CN101519689B

CN101519689B - 肿瘤转移相关基因骨桥蛋白的多态性和单体型构建及其应用

Info

Publication number: CN101519689B
Application number: CN 200810204364
Authority: CN
Inventors: 董琼珠; 钦伦秀; 贾户亮; 赵越; 闫兆伟; 张晓飞
Original assignee: INSTITUTE OF BIOMEDICAL SCIENCES FUDAN UNIVERSITY; Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: INSTITUTE OF BIOMEDICAL SCIENCES FUDAN UNIVERSITY; Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2008-12-10
Filing date: 2008-12-10
Publication date: 2012-04-25
Anticipated expiration: 2028-12-10
Also published as: CN101519689A

Abstract

本发明涉及肿瘤转移相关基因骨桥蛋白的多态性和单体型构建及其应用，具体涉及一种用于预测原发性肝癌病人预后的试剂盒，由纯化系统、扩增系统、单核苷酸多态性位点检测系统、5’→3’引物序列，3’→5’引物序列及测序引物组成。本发明还提供了一种肿瘤转移相关基因骨桥蛋白的单体型。本发明的检测试剂盒简便、快速且经济实用。对原发性肝癌病人预后进行评估，并及时采取综合手段干预，提高病人远期生存率，改善预后，方便于临床应用，为临床上进一步确定个体化治疗方案提供了有效的依据。

Description

肿瘤转移相关基因骨桥蛋白的多态性和单体型构建及其应用

技术领域

本发明涉及一促癌基因骨桥蛋白的单体型及用于预测原发性肝癌病人预后的试剂盒，属于基因工程领域。

背景技术

现有技术公开了骨桥蛋白基因与原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)复发转移相关。骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)，又称Secreted phosphoprotein I，SPPI；Bone sialoprotein I，BNSP或BSP I；EarlyT-lymphocyte activation-1，ETA-1。它最初由Senger于1979年在转化的恶性上皮细胞中发现的一种分泌性的非胶原磷蛋白。具有趋化因子样活性，属于SIBLING家族成员。在人、鼠、猪、牛、鸡等不同物种中均表达骨桥蛋白，而且不同物种的骨桥蛋白cDNA均含有高度一致性序列：包括氮端、碳端、凝血酶作用位点(thet hrombin cleavage site，RSK)、甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(GRGDS)序列。人骨桥蛋白(hOPN)是一种磷酸化、带负电荷、具有亲水性的酸性分泌糖蛋白，由一个单一基因编码，定位于染色体4q13位点上，含有7个外显子和6个内含子，延伸至大约8千碱基对核昔酸序列，编码314个氨基酸，广泛存在于骨、牙质、牙骨质、软骨、肾脏、血管等不同组织，在巨噬细胞、淋巴细胞和乳腺中特异的上皮细胞中发挥活性；参与骨组织的矿化与重建、动脉粥样硬化、抗感染、免疫调节、缺血-再灌注损伤等过程。近年来，骨桥蛋白与肿瘤的发生发展，特别是它与肿瘤转移的关系日益引起人们的关注。骨桥蛋白通过与不同的整合素和CD44受体相互作用调节肿瘤相关信号通路，阻断细胞周期，抑制细胞凋亡，促进细胞存活、基质降解和重塑、细胞迁移、免疫逃逸和血管形成，最终导致肿瘤的发生、发展。

单核苷酸多态性(SNP)是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性，是人类基因组中最常见的遗传变异，为第三代分子遗传标记。因为单个单核苷酸多态性本身的功能有限、利用单个位点单核苷酸多态性分析评价骨桥蛋白基因作用是不够全面的，它提供的信息量也较少。已有研究发现，由于单核苷酸多态性之间存在连锁不平衡，位于同一条染色体上相邻的单核苷酸多态性等位基因往往倾向于同时出现，并以一个整体遗传给后代。而这些位于一条染色体特定区域的一组相互关联并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态性的组合即为单体型。它决定了基因的功能单位和人群遗传变异的内在特征。单体型的存在可以极大地减少疾病关联研究的工作量，在肿瘤侯选基因研究具有重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一促癌基因骨桥蛋白的单体型及用于预测原发性肝癌病人预后的试剂盒。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种用于预测原发性肝癌病人预后的试剂盒，其特征在于，由纯化系统、扩增系统、单核苷酸多态性位点检测系统、5’→3’引物序列，3’→5’引物序列及测序引物组成；

