CN106244732B - 柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒及其应用。本发明设计了柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒的双重数字PCR定量检测试剂组合物。该试剂盒包含：病样RNA提取试剂、cDNA反转录合成试剂、数字PCR反应试剂、柑橘衰退病与柑橘裂皮病阳性对照样品模板和阴性对照样品模板。应用本发明试剂盒检测柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒具有特异性强、抗杂质干扰更好、简便快速、检测灵敏度与现有的实时荧光定量PCR检测方法相当等优点，可用于柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒的早期定性、定量检测以及流行病学调查等。

Description

柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于植物病害检测技术领域，具体涉及一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测试剂盒及其应用。
技术背景
柑橘衰退病和柑橘裂皮病是柑橘上的两种重要病毒病害。柑橘衰退病毒是长线形病毒属的正义单链RNA病毒；该病毒主要通过蚜虫和带病接穗进行传播，目前已经毁灭超过１亿株柑橘，对柑橘产业造成巨大危害。柑橘裂皮病毒为马铃薯纺缍块茎类病毒属，是一种低分子量的共价闭合环状RNA病毒，不具有蛋白质外壳, 也不具备规则的几何结构；该病毒可通过嫁接或修剪用的工具机械传播，引起砧木部树皮纵裂，导致树势衰弱、植株矮化和严重减产。近年来，柑橘衰退病和柑橘裂皮病在我国柑橘产区的发病率不断上升，二者复合侵染的情况越来越多，针对此二种病害建立快速定量检测方法有助于掌握其在我国的流行趋势和危害程度，及时发出病害预警，从而为我国柑橘产业的健康、持续发展提供保障。
针对柑橘衰退病和柑橘裂皮病的检测，目前已有核酸杂交和血清学检测的方法，但都非常耗时和繁琐。普通RT-PCR、实时荧光定量PCR也可用于此二种病害的检测，但普通RT-PCR检测灵敏度不足，而实时荧光定量PCR方法在定量分析时，需要依赖标准物质和标准曲线，仅能实现相对定量分析。另外，实时荧光定量PCR对反应扩增效率要求很高，且易受模板纯度和PCR抑制因子等因素的影响，导致对目标序列定量的不准确估计。此外，基于实时荧光定量PCR的复合多靶标体系的优化非常困难，定量分析通量较低；因此，实时荧光定量PCR已不能完全满足柑橘衰退病毒和柑橘裂皮病毒的高灵敏度定量检测需求。
本发明开发了一套柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测方法，与现有方法相比，本发明的柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测方法具有如下几个方面的优点。1.简便可靠的绝对定量：本发明所使用的柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测方法采用了数字检测芯片系统，其数字PCR的检测芯片微孔数远大于样品中病毒的靶标拷贝数，该方法通过样品极限稀释、泊松分布和终点法PCR，来实现核酸的绝对定量，因此本方法的靶标定量检测不依赖于扩增曲线的阈值，不受PCR扩增效率的影响，也不需建立标准曲线，不需进行复杂的转化运算，因此更加简便的实现绝对定量分析，并具有更好的检测准确度和重现性。2.抗杂质干扰能力强，检测灵敏度高：本方法的数字PCR检测方法，可将每个样品分成20,000多个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴都作为一个独立的PCR反应器，这种方法可在很大程度上把柑橘中的杂质及柑橘cDNA与病毒靶标隔离开，极大的减少了其他物质的干扰，由于该技术使每一出现阳性荧光的微孔对应一个病毒靶标拷贝，因此即使检测体系中仅有一个靶标拷贝也可以很好的检出。3.高特异性：本发明根据柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒的特有序列设计了特异性引物和特异探针，其特异性高，且非常稳定，保证了反应的顺利进行，进一步确保柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒检出的特异性。4.功能更多：本发明同时使用柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒的特异性引物和不同荧光标记的特异探针，结果读取时使用两个不同的荧光检测通道，一次实验可同时检出2种病毒，减少了实验时间和步骤。5.检测速度快：本发明提供的方法和试剂盒方便快捷，整个检测时间仅需要数小时，节省大量人力成本和时间成本。
检索相关的研究及专利文献未见有柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测的相关文献报道。
发明内容
一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒，其组成包括：病样RNA提取试剂、cDNA合成试剂、数字PCR反应试剂、柑橘衰退病与柑橘裂皮病阳性对照样品模板和阴性对照样品模板。
