CN101397592B - 用于乙型肝炎病毒共价闭合dna的检测用品及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明是用于乙型肝炎病毒共价闭合DNA的检测用品，包括跨越HBV基因组正负两链的两个缺口的特异性PCR引物、cccDNA提取液及处理液、定量标准品；所述特异性PCR引物是：针对乙型肝炎病毒基因组正链和负链缺口上游的特异性PCR引物HBV-ccc-F5′-CGGTCTGGGGCAAAGCTCAT-3′，5′-GCACAGCTTGGAGGCTTGA-3′；这对引物扩增片断长度为550个碱基。本发明检测用品为试剂盒，可检测出低于10²拷贝数/ml的cccDNA，有助于了解乙肝患者传染性，对临床HBV感染的诊断、治疗和疗效的观察及抗乙型肝炎病毒的药物筛选提供了一个参考指标。

Description

用于乙型肝炎病毒共价闭合DNA的检测用品及其应用

技术领域

本发明涉及用于乙型肝炎病毒共价闭合DNA(cccDNA)的检测用品及其应用。 

背景技术

乙肝病毒共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板。在乙肝病毒的复制过程中，病毒DNA进人宿主细胞核，在DNA聚合酶的作用下，其两条链的缺口均被补齐，形成超螺旋的共价、闭合、环状DNA分子(cccDNA)，这种共价闭合态的DNA分子对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具十分重要的意义。cccDNA不仅可以作为评价乙肝患者病情和传染性大小的指标，还可以作为评价抗乙肝病毒药物的新指标。最早用于cccDNA的检测多为Soutern blot定性检测，灵敏度低、操作繁琐、试剂成本高还仅限于科学研究领域，使其应用价值受到很大限制。近年来，有较多的文献报道用PCR技术对cccDNA进行检测，但是，由于PCR技术灵敏度高，rcDNA和cccDNA的序列具有高度同源性，因此在应用PCR技术检测cccDNA时，需要确保只能扩增cccDNA，而rcDNA不被扩增。由于已有的检测cccDNA的技术的上述不足，目前尚未有检测cccDNA的稳定、可靠、敏感的生物用品。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种用于乙型肝炎病毒共价闭合DNA的检测用品，可用于乙肝患者血清及组织中ccc DNA进行检测。 

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案： 

本发明提供的用于乙型肝炎病毒cccDNA的检测用品，包括跨越HBV基因组正负两链的两个缺口的特异性PCR引物、cccDNA提取液、cccDNA处理液和定量标准品。所述特异性PCR引物是：针对乙型肝炎病毒基因组正链缺口上游的特异性PCR引物HBV-ccc-F为5′-CGGTCTGGGGCAAAGCTCAT-3′，其核酸序列长度为20个碱基，与负链互补；针对乙型肝炎病毒基因组负链缺口下游的特异性PCR引物HBV-ccc-R为5′-GCACAGCTTGGAGGCTTGA-3′其核酸序列长度为19个碱基，与正链互补；这对引物扩增片断长度为550个碱基。 

上述引物的设计原理为：经过对Genbank中已有的乙肝病毒基因组序列进行序列比对之后，确定序列保守区域，然后用Primer Express 2.0软件在这些保守区域中确定即可。 

所述cccDNA提取液可以是0.5mol/L KOH；或者是1mol/L Tris-HCl，pH值为6.76。 

所述定量标准品可以是含有乙肝基因组中跨越双缺口区域的质粒HBV 56-1886。 

所述特异性PCR引物，在其扩增过程中，使用Eva green荧光染料检测时所具有的灵敏度为10²拷贝数/ml的cccDNA。 

本发明提供的检测用品是基于荧光定量PCR技术的检测乙型肝炎病毒HBV cccDNA的试剂盒。 

本发明根据rcDNA和cccDNA结构上的差异，设计跨越两个缺口的引物，使rcDNA不被扩增，为了进一步避免由于模板量过高造成的扩增，对从血清中提取的cccDNA样品用Plasmid-Safe ATP-depended Dnase处理，该酶可作用于单链，双链有缺口的DNA，而对于完整的共价闭合的DNA没有作用，经过处理后的样品中rcDNA含量少，减少了引物的非特异性配对。本发明的荧光定量PCR检测中这对特异性的引物，是利用荧光染料Eva green可与DNA双链结合的特性，在PCR反应过程中对HBV ccc DNA进行实时定量检测，特异性强，灵敏度高。 

附图说明

图1是重组质粒经EcoR I单酶切和PCR后，经0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测到约1.8Kb片段的示意图。 

图2是本发明的一对针对跨越乙肝病毒基因组双缺口的特异性PCR引物经PCR反应后扩增出的片断，经0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测到约550bp片段的示意图。 

