伝子の配列(GenBank受付番号D14813)(配列番号1)に基づいて設計される。
1.変異文字の組合せに合わせてプローブの鎖を決定する(たとえば、G-AやG-Tはミスマッチ結合が生じやすいことなどを考慮する)。
2.SNPの左右のTmがほぼ同じになる位置にSNPを配置する。すなわち、本発明のプローブの場合であれば、オステオポンチン遺伝子の転写開始点から443塩基上流にさかのぼった位置のC/T塩基がSNP位置となり、その左右のTmが同じになるようにする。
3.プローブの長さは、たとえば、
http://www.genosys.co.jp/whatsnew/tm/tm_syosail.html
の計算方法に従って、Tm=50℃程度となるようにする。
http://www.genosys.co.jp/whatsnew/tm/tm_syosail.html
の計算方法に従って、Tm=50℃程度となるようにする。
このようにして設計されたプローブは、一般的なオリゴヌクレオチド合成方法を使用して作製することができる。また、プローブは、検出したい配列に相補的な配列を有するように設計される。
上記プローブをアレイに固定化し、このアレイを使用してターゲットの配列を決定することができる。すなわち、本発明の方法の場合には、たとえばオステオポンチンの遺伝子のプロモーター領域に存在する多型に相補的な配列を有するプローブが固相化されたアレイに、被験者から抽出したゲノムDNA試料を注入した後、適切な条件下でハイブリダイズさせることによって決定することができる。
また、上記プローブが固定化されたアレイの作製は、一般的なDNAマイクロアレイの作製に用いるガラス基板、膜、電極を支持体として用いて、その上に上記プローブを固定することで達成してよい。たとえば、アレイの主な種類には、以下のような蛍光検出型および電位型マイクロアレイ(一般的に、遺伝子センサ型マイクロアレイとも称す)等が含まれる。
(1)蛍光検出型マイクロアレイ
蛍光検出型マイクロアレイは、一般的に、支持体としてガラスまたはシリコン基板等を用い、標識物質として蛍光物質を用いるものをいう。したがって、本発明の方法に使用するためには、上記のターゲットの増幅時にターゲットに蛍光物質で標識しておけばよい。たとえば、ターゲットの増幅に使用するプライマーに蛍光標識をしておけばよい。アレイ基板へのプローブの固定は、当該基板の表面に、スポッター等を使用する手段、半導体技術を使用した手段等、一般的な手法によって行うことができる。また、この固定は、共有結合、イオン結合、物理吸着または化学吸着の何れかによって、またはそれ自身公知の何れかの他の手段を用いて行ってもよい。続いて、被検物質を固定した該基板の固定領域に対して、上述の通りに調製した細胞抽出液を接触させる。次に、予め蛍光物質によって標識したランダムヌクレオチド混合物を親和的に結合させる。結合した該蛍光物質を、蛍光リーダー等を使用して検出することによって被検物質のヌクレオチド結合性を検出する。
蛍光検出型マイクロアレイは、一般的に、支持体としてガラスまたはシリコン基板等を用い、標識物質として蛍光物質を用いるものをいう。したがって、本発明の方法に使用するためには、上記のターゲットの増幅時にターゲットに蛍光物質で標識しておけばよい。たとえば、ターゲットの増幅に使用するプライマーに蛍光標識をしておけばよい。アレイ基板へのプローブの固定は、当該基板の表面に、スポッター等を使用する手段、半導体技術を使用した手段等、一般的な手法によって行うことができる。また、この固定は、共有結合、イオン結合、物理吸着または化学吸着の何れかによって、またはそれ自身公知の何れかの他の手段を用いて行ってもよい。続いて、被検物質を固定した該基板の固定領域に対して、上述の通りに調製した細胞抽出液を接触させる。次に、予め蛍光物質によって標識したランダムヌクレオチド混合物を親和的に結合させる。結合した該蛍光物質を、蛍光リーダー等を使用して検出することによって被検物質のヌクレオチド結合性を検出する。
(2)遺伝子センサ型マイクロアレイ
遺伝子センサ型DNAアレイの例についての詳細は、平成8年10月24日に登録された特許番号第2573443号の自動遺伝子検出装置等を参照されたい。
遺伝子センサ型DNAアレイの例についての詳細は、平成8年10月24日に登録された特許番号第2573443号の自動遺伝子検出装置等を参照されたい。
簡単には、遺伝子センサ型マイクロアレイは、一般的に、支持体として電極基板を用い、標識物質として電気的活性物質を用いるものをいう。