其中，所述病样RNA提取试剂的组成为：一包RNase-free的无菌1.5mL ep管50个，50mL的TRIzoL一瓶，6mL氯仿一瓶，25mL异丙醇一瓶，50mL的75vol％乙醇一瓶，50mL的Rnase-free ddH2O一瓶。
所述cDNA合成试剂的组成为：各组分浓度为2.5mmol/L each 的1mL dNTP mix一支，200U/μL M-MLV反转录酶50μL，浓度为50μmol /L的随机引物200μL，浓度为40U/μL的50μL RNase Inhibitor一支，5×RT buffer一支200 μL。
所述数字PCR反应试剂的组成成分为：1mL RNase-free ddH2O 1支，1mL 2×3DDigital PCR Master Mix 3支，200μL 浓度为10μmol/L的引物STB1-F/STB1-R/ LPB1-F/LPB1-R各1支，200μL 浓度为10μmol/L的探针STB1-P以及LPB1-P各1支，1mL浓度为50ng/μL的柑橘衰退病病样cDNA 1支作为阳性对照样品模板，1mL浓度为50ng/μL的柑橘裂皮病病样cDNA 1支作为阳性对照样品模板，1mL浓度为50ng/μL的健康柑橘样品cDNA 1支作为阴性对照样品模板。
所述引物与探针的序列为：
柑橘衰退病毒的特异引物及探针为：
上游引物STB1-F：5'- TGTGCTGTGTACATACAAGCTAAAG -3'
下游引物STB1-R：5'- ATTTCCCAAGCTGCCTGAC -3'
探针STB1-P：FAM 5’- GTAACTACRACHTCATCAGCCCCTCG -3’ BHQ
所述探针5’ 端荧光报告基因为FAM，3’ 端淬灭基团为BHQ；
柑橘裂皮病毒的特异引物及探针为：
上游引物LPB1-F：5'- GGAAACCTGGAGGAAGTCG -3'
下游引物LPB1 -R：5'- CAGCAGCGAAAGGAAGGAG -3'
探针LPB1 -P：HEX 5'- CCTGTTTCTCCGCTGGACGCC -3' BHQ
所述探针5’端荧光报告基因为HEX，3’端淬灭基团为BHQ。
上述柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒用于柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测，其具体检测方法包括如下步骤：
（1）提取柑橘病样RNA：称取0.05- 0.1g柑橘病叶于-80℃预冷研钵中，加液氮充分研磨；迅速转入到RNase-free的1.5mL无菌ep管中；加入1mL TRIzoL混匀，室温剧烈震荡15s后于室温下静置5min；加入0.2mL氯仿，室温剧烈震荡15s，室温放置5min；12,000rpm，4℃下离心15min，可见分为三层；将含有RNA的上层水相转移至一新的1.5mL无菌ep管中，加入等体积溶液异丙醇，混匀，放置15min；12,000rpm，4℃下离心10min，即可见有RNA 沉淀；弃上清留沉淀，加入1mL于-20℃预冷的75vol％乙醇，漂洗沉淀；12000rpm，4℃下离心5min，弃上清；室温充分干燥RNA 沉淀；加15μL RNase-Free ddH2O溶解沉淀即为总RNA样品，样品即可用于反转录合成cDNA。
（2）反转录合成cDNA：RT-PCR反应体系20μL，反应步骤如下：总RNA样品2μL，50μmol/L的随机引物1μL，RNase-free ddH2O 7μL，65℃变性5min，迅速置冰上5 min；再加入5×RT buffer 4μL，各组分浓度为2.5mmol/L的dNTP Mix 4μL，40U/μL的RNase Inhibitor0.5μL以及200U/μL的M-MLV反转录酶1μL，短暂离心后用RNase-free ddH2O补足至20μL，42℃温浴1h，95℃灭活5min，置冰上待用。
（3）配置数字PCR反应体系：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探针STB1-P、LPB1-P各0.4μL，10μM的引物STB1-F、STB1-R、LPB1-F、LPB1-R、各0.8μL，柑橘病样cDNA模板3μL，其余用ddH2O补足至16μL。
（4）数字PCR扩增：96℃预变性10min；98℃变性30s，60℃延伸2min；共进行40个循环，最后10℃停止反应。
（5）检测扩增产物的荧光信号，确定柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒的拷贝数：读取FAM与VIC通道的荧光信号，通过QuantStudio™ 3D Digital PCR机载软件进行定量分析，计算靶标拷贝数。
本发明的有益效果在于：
1.可进行简便可靠的绝对定量：本方法所使用的柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测方法采用了数字检测芯片系统，其数字PCR的检测芯片微孔数远大于样品中病毒的靶标拷贝数，该方法通过样品极限稀释、泊松分布和终点法PCR，来实现核酸的绝对定量，因此本方法的靶标定量检测不依赖于扩增曲线的阈值，不受PCR扩增效率的影响，也不需建立标准曲线，不需进行复杂的转化运算，因此更加简便的实现绝对定量分析，并具有更好的检测准确度和重现性。