其中，纯化系统由蛋白酶K、苯酚、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、核糖核酸酶和无水乙醇组成；

扩增系统由脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、胸腺嘧啶核苷三磷酸、高保真酶、水、聚合酶链式反应缓冲液、氯化镁、模板DNA组成；

单核苷酸多态性位点检测系统由DNA 多聚酶、腺苷三磷酸、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷酰硫酸和荧光素组成；

5’→3’引物序列为CAGAAATGCTGCCATCGTGTG、ATAGGTAGGCTGGGCGATTT、ATAGGTAGGCTGGGCGATTT和TGAATGCCCATCCCGTAA；

3’→5’引物序列为ACATACCCGCATAAGCGTGTC、GAGCCAGAAGGCTATTGTTCA、GAGCCAGAAGGCTATTGTTCA和ATGAGGTTTTCTGCCACTGC；

测序引物为GAGTAAACTACAGTAAATCC、CTCTCAAGCAGTCATCC、AAAGGACAGAGGCAAGT和ATTGTGTGTGTGCGTT。

所述试剂盒配合骨桥蛋白单体型构建软件系统使用。

本发明还提供了一种肿瘤转移相关基因骨桥蛋白的单体型，按SNP在染色体上的位置顺序依次为rs2728127(A/G)(-1748)、rs 2853744(G/T)(-616)、rs 11730582(T/C)(-443)、rs11439060(G/-)(-155)，所述的位置顺序中的rs 2728127、rs 2853744、rs11730582、rs11439060，顺序以1-2-3-4表示，其中11439060的-示无插入，分别为GTTG、AGT-、AGC-、ATT-、AGCG、ATTG、GTT-、AGTG、ATC-、GGTG和GTCG(共占99.1％)。

本发明通过对510例HCC病人的肿瘤转移相关基因OPN启动子区域目前所有的SNP位点检测，对该基因进行单体型构建。本发明构建的OPN基因单体型有如下11种，按SNP在染色体上的位置顺序依次为rs 2728127(A/G)(-1748)、rs 2853744(G/T)(-616)、rs 11730582(T/C)(-443)、rs11439060(G/-)(-155)，所述的位置顺序中的rs 2728127、rs 2853744、rs 11730582、rs11439060，顺序以1-2-3-4表示，其中11439060的-示无插入，分别为GTTG、AGT-、AGC-、ATT-、AGCG、ATTG、GTT-、AGTG、ATC-、GGTG和GTCG(共占99.1％)。

本发明通过对510例原发性肝癌病人的肿瘤转移相关基因骨桥蛋白启动子区域目前所有的单核苷酸多态性位点检测，对该基因进行单体型构建，具体实验步骤如下：

1、选择病人

本发明对2002年4月至2006年10月间在复旦大学肝癌研究所进行肝切除手术的510例原发性肝癌病人研究单体型与肝癌转移复发的关系，在510例原发性肝癌病人基础上，选取了351例具有五年随访资料的原发性肝癌病人，探讨单核苷酸多态性基因型、单体型与术后DFS(术后复发)以及生存的关系。将冰冻的肝癌及癌周组织放于液氮中，砸成粉末状，应用DNA提取纯化系统，提取组织中基因组DNA，使用DU800紫外分光光度计测定DNA的260吸光度值(A260)和260/280的吸光度比值(1.8-2.0)，以评估其浓度和质量，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。符合定量检测要求的样本置于-80℃保存备用。