プローブの電極基板上への固定は、当該基板の表面に対してスポッター等を用いる一般的な手法により達成できる。また、ここでの固定は、共有結合、イオン結合、物理吸着または化学吸着の何れかによって、またはそれ自身公知の何れかの他の手段によって行ってよい。次に、当該基板の固定領域に対して、上述の通りに調製したゲノムDNA抽出液を接触させる。次に、予め電気的活性物質で標識したランダムヌクレオチド混合物を親和的に結合させ、結合した該電気的活性物質を遺伝子センサによって検出することによって被検物質のヌクレオチド結合性を検出する。
図1および図2には、上記プローブが固定化されたアレイの模式図を示す。ポリリジンをコートしたスライドガラスからなる基体上にプローブ1〜5をスポットして乾燥させる。その後UV照射を行って基体6上に固定化させた図である。また、図2は、ガラス基板12上に5個の金電極13をパターニングしたプローブ固相化チップにプローブ7〜12を固定化させた図である。
上述のようなプローブ固定化アレイを使用する方法の他、ダイレクトシーケンス法を使用してゲノムDNA配列を決定することもできる。
ダイレクトシーケンス法では、まず、抽出したゲノムDNAをテンプレートとして、PCR反応を行うことによってオステオポンチン遺伝子プロモーター領域を増幅する。次いで、増幅産物を精製し、シーケンスを行う。
増幅に使用するプライマーは、オステオポンチン遺伝子の転写開始点から443塩基上流にさかのぼったプロモーター領域に存在する多型を増幅することが可能なプライマーであればいずれのプライマーを使用することもできる。一旦増幅したい配列が決定されれば、オステオポンチン遺伝子の配列に基づいて容易にこのようなプライマーを設計することができるであろう。すなわち、オステオポンチン遺伝子の転写開始点から443塩基さかのぼったプロモーター領域に存在する多型の上流に相補的な配列および下流の配列に相補的な配列を含むプライマー対を使用する。
また、増幅産物のシーケンスは、当業者に既知の種々の方法により、また市販のキットを使用して行うことができる。たとえば、以下の実施例に示した方法により、多型配列を決定することができる。
本発明の方法はデータを収集する方法であるから、該方法を実施する者は、医療機関に限定されない。
本発明のもう1つの態様において、本発明は、オステオポンチン遺伝子のプロモーター領域の配列を有する断片核酸であって、該遺伝子の転写開始点から443塩基さかのぼった位置の塩基がCであるプロモーター領域の断片核酸を提供する。該核酸断片は、オステオポンチン遺伝子の転写開始点から443塩基さかのぼった位置の塩基およびその上流および/または下流の塩基配列を有し、全長10塩基〜100塩基、好ましくは〜200塩基の核酸からなる。このような配列は、上記多型を有するゲノムDNAをテンプレートとし、上記プライマーを使用して増幅することによって得ることができる。
また、本発明は、上述の本発明の方法において記載したプローブおよびプライマー対を提供する。すなわち、オステオポンチン遺伝子の転写開始点から443塩基上流にさかのぼったプロモーター領域に存在する多型と相補的な配列を含むことを特徴とするプローブ、およびオステオポンチン遺伝子の転写開始点から443塩基上流にさかのぼったプロモーター領域に存在する多型の上流に相補的な配列および下流の配列に相補的な配列を含むことを特徴とするプライマー対である。特に、本発明のプローブは、該プローブが固相化された状態のアレイを含む。
加えて、本発明は、上記方法を使用して、ウイルスまたは細菌の感染により、被験者がどの程度の病変を惹起しうるかを予測するためのデータを収集するためのキットを提供する。該キットには、配列番号1に記載の配列を増幅することが可能なプライマーを含むことを特徴とする。たとえば、キットに含まれるプライマーは、5'-agagcctgcagcttctcaga-3'(配列番号2)および5'-acaaagtctggccataggac-3'(配列番号3)のプライマーであってもよい。また、該キットは、プライマーの他にPCR反応を行うために必要な酵素、バッファーなどを含んでいてもよく、試料からDNAを調製するための試薬などを含んでいてもよい。この場合、該プライマーを使用してPCR反応を行うことにより、反復回数を決定することができる。また、該プライマーを使用して多型配列を決定することにより、ウイルスまたは細菌の感染により、被験者がどの程度の病変を惹起しうるかを予測するためのデータを収集することができる。