2.抗杂质干扰能力强，检测灵敏度高：本方法的数字PCR检测方法，可将每个样品分成20,000多个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴都作为一个独立的PCR反应器，这种方法可在很大程度上把柑橘中的杂质及柑橘cDNA与病毒靶标隔离开，极大的减少了其他物质的干扰，由于该技术使每一出现阳性荧光的微孔对应一个病毒靶标拷贝，因此即使检测体系中仅有一个靶标拷贝也可以很好的检出。
3.高特异性：本发明根据柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒的特有序列设计了特异性引物和特异探针，其特异性高，且非常稳定，保证了反应的顺利进行，进一步确保柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒检出的特异性。
4.功能更多：本发明同时使用柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒的特异性引物和不同荧光标记的特异探针，结果读取时使用两个不同的荧光检测通道，可在一次实验可同时检出2种病毒，减少了实验时间和步骤。
5.检测速度快：本发明提供的方法和试剂盒方便快捷，整个检测时间仅需要数小时，节省大量人力成本和时间成本。
综上，本发明试剂盒和方法可以满足柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒的早期、准确、定量分析的要求，可为柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒的早期、精确和定量检测、流行病学调查提供科学依据，具有良好的发展应用前景。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，下面结合具体的实施例做进一步说明，下列具体实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制。
实施例1：引物初步筛选及检测。
利用primer primer5软件检测引物间的互补性及引物退火温度，选择退火温度接近，且扩增的目的片段易于区分的引物对。本发明针对柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒各设计2对引物和探针。本实施例给出了筛选最佳引物的过程，用于筛选的备选引物如下，见表1。
表1. 柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒的备选引物序列
用于备选的引物及探针组合包括：STB1-F+ STB1-R+ STB1-P，STB2-F+STB2-R+STB2-P，LPB1-F+LPB1-R+LPB1-P，LPB2-F+LPB2-R+LPB2-P，使用探针法荧光定量PCR分别进行引物与探针组合的检测效果对比分析，20μL的反应体系，Premix Ex Taq缓冲液10μL、模板3μL，引物终浓度250nM，探针终浓度150nM，补充ddH2O至20μL。PCR反应程序：95℃预变性20s，然后95℃ 5s，60℃ 40s，40个循环，最后10℃停止反应。其Ct值如表2所示，因此根据实验结果选择检测效果更好的STB1-F+ STB1-R+ STB1-P，和 LPB1-F+LPB1-R+LPB1-P的引物与探针组合。
表2 不同引物探针组合进行荧光定量PCR的Ct值
实施例2：引物特异性分析
为验证本发明柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测方法对柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒检测的特异性，分别运用STB1-F+STB1-R+STB1-P，和LPB1-F+LPB1-R+LPB1-P的引物与探针组合对柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒病样进行检测。运用数字定量PCR体系配方：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探针和引物STB1-F、STB1-R、STB1-P以及LPB1-F、LPB1-R、LPB1-P各0.2μL，柑橘病样cDNA模板3μL，其余用ddH2O 补足至16μL。数字PCR扩增反应程序为：96℃预变性10min；98℃变性30s；60℃延伸2min，共进行40个循环，最后10℃停止反应。在FAM通道下检测本研究室保存的柑橘溃疡病病样、柑橘炭疽病病样、柑橘脚腐病病样、柑橘衰退病病样、柑橘裂皮病病样、柑橘黄龙病病样、柑橘衰退病阳性对照样品、柑橘裂皮病阳性对照样品、健康柑橘阴性对照样品的荧光信号，结果显示：柑橘衰退病病样与柑橘衰退病阳性对照样品为阳性，其余样品显示阴性。在VIC通道下检测本研究室保存的柑橘溃疡病病样、柑橘炭疽病病样、柑橘脚腐病病样、柑橘衰退病病样、柑橘裂皮病病样、柑橘黄龙病病样、柑橘衰退病阳性对照样品、柑橘裂皮病阳性对照样品、健康柑橘阴性对照样品的荧光信号，结果显示：柑橘裂皮病病样和柑橘裂皮病阳性对照样品为阳性，其余样品显示阴性，实验结果见表3。该实验表明STB1-F+ STB1-R+ STB1-P以及LPB1-F+LPB1-R+LPB1-P引物与探针有较好的检测特异性。
表3柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒数字PCR定量检测方法的检测特异性验证
实施例3：不同退火温度对双重数字PCR反应的影响.
