JP2019515680A - Ｂ型肝炎ウイルスｃｃｃＤＮＡの定量的測定 - Google Patents

Abstract

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染は、ウイルスゲノムＤＮＡの宿主肝細胞への侵入をもたらす。このウイルス弛緩型環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）は、核に輸送され、共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に変換され、ウイルス転写のテンプレートとして働く。ＨＢＶ感染を治療するためには、ｃｃｃＤＮＡの排除が必要であり、これは依然として主要な治療上の課題である。本明細書に記載されたｃｃｃＤＮＡを測定するための堅牢で敏感な方法は、薬物開発を促進し、治療の有効性をモニターするのに有用である。ウイルスＤＮＡの亜硫酸水素ナトリウム処理と組み合わせてプライマーのセットを設計し、ｒｃＤＮＡの増幅の干渉なしでｃｃｃＤＮＡの特異的増幅を可能にした。この方法は、治療開発をさらに誘導し、抗ウイルス治療を受けているＨＢＶ感染患者のモニタリングのための非侵襲的代替手段を提供するために使用することができる。

Description

関連出願のクロスリファレンス
本出願は、２０１６年２月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／２９５，４８１号の優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

電子的に提出された配列リストへの参照
電子的に提出された配列リストの内容（ファイル名ｃｃｃＤＮＡ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＰＣＴ．ｔｘｔ、サイズ１１，６０９バイト；および作成日２０１７年２月１５日、本明細書と共に提出）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

技術分野
本開示は、概して共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））の検出または定量のための方法およびキットに関し、より詳細には、ＨＢＶに感染した生体サンプルにおける弛緩型環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡまたはＲＣ−ＤＮＡ）とは別にｃｃｃＤＮＡを検出するまたは定量する方法に関する。

ＨＢＶ感染は世界的な公衆衛生上の懸案事項である。世界中で２億４０００万人がＨＢＶに慢性的に感染している（Ｌａｖａｎｃｈｙ ａｎｄ Ｋａｎｅ ２０１６）。ＨＢＶの感染は、急性および慢性の肝炎を引き起こし、肝硬変および肝細胞癌へと至る（Ｋｅｗ ＭＣ ２０１０）。

ＨＢＶ感染への現在の治療法は限られており、主にｃｃｃＤＮＡの持続性のために、ウイルスを完全に排除することなくウイルス血症のみを抑制する（Ｔａｎｇ，Ｙａｕ ｅｔ ａｌ．２０１４）。治療の中止は、ほとんどの患者へのリバウンドをもたらし、これは持続感染症の原因となるウイルス残留物の存在を示唆している（Ａｂｄｅｌｈａｍｅｄ，Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．２００２）。抗ウイルス療法を受けている患者が治療を中止した場合、ＨＢＶはｃｃｃＤＮＡから再活性化することができる（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ Ｊ ２００７）。肝臓におけるｃｃｃＤＮＡの持続性をモニターするためには、度重なる肝生検が必要であり、これは患者にとって危険であり、不快であり、高価である（Ｗｕ、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｚｈｏｎｇ，Ｈｕ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｓｈｉ，Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．２０１５）。ｃｃｃＤＮＡは血液中、特に肝臓損傷後にも見出されるので、血清または血漿中でのその検出は、肝生検に頼らずに抗ウイルス療法の有効性および肝臓損傷の程度を評価することを可能にする（Ｗｏｎｇ，Ｙｕｅｎ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｔａｋｋｅｎｂｅｒｇ，Ｚａａｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９）。

ＨＢＶ感染後、ウイルスＤＮＡは、感染した肝細胞の核に移され、ｒｃＤＮＡは宿主細胞質に放出される。ウイルスＤＮＡは、最終的に核質に輸送され、ｃｃｃＤＮＡに変換される。ミニ染色体として偽装された宿主核内のｃｃｃＤＮＡの存在は、肝細胞核質におけるメッセンジャーＲＮＡの継続的なビリオン転写の鋳型として働く（Ｌｅｖｒｅｒｏ，Ｐｏｌｌｉｃｉｎｏ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｎａｓｓａｌ ２０１５）。したがって、ｃｃｃＤＮＡの持続性は、進行した肝臓疾患を発症する危険性がある慢性的に感染した人々において、従来の抗ウイルス療法によってＨＢＶを除去する上で障害となっている。興味深いことに、わずかな割合の患者が従来の抗ウイルス療法単独によってＨＢＶ Ｓ抗原（ＨＢＶｓＡｇ）を除去しており、ｃｃｃＤＮＡが排除できることが示されている（Ｔａｖｉｓ，ＪＥ ｅｔ ａｌ．２０１３）。この「治癒した」集団は、もしそのｃｃｃＤＮＡレベルを測定することができるならば、高価でありかつ未知の副作用を有する生涯にわたる抗ウイルス療法を中止することができる。したがって、肝生検または体液からのｃｃｃＤＮＡレベルの定量化のための高感度かつ特異的な方法がこの「治癒した」集団を同定するためには大変望ましい。

ｃｃｃＤＮＡの排除は、ＨＢＶ感染の治療法を見いだすＨＢＶ薬開発研究の最終目標である。ｃｃｃＤＮＡの定量化のための高感度かつ特異的な方法が非常に望ましい。

概要
本開示は、共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）および非ｃｃｃＤＮＡを含有するＤＮＡサンプル中のｃｃｃＤＮＡを検出するまたは定量するための方法およびキットを提供する。

第１の側面において、方法が開示される。前記方法は、以下の工程を含む：
ｉ）前記ＤＮＡサンプルを処理して、処理されたＤＮＡサンプル中の二本鎖ＤＮＡ分子の相補的な特徴を破壊し、それによって前記二本鎖ＤＮＡ分子の２つのストランドのリアニールを防止すること；および
ｉｉ）前記非ｃｃｃＤＮＡではなく前記ｃｃｃＤＮＡが増幅産物を生じることができるように、前記処理されたＤＮＡサンプルで増幅分析を実施すること。

本明細書中、ＤＮＡサンプルにおいて、ｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡは、ｃｃｃＤＮＡと実質的に同じＤＮＡ配列のものであるが、ｃｃｃＤＮＡとは異なるフォーム（例えば、弛緩型環状フォームまたはｒｃＤＮＡ）である。

ＤＮＡ配列は、ＨＢＶに由来してもよく、したがって、ＤＮＡサンプル中のＨＢＶ ＤＮＡは、ＨＢＶゲノムＤＮＡのｃｃｃＤＮＡフォームおよびｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡフォーム（例えばｒｃＤＮＡまたは他の中間フォーム）を含むことができる。ＤＮＡ配列は、他の種から得ることもできるし、人工配列であってもよい。

本明細書中、ＤＮＡサンプルは、組織または体液などの生体サンプルから得ることができ、体液は、血清、血漿、血液、尿または唾液であり得る。本方法およびキットは、研究環境または臨床環境で使用することができる。