さらに、本発明のキットは、プライマーではなく、オステオポンチン遺伝子の転写開始点から443塩基さかのぼったプロモーター領域に存在する多型を検出することが可能なプローブが含まれていてもよい。また、該キットは、プローブの他にハイブリダイゼーション反応のためのバッファー等を含んでいてもよい。本発明のキットに含まれるプローブを使用して上記方法を実施することにより、ウイルスまたは細菌の感染により、被験者がどの程度の病変を惹起しうるかを予測するためのデータを収集することができる。
図1には、オステオポンチン遺伝子のプロモーター領域と思われる領域であって、イントロン1の一部から転写開始点より上流に2000塩基程度上流までさかのぼった範囲の配列を示す(GenBank Acc.No. D14813)。また、確認された多型の位置を示す。D14813に表記された各種モチーフ配列と、本発明に使用したプライマ−の位置を表記した。今回確認された多型は既知のモチーフ配列中には見出されなかった。
この図に示したプライマーOPN10からOPN5の間の領域を解析した。解析は、OPN10とOPN13、OPN1とOPN3、OPN16とOPN17、そしてOPN2とOPN5の4箇所に分けて行った。その結果、この領域の中で確認された多型は4箇所であり、上流から−1748位のA/G、−616位のG/T、−443位のC/T、−155位のG/GGであった。−115位の多型は、GもしくはGGのホモかヘテロであるが、塩基の位置を示す数字はGGの場合で数えた。
このうち、−1748位と−616位、そして−155位は概ね相関があるように思われた。すなわち、−1748位のGは−616位のTそして−155位のGGと、−1748位のAは−616位のGそして−155位のGと連鎖している確率が高いが、100%ではなかった。そして、これらの変異による、C型慢性肝炎患者における肝障害の程度のちがいについて相関を調べた(表1)。
ここで、対象とする症例は、PCR検査によってHCV RNAが陽性であるが、何らかの理由で抗ウイルス的治療を行わず、対症療法のみで18ヶ月以上の期間を経過観察可能であった症例である。肝炎の活動性は「低活動群」と「高活動群」の2種類に分類した。「低活動群」は、経過観察期間においてAST及びALTともに正常値を示し、かつASTがALTよりも高値であった16症例であり、「高活動群」はALTが80IU以上の時期が認められた55症例である。この両群間には、性差及びHCV遺伝子型、そして血中HCV濃度等の各要因については、有意な差を認めなかった。
上記の計71例について、オステオポンチン遺伝子のプロモーター領域を解析し、肝炎の活動性との関連を調べた。連鎖している3箇所の多型は、抜粋して−616位のみを表記したが、このほかの箇所も同じ数字を示した。低活動群ではG/Gホモが9例(56.3%)であるのに対し、それ以外の型が7例(43.7%)であった。一方の高活動性群では、G/Gホモが28例(50.9%)であるのに対して、それ以外の型が27例(49.1%)であった。これらには有意な差は認められなかった。また、他の−1748位と−155位も同じ頻度であった。
一方、連鎖していない−443位の遺伝子型と肝炎の活動性に関しての解析結果は以下のようになった。低活動群ではT/Tホモが2例(12.5%)であるのに対し、それ以外が14例(87.5%)であった。一方の高活動性群では、T/Tホモが26例(47.3%)であるのに対して、それ以外が29例(53.7%)であった。これは、χ2乗検定をおこなって、有意な差であることが確認された。
すなわち、オステオポンチンのプロモーター領域にある−443位の塩基がTTホモであるような個体において起こる各種炎症反応は、それ以外の遺伝子型をとる個体に比して活動性が高くなる可能性が有意に高いと考えられる。
実施例1
ダイレクトシーケンス法によってオステオポンチン遺伝子のプロモーター遺伝子型を検出する方法。
ダイレクトシーケンス法によってオステオポンチン遺伝子のプロモーター遺伝子型を検出する方法。
1−1.概要
ウイルスや細菌に感染した場合の、宿主の炎症反応の強度を予め予測する目的で、オステオポンチン遺伝子のプロモーター領域にあるSNP(−443位)を解析する必要が生じた。ここでは、ダイレクトシーケンス法を用いて、付近の数百塩基と共に配列を決定することによって目的のSNP情報を得る方法を述べる。
