CN108441578A

CN108441578A - 一种乙型肝炎病毒cccDNA的数字微滴PCR检测方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN108441578A
Application number: CN201710080657.7A
Authority: CN
Inventors: 张继明; 江培学; 毛日成
Original assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Current assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Priority date: 2017-02-15
Filing date: 2017-02-15
Publication date: 2018-08-24

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种检测乙型肝炎病毒共价闭合环状脱氧核糖核酸的方法以及试剂盒。本发明采用专用组织DNA提取试剂盒提取HBV DNA，并采用选择性荧光定量PCR技术对乙型肝炎病毒cccDNA进行检测，核酸提取后，采用PSAD酶处理，及采用数字微滴PCR方法扩增目的基因并直接定量，提高检测灵敏性和特异性，检测结果表明，能对HBVcccDNA进行准确定量分析，明显优于一般方法，具有特异性好，灵敏度高，定量准确，快速简便，重复性好的特点，本发明的方法及试剂盒可用于HBVcccDNA检测，也可作为临床实验室对HBV感染的辅助诊断方法和临床治疗效果的监测手段。

Description

一种乙型肝炎病毒cccDNA的数字微滴PCR检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及检测乙型肝炎病毒的方法及试剂盒，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒共价闭合环状脱氧核糖核酸(HBVcccDNA) 的方法以及试剂盒。

背景技术

现有技术公开了乙型肝炎病毒(HBV) 属于嗜肝DNA 病毒家族，其基因组是双链松弛环状DNA(relaxed circu2lar，rcDNA)，相对分子量为(116 ～210)×109 全长约为312kb。研究表明，在HBV的生活周期中，共价闭合环状DNA(covalently closed circularDNA，cccDNA)的形成是关键一步，其是HBV 的原始复制模板，对乙肝病毒的复制及感染状态的建立具有十分重要的意义。有研究显示，cccDNA 的半衰期约为33～70 天，只要肝细胞中还存在cccDNA，乙肝病毒的复制就不会停止，即使在药物的强烈抑制下，肝细胞中的cccDNA仍然在少量复制，因此停用药物后，常可见到患者病情的反复，因此，研究人员认为，只有清除细胞核内的cccDNA，才能彻底清除乙肝患者病毒携带状态。

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA) 的发现与检测方法的建立始于上世纪80 年代。最初采用DNA 电泳及Southern 杂交检测技术，发现慢性乙型肝炎患者肝组织内存在一种电泳带位置为2.0kb 左右的HBV DNA 分子，并在电镜下证实为大小约3.2kb 的超螺旋DNA 分子；20 世纪90 年代，PCR 技术开始应用于cccDNA 检测，Kock(Hepatology,1996) 等建立了选择性PCR cccDNA 检测技术；本世纪初，香港学者He(Biochem Biophys Res Commun 2002) 等建立了选择性数字微滴PCR 检测cccDNA 的技术，实现了真正意义上的定量检测。

目前cccDNA 检测技术面临的主要问题是特异性和敏感性，尚存在争议。有研究在研究过程中发现了一些引人注意的问题，如：通常国内外有关机构将实验室建立的技术用于临床标本的检测，但迄今为止，国内外尚无公认的、较稳定并得到CFDA正式批准的HBVcccDNA 检测试剂盒问世；采用相同或不同技术研究外周血单个核细胞内是否存在cccDNA，所得出结论截然相反；若干作者报告在慢性乙型肝炎的血清内检测到了高含量HBVcccDNA，个别报告甚至高达10⁷ 拷贝/ml ，结果的可信度值得探讨；越来越多的研究报告采用cccDNA 定量检测结果比较或评价抗病毒药物疗效，但是鲜有作者关注cccDNA 检测技术问题。

