CN104109721B - 一种同时检测rna病毒、dna病毒、支原体和衣原体的方法 - Google Patents

一种同时检测rna病毒、dna病毒、支原体和衣原体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术应用领域，公开了一种在同一台实时荧光定量PCR仪上同时检测RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体的上机反应程序，通过与相应的RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体在不同的荧光定量PCR仪器上、以不同的反应程序进行检测相比较，具有较高的特异性、稳定性以及统一性。

Description

一种同时检测RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体的方法
技术领域
本发明涉及生物技术应用领域，尤其是用于常见的RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体的同时检测与鉴定。
背景技术
目前，国内外新兴的检测病原微生物的方法是实时荧光定量PCR技术(Real-timefluorescent quantitative PCR)，这是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，该技术不仅实现了对模板的定性和定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具有实时性和准确性等特点。因而，在呼吸道病原体检测中具有巨大应用优势。
但目前对于RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体的检测都是分别进行，由于基因组的特性、长度以及复杂度不同，不易于同时在同一个PCR仪上同时检测，假阳性高，不稳定，效率低。
本专利成功建立的在同一台荧光定量PCR仪上、同时检测RNA病毒(以甲型H1N1流感病毒为例、简写H1)、DNA病毒(以人腺病毒为例、简写ADV)、支原体(以人肺炎支原体为例、简写MP)和衣原体(以人肺炎衣原体为例、简写CP)的方法，该方法具有特异性强、灵敏度高、稳定性强的特点且操作简便快速，在急性呼吸道病毒的现场检测、卫生评价、临床诊断等方面显示出良好的应用前景。
发明内容
本发明是由国家“十二五”科技重大专项2012ZX10004206-002支持的。在本发明中，我们成功建立了在同一台荧光定量PCR仪上、应用同样的反应程序检测RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体的方法。通过与各自病原体在不同的PCR仪上、以不同的反应程序进行检测的结果进行比较，说明该方法具有较高的特异性、灵敏度、高效性和稳定性。
在本发明的第一方面，提供一种同时检测RNA病毒(以甲型H1N1流感病毒为例)、DNA病毒(以人腺病毒为例)、支原体(以人肺炎支原体为例)和衣原体(以人肺炎衣原体为例)的配制体系，该方法使用针对各自病原体设计及合成的引物和探针进行配制。
在一个实施方案中，所述方法包括以下配制成份：
a)反应缓冲液；
b)反应酶；
c)针对各自病原体的上、下游引物；
d)针对各自病原体的探针；
e)无RNA酶的水补足体系要求的体积。
在一个具体实施方案中，所述方法为荧光定量PCR/RT-PCR配制体系。
在本发明的第二方面，提供一种在同一台实时荧光定量PCR仪上、同时检测RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体(以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原体和人肺炎衣原体为例)的上机反应程序，该方法使用第一方面所述的配制体系。
在一个实施方案中，所述方法包括以下程序：
a)荧光通道的设置；
b)反转录的温度与时间；
c)预热的温度与时间；
d)预循环(预热温度与时间、退火温度与时间、荧光收集温度、循环数)；
e)热循环(预热温度与时间、退火温度与时间、荧光收集温度、循环数)；
f)以界定的Ct值来判定检测结果。
在一个具体实施方案中，所述方法为荧光定量PCR/RT PCR扩增程序，并使用所述配制体系作为反应体系。
在本发明的第三方面，提供第二方面所述的上机反应程序的诊断试剂中的应用。
附图说明
图1为同时加入甲型H1N1型流感病毒(RNA病毒)、人腺病毒(DNA病毒)、人肺炎支原体(支原体)、人肺炎衣原体(衣原体)阳性模板的荧光扩增图。
具体实施方式
本发明的技术途径是首先利用已经设计并合成的RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体(以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原体以及人肺炎衣原体为例)相应基因的保守区设计特异性引物和探针序列，确定了最佳配制体系及上机扩增程序，并且进行特异性、灵敏度及稳定性的验证实验及临床样本的检测应用，成功建立了RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体(以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原体以及人肺炎衣原体为例)一步法多重荧光RT-PCR同一台PCR仪的上机反应。
同时，需要指出的是，本发明所述的检测方法和试剂盒不仅应用于对患者(人)的样品进行检测，也包括对环境中的水样品、食物样品、空气样品、微生物样品、动物样品等多种样品的非诊断目的的检测。其应用也都是本领域技术的常用技术手段，并不需要进行特别的、富有创造性的改变。
实施例1.RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体(以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原体以及人肺炎衣原体为例)各病原体特异性引物和探针一步法荧光定量PCR/RT-PCR检测程序的建立
1.1按照英杰公司的核酸提取试剂盒(viral RNA Mini Kit)来提取样本核酸。
1.2RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体(以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原体以及人肺炎衣原体为例)一步法多重荧光RT-PCR检测体系的配制
配制试剂采用Ambion公司的AgPath-IDTM One-step RT-PCR Kit(P/N：4387424)，体系为25μ1：