2、单核苷酸多态性检测

采用焦磷酸测序方法(Pyrosequencing 96，PSQ 96)，对目前美国国立生物技术信息中心上(NCBI)已经登录的单核苷酸多态性多态性数据库中骨桥蛋白基因的所有15个单核苷酸多态性位点(rs2853746、rs29001511、rs 2728127、rs3891314、rs 2853744、rs 11730582、rs 41351345、rs 2853745、rs11439060、rs 17524488、rs3841116、rs 28357094、rs 41497449、rs 11544548、rs 11544544)和在美国国立生物技术信息中心上未登录-1263处插入单核苷酸多态性GG进行检测。单核苷酸多态性检测结果：在这部分原发性肝癌人群中，15个单核苷酸多态性位于骨桥蛋白基因启动子区域，有4个单核苷酸多态性呈多态性，分别为rs 2728127(A/G)、rs 2853744(G/T)、rs 11730582(T/C)、rs11439060(G/-)，在中国人群中，美国国立生物技术信息中心上未登录-1263处均有插入单核苷酸多态性AA。单核苷酸多态性基因检测结果如下表所示：

3、构建单体型

单体型结构、频数及连锁不平衡分析采用Haploview version 3.32分析软件，根据15个单核苷酸多态性的检测结果，选择有信息并最少等位基因频数(minor allelefrequency，MAF)大于或等于10％的单核苷酸多态性进行单体型分析。本发明构建的骨桥蛋白基因单体型有如下11种，按单核苷酸多态性在染色体上的位置顺序依次为rs 2728127(A/G)(-1748)、rs2853744(G/T)(-616)、rs 11730582(T/C)(-443)、rs11439060(G/-)(-155)，所述的位置顺序中的rs 2728127、rs 2853744、rs11730582、rs11439060，顺序以1-2-3-4表示，其中rs 11439060的-示无插入，分别为GTTG、AGT-、AGC-、ATT-、AGCG、ATTG、GTT-、AGTG、ATC-、GGTG和GTCG(共占99.1％)，其他少见的单体型及其具体频数见下表：

一组单核苷酸多态性的单尾95％置信区间(Confidence Interval，CI)的D’值上限大于0.95，下限大于0.7即定为该组单核苷酸多态性之间存在强的连锁不平衡关系；相反，单核苷酸多态性的单尾95％置信区间的D’值上限小于0.9即认为该单核苷酸多态性之间存在历史上的重组；一染色体区域中单核苷酸多态性存在历史上的重组的比例小于5％即认为该区域单核苷酸多态性处于同一单体型块中。Haploview软件单体型构建结果：在这550例原发性肝癌人群中，3个单核苷酸多态性(rs 2728127、rs 2853744、rs 11730582)表现为强连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)关系，处于同一单体型块中。而rs11439060出现重组现象，但是从整体看，他们还是在一个单体型块中。在这单体型块中，4个单核苷酸多态性的平均间距为531bp，且4个之间实际间距较均匀。根据Gabriel等的建议：侯选基因的单体型一般应小于1单核苷酸多态性/5千碱基对且实际间距趋于均匀，方适于单体型分析。因此，本研究中我们构建的骨桥蛋白的单体型能够代表该基因的功能单位，并可以应用于骨桥蛋白基因的功能研究。骨桥蛋白基因启动子区域4个单核苷酸多态性之间连锁不平衡分析如图1所示。

4、不同单体型与原发性肝癌病人侵袭转移潜能分析

在此基础上，我们讨论了单核苷酸多态性基因型、单体型与肝癌侵袭性(子灶和癌栓)的关系，发现单体型AGT-与高侵袭潜能正相关[危险度(Hazard Ratios，HR)＝1.60(1.06-2.40)，P＝0.03]，而GTTG、AGC-和ATT-则与原发性肝癌侵袭性潜能未见统计相关。基因型与肝癌侵袭转移潜能的关系见下表：