ウイルスや細菌に感染した場合の、宿主の炎症反応の強度を予め予測する目的で、オステオポンチン遺伝子のプロモーター領域にあるSNP(−443位)を解析する必要が生じた。ここでは、ダイレクトシーケンス法を用いて、付近の数百塩基と共に配列を決定することによって目的のSNP情報を得る方法を述べる。
1−2.患者検体の採取法
測定すべきHCV感染患者71例から末梢血を採血し、インセパック(積水化学工業)などEDTA 2K入りの採血管に採取した。(なお、すべての患者に本研究の対象となることに関してのインフォームドコンセントを行った。)採血後の血液は、分析までの間4℃にて保存した。
測定すべきHCV感染患者71例から末梢血を採血し、インセパック(積水化学工業)などEDTA 2K入りの採血管に採取した。(なお、すべての患者に本研究の対象となることに関してのインフォームドコンセントを行った。)採血後の血液は、分析までの間4℃にて保存した。
1−3.ヒトゲノム抽出法
ゲノムの抽出には、1検体あたり全血1〜3mlを用いて行った。抽出には
QIAamp DNA Blood Midi Kit(キアゲン 社製)等のキットを用いた。抽出産物は−20℃にて保存した。
ゲノムの抽出には、1検体あたり全血1〜3mlを用いて行った。抽出には
QIAamp DNA Blood Midi Kit(キアゲン 社製)等のキットを用いた。抽出産物は−20℃にて保存した。
1−4.オステオポンチン遺伝子プロモーター領域の増幅法、および塩基配列解析法
必要な箇所を含む領域を挟んで2種類のプライマ−を合成した(OPN2(forward) : 5’-agccctctcaagcagtcatc-3’(配列番号2), OPN5(reverse) : 5’-atgctgctgcagacatcctc-3)’(配列番号3)。これらの配列は、GenBank受付番号D14813に基づいて作成した。増幅はFastStart Taq DNA polymerase(Roche)を用いて、総量50μlで行った。反応条件は、94℃で4分間処理した後、94℃30秒、55℃30秒、72℃1分を1サイクルとする反応を40回繰り返し、最後に72℃7分の処理を行った。反応後は反応液の一部をアガロースゲルにて電気泳動し、バンドが一本であることを確認した後、残りをExo Sap Kit(アマシャムバイオサイエンス)にて精製した。シークエンス反応は、プライマ−OPN2を用い、DYEnamic ET dye terminator kit(アマシャムバイオサイエンス)を用いて行い、シークエンスはMegaBASE1000を用いて解析した。
必要な箇所を含む領域を挟んで2種類のプライマ−を合成した(OPN2(forward) : 5’-agccctctcaagcagtcatc-3’(配列番号2), OPN5(reverse) : 5’-atgctgctgcagacatcctc-3)’(配列番号3)。これらの配列は、GenBank受付番号D14813に基づいて作成した。増幅はFastStart Taq DNA polymerase(Roche)を用いて、総量50μlで行った。反応条件は、94℃で4分間処理した後、94℃30秒、55℃30秒、72℃1分を1サイクルとする反応を40回繰り返し、最後に72℃7分の処理を行った。反応後は反応液の一部をアガロースゲルにて電気泳動し、バンドが一本であることを確認した後、残りをExo Sap Kit(アマシャムバイオサイエンス)にて精製した。シークエンス反応は、プライマ−OPN2を用い、DYEnamic ET dye terminator kit(アマシャムバイオサイエンス)を用いて行い、シークエンスはMegaBASE1000を用いて解析した。
1−5.結果
結果を図2に示した。解析対象となった71例はにおいて、−443位の遺伝子型と肝炎の活動性に関しての解析結果は以下のようになった。低活動群ではT/Tホモが2例(12.5%)であるのに対し、それ以外が14例(87.5%)であった。一方の高活動性群では、T/Tホモが26例(47.3%)であるのに対して、それ以外が29例(53.7%)であった。これは、χ2乗検定をおこなって、有意な差であることが確認された。
結果を図2に示した。解析対象となった71例はにおいて、−443位の遺伝子型と肝炎の活動性に関しての解析結果は以下のようになった。低活動群ではT/Tホモが2例(12.5%)であるのに対し、それ以外が14例(87.5%)であった。一方の高活動性群では、T/Tホモが26例(47.3%)であるのに対して、それ以外が29例(53.7%)であった。これは、χ2乗検定をおこなって、有意な差であることが確認された。
実施例2