本方法およびキットは、ＤＮＡサンプル中のｃｃｃＤＮＡを検出するまたは定量するなどの特性を明らかにするために使用することができる。ＨＢＶの診断、管理、および予後の分野における１つの用途において、本方法およびキットは、ＨＢＶに感染した患者における肝臓損傷の重篤度を評価するために使用することができ、または、ＨＢＶに感染した患者における抗ウイルス療法の効率をモニターするために使用することができる。

本開示のいくつかの実施形態によれば、方法は、工程ｉ）の前に、生体サンプルからＤＮＡ試料を得る工程をさらに含むことができる。

本明細書中、ＤＮＡサンプルは、生体サンプルから得る、単離するまたは抽出することができ、これは、限定されないが、エタノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出、ミニカラム精製、または任意の関連する市販のキット（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標） Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｋｉｔ）を含む任意の標準的な方法によって実施することができる。

本方法のいくつかの実施形態によれば、工程ｉ）において、前記ＤＮＡサンプルを前記処理されたＤＮＡサンプル中の二本鎖ＤＮＡ分子の２つのストランドの配列を変更するように構成された化学試薬で処理し、それによって、前記２つのストランドの相補的な特徴を破壊することができる。

上記化学試薬は、脱アミノ化反応を引き起こすことによって作用することができ、特定のヌクレオチド（例えば、シトシン）に選択的であり得る、または非選択的（例えば、アデノシンおよびシトシン）であり得る。化学試薬は、亜硝酸、亜硝酸ナトリウム、ニトロソアミン類、または亜硫酸水素ナトリウムであり得る。化学試薬は、ＤＮＡ分子のストランド上の他の反応を引き起こすことにより作用しうる。

本方法のいくつかの実施形態によれば、工程ｉｉ）における増幅分析が前記ＤＮＡ配列上の２つの戦略的位置にそれぞれアニーリングするように構成され、同時に前記ｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡではなく前記ｃｃｃＤＮＡから増幅産物を生成することができるように構成された一対のプライマーを用いて実施される。

いくつかの実施形態において、工程ｉｉ）の増幅分析は、増幅産物に基づいて、前記ｃｃｃＤＮＡを定量するように構成されたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むことができる。

２つの戦略的位置は、それぞれｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡにおける不連続なストランドの既知の不連続領域の２つのサイドにあってもよい。一対のプライマーは、処理されたＤＮＡサンプル中の連続したストランドの２つの戦略的位置にそれぞれアニーリングして、それによって連続したストランドから増幅産物を生成するように構成することができる。

ＤＮＡ配列がＨＢＶ ＤＮＡであるいくつかの実施形態において、２つの戦略的位置は、ｒｃＤＮＡ中のＨＢＶ（−）ストランドの不連続領域の２つのサイド、またはｒｃＤＮＡ中のＨＢＶ（＋）ストランドのギャップ領域のいずれか１つの２つのサイドにありうる。

ＨＢＶ ＤＮＡをターゲットとする本方法のいくつかの実施形態によれば、一対のプライマーのフォワードプライマーは、配列番号１〜２１（表１参照）のいずれか１つに記載の配列を含むことができ、一対のプライマーのリバースプライマーは、配列番号２２〜２８（表１参照）のいずれか１つに記載の配列を含むことができる。

本方法のいくつかの他の実施形態では、工程ｉｉ）における増幅分析は、処理されたＤＮＡサンプルにおいて、不連続なストランドではなく連続したストランドにアニーリングするように構成され、ｃｃｃＤＮＡの定量を可能にするように構成されたプローブを用いてさらに行うことができる。プローブは、５’末端および３’末端それぞれに、蛍光強度を測定することによってｃｃｃＤＮＡの定量を可能にするように構成された蛍光色素および蛍光消光剤で標識されていてもよい。

ＤＮＡ配列がＨＢＶ ＤＮＡであるいくつかの実施形態において、プローブは、配列番号２９〜３１（表１参照）のいずれか１つに記載の配列を含むことができる。

第２の側面では、ｃｃＤＮＡおよび前記ｃｃｃＤＮＡと実質的に同じＤＮＡ配列であり、異なるフォームであるｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡを含むＤＮＡサンプル中の前記ｃｃｃＤＮＡを検出するまたは定量するためのキットを開示する。

キットは、化学試薬および一対のプライマーを含む。化学試薬は、それにより処理されたＤＮＡサンプル中の二本鎖ＤＮＡ分子の相補的な特徴を破壊し、それによって前記二本鎖ＤＮＡ分子の２つのストランドのリアニールを防止するように構成される。一対のプライマーは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ＤＮＡ配列上の２つの戦略的位置にそれぞれアニーリングするように構成され、同時にｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡではなくｃｃｃＤＮＡから増幅産物を生成することができるように構成される。

本キットのいくつかの実施形態では、化学試薬は、以下の４つの試薬の少なくとも１つを含む：亜硝酸、亜硝酸ナトリウム、ニトロソアミン類、および亜硫酸水素ナトリウム。

本キットにおいて、２つの戦略的位置は、それぞれｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡにおける不連続なストランドの既知の不連続領域の２つのサイドにあり、一対のプライマーは、処理されたＤＮＡサンプル中の連続したストランドの２つの戦略的位置にそれぞれアニーリングして、それによって連続したストランドから増幅産物を生成するように構成されうる。

本開示のいくつかの実施形態によれば、キットは、さらにプローブを含んでもよく、プローブは、処理されたＤＮＡサンプルにおいて、不連続なストランドではなく連続したストランドにアニーリングするように構成され、ｃｃｃＤＮＡの定量を可能にするように構成される。

プローブは、５’末端および３’末端それぞれに、蛍光色素および蛍光消光剤で標識されていてもよい。蛍光色素は、６−カルボキシフルオレセイン、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン）、ＨＥＸ（２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン）、またはＣｙ５（シアニン−５）の少なくとも１つを含むことができる。蛍光消光剤は、６−カルボキシテトラメチル−ローダミン、ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）、ＢＢＱ（ブラックベリークエンチャー（ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ））、またはＢＨＱ３（ブラックホールクエンチャー３（ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ ３））の少なくとも１つを含むことができる。

本キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼバッファー、ｄＮＴＰ、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。

本開示のいくつかの実施形態によれば、本キットは、ＨＢＶのためにカスタマイズすることができる。具体的には、ｃｃｃＤＮＡは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のｃｃＤＮＡフォームを含み、ｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の弛緩型環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）フォームを含む。

そのようなものとして、フォワードプライマーは、配列番号１〜２１（表１参照）のいずれか１つに記載の配列を含むことができ、リバースプライマーは、配列番号２２〜２８ （表１参照）のいずれか１つに記載の配列を含むことができる。

いくつかの好ましい実施形態において、リバースプライマーは、配列番号２４に記載の配列を含み、フォワードプライマーは、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１７に記載の配列を含む。

