CN103555859B - 一种检测甘蔗条纹花叶病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒 - Google Patents
一种检测甘蔗条纹花叶病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种检测甘蔗条纹花叶病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，包括：（1）阳性标准品；（2）阴性对照；（3）RT-PCR反应液；（4）反应酶混合液；（5）探针溶液；（6）无RNase水。本试剂盒对甘蔗条纹花叶病毒的检测有高度的特异性，与其他植物病毒无交叉反应；检测的灵敏度达102拷贝，可直接用于甘蔗植株、脱毒种苗等样本的定量检测甘蔗条纹花叶病毒；利用本发明试剂盒检测快速简单，准确性好，灵敏度高，检测结果可靠稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测植物病毒的试剂盒，具体涉及一种检测甘蔗条纹花叶病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，属于植物病毒检测技术领域。
背景技术
甘蔗条纹花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus, SCSMV）属于马铃薯Y病毒科Poacevirus属，是引起甘蔗花叶病的病原物之一。感病植株一般出现黄绿相间不规则的花纹、条斑或斑驳，长短、大小不一，布满整个叶片，尤以新叶基部症状最为明显。感病植株叶片黄化，植株矮化，分蘖减少，节间缩短，造成甘蔗产量及蔗茎含糖量降低。SCSMV主要通过植株无性繁殖材料长距离传播的，传播虫媒尚未确定。该病毒有着广泛的寄主范围，可以侵染玉米、高粱、狼尾草等植物。目前该病毒主要分布于印度、巴基斯坦、泰国、缅甸、越南、孟加拉、斯里卡兰、印尼等亚洲国家。在我国的广东、云南、海南甘蔗种质资源圃有检测到SCSMV，生产蔗区种植的甘蔗尚未发现。
为防止国外SCSMV株系随着蔗茎种苗引种入境以及在国内进一步扩散传播，为我国甘蔗脱毒种苗质量安全提供技术支撑，必需具有一种快速、可靠、灵敏的检测试剂盒及检测方法。国内外有关SCSMV检测技术主要利用血清学反应和常规的RT-PCR技术。血清学反应方法具有操作简单、高通量的优点，但需要制备高质量的血清和灵敏度不高等缺点，在实际中很难应用。常规的RT-PCR方法需要进行PCR后处理，接触溴化乙锭（EB）等有毒试剂，且只能终点定性检测，无法对病毒滴度进行准确定量。随着分子检测技术的发展，实时荧光定量RT-PCR以其高灵敏度、高特异性和高准确度等优点，被广泛应用于植物病害的检测。与常规PCR相比，它具有特异性更强、检测周期更短、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。有关检测甘蔗条纹花叶病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒及其方法未见报道。
本发明选择甘蔗条纹花叶病毒外壳蛋白（CP）基因保守区序列，设计用于荧光定量RT-PCR检测的引物及探针，通过对反应体系的优化，设计用于检测甘蔗条纹花叶病毒的荧光RT-PCR试剂盒。
发明内容
本发明目的是提供一种检测甘蔗条纹花叶病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，该试剂盒能快速准确的对待测样品的甘蔗条纹花叶病毒进行定量检测。该试剂盒不仅可使用于目前市场上的所有类型荧光定量PCR仪，而且能够灵敏、特异的对甘蔗条纹花叶病毒进行定量检测。
为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
本发明采用Taqman探针建立荧光定量RT-PCR检测甘蔗条纹花叶病毒试剂盒，通过制备RNA标准样品与待测样品同时检测得到待测样品的初始病毒拷贝数，对病毒进行定量检测。
本发明提供了一种利用荧光定量RT-PCR方法检测甘蔗条纹花叶病毒的引物对QPCR-F1、QPCR-R1和Taqman探针QPCR-P1，所述的引物对序列如下：
QPCR-F1：5’-CGGGAAACCCATAATACCAC-3’，
QPCR-R1：5’-GTCGATTTCTGCTGGTGAGA-3’；
Taqman探针QPCR-P1的序列如下：
5’-FAM-CACCATCACGAAATCAATGCAGCA-TAMRA-3’。
本发明还提供一种检测甘蔗条纹花叶病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒由下列试剂组成：
（1）阳性标准品：采用T7 RNA聚合酶体外转录合成含有目的检测基因的RNA作为标准样品，1×1010拷贝/μL，50 μL/瓶，-20℃冷冻保存；
（2）阴性对照：采用无甘蔗条纹花叶病毒感染的甘蔗叶片组织，提取叶片总RNA为阴性对照，100 ng/μL，50 μL/瓶，-20 ℃冷冻保存备用；