オステオポンチン遺伝子プロモーターSNPである−443位の変異とC型肝炎患者のインターフェロン治療効果との関連。
オステオポンチン遺伝子プロモーターSNPである−443位の変異とC型肝炎患者のインターフェロン治療効果との関連。
2−1.概要
ウイルスや細菌が感染した後、その個体がどの程度の炎症作用を発揮することができるかを調べることで、その個体の持つ生体防御能力が測定できる可能性がある。一方では、生体防御能力が高いほど、インターフェロン(IFN)等の抗ウイルス治療が奏効する可能性が高いといわれている。そこで、C型肝炎患者でIFN治療を経験し治療の効果が明らかとなった症例に対し、本発明のオステオポンチン遺伝子プロモーター−443位のSNPを測定し、インターフェロン治療効果との関連を調べた。
ウイルスや細菌が感染した後、その個体がどの程度の炎症作用を発揮することができるかを調べることで、その個体の持つ生体防御能力が測定できる可能性がある。一方では、生体防御能力が高いほど、インターフェロン(IFN)等の抗ウイルス治療が奏効する可能性が高いといわれている。そこで、C型肝炎患者でIFN治療を経験し治療の効果が明らかとなった症例に対し、本発明のオステオポンチン遺伝子プロモーター−443位のSNPを測定し、インターフェロン治療効果との関連を調べた。
2−2.患者検体の採取法
1)患者
患者の血液および肝組織による血液生化学的・組織学的な検査、さらに画像診断的検査によりC型慢性肝炎であると診断され、さらにIFN治療を経験しその治療効果が明らかとなった153例の患者の血液サンプルを本研究に使用した。なお、すべての患者に本研究の対象となることに関してのインフォームドコンセントを行った。IFN治療効果判定は、IFN投与終了後6ヶ月の間に、血中のトランスアミナーゼが正常範囲にあり且つHCV RNAが陰性であった患者を完全著効と判定した。一方、治療によってHCVの排除が起こらなかった、もしくは排除されたが投与終了後6ヶ月の間に再燃した、或いはHCVの排除は起こったが投与終了後6ヶ月の間に血中のトランスアミナーゼが異常値を示した患者はすべて非著効と判定した。以上の判定基準により、全153例の患者は、完全著効51例、非著効102例に判別された。
1)患者
患者の血液および肝組織による血液生化学的・組織学的な検査、さらに画像診断的検査によりC型慢性肝炎であると診断され、さらにIFN治療を経験しその治療効果が明らかとなった153例の患者の血液サンプルを本研究に使用した。なお、すべての患者に本研究の対象となることに関してのインフォームドコンセントを行った。IFN治療効果判定は、IFN投与終了後6ヶ月の間に、血中のトランスアミナーゼが正常範囲にあり且つHCV RNAが陰性であった患者を完全著効と判定した。一方、治療によってHCVの排除が起こらなかった、もしくは排除されたが投与終了後6ヶ月の間に再燃した、或いはHCVの排除は起こったが投与終了後6ヶ月の間に血中のトランスアミナーゼが異常値を示した患者はすべて非著効と判定した。以上の判定基準により、全153例の患者は、完全著効51例、非著効102例に判別された。
(2)患者検体の採取法とヒトゲノム抽出法
患者検体の採取法とゲノム抽出法は、実施例1に準ずる。
患者検体の採取法とゲノム抽出法は、実施例1に準ずる。
2−3.オステオポンチン遺伝子プロモーター領域の増幅法、および塩基配列解析法
オステオポンチン遺伝子プロモーター領域の増幅法、および塩基配列解析法は、実施例1に準ずる。
オステオポンチン遺伝子プロモーター領域の増幅法、および塩基配列解析法は、実施例1に準ずる。
2−4.HCV遺伝子型の解析
上述した153例のIFN治療前の血清を用いて、IFN治療効果に大きく影響すると言われているHCV遺伝子型の解析を行った。HCV RNAの抽出にはSepaGeneRV−R(三光純薬社製)を用いた。その後、M−MLV 逆転写酵素(Invitrogen社製)を用いてcDNAを合成した。その後の増幅には、一定方向のプライマーを各遺伝子型に特異的な配列を持つ箇所に位置をずらして設計することにより、増幅する産物の長さに差を持たせ、電気泳動の移動度で遺伝子型判定が可能となるPCR法(Okamoto H. et al., J. Gen. Virol.73, 673-679, 1992, Chayama K. et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 8, 150-156, 1993)を用いて行なった。