別の側面において、本開示は、サンプルにおいて、ｃｃｃＤＮＡをｒｃＤＮＡと識別可能に検出する方法を提供する。本方法は、（ａ）ヌクレオチドコンバーター（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）試薬で前記サンプルを処理すること；および（ｂ）ＰＣＲプロシージャによって前記ｃｃｃＤＮＡを検出することを含む。本方法のいくつかの実施形態では、ヌクレオチドコンバーター試薬は、Ｃ残基をＵ残基に転換する。そのようなものとして、ヌクレオチドコンバーター試薬は、脱アミノ化剤（ｄｅａｍｉｎａｔｏｒ）でありうる（すなわち、ヌクレオチドに対する脱アミノ化反応を引き起こす化学試薬）。上記ヌクレオチドコンバーター試薬は、亜硝酸、亜硝酸ナトリウム、ニトロソアミン類、亜硫酸水素ナトリウム、およびそれらの組み合わせから選択することができる。

本開示のいくつかの実施形態によれば、ＰＣＲプロシージャは、不連続領域に及ぶ一対のプライマーを使用する。一対のプライマーは、不連続領域の２つのサイド上の２つの戦略的位置にそれぞれアニーリングするように構成することができ、同時にｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡではなくｃｃｃＤＮＡから増幅産物を生成することができるように構成することができる。

本開示のいくつかの実施形態によれば、ＰＣＲプロシージャは、プローブをさらに使用し、プローブは、不連続なストランドではなく連続したストランドにアニーリングするように構成される。

図１は、亜硫酸水素ナトリウムでの脱アミノ化によるシトシンヌクレオチドのウラシルヌクレオチドへの分子転換を示す。示すように、シトシンとの相補的塩基対合は、グアニンであり、ウラシルとの相補的塩基対合は、アデニンである。 図２Ａ〜図２Ｇは、文献からの現在利用可能なｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析と比較した、「ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析」と表すｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析を示す。 図２Ａ〜図２Ｇは、文献からの現在利用可能なｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析と比較した、「ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析」と表すｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析を示す。 図２Ａ〜図２Ｇは、文献からの現在利用可能なｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析と比較した、「ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析」と表すｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析を示す。 図２Ａ〜図２Ｇは、文献からの現在利用可能なｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析と比較した、「ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析」と表すｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析を示す。 図２Ａ〜図２Ｇは、文献からの現在利用可能なｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析と比較した、「ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析」と表すｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析を示す。 図２Ａ〜図２Ｇは、文献からの現在利用可能なｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析と比較した、「ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析」と表すｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析を示す。 図２Ａ〜図２Ｇは、文献からの現在利用可能なｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析と比較した、「ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析」と表すｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析を示す。 図２Ａ〜図２Ｇは、文献からの現在利用可能なｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析と比較した、「ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析」と表すｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析を示す。 図２Ａ〜図２Ｇは、文献からの現在利用可能なｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析と比較した、「ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析」と表すｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析を示す。 図２Ａ〜図２Ｇは、文献からの現在利用可能なｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析と比較した、「ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析」と表すｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析を示す。 図３は、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの検出を示す。 図４Ａおよび４Ｂは、ＰＣＲの標的であるＤＲ２領域におけるＨＢＶウイルス（Ａ−Ｈ）の８遺伝子型のマルチシーケンス分析を示す。 図４Ａおよび４Ｂは、ＰＣＲの標的であるＤＲ２領域におけるＨＢＶウイルス（Ａ−Ｈ）の８遺伝子型のマルチシーケンス分析を示す。 図５は、興味のある領域で亜硫酸水素塩変換ＨＢＶ ＤＮＡに似ている２つの合成ＤＮＡテンプレートを示す。 図６は、１０^５コピーのＢＳ−ｒｃＤＮＡのバックグラウンドおける１０^８〜１０コピーの合成ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡテンプレートからの２ステップＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ分析の線形性および感度を示す。 図７は、１ステップｃｃｃＤＮＡ分析におけるＢＳ−ｃｃｃＤＮＡテンプレートの１００コピーの線形性および感度を示し、線形性は、１０^５コピーのｒｃＤＮＡのバックグランドのおける１０^８〜１００コピーの合成ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡからのものである。 図８は、亜硫酸水素塩処理（ＢＳ）がＤＮＡターゲット領域のコピー検出を有意に減少させないことを示す。 図９は、ＨＢＶに感染した患者の組織サンプルから検出されたＨＢＶ ＤＮＡの量を示す。

詳細な説明
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、記載される方法および組成物に関連する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語および語句は、他に特定されない限り、それらに帰する意味を有する。

様々な実施形態を、表示した図を用いて詳細に説明する。これらの実施形態への言及は、特許請求の範囲を限定するものではない。挙げられた例は、本明細書の方法および特許請求の範囲を限定することを意味するのではなく、特許請求の範囲の実施形態の例示的な使用を記載する。

本明細書および添付の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、２つ以上の細胞の組み合わせなどを含む。

本明細書で使用する「ヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」および「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、ワトソン−クリック相互作用を介して相補的配列と塩基対合することができる核酸（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）の繰り返しポリマーを示す。このポリマーは、合成的に製造されてもよいし、生物源に由来してもよい。

「デオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」および「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸の繰り返しポリマーを指す。

「リボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ））」および「ＲＮＡ」という用語は、リボ核酸の繰り返しポリマーを指す。

「疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）」または「障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」という用語は、本明細書では互換的に使用され、機能パフォーマンスの中断または妨害、および／または苦しめられた人に不快感、機能不全、苦痛、またはさらに死などの症状または人と接触して症状を引き起こす、身体またはいくつかの器官の状態のいかなる変化を意味する。疾患または障害は、ジステンバー（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ）、病的な状態（ａｉｌｉｎｇ）、軽い慢性の病気（ａｉｌｍｅｎｔ）、病気（ｍａｌａｄｙ）、障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、病気（ｓｉｃｋｎｅｓｓ）、病気（ｉｌｌｎｅｓｓ）、愁訴（ｃｏｍｐｌａｉｎｔ）、インダーディスポーション（ｉｎｄｅｒｄｉｓｐｏｓｉｏｎ）または疾患（ａｆｆｅｃｔｉｏｎ）に関連しうる。

「遺伝子」は、当技術分野において周知であり、そして本明細書では、プロモーターまたは他の調節配列などのノンコーディング領域、または近位のノンコーディング領域を含む。

生体サンプルは、生検サンプルなどの組織全体を含むことができる。生体サンプルの他の例は、特に制限されないが、唾液、鼻咽頭、血液、血漿、血清、胃腸液、胆汁、脳脊髄液、心膜、膣液、精液、前立腺液、腹水、胸膜液、尿、滑液、間質液、細胞内液もしくは細胞質およびリンパ液、気管支分泌物、粘液、または硝子体液もしくは房水を含む体液を含む。生体サンプルはまた、培養培地を含んでもよい。特定の実施形態では、好ましい体液は、尿である。