（3）RT-PCR反应液：每个反应包括2×RT-PCR缓冲液10 μL、10 mmol dNTPs 0.4 μL、25 mmol MgCl2 1.6 μL以及浓度为10 μmol/L的引物对 QPCR-F1和QPCR-R1各0.4 μL，共12.8 μL，50个反应体系共计640 μL，-20 ℃保存备用；
（4）反应酶混合液：每个反应体系包括AMV逆转录酶液 0.4 μL、Taq酶0.4 μL，含量为5 U/μL，共0.8 μL，50个反应体系共计40 μL，-20℃保存备用；
（5）探针溶液：Taqman探针QPCR-P1采用5’-FAM和3’-TAMRA修饰，合成后采用无RNase水稀释，浓度为10 μmol/L，每个反应体系0.8 μL，50个反应体系共计40 μL，-20℃保存备用；
（6）无RNase水：2×10mL/瓶。
本发明的优点和有益效果主要体现在：本试剂盒对甘蔗条纹花叶病毒的检测有高度的特异性，与其他甘蔗病毒无交叉反应；检测的灵敏度达102拷贝，可以在甘蔗田间样品和脱毒种苗等样本中检测甘蔗条纹花叶病毒；利用本发明试剂盒检测操作简单快速，从样品病毒核酸提取至完成检测，耗时不超过3小时。
附图说明
图1是甘蔗条纹花叶病毒RNA标准品荧光定量RT-PCR的动力学曲线。图中横坐标代表荧光定量RT-PCR扩增循环数，纵坐标代表荧光信号强度，扩增曲线分别是RNA标准品1×109拷贝/μL、1×108拷贝/μL、1×107拷贝/μL、1×106拷贝/μL、1×105拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×103拷贝/μL和1×102拷贝/μL。
图2是甘蔗条纹花叶病毒RNA标准品荧光定量RT-PCR的标准曲线。横坐标x代表标准品拷贝数的对数值，纵坐标y代表RT-PCR扩增循环数；y= -3.243x+42.12；R代表相关系数，决定系数R2=0.997。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
实施例1 一种检测甘蔗条纹花叶病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，包括Taqman探针QPCR-P1和引物对QPCR-F1、QPCR-R1，其中Taqman探针QPCR-P1序列为5’- CACCATCACGAAATCAATGCAGCA -3’，探针的5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和TAMRA进行修饰；引物对QPCR-F1和QPCR-R1序列为5’-CGGGAAACCCATAATACCAC-3’和5’-GTCGATTTCTGCTGGTGAGA-3’；该试剂盒包括下列试剂：
（1）阳性标准品：利用常规RT-PCR扩增方法扩增获得甘蔗条纹花叶病毒CP完整基因，PCR产物纯化克隆到pGEM-T载体，然后用EcoRI酶切线性化重组质粒，采用T7 RNA聚合酶体外转录合成含有CP基因的RNA，用DNase I酶消化剩余的DNA，然后将转录RNA产物纯化，得到甘蔗条纹花叶病毒的RNA作为标准样品。用核酸蛋白分析仪测定体外转录产物的含量为100 ng/μL，转录产物大小为913 bp，根据公式计算RNA标准样品的拷贝数为1.94×1011拷贝/μL，并稀释成标准样品1×1010拷贝/μL，50 μL/瓶，-20 ℃冷冻保存。
（2）阴性对照：采用无甘蔗条纹花叶病毒感染的甘蔗叶片组织，提取叶片总RNA为阴性对照，用核酸蛋白分析仪测定提取的总RNA浓度，并稀释成浓度为100 ng/μL作为阴性样品，50 μL/瓶，-20 ℃冷冻保存备用。
（3）RT-PCR反应液：每个反应包括2×RT-PCR缓冲液10 μL、10 mmol dNTPs 0.4 μL、25 mmol MgCl2 1.6 μL，以及浓度为10 μmol/L的引物对 QPCR-F1和QPCR-R1各0.4 μL，共12.8 μL，50个反应体系共计640 μL，-20 ℃保存备用。
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（5）探针溶液：Taqman探针QPCR-P1采用5’-FAM和3’-TAMRA修饰，合成后采用无RNase水稀释，浓度为10 μmol/L，每个反应体系0.8 μL，50个反应体系共计40 μL， -20 ℃保存备用。
（6）无RNase水：2×10 mL/瓶。
实施例2 甘蔗条纹花叶病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒检测应用
1）标准品RNA稀释：将甘蔗条纹花叶病毒RNA标准品用无RNase水按10倍稀释成1×109~1×102拷贝/μL的一系列RNA标准品。
2）标准曲线方程建立