1.3RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体(以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原体以及人肺炎衣原体为例)一步法荧光定量PCR/RT-PCR检测方法的上机扩增程序
采用罗氏公司的Roche480仪进行上机扩增，其程序如下：
先设置FAM荧光采集通道；
结果判定标准为：Ct值≤34，判定为阳性；Ct值≥36，判断为阴性；Ct值在34～36之间为可疑。
检测病原微生物及引物如下所示：
RNA病毒——甲型H1N1型流感病毒(H1)
上游引物序列5’-TGGCTGGATCCTGGGAAAT-3’；(SEQ ID NO：1)
下游引物序列5’-CCACAATGTAGGACCATGAGCTT-3’；(SEQ ID NO：2)
探针序列5’-AGTGTGAATCACTCTCCA-3’)；(SEQ ID NO：3)
DNA病毒——人腺病毒(ADV)
上游引物序列5’-CTCTGGCTTTGTGGGTTACATG-3’；(SEQ ID NO：4)
下游引物序列5'-TTAGCGGGATAGGGTTGACCTT-3’；(SEQ ID NO：5)
探针序列5’-CTCCGACCATGCGC-3’；(SEQ ID NO：6)
支原体——人肺炎支原体(MP)
上游引物序列5'-AGGCACTTTTTCGGGATGATAC-3’；(SEQ ID NO：7)
下游引物序列5'-TGTTGAAACTGCCAGAGAATTCC-3’；(SEQ ID NO：8)
探针序列5’-TCATTAATCCAGAAAACAAC-3’；(SEQ ID NO：9)
衣原体——人肺炎衣原体(CP)
上游引物序列5’-GATCCGCTGCTGCAAACTATACT-3’；(SEQ ID NO：10)
下游引物序列5’-TGCTTATTGTAGGCCGGGTTA-3’；(SEQ ID NO：11)
探针序列5’-CTGCCGTAGATAGAC-3’(SEQ ID NO：12)。
将上述四种病原体的阳性核酸作为检测对象，利用上述反应体系，以及上述上机扩增程序进行验证，结果与阳性核酸相符(参见附图1)。本试验实现了RNA、DNA、支原体以及衣原体四种类别的病原体在同一台荧光定量PCR仪上同步上机操作，本发明克服了常规RNA、DNA、支原体以及衣原体分机或分批扩增的操作繁琐，节省大量工作时间，并且充分利用了荧光定量PCR仪的利用效率。
实施例2.RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体(以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原体以及人肺炎衣原体为例)一步法多重荧光RT-PCR检测方法的特异性鉴定。
利用实施例1建立的荧光定量PCR/RT-PCR反应体系分别对甲型H1N1流感病毒、季节性H1N1流感病毒、季节性H3N2流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、肠道病毒、鼻病毒、腺病毒、博卡病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体的阳性核酸进行检测，其结果表明，只有甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原体以及人肺炎衣原体都在检测通道出现相应的特异性荧光扩增曲线，并且没有出现交叉反应，而加入其他病原体后并没有出现检测扩增曲线，说明该方法具有很强的特异性。
实施例3.RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体(以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原体以及人肺炎衣原体为例)一步法荧光定量PCR/RT-PCR检测方法的灵敏度鉴定
3.1实施例1中的一步法荧光定量PCR/RT-PCR反应程序与各自在不同荧光定量PCR仪上、采用不同的反应程序检测灵敏度的比较
RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体(以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原体以及人肺炎衣原体为例)的阳性核酸进行10倍梯度系列稀释(10-3～10-8)，用实施例1建立的荧光定量PCR/RT-PCR方法和与各自在不同荧光定量PCR仪上、采用不同的反应程序对其进行检测。结果表明，同一荧光定量PCR/RT-PCR扩增检测方法的灵敏度比各自病原体在不同荧光定量PCR仪上、采用不同的上机反应程序检测的灵敏度相近，甲型H1N1流感病毒在两种情况下的核酸检测灵敏度为10-6、人腺病毒在两种情况下的核酸检测灵敏度为10-6、人肺炎支原体在两种情况下的核酸检测灵敏度为10-5、人肺炎衣原体在两种情况下的核酸检测灵敏度为10-5。
实施例4.RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体(以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原体以及人肺炎衣原体为例)一步法荧光定量PCR/RT-PCR方法检测效率的鉴定
对468份实验室样本，利用实施例1建立的同一台荧光定量PCR仪上、采用同样的反应程序进行检测，并与各自在不同荧光定量PCR仪上、采用不同的反应程序对其进行检测。结果表明，同一荧光定量PCR/RT-PCR扩增检测方法的效率远远高于各自病原体在不同荧光定量PCR仪上、采用不同的上机反应程序检测的。时间节省了将近1/3，更具高效性和通量性，尤其是进行大量样本筛检时，其优势更明显。
实施例5.RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体(以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原体以及人肺炎衣原体为例)一步法荧光定量PCR/RT-PCR检测方法的稳定性鉴定
在同一次试验中(同一个PCR板)，对10倍梯度稀释的RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体(以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原体以及人肺炎衣原体为例)阳性核酸(设置10-1、10-2、10-3稀释梯度)利用实施例2建立的荧光定量PCR/RT-PCR方法进行检测，每个样本做3个重复；另外在不同PCR板上重复3次，结果各个稀释度样品的批内三个重复反应获得的Ct值的变异系数在(0.39％～0.71％)之间，批间重复的变异系数在(0.43％～0.89％)之间，表明本发明所建立的多重荧光RT-PCR检测方法误差小、重复性好，可对RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体进行稳定、可靠的检测。