「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」という用語は、相補的標的配列にアニーリングすることができ、それによって出発点としての部分的に二本鎖の領域を形成し、そこからポリメラーゼ酵素がＤＮＡ伸長を継続して相補的なストランドを生成することができるオリゴヌクレオチド配列を規定する。

「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」という用語は、異常または疾患の状態もしくは表現型が存在する任意の方法、決定または兆候を意味する。診断するには、異常または疾患状態の存在または非存在を検出することが含まれ、定性的または定量的であり得る。

「ゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）」および「ゲノムの（ｇｅｎｏｍｉｃ）」という用語は、任意の生命体もしくは非生命体または単細胞に由来する任意の核酸配列（コーディングまたはノンコーディング）を意味する。これらの用語はまた、生物学的または人工的な影響を介して突然変異または組換えによって生じる可能性のある自然発生の変異にも適用される。一例はヒトゲノムであり、染色体にパッケージされた約３×１０^９塩基対のＤＮＡで構成され、２２対の常染色体と１つの異質染色体対がある。

選択または標的核酸配列の増幅は、多くの適切な方法によって実施することができる。一般に、Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ａｍ．Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌａｂ．８：１４−２５参照。多数の増幅技術が記載されており、当業者の特定のニーズに適合するように容易に適合させることができる。増幅技術の非限定的な例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写に基づく増幅、ＱβレプリカーゼシステムおよびＮＡＳＢＡを含む（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３−１１７７；Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７−１２０２；Ｍａｌｅｋ ｅｔ；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ｓｕｐｒａ）。好ましくは、増幅は、ＰＣＲを用いて行われる。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、既知の技術に従って行われる（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号明細書；米国特許第４，６８３，２０２号明細書；米国特許第４，８００，１５９号明細書；および米国特許第４，９６５，１８８号明細書、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。一般に、ＰＣＲは、ハイブリダイズする条件下で、検出すべき特定の配列の各ストランドのための１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、核酸サンプル（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下）を処理することを含む。合成される各プライマーの伸長産物は、２つの核酸ストランドのそれぞれに相補的であり、プライマーは、それとハイブリダイズする特定の配列の各ストランドに対して十分に相補的である。各プライマーから合成された伸長産物は、同じプライマーを用いた伸長産物のさらなる合成のための鋳型としても機能することができる。伸長産物の十分な数の合成のラウンドに続いて、サンプルを分析して、検出すべき配列または複数の配列が存在するかどうかを評価する。増幅された配列の検出は、ゲル電気泳動後のＤＮＡのＥｔＢｒ染色後の可視化、または既知の技術に従って検出可能な標識の使用などによって行うことができる。ＰＣＲ技術に関する総説については、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９０参照。

「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓ）」および「産生する（ｐｒｏｄｕｃｅ）」という用語は、本明細書中で同義的に使用され、遺伝子産物の生合成をいう。これらの用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。これらの用語はまた、ＲＮＡの１つ以上のポリペプチドへの翻訳を包含し、さらに自然発生のすべての転写後および翻訳後修飾を包含する。

「ｒｃＤＮＡ」、「ＲＣ−ＤＮＡ」または「弛緩型環状ＤＮＡ（ｒｅｌａｘｅｄ−ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ）」という用語は、部分的に二本鎖であり、環状であるが共有結合ではないＤＮＡのフォームに関する。（＋）ストランドは、（−）ストランドと部分的に二本鎖ＤＮＡを形成し、分子間で長さが異なる３’末端にギャップを残している（Ｇｕｏ，Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００７）。例えば、ＨＢＶゲノムは、ｒｃＤＮＡのフォームで存在しうる。ＨＢＶゲノムの場合、ｒｃＤＮＡの（−）ストランドの５’末端をウイルスＰタンパク質に共有結合させることができる。

「ｃｃｃＤＮＡ」または「共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ）」は、非融合プラスミド様分子であるＤＮＡのフォームに関する。（−）ストランドの不連続性を有さず、（＋）ストランドギャップを有さないことによってｒｃＤＮＡは異なる。例えば、ＨＢＶゲノムは、ｃｃｃＤＮＡのフォームで存在し得る。ＨＢＶゲノムの場合、ｃｃｃＤＮＡは、ウイルスＲＮＡのテンプレートとなり、子孫ウイルス粒子の生成を担う（Ｇｕｏ，Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｎａｓｓａｌ ２０１５）。

本開示で詳述する技術的アプローチは、ＨＢＶ（−）ストランドおよび（＋）ストランドの相補性を除去し、ｒｃＤＮＡではなくｃｃｃＤＮＡによって提供される連続するＨＢＶ ＤＮＡを増幅することによって、本明細書で提供される手順が、患者サンプル中のｃｃｃＤＮＡのみを検出および定量することができるという利点を有する。

任意のオリジンのサンプル中のｃｃｃＤＮＡの検出および定量のための方法が本明細書にて開示される。いくつかの実施形態では、サンプルは、特に制限されないが、組織、血液、血清、血漿、または得られる任意の体液など、患者から得られた臨床サンプルであり得る。他の実施形態では、サンプルは、特に制限されないが、細胞培養および動物研究など、研究に基づくサンプルであり得る。

本開示は、ｃｃｃＤＮＡテンプレートの高度に特異的かつ高感度な定量および検出を可能にする方法を提供する。本細書に開示された方法を用いることにより、ＤＮＡの亜硫酸水素ナトリウム処理を行い、それによってＨＢＶゲノムの相補的な（＋）および（−）ストランドを非相補的なストランドに変換する。図１は、亜硫酸水素ナトリウムでの脱アミノ化によるシトシンヌクレオチドのウラシルヌクレオチドへの分子変換を示す。図１に示すように、シトシンとの相補的塩基対合は、グアニンであり、ウラシルとの相補的塩基対合は、アデニンである。

このようなＨＢＶ ＤＮＡの２つのストランドの分離は、プライマーがｒｃＤＮＡの（＋）ストランドおよび不連続な（−）ストランドにおけるギャップを含む領域（一方、この領域は、ｃｃｃＤＮＡにおいて連続である）に及ぶように選択されるストランド特異的なＰＣＲの設計を可能にする。プライマーは、ヒトゲノムＤＮＡと重複しないように設計されている。しかし、以前のアプローチとは異なり、処理され、お互いに非相補的にされた（＋）および（−）ストランドは、互いにアニーリングすることができ、ｃｃｃＤＮＡからのものと同一の単位複製配列を生成することができ、短いが重複する産物を生成する個々のプライマーの線状伸長の課題を克服する。この戦略は、ｃｃｃＤＮＡと、ｒｃＤＮＡのような、このウイルスゲノムＤＮＡの他のフォームと、を区別することができる、真にｃｃｃＤＮＡ特異的ＰＣＲである。

図２Ａ〜２Ｇは、文献からの現在利用可能なｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析と比較した、「ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲアッセイ」と表す前述のｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析の動作原理を示す。