以此稀释后RNA标准品为模板，每个标准样品处理重复3次。并以无甘蔗条纹花叶病毒感染的甘蔗叶片总RNA为阴性对照，以无RNase水为空白对照。按上述试剂盒内组分，荧光定量RT-PCR反应总体系为20 μL，包括RT-PCR反应液12.8 μL，反应酶混合液0.8 μL，探针溶液0.8 μL，标准样品RNA 1.0 μL，无RNases水补至20 μL；然后放于ABI公司7500定量PCR仪进行荧光定量RT-PCR扩增。扩扩增程序为：第一阶段为RNA样品反转录反应：42 ℃ 5 min反转录，95 ℃ 10 s终止反转录；第二阶段为PCR反应：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环，在60 ℃进行单点荧光检测。获得如图1所示的扩增曲线，然后绘制如图2所示的标准曲线，构建标准曲线方程。本实施例构建的标准曲线方程为Y=-3.2436X+42.127，决定系数R2为0.9976，扩增效率为103.37%，满足荧光定量RT-PCR正常的标准曲线要求。检测灵敏度可102 拷贝/μL。将荧光定量RT-PCR方法获得产物用常规电泳检测，只能检测到104 拷贝/μL，比常规的RT-PCR检测灵敏度至少高100倍。
3）待测样品RNA提取：采用 试剂盒提取几份待测甘蔗叶片RNA，在核酸蛋白分析仪上测定RNA的光吸收值，计算提取的RNA浓度，然后统一稀释成100 ng/μL。
4）荧光定量RT-PCR扩增：以待测样品的RNA为模板，荧光定量RT-PCR反应总体系和扩增程序同上述标准曲线方程建立。在ABI公司7500定量PCR仪进行荧光定量RT-PCR扩增，获得待测样品的甘蔗条纹花叶病毒标准品荧光定量RT-PCR的动力学曲线。将待测样品的Ct值代入标准曲线方程转化成初始病毒分子拷贝数，即一个分子拷贝数代表一个甘蔗条纹花叶病毒，从而定量分析甘蔗样品中感染甘蔗条纹花叶病毒的数量，结果如表1所示。检测结果表明，具有花叶病症状的福农39号、云蔗07-2384、新台糖22、云蔗05-49这4个田间样品证实感染了甘蔗条纹花叶病毒，病毒含量达104~107拷贝/μL。为了进一步证实感染的病毒是甘蔗条纹花叶病毒，我们将荧光定量RT-PCR产物进行克隆和测序，核苷酸序列提交http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/比对，结果证实是甘蔗条纹花叶病毒，属于马铃薯Y病毒科禾本科属（Poacevirus）。本发明建立的检测甘蔗条纹花叶病毒荧光定量RT-PCR方法具有很好的重复性，同一样品的Ct值变异系数小于2 %。
利用本发明的Taqman探针荧光定量一步法RT-PCR试剂盒进行检测时，可以准确快速的得到样品的甘蔗条纹花叶病毒初始拷贝数，可以应用于甘蔗田间样品检测、脱毒种苗质量监控和甘蔗抗性鉴定。
表1 待测样品Ct值及稳定性
<110> 福建农林大学
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<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgggaaaccc ataataccac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcgatttct gctggtgaga 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caccatcacg aaatcaatgc agca 24
Claims (2)
1.一种检测甘蔗条纹花叶病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，包括Taqman探针QPCR-P1和引物对QPCR-F1、QPCR-R1，其中Taqman探针QPCR-P1序列为5’-CACCATCACGAAATCAATGCAGCA-3’，探针的5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和TAMRA进行修饰；引物对QPCR-F1和QPCR-R1序列为5’-CGGGAAACCCATAATACCAC-3’和5’-GTCGATTTCTGCTGGTGAGA-3’。
2.一种如权利要求1所述的检测甘蔗条纹花叶病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒由下列试剂组成：
（1）阳性标准品：采用T7 RNA聚合酶体外转录合成含有目的检测基因的RNA作为标准样品，1×1010拷贝/μL，50μL/瓶，-20℃冷冻保存；
（2）阴性对照：采用无甘蔗条纹花叶病毒感染的甘蔗叶片组织，提取叶片总RNA为阴性对照，100 ng/μL，50μL/瓶，-20 ℃冷冻保存备用；
（3）RT-PCR反应液：每个反应包括2×RT-PCR缓冲液10μL、10 mmol dNTPs 0.4μL、25 mmol MgCl2 1.6μL，以及10μmol/L的 QPCR-F1和QPCR-R1各0.4μL，共12.8μL，50个反应体系共计640μL，-20 ℃保存备用；
（4）反应酶混合液：每个反应体系包括AMV逆转录酶液 0.4μL、Taq酶0.4μL，含量为5 U/μL，共0.8μL，50个反应体系共计40μL，-20 ℃保存备用；
（5）探针溶液： Taqman探针QPCR-P1，采用5’-FAM和3’-TAMRA修饰，合成后采用无RNase水稀释，浓度为10μmol/L，每个反应体系0.8μL，50个反应体系共计40μL，-20℃保存备用；
（6）无RNase水：2×10 mL/瓶。
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