5、不同单核苷酸多态性位点基因型和单体型与术后总生存率和无瘤生存(术后复发)的关系

在上述550例原发性肝癌病人的基础上，我们筛选了351例具有五年随访资料的原发性肝癌病人，探讨单核苷酸多态性s基因型、单体型与术后总生存率和无瘤生存(术后复发)的关系。生存分析提示三个单核苷酸多态性位点rs 2728127(A/G)、rs11439060(G/-)、rs 2853744(G/T)的基因型与原发性肝癌之间的术后总生存率具有统计学差异(P＝0.038，P＝0，018，P＝0.007)，三个单核苷酸多态性位点rs 2728127(A/G)、rs11439060(G/-)、rs 2853744(G/T)的基因型与原发性肝癌之间的术后总生存关系分别见附图2(A：a/a，B：a/gC：g/g，P＝0.038)，附图3(A：-/-，B：g/-，C：g/g，P＝0.007)，附图4(A：g/g，B：g/t，C：t/t，P＝0.018)。rs 11730582(T/C)的基因型与原发性肝癌之间的术后无瘤生存率具有统计差异(P＝0.014)。rs 11730582(T/C)的基因型与原发性肝癌之间的术后无瘤生存率见附图5(A：t/t，B：t/c C：c/c，P＝0.018)。单体型与预后分析发现AGC-纯合子较AGC-杂合子和其它单体型总生存率和无瘤生存率具有统计学差异(P＝0.003，P＝0.024)，提示具有较好的预后。单体型AGC-与总生存和无瘤生存关系分别见附图6(A：单体型3/单体型3，B：单体型3/其他单体型C：其他单体型/其他单体型，P＝0.003)，附图7(A：单体型3/单体型3，B：单体型3/其他单体型，C：其他单体型/其他单体型，P＝0.024)。Cox风险比例模型多因素分析发现rs 2853744(G/T)、rs11730582(C/C)基因型和不含AGT-单体型是术后生存的独立相关因子(分别为G/T：P＝0.03，危险度＝1.95，95％置信区间＝1.06-3.59，C/C：P＝0.05，危险度＝1.9，95％置信区间＝1.03-3.45；不含AGT-P＝0.01HR＝2.42，95％置信区间＝1.23-4.74。Cox比例风险模型(多因素)分析骨桥蛋白基因型和单体型与术后生存关系见下表：

我们研究表明肿瘤转移相关基因骨桥蛋白上的核苷酸多态性会改变肿瘤的侵袭转移潜能与预后。单体型AGT-与高侵袭潜能正相关，rs 2728127(A/G)、rs 2853744(G/T)、rs11439060(G/-)三个单核苷酸多态性位点上AA、GG、--基因型和不含AGT-单体型总生存率明显上调，rs 11730582(T/C)单核苷酸多态性位点上CC基因型和含AGC-单体型无瘤生存率明显上调，为原发性肝癌术后低复发风险的独立相关因子。

本发明的创新点为：(1)通过对原发性肝癌病人的肿瘤相关基因骨桥蛋白的单核苷酸多态性检测，首次构建中国原发性肝癌人群中骨桥蛋白基因的单体型。(2)首次发现在中国人群中，肿瘤转移相关基因骨桥蛋白有一新的在NCBI上未登录的单核苷酸多态性位点(-1263处插入核苷酸AA)。(3)首次探讨了骨桥蛋白基因启动子区域的单体型与原发性肝癌的转移复发的关联性并结合预后分析，为肝癌转移复发、预后预测提供新的试剂盒。

本发明的优点为：(1)通过对原发性肝癌病人的单核苷酸多态性检测，可以指导病人的术后转移复发，简单、方便、实用。(2)对原发性肝癌病人预后进行评估，并及时采取综合手段干预，提高病人远期生存率，改善预后。(3)为原发性肝癌复发诊断、预后预测提供新的试制盒，方便于临床应用。