图3是用EvaGreen荧光染料和本发明的一对针对跨越乙肝病毒基因组双缺口的特异性PCR引物进行荧光定量PCR检测时的融解曲线。 

图4是用EvaGreen荧光染料和本发明的一对针对跨越乙肝病毒基因组双缺口的特异性PCR引物进行荧光定量PCR检测的标准曲线。 

具体实施方式

本发明利用荧光染料EvaGreen结合双链DNA的特性，建立了新的HBV cccDNA荧光定量PCR检测系统，该系统根据rcDNA和cccDNA结构上的差异，设计跨越两个缺口的引物，使rcDNA不被扩增，为了进一步避免由于模板量过高造成的扩增，对从血清中提取的cccDNA样品用Plasmid-Safe ATP-depended Dnase处理，该酶可作用于单链，双链有缺口的DNA，而对于完整的共价闭合的DNA没有作用，经过处理后的样品中rcDNA含量少，减少了引物的非特异性配对。由此提供了本发明的检测用品。 

本发明提供的检测用品是一种基于荧光定量PCR技术的检测乙型肝炎病毒HBVcccDNA的试剂盒。 

下面结合实施实例及附图对本发明作进一步说明。 

一.用荧光定量检测乙型肝炎病毒的引物 

1.所述引物的种类： 

(1)针对乙型肝炎病毒基因组正链缺口上游的特异性PCR引物HBV-ccc-F： 

5′-CGGTCTGGGGCAAAGCTCAT-3′，其核酸序列长度为20个碱基，与负链互补。 

(2)针对乙型肝炎病毒基因组负链缺口下游的特异性PCR引物HBV-ccc-R： 

5′—GCACAGCTTGGAGGCTTGA—3′，其核酸序列长度为19个碱基，与正链互补； 上述两种引物扩增片断长度为550个碱基。 

2.相关试剂： 

质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自武汉博大泰克公司；Taq DNA聚合酶、dNTP及10xbuffer购自Biostar公司；20xEvaGreen购自Biotium公司；乙肝病毒ELISA检测试剂盒和乙肝病毒荧光定量试剂盒分别由上海科华公司和深圳匹基公司提供，实验操作和判断结果严格按厂家提供的说明书进行。 

3.所用仪器： 

荧光定量PCR扩增仪型号CFD—3200，采用option监控软件，冷冻离心机，恒温水浴锅，振荡器等。 

4.标准品的制备及检测方法： 

标准品的克隆：用高保真KOD酶扩增目的PCR产物，经胶回收试剂盒回收，用TaqDNA聚合酶与pGEM-T Easy载体经T4 DNA连接酶连接，电转入大肠杆菌DH5α，在含X-gal，IPTG，氨苄青霉素的LB平板上挑选白斑，接入液体LB培养基过夜培养后用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，经EcoR I酶切电泳，PCR鉴定和DNA测序证实目的DNA片段后确定为阳性质粒。 

5.血清中HBV cccDNA的提取和处理：取50ul的血清，加入25ul的提取液1，100℃煮沸加热10分钟后，加入25ulDNA处理液，振荡混匀后12000rpm离心15分钟，将上清转移至另一干净管内，加入10U的Plasmid-Safe ATP-depended Dnase及反应缓冲液5μl，于37℃反应2小时后，70℃灭活15分钟。 

荧光定量PCR反应条件的探讨：对PCR反应参数及引物和探针、染料浓度进行探讨，以期找到曲线形状好、无非特异性扩增、检测灵敏度高、重复性好的最佳反应条件。 

定量标准曲线的建立：将鉴定好的阳性质粒测定吸光值，计算拷贝数/ml，方法为拷贝数＝(质量÷分子量)×6.0×10²³，然后进行10倍倍比稀释成10⁷—10¹拷贝数/ml浓度梯度，在最佳反应条件下上定量PCR仪扩增，反应结束后仪器会自动绘制标准曲线。 

灵敏度检测：选择2份检测结果为cccDNA阳性的已知样本，按5倍倍比稀释并检测，确定灵敏度。 

重复性实验：选6份不同含量的样本，每份样本从提取开始重复3次，计算各个检测方法的重复性。 

质量控制：为增加数据的可信度，每次实验均设置空白对照管，已知样本量靶序列的阳性对照管及阴性对照管。 

结果处理：调整基线以试剂空白和阴性管不出现阳性为准，与基线的交点的循环次数(Ct)值为横坐标，HBV cccDNA浓度的对数值为纵坐标，制作标准曲线，利用待测标本的Ct值求出相应的HBV cccDNA含量。 

数据分析：定量结果对数值计算HBV cccDNA平均拷贝数(均数±标准差)，阴性结果不参与平均值计算。采用几何均数t检验分析差异的显著性，以P<0.05差异具有显著意义， P<0.01差异具有高度显著意义。 