运用STB1-F+ STB1-R+ STB1-P以及LPB1-F+LPB1-R+LPB1-P的引物与探针组合。运用数字定量PCR体系配方：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探针和引物STB1-F、STB1-R、STB1-P、LPB1-F、LPB1-R、LPB1-P各0.2μL，柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒复合侵染病样cDNA模板3μL，其余用ddH2O补足至16μL。PCR扩增反应程序为：96℃预变性10min；98℃变性30s；然后分别在温度梯度（56，58，60，62）下退火延伸2min，共进行40个循环；最后10℃停止反应。
结果：不同退火温度下，FAM信号通道和VIC检测通道中的检测值差异不大，根据实验结果选择60℃的退火延伸温度。
实施例4：不同引物和探针浓度对双重数字PCR反应的影响.
运用不同浓度组合的STB1-F+STB1-R+ STB1-P以及LPB1-F+LPB1-R+LPB1-P进行数字PCR检测。运用数字定量PCR体系配方：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，引物探针STB1-F、STB1-R、STB1-P、LPB1-F、LPB1-R、LPB1-P浓度均为10μmol/L，加入不同体积的引物和探针，柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒复合侵染病样cDNA模板3μL，其余用ddH2O 补足至16μL。PCR扩增反应程序为：96℃预变性10min；98℃，变性30s；60℃退火延伸2min，共进行40个循环，最后10℃停止反应。所使用的引物、探针量以及试验结果如表4所示。
表4 双重数字PCR定量检测体系中不同浓度的引物与探针组合。
根据实验结果，选择最佳的组合3。
实施例5：柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测方法的建立
1、柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测试剂盒的组装
该试剂盒包含：病样RNA提取试剂、cDNA合成试剂、数字PCR反应试剂、柑橘衰退病与柑橘裂皮病阳性对照样品模板和阴性对照样品模板。
其中，所述病样RNA提取试剂的组成为：一包RNase-free的无菌1.5mL ep管50个，50mL的TRIzoL一瓶，6mL氯仿一瓶，25mL异丙醇一瓶，50mL的75vol％乙醇一瓶，50mL的Rnase-free ddH2O一瓶。
所述cDNA合成试剂的组成为：各组分浓度为2.5mmol/L each 的1mL dNTP mix一支，200U/μL M-MLV反转录酶50μL，浓度为50μmol /L的随机引物200μL，浓度为40U/μL的50μL RNase Inhibitor一支，5×RT buffer一支200 μL。
所述数字PCR反应试剂的组成成分为：1mL RNase-free ddH2O 1支，1mL 2×3DDigital PCR Master Mix 3支，200μL 浓度为10μmol/L的引物STB1-F/STB1-R/ LPB1-F/LPB1-R各1支，200μL 浓度为10μmol/L的探针STB1-P以及LPB1-P各1支，1mL浓度为50ng/μL的柑橘衰退病病样cDNA 1支作为阳性对照样品模板，1mL浓度为50ng/μL的柑橘裂皮病病样cDNA 1支作为阳性对照样品模板，1mL浓度为50ng/μL的健康柑橘样品cDNA 1支作为阴性对照样品模板。
所述引物与探针的序列为：
柑橘衰退病毒的特异引物及探针为：
上游引物STB1-F：5'- TGTGCTGTGTACATACAAGCTAAAG -3'
下游引物STB1-R：5'- ATTTCCCAAGCTGCCTGAC -3'
探针STB1-P：FAM 5’- GTAACTACRACHTCATCAGCCCCTCG -3’ BHQ
所述探针5’ 端荧光报告基因为FAM，3’ 端淬灭基团为BHQ；
柑橘裂皮病毒的特异引物及探针为：
上游引物LPB1-F：5'- GGAAACCTGGAGGAAGTCG -3'
下游引物LPB1 -R：5'- CAGCAGCGAAAGGAAGGAG -3'
探针LPB1 -P：HEX 5'- CCTGTTTCTCCGCTGGACGCC -3' BHQ
所述探针5’端荧光报告基因为HEX，3’端淬灭基团为BHQ。
2、一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测方法，其具体检测方法包括如下步骤：
（1）提取柑橘病样RNA：称取0.05- 0.1g柑橘病叶于-80℃预冷研钵中，加液氮充分研磨；迅速转入到RNase-free的1.5mL无菌ep管中；加入1mL TRIzoL混匀，室温剧烈震荡15s后于室温下静置5min；加入0.2mL氯仿，室温剧烈震荡15s，室温放置5min；12,000rpm，4℃下离心15min，可见分为三层；将含有RNA的上层水相转移至一新的1.5mL无菌ep管中，加入等体积溶液异丙醇，混匀，放置15min；12,000rpm，4℃下离心10min，即可见有RNA 沉淀；弃上清留沉淀，加入1mL于-20℃预冷的75vol％乙醇，漂洗沉淀；12000rpm，4℃下离心5min，弃上清；室温充分干燥RNA 沉淀；加15μL RNase-Free ddH2O溶解沉淀即为总RNA样品，样品即可用于反转录合成cDNA。