附图说明

图1为骨桥蛋白基因启动子区域4个单核苷酸多态性之间连锁不平衡分析图；

图2为rs 2728127D单核苷酸位点与总生存分析图；

图3为rs11439060单核苷酸位点与总生存分析图；

图4为rs 2853744单核苷酸位点与总生存分析图；

图5为rs 11730582单核苷酸位点与无瘤生存分析图；

图6为单体型AGC-与总生存分析图；

图7为单体型AGC-与无瘤生存分析图。

具体实施方式

下面结合实施例来具体说明本发明。

实施例1

一种用于预测原发性肝癌病人预后的试剂盒，由纯化系统、扩增系统、单核苷酸多态性位点检测系统、5’→3’引物序列，3’→5’引物序列及测序引物组成；

单核苷酸多态性位点检测系统由DNA多聚酶、腺苷三磷酸、荧光素酶和腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷酰硫酸和荧光素组成；

应用上述试剂盒预测原发性肝癌病人预后的方法如下：

1、选取10例肝癌病人，将肝癌组织(30mg)放于液氮中，砸成粉末状，应用DNA提取纯化系统：3μl蛋白酶K(20mg/ml)、100μl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(10mmol/L)、100μl 乙二胺四乙酸(0.1mol/L)、100μl 0.5％SDS、600μl苯酚∶氯仿(1∶1)、3μl核糖核酸酶(20ug/ml)和300μl无水乙醇组成，提取组织中基因组DNA，使用DU800紫外分光光度计测定DNA的260的吸光度值和260和A280的吸光度比值(1.8-2.0)，以评估其浓度和质量，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。符合定量检测要求的样本置于-80℃保存备用。

2、扩增系统

1)将29.6μl水，4μl 10×PCR缓冲液，1μl 25mM MgCl₂，1μl5’→3’引物，1μl3’→5’引物，1μl 100mM脱氧核糖核苷三磷酸混合物(脱氧腺苷三磷酸∶脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸∶胸腺嘧啶核苷三磷酸＝1∶1∶1∶1)，0.4μl高保真酶，模板2μl，充分混合均匀，PCR反应程序如下：94℃，3分钟；94℃20秒；60℃，20秒，72℃，30秒(45个循环)，72℃，3分钟。

2)取5ul电泳检查，条带大小正确，带型单一，无拖尾及引物二聚体，可以用来进行下一步测定。

3、单核苷酸多态性位点检测系统：采用焦磷酸测序方法，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段，具体步骤如下：

第1步：用专用工具DNA酶按步骤纯化得到单链DNA，并与测序引物混合退火。

第2步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入DNA多聚酶、腺苷三磷酸、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷酰硫酸和荧光素。

第3步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。

第4步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。

第5步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在腺苷三磷酸双磷酸酶的作用下发生降解。

第6步：加入另一种dNTP，使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。

4、单体型构建分析：利用Haploview version 3.32和PHASE v2.1.1软件，将编辑好原发性肝癌的4个单核苷酸多态性的信息导入，根据软件提示，系统即给出每个原发性肝癌的单体型结果，每个原发性肝癌有两种单体型，两种单体型一样者为纯合子，否则为杂合子。

6、根据单核苷酸多态性位点检测和单体型构建分析，当病人rs 2728127(A/G)、rs2853744(G/T)、rs11439060(G/-)三个单核苷酸多态性位点为AA、GG、--基因型时，病人术后生存状况好，当rs 11730582(T/C)单核苷酸多态性位点为CC基因型和不含AGT-单体型时，病人术后不宜复发，提示患者预后相对较好，辅助治疗应适量进行。

实施例2

选取10例肝癌病人，按实施例1步骤，当病人rs 2728127(A/G)、rs 2853744(G/T)、rs11439060(G/-)三个单核苷酸多态性位点为非AA、GG、--基因型时，病人术后生存状况差，当病人rs 11730582(T/C)单核苷酸多态性位点为T/C或TT基因型和AGT-单体型时，病人术后易转移复发，提示病人预后差，三年内复发风险偏高，术后需加强监测，适当加以辅助治疗。

Claims

1.一种肿瘤转移相关基因骨桥蛋白基因的单体型，该单体型在-1748位的rs 2728127A/G、-616位的rs 2853744G/T、-443位的rs 11730582T/C、-155位的rs11439060G/-四个SNP位点的单核苷酸分别是A、G、C和-，其中，rs11439060G/-中的-表示无插入。