5.检测原理 

EvaGreen荧光定量PCR原理：EvaGreen是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；当它从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱，引物二聚体的荧光信号可以通过熔解曲线来消除。因此，荧光信号强度与不断生成的产物成正比。 

6.检测结果 

重组质粒的鉴定：重组质粒经EcoR I单酶切和PCR后，经0.7％的琼脂糖凝胶电泳得到约1.8Kb的片断(图1)，测序结果也显示插入片断与预期序列完全一致。图1中：①重组质粒用EcoR I单酶切鉴定。②DNA maker③2000DNA maker。④重组质粒PCR鉴定。⑤乙肝病毒基因组PCR扩增产物。⑥阴性对照。 

EvaGreen荧光定量PCR体系：最佳反应体系为50ul，0.40uM引物HBV-ccc-F，0.40uM引物HBV-ccc-R，2μl 20xEvaGreen，dNTP、PCR反应缓冲液和taq聚合酶按说明书的量添加入反应体系。扩增条件均为94℃，2min；94℃15sec，58℃30sec，72℃30sec，89℃3sec、读板，38个循环；16℃5sec；熔解曲线绘制从55℃到94℃之间，每隔0.2℃读板一次，每次持续2sec。荧光信号收集设在87℃，因产物的熔解度约为90℃。 

PCR特异性产物的产生：利用HBV-ccc-F和HBV-ccc-R分别做为正反向引物，按定量体系所述的程序进行PCR，取10ul PCR产物点样于0.7％的琼脂糖凝胶并电泳检测后，得到550bp大小的条带，与预测的片断大小相符(图2)。 

定量体系的融解曲线绘制：取PCR产物10μl于荧光定量PCR管中加入0.2μl20xEva Green用型号为CFD-3200的荧光定量PCR扩增仪绘制55℃到94℃之间融解曲线，结果显示出90℃的特异性峰(图3)。 

定量标准曲线的建立：图4所示的荧光定量PCR体系的标准曲线，起始模板分别在10⁹-10¹、10⁹-10²拷贝数/ml时线性较好，相关系数分别为0.997。 

7.方法学评价： 

(1)灵敏度分析：见表1，不难看出，该检测体系的灵敏度较高，反应体的cccDNA的拷贝数低到10¹时该体系也可以检测到荧光值扩增。 

(2)重复性分析：据3次结果计算出均数、标准差S及变异系数CV(见表2)，六个样本的平均变异系数范围在1.62％和0.33％之间。 

(3)临床样本检测： 

共检测血清标本29例，结果见表3：大三阳sAg(+)eAg(+)cAb(+)，6例；小三阳sAg(+)eAb(+)cAb(+)，10例；急性感染sAg(+)eAb(+)cAbIgM(+)cAbIgG(+)，3例；其他非典型sAg(+)cAb(+)，5例；被动免疫的健康血清sAb(+)，5例。 

从表3可以看出在六例大三阳患者的血清中有五例检测到了cccDNA，而其他小三阳等样本中没有检测到ccc DNA，所得的结果和有关研究报道的相似。 

8.结论 

cccDNA主要存在于感染宿主的细胞核中，肝组织cccDNA监测被认为是评价抗HBV疗效和临床治愈的金标准，但这种方法取材困难，临床上受到了极大限制，如何能从血清中简单快速的检测到cccDNA是许多专家学者研究和开发的目标，遗憾的是血液中的cccDNA水平远远低于肝脏中的cccDNA水平，也远远低于HBV rcDNA的水平，一般方法难以检测到。近几年随着PCR和荧光定量PCR技术的出现，也出现了一些用于定量研究cccDNA的方法，但这些方法要么操作过程复杂，要么灵敏度达不到，要么成本价格较高，适用于临床检测存在局限，我们根据HBV复制的特点，依据HBV DNA正负链都存在缺口或缺刻，而cccDNA两个缺口或缺刻都已补平的特点，设计一对跨越双缺口的引物，由于cccDNA的结构完整性，这对PCR引物能合成新的子链，而松弛环状的HBV DNA由于存在缺口不能得到扩增产物，同时在提取cccDNA时增加一步酶处理过程，由于该酶不能作用于cccDNA，而降解HBV DNA及整合的线状基因组DNA，进一步保证了由于样本中HBV DNA起始模板过高而引起的非特异性扩增的干扰。 

对于感染者的血清中存在的cccDNA进行监测具有重要的理论和现实意义，特别是对于监测患者病情、评价抗病毒疗效以及指导用药方面具有重要意义。本文建立了一种检测血清中HBV cccDNA的荧光定量PCR方法，并通过对一些血清样本进行检测，充分证明了其检测的可信度。同时，使用重组HBV质粒作为定量标准品具有稳定性好、重复性好和扩增效率高等优点。 