业内共识，建立HBV cccDNA 检测技术的难点在于体内有大量与cccDNA 序列同源性较高的其他形式的HBV DNA存在，包括：①成熟病毒颗粒中的松弛、环状、双链DNA(relaxed circular DNA，rcDNA) 分子；②在5％～ 10％的病毒颗粒中存在的双链线性DNA分子(double-strandlinear DNA，dsl-DNA) ；③由前基因组RNA(pregenomic RNA，pgRNA)逆转录形成的单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)。选择性荧光定量PCR 的设计原理是：由于rcDNA 的正链和负链上均存在缺口，故可以设计跨越两个缺口的引物，使rcDNA 不会被扩增，而cccDNA则可被选择性扩增，如模板为dsl-DNA 或ssDNA，由于两条引物的方向相反，也不会被扩增；嵌合引物法和侵入分析法区分rcDNA 和cccDNA 的主要依据是rcDNA的正链不完整，因而嵌合引物或初始探针不能与之互补结合；但是，dsl-DNA 分子用两种方法均可以被扩增，两种方法的检测低限为50 拷贝/ 反应，相当于模板浓度为5×10⁴拷贝/ml，由于dsl-DNA 占总病毒基因组载量的5％～ 10％，当病毒载量超过5×10 ⁴～ 1×10⁴拷贝/ml，可出现病毒基因组“非特异”扩增而出呈假阳性。

研究实践中，通常采用下述方式解决上述方法的缺陷：一，需要通过反复实验，确定每一种方法能有效区分cccDNA 和其他形式的HBV DNA 的“安全”范围；二，在“噪声”背景较高时，采取有效措施降低其他形式HBVDNA的含量，从而消除它们对cccDNA 检测的影响，根据cccDNA 本身的特殊性可以提高检测特异性，如，根据cccDNA 分布特点，cccDNA 仅位于细胞核内，而其他几种DNA 分子均位于细胞浆内，可采用细胞核分离技术，将细胞核分离出来进行cccDNA 检测；另外，其他三种DNA 均位于核衣壳蛋白中，且末端与P 蛋白共价结合，易于与十二烷基硫酸钠(SDS) 结合，加氯化钾后即形成沉淀，通过离心可加以分离；另外，cccDNA 不能被一些酶如绿豆核酸酶(mung bean nuclease，MBN) 等降解，而其他形式的DNA 可降解，等等。

基于现有技术的现状，本申请的发明人结合市场需求，拟提供一种乙型肝炎病毒cccDNA的数字微滴PCR 检测方法及其试剂盒。本发明采用专用组织DNA 提取试剂盒提取HBV DNA，同时采用选择性荧光定量PCR 技术对乙型肝炎病毒cccDNA 进行检测，在核酸提取结束后，采用PSAD 酶(Plasmid-Safe ATP-dependent DNase)处理，该操作可以提高检测cccDNA的灵敏性和特异性。

发明内容

本发明的目的在于为克服现有技术的缺陷，提供一种乙型肝炎病毒cccDNA的数字微滴PCR 检测方法及其试剂盒。具体涉及一种设计有高特异性的引物借助微滴数字PCR系统实时检测乙型肝炎病毒cccDNA 的方法；

本发明的另一目的在于提供一种用于上述方法的试剂盒。

本发明采用专用组织DNA 提取试剂盒提取HBV DNA，同时采用选择性荧光定量PCR技术对乙型肝炎病毒cccDNA 进行检测，在核酸提取结束后，采用PSAD 酶(Plasmid-SafeATP-dependent DNase)处理，该操作可以提高检测cccDNA的灵敏性和特异性。

本发明中，在对HBV 序列分析的基础上，设计跨越两个缺口的引物，使rcDNA 不被扩增，而cccDNA 则可被选择性扩增。

更具体的，本发明的一种乙型肝炎病毒cccDNA的数字微滴PCR 检测方法及其试剂盒包括：

在按下述方法设计的引物和探针存在下，用PSAD 酶预处理乙肝病毒DNA，实现对HBVcccDNA 特异性检测：

1、引物和探针的制备：

根据HBV 全序列，在HBV 基因组前C 编码区，设计并合成如下序列的引物：

PCR引物F ：5’-TCCCCGTCTGTGCCTTC-3’(nt1547-nt1565)

PCR引物R ：5’-CCCCAAAGCCACCCAA-3’(nt1902-nt1887)