（2）反转录合成cDNA：RT-PCR反应体系20μL，反应步骤如下：总RNA样品2μL，50μmol/L的随机引物1μL，RNase-free ddH2O 7μL，65℃变性5min，迅速置冰上5 min；再加入5×RT buffer 4μL，各组分浓度为2.5mmol/L的dNTP Mix 4μL，40U/μL的RNase Inhibitor0.5μL以及200U/μL的M-MLV反转录酶1μL，短暂离心后用RNase-free ddH2O补足至20μL，42℃温浴1h，95℃灭活5min，置冰上待用。
（3）配置数字PCR反应体系：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探针STB1-P、LPB1-P各0.4μL，10μM的引物STB1-F、STB1-R、LPB1-F、LPB1-R、各0.8μL，柑橘病样cDNA模板3μL，其余用ddH2O补足至16μL。
（4）数字PCR扩增：96℃预变性10min；98℃变性30s，60℃延伸2min；共进行40个循环，最后10℃停止反应。
（5）检测扩增产物的荧光信号，确定柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒的拷贝数：读取FAM与VIC通道的荧光信号，通过QuantStudio™ 3D Digital PCR机载软件进行定量分析，计算靶标拷贝数。
实施例6 柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测方法与现有荧光定量PCR检测方法的检测灵敏度对比分析
为比较本检测方法与现有的柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒荧光定量PCR检测方法的检测灵敏度，首先获得柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒复合侵染样品的cDNA模板，然后10倍梯度稀释为10-1至10-4等系列稀释液，作为反应的模板。以本试剂盒中二个病毒病样的阴性对照模板和阳性对照模板为参照，使用柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测方法进行检测，实验检测方法及体系参照本发明前述说明。同时作为对照，分别使用现有的柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒荧光定量检测方法进行检测，柑橘衰退病毒实时荧光定量PCR实验参照文献：Saponari M. et al.,2008；柑橘裂皮病毒实时荧光定量PCR实验参照文献：Papayiannis L. 2014。实验结束后，记录检测结果。
结果发现：两类检测方法均可对柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒检出阳性结果。两类检测方法在样品稀释梯度为10-1至10-3的3个cDNA 模板中均可检出阳性结果；其中，在10-3稀释的cDNA模板中可检到约5.153个柑橘衰退病毒靶标和3.258个柑橘裂皮病毒靶标拷贝(表5)，但在10-4稀释度cDNA 模板中均不能检出阳性结果。表明本发明所采用的柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测方法不但可以同时检测柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒，而且其检测灵敏度与现有的柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒荧光定量PCR检测相当。
表5两类病毒检测方法的检测灵敏度对比研究。
实施例7. 柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测方法对田间实际样品的检测
于广东柑橘产区采集疑似柑橘衰退病毒和柑橘裂皮病毒的5个柑橘病样，参照实施例5，提取病样总RNA，反转录合成cDNA作为模板，并用本发明所述的柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测方法进行检测，同时设置柑橘衰退病毒和柑橘裂皮病毒阳性对照及健康柑橘阴性对照，结果表明：1、3、4、5号样品复合感染柑橘衰退病毒和柑橘裂皮病毒，2号样品仅感染衰退病毒。柑橘衰退病毒和柑橘裂皮病毒阳性对照及健康柑橘阴性对照可正确检测；进一步通过柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒荧光定量PCR检测方法进行验证，结果完全一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院植物保护研究所
<120> 柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒及其应用
<130> 12
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> STB1-F
<400> 1
tgtgctgtgt acatacaagc taaag 25
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> STB1-R
<400> 2
atttcccaag ctgcctgac 19
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> STB1-P
<400> 3
gtaactacra chtcatcagc ccctcg 26
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> LPB1-F