上述した153例のIFN治療前の血清を用いて、IFN治療効果に大きく影響すると言われているHCV遺伝子型の解析を行った。HCV RNAの抽出にはSepaGeneRV−R(三光純薬社製)を用いた。その後、M−MLV 逆転写酵素(Invitrogen社製)を用いてcDNAを合成した。その後の増幅には、一定方向のプライマーを各遺伝子型に特異的な配列を持つ箇所に位置をずらして設計することにより、増幅する産物の長さに差を持たせ、電気泳動の移動度で遺伝子型判定が可能となるPCR法(Okamoto H. et al., J. Gen. Virol.73, 673-679, 1992, Chayama K. et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 8, 150-156, 1993)を用いて行なった。
153例全体で見た場合には、T/Cヘテロが最も多く71例(46.4%)、ついでTTホモが54例(35.2%)、最も少ない型はCCホモで28例(18.4%)であった。これを、IFN治療効果別に示すと、完全著効例(SR)ではT/Cヘテロ24例(47.1%)、T/Tホモ20例(39.2%)、C/Cホモ7例(13.7%)であり、非著効例ではT/Cヘテロ47例(46.1%)、T/Tホモ34例(33.3%)、C/Cホモ21例(20.6%)であった。完全著効例と非著効例の間に有意な差は認められなかった。
同様に、IFN治療効果に大きく影響を与えるとされているHCV遺伝子型別に、−443位SNPとIFN治療効果との関係を調べた(表2−2)。HCV遺伝子型1型においては、完全著効例ではT/Cヘテロ6例(33.3)%)、T/Tホモ9例(50.0%)、C/Cホモ3例(16.7%)、であり非著効例ではT/Cヘテロ36例(43.9%)、T/Tホモ30例(36.6%)、C/Cホモ16例(19.5%)で、157例全体で見た場合と同様に有意な傾向は認められなかった。対するHCV遺伝子型2型においては、完全著効例ではT/Cヘテロ18例(54.6%)、T/Tホモ11例(33.3%)、C/Cホモ4例(12.1%)、であり非著効例ではT/Cヘテロ11例(55.0%)、T/Tホモ4例(20.0%)、C/Cホモ5例(25.0%)であった。HCV遺伝子型1型と同様に2型でも、有意な傾向は認められなかった。
以上のことから、ある個体の生体防御的炎症反応の程度を予知できるオステオポンチンプロモーターSNP(−443)は、C型肝炎患者におけるインターフェロン治療の治療効果には影響していない可能性が示唆された。
実施例3
プローブ候補配列の設計
上述のプローブ設計方法により、プローブ候補配列の設計を行った。上記方法に従って、配列を設計した結果、一例として図5に示した配列が候補配列として得られた(配列番号4〜11)。
プローブ候補配列の設計
上述のプローブ設計方法により、プローブ候補配列の設計を行った。上記方法に従って、配列を設計した結果、一例として図5に示した配列が候補配列として得られた(配列番号4〜11)。
実施例4
ターゲット配列および該ターゲットを増幅するためのプライマー配列の候補配列の設計
上述のターゲット設計方法により、ターゲットおよびプライマーの候補配列の設計を行った。上記方法に従って、配列を設計した結果、一例として図6に示した配列が候補配列として得られた(配列番号12〜23)。
ターゲット配列および該ターゲットを増幅するためのプライマー配列の候補配列の設計
上述のターゲット設計方法により、ターゲットおよびプライマーの候補配列の設計を行った。上記方法に従って、配列を設計した結果、一例として図6に示した配列が候補配列として得られた(配列番号12〜23)。
本発明により、HCV感染のみならず、種々のウイルスまたは細菌によってひきおこされる肝障害の程度を予め予測することができ、診断のために有用である。
1・・・DNAプローブ
2・・・DNAプローブ
3・・・DNAプローブ
4・・・DNAプローブ
5・・・DNAプローブ
6・・・基体
7・・・DNAプローブ
8・・・DNAプローブ
9・・・DNAプローブ
10・・・DNAプローブ
11・・・DNAプローブ
12・・・基体
13・・・金電極
14・・・接続部
2・・・DNAプローブ
3・・・DNAプローブ
4・・・DNAプローブ
5・・・DNAプローブ
6・・・基体
7・・・DNAプローブ
8・・・DNAプローブ
9・・・DNAプローブ
10・・・DNAプローブ
11・・・DNAプローブ
12・・・基体
13・・・金電極