2、制备包括以下成分的试剂盒：

一对特异性HBV引物、Taq酶、Plasmid-Safe ATP-dependent DNase 酶、乙型肝炎病毒cccDNA 阳性对照、阴性对照和PCR Buffer；

3、制备反应液：

反应液每份为26μl，每份反应液中含组分：5×PCR Buffer，0.2mmol/L dNTPs，

2.5mmol/LMgCl2，引物HBV-F 和HBV-R 各0.2μmol/L， DNA 聚合酶1U；

4、PSAD 酶处理HBV DNA ：在25μl 总反应体系中：依次加进1μl 25mM ATP，

2.5μl10 倍的Buffer，提取好的乙肝DNA 模板溶液12.5μl，和0.5μl 的质粒保护DNA酶，再用25μl。将反应体系置于37℃环境中温育30min，再70℃灭活30min；

5、定量检测：PSAD 酶处理的HBVcccDNA，浓度分别为108、107、106、105、104copies/ml的5 个标准品各4μl，各加入步骤(3) 制得的反应液26μl，分别放入各个反应管中进行处理，同时设空白管和阴性对照；各反应管进行扩增，将含待测样品反应管的扩增结果与其它反应管扩增结果比较，得出待测样品中HBVcccDNA 的含量。

本发明中，步骤（5）中的扩增是于伯乐微滴数字PCR仪中进行扩增：扩增时的温度条件依次为50℃下2 分钟、94℃预变性4 分钟、94℃下15 秒、60℃ 45 秒构成一个循环，共40 个循环。

本发明经对150 例阳性乙型肝炎临床样品进行检测，结果显示，其中检出HBVcccDNA 患者141 例，占总数的94％，并且能够对HBVcccDNA 进行准确定量分析，明显优于一般方法，本发明具有特异性好，灵敏度高，定量准确，快速简便，重复性好的特点，有宜于提高检测cccDNA的灵敏性和特异性，本发明的方法及试剂盒不仅可用于HBVcccDNA 的检测，也可作为临床实验室对HBV 感染的辅助诊断方法和临床治疗效果的监测手段，具有潜在的应用价值。

附图说明

图1-3分别显示了于伯乐数字PCR仪中进行扩增的扩增结果。

具体实施方式

实施例1 按下述步骤进行乙型肝炎病毒cccDNA数字微滴PCR 检测

1、组成乙型肝炎病毒cccDNA数字微滴PCR 诊断试剂盒：一对特异性引物PHBV、一条TaqMan 荧光探针FPHBV、Taq 酶、Plasmid-Safe ATP-dependent DNase 酶、乙型肝炎病毒cccDNA 阳性对照、阴性对照、乙型肝炎病毒cccDNA；

定量标准品和PCR Buffer；

2、根据HBV 全序列，在HBV 基因组前C 编码区，应用Beacon Designer2.1 软件，设计并合成如下序列的引物：

PCR引物F ：5’-TCCCCGTCTGTGCCTTC-3’(nt1547-nt1565)

PCR引物R ：5’-CCCCAAAGCCACCCAA-3’(nt1902-nt1887)

3、制备反应液：反应液每份为26μl，每份反应液中含下列组分：5×PCR Buffer，

0.2mmol/L dNTPs，2.5mmol/LMgCl2，引物HBV-S 和HBV-AS 各0.2μmol/L，探针HBV-P0.1μmol/L，DNA 聚合酶1U；

4、PSAD 酶处理HBVcccDNA ：在25μl 总反应体系中：依次加进1μl 25mMATP，2.5μl10倍的Buffer，提取的乙肝DNA 模板溶液12.5μl，和0.5μl 的质粒保护DNA 酶，再用25μl，将反应体系置于37℃环境中温育30min，再70℃灭活30min；

5、荧光定量检测：PSAD 酶处理的HBVcccDNA，浓度分别为108、107、106、105、104copies/ml 的5 个标准品各4μl，各加入步骤(3) 制得的反应液26μl，分别放入各个反应管中进行处理