図２に示すように、ｃｃｃＤＮＡ測定の「偽陽性（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」は、現在のｃｃｃＤＡＮ ＰＣＲ分析（出典 Ｎａｓｓａｌ，２０１５ Ｍ．）によるｒｃＤＮＡテンプレートに由来した。最新のｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析（またはｎｏｎ−ＢＳ ｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析）は、矢印によって示されるように、ＤＲ１およびＤＲ２領域のいずれかのサイドにプライマーを設計した。囲んだダイアグラムに示されるように、ｒｃ ＤＮＡ から生成された偽陽性は、互いにアニーリングすることができ、その後増幅してｃｃｃＤＮＡと同一の単位複製配列を形成することができる、より短いが重複する産物を生成する個々のプライマーの線状伸長に起因する。

図２Ｂは、Ｃ／Ｔ変換をもたらす亜硫酸水素塩処理（ＢＳ）の図である。右のパネルに示す一例は、亜硫酸水素塩処理後、ＣｐＧ部位のシトシン「Ｃ」は、メチル化されていればＣのままであることを示す。全ての非メチル化Ｃは、ＤＮＡ配列におけるそれらの位置にかかわらず、Ｕへと変換され、Ｔと同様Ａに相補的である。したがって、この結果は、ＤＮＡのプラス（＋）ストランドおよびマイナス（−）ストランドの相補的な特徴を破壊するＤＮＡ配列の改変である。

図２Ｃは、ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲ分析設計に使用したｎｔ位置１５５６〜１６２８（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃ ＮＣ＿００３９７７）からのＨＢＶ ＤＮＡ配列を示し、亜硫酸水素塩処理後のＤＮＡ配列の変化により、プラスおよびマイナスストランドは、もはや互いに相補的ではないことを示す。

図２Ｄは、ＢＳ−変換プラスストランド鎖配列を用いた「ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ」ＰＣＲ分析設計を示す。フォワードプライマー、リバースプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブの位置（網掛け）と配列とを示す。

図２Ｅは、「ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ」と従来の、現在の、または公開された「ｃｃｃＤＮＡ」ＰＣＲアプローチとの概要の比較を示す。図は、たとえプライマー設計がｒｃＤＮＡのプラスストランドにおいて不連続である領域であっても、ＰＣＲがプラスおよびマイナスストランドの相補性を、例えば亜硫酸水素塩処理によって破壊することなく行われた場合、生じる可能性のある偽陽性を示す。

図２Ｆは、亜硫酸水素塩処理なしで、ｃｃｃＤＮＡ ＰＣＲによるｒｃＤＮＡテンプレートから生成された偽陽性のＤＮＡ配列によるさらに詳細な図を提供する。

図２Ｇは、プラスストランド特異的でＢＳ−特異的なプライマーおよびプローブを用いたＰＣＲ増幅の前にＤＮＡの亜硫酸水素塩処理を含む「ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ」ＰＣＲ分析によって、ｃｃｃＤＮＡテンプレートおよびｒｃＤＮＡテンプレートからそれぞれ生成された真陽性および真偽性のＤＮＡ配列による別の図を提供する。

図３は、本開示のいくつかの実施形態によるＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの検出を示す。図２Ｅ（および図２Ｇ）におけるＰＣＲ増幅戦略から生成された相補的な増幅ストランドは、プローブに結合する。相補的なプライマーがこの増幅ストランドをコピーし始めると、プローブに遭遇し、プローブを消化して、消光剤（ＢＢＱ）から色素（ＦＡＭ）を放出する。蛍光におけるこの変化は、リアルタイムＰＣＲによる定量的検出を可能にする。

図４Ａおよび４Ｂは、ＰＣＲの標的であるＤＲ２領域におけるＨＢＶウイルス（Ａ−Ｈ）の８遺伝子型のマルチシーケンス分析を示す。

図５は、目的の領域で亜硫酸水素塩変換ＨＢＶ ＤＮＡに似ている２つの合成ＤＮＡテンプレートを示す。両方のストランドが使用されるが、相補的ではなく、一本鎖である。合成ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡテンプレートは、２つのＤＮＡオリゴから構成され、ＢＳ−ｒｃＤＮＡはマイナスストランドの不連続を模倣する３つのＤＮＡオリゴから構成される。

この技術は、酵素によるプラスミドセーフＤＮａｓｅ前処理（Ｓｉｎｇｈ，Ｄｉｃａｉｒｅ ｅｔ ａｌ．２００４）に依存しないが、必要に応じて組み合わせることができる。この独立性は、ｒｃＤＮＡのほぼ完全な（＋）ストランドがこの増幅反応の基質として作用できないためである。（＋）ストランドのギャップと重複する亜硫酸水素塩処理領域のために設計されたＴａｑＭａｎプローブは、ｃｃｃＤＮＡの特異的定量を保証する。この方法はまた、ＤＮａｓｅまたはエキソヌクレアーゼを必要としないので、トータルのＨＢＶ ＤＮＡの定量化を可能にし、それによってｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡバックグラウンドの完全性を保存する。

本明細書中に開示される方法は、肝臓損傷の重篤度を評価し、抗ウイルス療法の有効性を評価するため、制限されないが、Ｂ型肝炎患者由来の血清などの任意のオリジンのｃｃｃＤＮＡの検出および／または定量に適している。

抗ウイルス療法を受けていて、治療を中止した患者では、ＨＢＶは、ｃｃｃＤＮＡから再活性化することができる（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ Ｊ ２００７）。肝臓におけるｃｃｃＤＮＡの持続性をモニターするためには、繰り返しの肝生検が必要であり、これは患者にとって危険で不快であり、高価である（Ｗｕ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｚｈｏｎｇ，Ｈｕ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｓｈｉ，Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．２０１５）。ｃｃｃＤＮＡは、血液中、特に肝臓損傷後にも見出されるので、血清または血漿中でのその検出は、肝生検によらずに抗ウイルス療法の有効性および肝臓損傷の程度を評価することを可能にする（Ｗｏｎｇ，Ｙｕｅｎ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｔａｋｋｅｎｂｅｒｇ，Ｚａａｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９）。

ｃｃｃＤＮＡの定量のための高感度かつ特異的な方法が非常に望まれていたが、このようなアッセイの開発は、細胞あたりのｃｃｃＤＮＡの低コピー数などの要因により困難であることが判明していた（Ｎａｓｓａｌ ２０１５）。細胞あたりのｃｃｃＤＮＡコピー数を増加させるための細胞株が生み出されており（Ｓｉｎｇｈ，Ｄｉｃａｉｒｅ ｅｔ ａｌ．２００４）、サザンブロットによる検出を可能にする（Ｌｉｕ，Ｃａｍｐａｇｎａ ｅｔ ａｌ．２０１３）。しかし、サザンブロットは、患者サンプルからのｃｃｃＤＮＡの検出に適切な方法ではない。ＰＣＲに基づくアプローチも、ＨＢＶ ＤＮＡの（−）ストランド重複および（＋）ストランドギャップ領域を標的とするプライマーを設計することにより開発されている（Ｈｅ，Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２００２）。このアプローチはＨＢＶ ＤＮＡに対して選択的に行うことができるが、ＨＢＶゲノムのｃｃｃＤＮＡとｒｃＤＮＡとのフォームを区別することはできない（Ｎａｓｓａｌ ２０１５）。ローリングサークル増幅およびＩｎｖａｄｅｒ技術のような他の技術が記載されているが、正確でクリーンな定量は、得られない（Ｗｏｎｇ，Ｙｕｅｎ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｚｈｏｎｇ，Ｈｕ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｎａｓｓａｌ ２０１５）。