本发明建立的荧光定量PCR技术具有线性范围宽(10⁹—10²拷贝数/ml)、相关性好(相关系数为0.997)、重复性好(平均变异系数分别为2.57％)、特别是灵敏度高(10²拷贝数/ml)。更有利于诊断及了解乙肝患者传染性，和对临床HBV感染的诊断，治疗方案的选择及疗效的观察，也可以作为药物筛选的重要的评价指标。 

二.用荧光定量方法检测乙型肝炎病毒的试剂盒 

1.试剂盒的成份： 

在所述试剂盒内，设有上述的用于荧光定量检测乙型肝炎病毒的引物HBV-ccc-F、HBV-ccc-R，cccDNA提取液，cccDNA处理液及定量标准品。 

引物HBV-ccc-F：5′—CGGTCTGGGGCAAAGCTCAT—3′，其核酸序列长度为20个碱基，位于正链缺口上游，与负链互补。 

引物HBV-ccc-R：5′—GCACAGCTTGGAGGCTTGA—3′，其核酸序列长度为19个碱基，位于负链缺口下游，与正链互补。 

上述引物扩增片断长度为550个碱基。 

所述定量标准品为含有乙肝基因组中跨越双缺口区域的质粒(HBV56—1886)。 

所述cccDNA提取液为0.5mol/L KOH 

所述cccDNA处理液为1mol/L Tris-HCl(pH6.76)

2.乙型肝炎病毒cccDNA检测试剂盒的制备： 

可采用或参考现有的其它乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒的方法进行制备和使用，可检测出低于10²拷贝数/ml的cccDNA。这有助于对乙肝患者特别是大三阳病人进行HBV cccDNA测定，及时了解乙肝患者传染性及病情，为治疗提供方案选择及疗效的观察。 

3.乙型肝炎病毒cccDNA检测试剂盒的使用： 

试剂盒使用的简要步骤包括：1).乙型肝炎病毒cccDNA核酸的提取；2).用实例中所描述的荧光定量PCR体系进行扩增，荧光定量检测的结果用荧光定量PCR仪直接读出。 

三.附表： 

表1：灵敏度分析 

稀释度	样本1	样本2
			1∶1	84421.26	7566.236
1∶5	13701.2	1571.263
			1∶25	2868.42	504.8459
1∶125	1213.32	143.6739
			1∶625	414.2416	61.8835
1∶3125	177.7347	None
			1∶15625	83.85895	None
1∶78125	None	None

表2：重复性分析 

表3：部分血清HBV ccc DNA检测结果(N/A为在该条件下未检测到) 

序列表 

<110>中国科学院武汉病毒研究所 

<120>用于乙型肝炎病毒共价闭合DNA的检测用品及其应用 

<140> 

<141> 

<160>1 

<170> 

<210>1 

<211>20 

<212>DNA 

<213>特异性PCR引物HBV-ccc-F 

<220> 

<221> 

<222> 

<223> 

<400>1 

5′-CGGTCTGGGGCAAAGCTCAT-3′ 

<210>2 

<211>19 

<212>DNA 

<213>特异性PCR引物HBV-ccc-R 

<220> 

<221> 

<222> 

<223> 

<400>2 

5′-GCACAGCTTGGAGGCTTGA-3′ 

Claims (6)

1.用于乙型肝炎病毒共价闭合DNA的检测用品，包括跨越HBV基因组正负两链的两个缺口的特异性PCR引物、cccDNA提取液、cccDNA处理液和定量标准品，其特征是所述特异性PCR引物是：

针对乙型肝炎病毒基因组正链缺口上游的特异性PCR引物HBV-ccc-F为：

5′-CGGTCTGGGGCAAAGCTCAT-3′，其核酸序列长度为20个碱基，与负链互补；

针对乙型肝炎病毒基因组负链缺口下游的特异性PCR引物HBV-ccc-R为：

5′-GCACAGCTTGGAGGCTTGA-3′，其核酸序列长度为19个碱基，与正链互补；

这对引物扩增片断长度为550个碱基。

2.根据权利要求1所述的检测用品，其特征在于所述cccDNA提取液为0.5mol/LKOH。

3.根据权利要求1所述的检测用品，其特征在于所述cccDNA处理液为1mol/LTris-HCl，pH值为6.76。

4.根据权利要求1所述的检测用品，其特征在于所述定量标准品为含有乙肝基因组中跨越双缺口区域的质粒HBV 56-1886。

5.根据权利要求1所述的检测用品，其特征在于所述特异性PCR引物，在其扩增过程中，使用Eva green荧光染料检测时所具有的灵敏度为10²拷贝数/ml的cccDNA。

6.根据权利要求1所述的检测用品，其特征在于所述检测用品是基于荧光定量PCR技术的检测乙型肝炎病毒HBV cccDNA的试剂盒。

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