，同时设空白管和阴性对照；各反应管进行扩增，将含待测样品反应管的扩增结果与其它反应管扩增结果比较，得出待测样品中HBVcccDNA 的含量；

其中的扩增是于伯乐数字PCR仪中进行扩增：扩增时的温度条件依次为50℃下2 分钟、94℃预变性10分钟、94℃下15 秒、60℃ 45 秒构成一个循环，共40 个循环；

附图1-3分别显示了扩增结果。

实施例2 临床检测

采用本发明方法对150 例阳性乙型肝炎临床样品进行检测，结果显示，其中检出HBVcccDNA 患者141 例，占总数的94％，并且能够对HBVcccDNA 进行准确定量分析，明显优于一般方法，具有特异性好，灵敏度高，定量准确，快速简便，重复性好的优点；尤其本发明中设计跨越两个缺口的引物，使rcDNA 不被扩增，而cccDNA 则可被选择性扩增，而且通过PSAD 酶对提取的样本DNA 进行处理，能有效降低非cccDNA 扩增，进一步提高检测的灵敏性和特异性。

本发明不仅可用于HBVcccDNA 的检测，也可作为临床实验室对HBV 感染的辅助诊断方法和临床治疗效果的监测手段，具有潜在的应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学附属华山医院

<120> 一种乙型肝炎病毒cccDNA的数字微滴PCR检测方法及其试剂盒

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3215

<212> DNA

<213> 乙肝病毒序列

<400> 1

ctccacaaca ttccaccaag ctctgctaga ccccagagtg aggggcctat acttccctgc 60

tggtggctcc agttccggaa cagtaaaccc tgttccgact actgcctcac ccatatcgtc 120

aatctcctcg aggactgggg accctgcacc gaacatggag aacacaacat caggattcct 180

aggacccctg ctcgggttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240

acagagtcta gacttgtggt ggacttctct caattttcta gggggagcac ccaagtgtcc 300

tggcctaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcttgtc ctccaatttg 360

tcctggctat cgctcgatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 420

atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480

acttccagga acaccaacta ccagcacagg accatgcaag acctgcacga gtcctgctca 540

aggaaactct acgtttccct cttgttgctg tacaaaacct tcggacggaa actgcatttg 600

tattcccatc ccatcatcct gggctttcgc aagattccta tgggagtggg cctcagtccg 660

tttctcctgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccat 720

tgtttggctt tcagttatat ggatgatgtg gtattggggg cgaagtctgt acaacatctt 780

gagtcccttt ttaccgctgt taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttgaaccct 840

cataaaacca aacgttgggg ctactccctt aacttcatgg gatatgtaat tggatgttgg 900

ggtactttac cgcaagaaca tattgtacta aaaatcaaga actgttttcg aaaactgcct 960

gtaaatagac ctattgattg gaaagtctgt cagagaattg tgggtctttt gggctttgct 1020

gcccctttta cacaatgtgg ctatcctgcc ttaatgcctt tatatgcatg tatccaatct 1080

aagcaggctt tcactttctc gccaacttac aaggcctttc tgcgtaaaca atatctgaac 1140

ctttaccccg ttgcccggca acggtccggt ctctgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200

actggctggg gcttggctat tggccatcgc cgcgtgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260

ccgatccata ctgcggaact cctagcagct tgttttgctc gcagccggtc tggagcgaaa 1320

cttctcggca ccgacaactc tgttgtcctc tctcggaaat acacctcctt tccatggctg 1380

ctagggtgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtctacgt cccgtcggcg 1440

ctgaatcccg cggacaaccc gtctcggggc cgtttgggac tctaccgtcc ccttcttcgc 1500

ctgccgttcc ggccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560

tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gaaaccaccg 1620

tgaacgccca ccaggtcttg cccaaggtct tatataagag gactcttgga ctctcagcga 1680

tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgttt gtttaaggac tgggaggagt 1740

tgggggagga gattaggtta aagatttatg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800

gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860

tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccgtataa 1920

agaatttgga gcttctgcgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat 1980

tcgagatctc ctcgacaccg cctcagctct gtatcgggag gccttagagt ctccagaaca 2040

ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg tgttggggtg agttgatgaa 2100

tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca tccagggaat tagtagtcag 2160

ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta ctgtggtttc acatttcctg 2220

tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga gtatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280

cactcctcct gcttacagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340

tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400

gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggga tctcaatgtt agtatccctt 2460

ggactcataa ggtgggaaac tttactgggc tttattcttc tactgtacct gtctttaatc 2520

ctgagtggca aactccctcc tttcctcaca ttcatttaca ggaggacatt attgatagat 2580

gtcaacaata tgtgggccct cttacagtca atgaaaaaag gagattaaaa ttaattatgc 2640

ctgctaggtt ctatcctaac cttaccaaat atttgccatt ggacaaaggc attaaaccat 2700

attatcctga acatgcagtt aatcattact tcaaaactag gcattattta catactctgt 2760

ggaaggcggg cattctatat aagagagaaa ctacacgcag tgcctcattt tgtgggtcac 2820

catattcttg ggaacaagag ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcgacgaggc 2880

atggggacga atctttctgt tcccaatccg ctgggattct ttcccgatca ccagttggac 2940

cctgcgttcg gagccaactc aaacaatcca gattgggact tcaaccccaa caaggatcat 3000

tggccagagg caaatcaggt aggagcggga gcattcgggc cagggttcac cccaccacac 3060

ggcggtcttt tggggtggag cccgcaggct cagggcgcac tgacaaccgt gccagtagca 3120

cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaagacagc ctactcccat ctctccacct 3180

ctaagagaca gtcatcctca ggccatgcag tggaa 3215

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> PCR引物F

<400> 2

tccccgtctg tgccttc 17

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> PCR引物R

<400> 3

ccccaaagcc acccaa 16

Claims

1.一种乙型肝炎病毒cccDNA的数字微滴PCR 检测方法，其特征在于，其包括：

1) 根据HBV 全序列，在HBV 基因组前C 编码区，设计并合成如下序列的引物和探针：

PCR引物F ：5’-TCCCCGTCTGTGCCTTC-3’(nt1547-nt1565)

PCR引物R ：5’-CCCCAAAGCCACCCAA-3’(nt1902-nt1887)

2) 组成乙型肝炎病毒cccDNA数字微滴PCR 诊断试剂盒；

3) 制备反应液；

4) PSAD 酶处理HBV DNA；

5) 定量检测待测样品中HBVcccDNA 的含量。

2.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤3）中，反应液每份为26μl，每份反应液中含组分：5×PCR Buffer，0.2mmol/L dNTPs，2.5mmol/LMgCl2，引物HBV-F和HBV-R 各0.2μmol/L， DNA 聚合酶1U。

3.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤4）中，在25μl 总反应体系中：依次加进1μl 25mM ATP，2.5μl10 倍的Buffer，提取的乙肝DNA 模板溶液12.5μl，和0.5μl 的质粒保护DNA 酶，再用25μl，将反应体系置于37℃环境中温育30min，70℃灭活30min。

4.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤5）中，定量检测待测样品中HBVcccDNA 的含量：PSAD 酶处理的HBVcccDNA，浓度分别为108、107、106、105、104copies/ml 的5 个标准品各4μl，各加入步骤(3) 制得的反应液26μl，分别放入各个反应管中进行处理，同时设空白管和阴性对照；各反应管进行扩增，将含待测样品反应管的扩增结果与其它反应管扩增结果比较，得出待测样品中HBVcccDNA 的含量。

5.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤5）中，所述的扩增是于伯乐微滴数字PCR仪中进行扩增：扩增时的温度条件依次为50℃下2 分钟、94℃预变性4 分钟、94℃下15 秒、60℃ 45 秒构成一个循环，共40 个循环。

6.一种乙型肝炎病毒cccDNA数字微滴PCR 检测试剂盒，其特征是：该试剂盒包括成分：如权利要求1所述的一对特异性HBV引物， Taq 酶，Plasmid-Safe ATP-dependent DNase酶，乙型肝炎病毒cccDNA阳性对照，和阴性对照和PCR Buffer。