以前の研究は、血清ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡレベルが慢性的に感染しているＨＢＶ患者における肝内ｃｃｃＤＮＡ量と関連していることを示している（Ｌｉ，Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．２０１４）。したがって、血清ｃｃｃＤＮＡの検出は、繰り返しの肝生検の必要なく、肝内ｃｃｃＤＮＡレベルの相対的かつ連続的なモニタリングとしての機能を果たす。血清中のｃｃｃＤＮＡの定量的検出は、抗ウイルス療法の有効性および指針の評価を可能にする（Ｃｈｅｎ、Ｓｚｅ ｅｔ ａｌ．２００４）。ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの検出方法は報告されているが、現在、ｃｃｃＤＮＡの検出および定量のための市販のキットは存在しない。

ｃｃｃＤＮＡのための実現可能な検出方法は、ＨＢＶに対する新たな抗ウイルス剤の開発、ウイルス進行および抵抗のモニタリング、肝外の感染の発見のために重要であろう。ＨＢＶ創薬努力の多くは、ＨＢＶを抑制するよりむしろ治療する改善した抗ウイルス剤の開発を目的としている（Ａｈｍｅｄ，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｋｕｍａｒ，Ｐｅｒｅｚ−ｄｅｌ−Ｐｕｌｇａｒ ｅｔ ａｌ．２０１６）。これは、感染した肝臓あたり、細胞あたり平均０．１〜１コピーの非常に低い濃度で存在するためｃｃｃＤＮＡの非常に正確で高感度の検出方法を必要とする。今後何年も、抗ウイルス療法を受けるＨＢＶ感染者のかなりの割合が、ｃｃｃＤＮＡの検出のための容易な診断方法へのアクセスの恩恵を受けるであろう。

上述の実施形態は、本開示の原理の適用を構成するであろう多くの様々な他の実施形態を例示するだけであることを理解すべきである。そのような他の実施形態は、本開示の主旨および範囲から逸脱することなく、当業者によって容易に考案することができ、それらは、本開示の範囲であるとみなされるべきである。

本出願に引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本開示に記載の技術的なアプローチを以下の非限定的な例によってさらに説明する。

実施例１：ＰＣＲによって検出される亜硫酸水素塩処理後のＤＮＡの回収
二本鎖ＤＮＡの相補的なストランドは、図２Ｂに示すように、シトシンヌクレオチドをウラシルに変換する、亜硫酸水素塩処理により非相補的にすることができる。

ここで、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｐｉｔｅｃｔ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）およびＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｇｏｌｄ ｋｉｔｓ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ）を亜硫酸水素塩処理のため、製造業者の仕様書に従って使用した。ヒトＨＣＣ組織サンプルからのＤＮＡを亜硫酸水素塩処理し、亜硫酸水素塩処理の前後に特定のアッセイで試験した。構成遺伝子上の領域、アクチンを、亜硫酸水素塩未処理ＤＮＡ領域および亜硫酸水素塩処理ＤＮＡ領域を標的とするアッセイを実行することによって比較するために使用した（図８参照）。

図８は、亜硫酸水素塩処理（ＢＳ）がＤＮＡ標的領域のコピー検出を有意に減少させないことを示す。亜硫酸水素塩未処理および亜硫酸水素塩処理ＤＮＡ両方のアクチン遺伝子における短い産物を増幅するプライマーを比較し、大きな差がないことを明らかにした。ＨＢＶに感染した患者由来の５つの組織サンプルおよび５つの血清サンプルをこの比較に使用した。アクチン遺伝子での亜硫酸水素塩処理前後の比較は、製造業者の仕様ごとの高さであり、本明細書に記載のＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ分析における使用のための適性を明らかにする。

実施例２：リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によるＤＮＡ定量
全ＨＢＶ ＤＮＡは、製造業者の仕様書に従い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＰＣＲ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたリアルタイムＰＣＲにより定量した。亜硫酸水素塩処理した全ＨＢＶ ＤＮＡのプライマー（フォワード、５’−ＴＴＡＴＧＴＴＡＡＴＧＴＴＡＡＴＡＴＧＧＧＴＴＴＡＡ−３’；リバース、５’−ＴＴＣＴＣＴＴＣＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＡ−３’；プローブ、５’−６ＦＡＭ−ＴＴＡＧＡＴＡＡＴＴＡＴＴＧ＋ＴＧＧ＋Ｔ＋Ｔ＋Ｔ＋ＴＡ＋ＴＡ＋Ｔ−ＢＢＱ３’）および定量化の標準として段階希釈ＨＢＶ ＤＮＡプラスミドを定量化のために使用した。

亜硫酸水素塩変換ｃｃｃＤＮＡを定量するため、（＋）ストランドギャップ領域内でのプライマー（フォワード、５’ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＴＴＴＧＴＹＧＧＡＴＹＧＴＧＴＧＴＡＴＴＴ−３’；リバース、５’−ＡＡＣＲＴＴＣＡＣＲＡＴＡＡＴＣＴＣＣＡＴＡＣ−３’）をｒｃＤＮＡの増幅を防止するために選択した。ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ ５’ ６ＦＡＭ− ＴＴＴＴＡＴ＋Ｔ＋Ｔ＋Ｔ＋Ｔ＋Ｇ＋ＴＡＹ＋Ｇ＋ＴＡ−ＢＢＱ−３’を増幅産物を検出するために使用した。

実施例３：リアルタイムＰＣＲによるｃｃｃＤＮＡの検出のための１ステップＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ分析
図７は、１００コピーの感度を示すＢＳ−ｃｃｃＤＮＡのテンプレートワンステップｃｃｃＤＮＡ分析における１００コピーのＢＳ−ｃｃｃＤＮＡのテンプレートの感度、および１０^５コピーのバックグランドにおける１０^８から１００コピーの合成ＢＳ−ｃｃｃＤＮＡの線形性を示す。図５に記載の合成ＨＢＶテンプレートの１０倍段階希釈は、分析での１００から１０^８コピーの感度および線形性の範囲である。データは、増幅曲線（上）および標準曲線（下）として示される。