14・・・接続部
Claims (10)
- ウイルスまたは細菌の感染により、被験者がどの程度の病変を惹起しうるかを予測するためのデータを収集する方法であって、
(1)被験者に由来する試料からゲノムDNAを調製する工程と、
(2)前記オステオポンチン遺伝子の転写開始点から443塩基上流にさかのぼったプロモーター領域に存在する多型を決定する工程と、
を具備する方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記試料が、前記被験者から採取された血液である方法。
- 請求項1または2に記載の方法であって、前記工程(1)における多型の決定は、マイクロアレイを使用して行われることを特徴とする方法。
- 請求項3に記載の方法であって、前記マイクロアレイが電気化学的にハイブリダイゼーションを検知することを特徴とする方法。
- オステオポンチン遺伝子のプロモーター領域の配列を有する断片核酸であって、該遺伝子の転写開始点から443塩基上流にさかのぼった位置の塩基がCである断片核酸。
- オステオポンチン遺伝子の転写開始点から443塩基上流にさかのぼったプロモーター領域に存在する多型を検出することが可能なプローブであって、前記多型と相補的な配列を含むことを特徴とするプローブ。
- オステオポンチン遺伝子の転写開始点から443塩基上流にさかのぼったプロモーター領域に存在する多型を増幅することが可能なプライマー対であって、前記多型の上流に相補的な配列および下流の配列に相補的な配列を含むことを特徴とするプライマー対。
- 請求項6に記載のプローブが固定化されたアレイ。
- ウイルスまたは細菌の感染により、被験者がどの程度の病変を惹起しうるかを予測するためのデータを収集するためのキットであって、請求項6に記載の多型を増幅することが可能なプライマーを含むことを特徴とするキット。
- ウイルスまたは細菌の感染により、被験者がどの程度の病変を惹起しうるかを予測するためのデータを収集するためのキットであって、請求項7に記載の多型を増幅することが可能なアレイを含むことを特徴とするキット。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003332067A JP2005095043A (ja) | 2003-09-24 | 2003-09-24 | 感染による病変の程度を予測するためのデータを収集する方法 |
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008000096A (ja) * | 2006-06-23 | 2008-01-10 | Nagoya City Univ | 尿路結石症の発症リスク判定方法、及び発症リスク判定用キット |
EP2192199A1 (en) | 2005-12-08 | 2010-06-02 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Method of detecting human papilloma virus by using nucleic acid amplification method and nucleic acid chain-immobilized carrier |
US7910719B2 (en) | 2005-12-08 | 2011-03-22 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Method of detecting human papilloma virus by using nucleic acid amplification method and nucleic acid chain-immobilized carrier |
CN101519689B (zh) * | 2008-12-10 | 2012-04-25 | 复旦大学附属中山医院 | 肿瘤转移相关基因骨桥蛋白的多态性和单体型构建及其应用 |
-
2003
- 2003-09-24 JP JP2003332067A patent/JP2005095043A/ja active Pending
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A521 | Written amendment |
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