Claims (2)

1.一种非诊断目的的同时检测甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原体以及人肺炎衣原体的方法：
采用Ambion公司的AgPath-IDTM One-step RT-PCR Kit，P/N：4387424，配制PCR反应体系，体系为25μl：
2×RT-PCR buffer 12.5μl
25×RT-PCR Enzyme 1μl
Detection Enhancer 1.5μl
引物、探针 0.5μl
模版 5μl
无RNA酶的水 4.5μl
引物终浓度为400nM、探针终浓度为100nM；
上机反应程序设置如下：
先设置FAM荧光采集通道；
反转录温度与时间：48℃，30min；
预变性温度与时间：95℃，10min；
预循环程序如下所示：荧光吸收温度为60℃，共10个循环
预热温度与时间：95℃，15s；
退火温度与时间：60℃，45s；
热循环程序如下所示：荧光吸收温度为60℃，共35个循环
预热温度与时间：95℃，15s；
退火温度与时间：60℃，45s；
结果判定标准为：Ct值≤34，判定为阳性；Ct值≥36，判断为阴性；Ct值在34～36之间为可疑；
其中所述引物序列为SEQ ID NO：1-2、4-5、7-8、10-11所示，所述探针序列如SEQ IDNO：3、6、9、12所示。
2.如权利要求1所述方法在检测食品及原料、环境样本中病原微生物方面的用途。
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