１ステップリアルタイムＰＣＲを配列番号１１および配列番号２４のプライマーセットを用いて行った。増幅産物の検出をプローブとして配列番号２９を用いて行った。ヒトメチル化亜硫酸水素塩処理ＤＮＡをネガティブコントロールとして１０，０００コピーで使用すると、観察可能な増幅はなかった。１０^４ＨＭＢＳは、１０コピーのｃｃｃＤＮＡと同様のｃｐ値で増幅されたので、１ステップＢＳ−ｃｃｃＤＮＡの感度または検出限界は、１０^４ＨＭＢＳバックグラウンドの存在下で１００コピーであることに注意されたい。

以下のプロトコルは、Ｒｏｃｈｅ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｓｙｓｔｅｍとともに１０μｌの反応を用いたＲｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置を使用する。以下の試薬を添加した：順に、５μｌの２Ｘ ＬＣ ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（１Ｘ最終濃度）、１μｌのＰＣＲグレード水、１μｌの１０μＭフォワードプライマー（配列番号１１、５’−ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＴＴＴＧＴＹＧＧＡＴＹＧＴＧＴＧＴＡＴＴＴ−３’；１μＭ最終濃度）、１μｌの１０μＭリバースプライマー（配列番号２４、５’−ＡＡＣＲＴＴＣＡＣＲＡＴＡＡＴＣＴＣＣＡＴＡＣ−３’；１μＭ最終濃度）、および１μｌの２μＭプローブ（配列番号２９、５’−６ＦＡＭ−ＴＴＴＴＡＴ＋Ｔ＋Ｔ＋Ｔ＋Ｔ＋Ｇ＋ＴＡＹ＋Ｇ＋ＴＡ−ＢＢＱ−３’；０．２ｕＭ最終濃度）。よく混合し、このＰＣＲ反応９μｌを、Ｒｏｃｈｅ ９６−ｗｅｌｌ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ｐｌａｔｅにおいて合計１０μｌの最終量となるよう、それぞれのＤＮＡテンプレートまたはサンプル１μｌに添加する。ＲＴ−ＰＣＲ反応を以下の条件で行う：９５℃５分、その後９５℃１０秒、５２℃１０秒、７２℃１０秒を４５サイクル、その後４０℃３０秒の冷却プログラム。

実施例４：ＲＴ−ＰＣＲによるｃｃｃＤＮＡの検出のための２ステップＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ分析
図６は、２ステップＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ分析の結果を示す。図５に記載の合成ＨＢＶテンプレートの１０倍段階希釈は、分析での１０から１０^８コピーの感度および線形性の範囲である。データは、増幅曲線（上）および標準曲線（下）として示される。第１ステップとして、配列番号１７および配列番号２４のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。第２ステップとして、第１ステップの産物と配列番号１２および配列番号２４のプライマーセットとを用いてＰＣＲを行った。プローブとして配列番号２９を用いて増幅産物を検出し、定量した。ヒトメチル化亜硫酸水素塩処理ＤＮＡをネガティブコントロールとして１０，０００コピーで使用すると、観察可能な増幅はなかった。

具体的には、以下のようにしてＰＣＲ反応を実施した：０．５ｍＬのＰＣＲ微小遠心管内に１５μｌの全容量を含有するＰＣＲ反応のアセンブリ。ＱＩＡＧＥＮ ＨｏｔＳｔａｒｔＰｌｕｓ ＤＮＡ Ｔａｑ（登録商標） Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて、順に７．９μｌのＰＣＲグレード水、１．５μｌの１０Ｘ ＰＣＲバッファー（１Ｘ最終濃度）、１．５μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（０．２５ｍＭ最終濃度）、１μｌの１０μＭフォワードプライマー（配列番号１７、５’−ＴＴＡＹＧＹＧＧＴＴ ＴＴＴＴＹＧＴＴＴＧ Ｔ−３’；１μＭ最終濃度）、１μｌの１０μＭリバースプライマー（配列番号２４、５’−ＡＡＣＲＴＴＣＡＣＲＡＴＡＡＴＣＴＣＣＡＴＡＣ−３’；１μＭ最終濃度）、および０．１μｌのＴａｑポリメラーゼ（最終濃度０．０３３Ｕ）、ならびに１μｌのそれぞれのＤＮＡテンプレートまたはサンプル。以下のＰＣＲ増幅条件で反応を実施する：９５℃５分、その後９５℃３０秒、５２℃３０秒、７２℃３０秒を２０サイクル、その後４０℃３０秒伸長。使用の準備が整うまでＰＣＲ産物を４℃に保つ。

リアルタイム検出のために、ステップ２反応は、実施例３に記載のものと同じ手順を用いて行い、１μｌ ＤＮＡテンプレートインプットは、前のステップ１、２０サイクル増幅産物からのものであり、プライマーは、１μｌの１０μＭフォワードプライマー（配列番号１２、５’−ＧＣＴＣＴＴＣＧＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＹＧＧＡＴＹＧＴＧＴＧＴＡＴＴＴ−３’；１μＭ最終濃度）および１μｌの１０μＭリバースプライマー（配列番号２４、５’−ＡＡＣＲＴＴＣＡＣＲＡＴＡＡＴＣＴＣＣＡＴＡＣ−３’；１μＭ最終濃度）である。

実施例５：ＨＢＶに感染した患者の肝生検におけるｃｃｃＤＮＡの検出
ＨＣＣの肝組織生検は、ＨＢＶに感染した患者から取得され、これらのサンプルからの単離ＤＮＡは、亜硫酸水素塩処理を受けた。次いで、亜硫酸水素塩処理ＤＮＡを総ＨＢＶのためのＰＣＲによって分析し、２ステップＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ分析によって検査した（図９参照）。

図９は、ＨＢＶに感染した患者の組織サンプルから検出されたＨＢＶ ＤＮＡの量を示す。２ステップＢＳ−ｃｃｃＤＮＡ分析を使用してｃｃｃＤＮＡを検出し、個体におけるＨＢＶ ＤＮＡで変化したｃｃｃＤＮＡの量を示す。患者１および２については、ＨＢＶ ＤＮＡレベルは、ＨＢＶ分析の検出限界（反応あたり１００コピー）未満であったが、高感度ｃｃｃＤＮＡ分析は、低レベルのｃｃｃＤＮＡを検出することができた。

全ＨＢＶ ＤＮＡインプットは、１０^５コピー未満であり、ｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ含む）は、２ステップｃｃｃＤＮＡ分析によって検出すべきではないことを示した。したがって、この分析からの増幅は、ＨＢＶ感染肝組織サンプルにおける特異的なｃｃｃＤＮＡ検出の明らかな証拠である。

Claims (30)

1. 共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）および前記ｃｃｃＤＮＡと実質的に同じＤＮＡ配列であり、異なるフォームである非ｃｃｃＤＮＡ（ｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡ）を含むＤＮＡサンプル中の前記ｃｃｃＤＮＡを検出するまたは定量する方法であって、
   ｉ）前記ＤＮＡサンプルを処理して、処理されたＤＮＡサンプル中の二本鎖ＤＮＡ分子の相補的な特徴を破壊し、それによって前記二本鎖ＤＮＡ分子の２つのストランドのリアニールを防止すること；および
   ｉｉ）前記非ｃｃｃＤＮＡではなく前記ｃｃｃＤＮＡが増幅産物を生じることができるように、前記処理されたＤＮＡサンプルで増幅分析を実施することを含む、方法。
2. 工程ｉ）において、前記ＤＮＡサンプルを前記処理されたＤＮＡサンプル中の二本鎖ＤＮＡ分子の２つのストランドの配列を変更するように構成された化学試薬で処理し、それによって、前記２つのストランドの相補的な特徴を破壊する、請求項１に記載の方法。
3. 前記化学試薬が脱アミノ化反応を起こすことによって作用する、請求項２に記載の方法。
4. 前記脱アミノ化反応は、特定のヌクレオチドに対して選択的である、請求項３に記載の方法。
5. 工程ｉｉ）における増幅分析が前記ＤＮＡ配列上の２つの戦略的位置にそれぞれアニーリングするように構成され、同時に前記ｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡではなく前記ｃｃｃＤＮＡから増幅産物を生成することができるように構成された一対のプライマーを用いて実施される、請求項１に記載の方法。
6. 前記２つの戦略的位置がそれぞれ前記ｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡにおける不連続なストランドの既知の不連続領域の２つのサイドにある、請求項５に記載の方法。
7. 前記一対のプライマーが前記処理されたＤＮＡサンプル中の連続したストランドの前記２つの戦略的位置にそれぞれアニーリングして、それによって前記連続したストランドから増幅産物を生成するように構成される、請求項６に記載の方法。
8. 工程ｉｉ）における増幅分析が前記増幅産物に基づいて、前記ｃｃｃＤＮＡを定量するように構成されたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、請求項７に記載の方法。
9. 工程ｉｉ）における増幅分析が前記処理されたＤＮＡサンプルにおいて、不連続なストランドではなく連続したストランドにアニーリングするように構成され、前記ｃｃｃＤＮＡの定量を可能にするように構成されたプローブを用いてさらに行われる、請求項７に記載の方法。
10. 前記プローブが、５’末端および３’末端それぞれに、蛍光強度を測定することによって前記ｃｃｃＤＮＡの定量を可能にするように構成された蛍光色素および蛍光消光剤で標識されている、請求項９に記載の方法。
11. 前記ｃｃｃＤＮＡがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＤＮＡフォームを含む；および
    前記ｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡがＨＢＶの弛緩型環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）フォームを含む、請求項１に記載の方法。
12. 工程ｉ）の前に、生体サンプルからＤＮＡサンプルを得ることをさらに含み、前記生体サンプルが組織または体液である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記体液が血清、血漿、血液、尿、または唾液である、請求項１２に記載の方法。
14. 共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）および前記ｃｃｃＤＮＡと実質的に同じＤＮＡ配列であり、異なるフォームである非ｃｃｃＤＮＡ（ｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡ）を含むＤＮＡサンプル中の前記ｃｃｃＤＮＡを検出するまたは定量するためのキットであって、
    それにより処理されたＤＮＡサンプル中の二本鎖ＤＮＡ分子の相補的な特徴を破壊し、それによって前記二本鎖ＤＮＡ分子の２つのストランドのリアニールを防止するように構成された、化学試薬；および
    フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、前記ＤＮＡ配列上の２つの戦略的位置にそれぞれアニーリングするように構成され、同時に前記ｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡではなく前記ｃｃｃＤＮＡから増幅産物を生成することができるように構成された、一対のプライマー、を含む、キット。
15. 前記化学試薬が亜硝酸、亜硝酸ナトリウム、ニトロソアミン類、または亜硫酸水素ナトリウムの少なくとも一つを含む、請求項１４に記載のキット。
16. 前記２つの戦略的位置がそれぞれ前記ｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡにおける不連続なストランドの既知の不連続領域の２つのサイドにある；および
    前記一対のプライマーが前記処理されたＤＮＡサンプル中の連続したストランドの前記２つの戦略的位置にそれぞれアニーリングして、それによって前記連続したストランドから増幅産物を生成するように構成される、請求項１４に記載のキット。
17. さらにプローブを含み、
    前記プローブは、前記処理されたＤＮＡサンプルにおいて、不連続なストランドではなく連続したストランドにアニーリングするように構成され、前記ｃｃｃＤＮＡの定量を可能にするように構成される、請求項１６に記載のキット。
18. 前記プローブが５’末端および３’末端それぞれに、蛍光色素および蛍光消光剤で標識されている、請求項１７に記載のキット。
19. 前記蛍光色素が６−カルボキシフルオレセイン、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン）、ＨＥＸ（２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン）、またはＣｙ５（シアニン−５）の少なくとも１つを含む；および
    前記蛍光消光剤が６−カルボキシテトラメチル−ローダミン、ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）、ＢＢＱ（ブラックベリークエンチャー（ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ））、またはＢＨＱ３（ブラックホールクエンチャー３（ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ ３））の少なくとも１つを含む、請求項１８に記載のキット。
20. 前記ｃｃｃＤＮＡがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のｃｃｃＤＮＡフォームを含む；および
    前記ｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡがＨＢＶのｒｃＤＮＡフォームを含む、請求項１４に記載のキット。
21. 前記フォワードプライマーが配列番号１〜２１のいずれか１つに記載の配列を含む、請求項２０に記載のキット。
22. 前記リバースプライマーが配列番号２２〜２８のいずれか１つに記載の配列を含む、請求項２０に記載のキット。
23. 前記リバースプライマーが配列番号２４である、請求項２２に記載のキット。
24. 前記フォワードプライマーが配列番号１１、配列番号１２または配列番号１７である、請求項２３に記載のキット。
25. プローブをさらに含み、前記プローブが配列番号２９〜３１のいずれか１つに記載の配列を含む、請求項２０に記載のキット。
26. サンプルにおいて、ｃｃｃＤＮＡをｒｃＤＮＡと識別可能に検出する方法であって、（ａ）ヌクレオチドコンバーター（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）試薬で前記サンプルを処理すること；および（ｂ）ＰＣＲプロシージャによって前記ｃｃｃＤＮＡを検出すること、を有する方法。
27. 前記ヌクレオチドコンバーター試薬が脱アミノ化剤（ｄｅａｍｉｎａｔｏｒ）である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記ＰＣＲプロシージャが不連続領域に及ぶ一対のプライマーを使用する、請求項２６に記載の方法。
29. 前記一対のプライマーが前記不連続領域の２つのサイド上の２つの戦略的位置にそれぞれアニーリングするように構成され、同時にｎｏｎ−ｃｃｃＤＮＡではなく前記ｃｃｃＤＮＡから増幅産物を生成することができるように構成される、請求項２８に記載の方法。
30. 前記ＰＣＲプロシージャがプローブをさらに使用し、前記プローブが不連続なストランドではなく連続したストランドにアニーリングするように構成される、請求項２８に記載の方法。