<400> 4
ggaaacctgg aggaagtcg 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> LPB1-R
<400> 5
cagcagcgaa aggaaggag 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> LPB1-P
<400> 6
cctgtttctc cgctggacgc c 21
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> STB2-F
<400> 7
atgahtttaa ctcgtttctc gctt 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> STB2-R
<400> 8
tcrtggtgrc catcctgatg 20
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> STB2-P
<400> 9
ccgttcaygt cygacttcat agagtgya 28
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> LPB2-F
<400> 10
cgggatcttt cttgaggttc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> LPB2-R
<400> 11
tccctgaagg acttcttccc 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> LPB2-P
<400> 12
gctcacctga ccctgcaggc ag 22

Claims (8)

1.一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒，其特征在于，其组成包括：病样RNA提取试剂、cDNA合成试剂、数字PCR反应试剂、柑橘衰退病与柑橘裂皮病阳性对照样品模板和阴性对照样品模板；数字PCR反应试剂包含以下引物与探针：
柑橘衰退病毒的特异引物及探针的序列为：
上游引物STB1-F：5'- TGTGCTGTGTACATACAAGCTAAAG -3'
下游引物STB1-R：5'- ATTTCCCAAGCTGCCTGAC -3'
探针STB1-P：FAM 5’- GTAACTACRACHTCATCAGCCCCTCG -3’ BHQ
所述探针5’ 端荧光报告基因为FAM，3’ 端淬灭基团为BHQ；
柑橘裂皮病毒的特异引物及探针的序列为：
上游引物LPB1-F：5'- GGAAACCTGGAGGAAGTCG -3'
下游引物LPB1-R：5'- CAGCAGCGAAAGGAAGGAG -3'
探针LPB1-P：HEX 5'- CCTGTTTCTCCGCTGGACGCC -3' BHQ
所述探针5’端荧光报告基因为HEX，3’端淬灭基团为BHQ。
2.如权利要求1所述的一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒，其特征在于，所述病样RNA提取试剂的组成为：一包RNase-free的无菌1.5mL ep管50个，50mL的TRIzoL一瓶，6mL氯仿一瓶，25mL异丙醇一瓶，50mL的75vol％乙醇一瓶，50mL的Rnase-freeddH2O一瓶。
3.如权利要求1所述的一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒，其特征在于，所述cDNA合成试剂的组成为：各组分浓度为2.5mmol/L each 的1mL dNTP mix一支，200U/μL M-MLV反转录酶50μL，浓度为50μmol /L的随机引物200μL，浓度为40U/μL的50μLRNase Inhibitor一支，5×RT buffer一支200 μL。
4.如权利要求1所述的一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒，其特征在于，所述数字PCR反应试剂的组成成分为：1mL RNase-free ddH2O 1支，1mL 2×3D DigitalPCR Master Mix 3支，200μL 浓度为10μmol/L的引物STB1-F/STB1-R/ LPB1-F/LPB1-R各1支，200μL 浓度为10μmol/L的探针STB1-P以及LPB1-P各1支，1mL浓度为50ng/μL的柑橘衰退病病样cDNA 1支作为阳性对照样品模板，1mL浓度为50ng/μL的柑橘裂皮病病样cDNA 1支作为阳性对照样品模板，1mL浓度为50ng/μL的健康柑橘样品cDNA 1支作为阴性对照样品模板。
5.如权利要求1所述的一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒的应用，其特征在于，其具体检测方法包括如下步骤：
（1）提取柑橘病样RNA；
（2）反转录合成cDNA；
（3）配置数字PCR反应体系；
（4）数字PCR扩增；
（5）检测扩增产物的荧光信号，确定柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒的靶标拷贝数。
6.如权利要求5所述的一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒的应用，其特征在于，所述数字PCR的反应体系为：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探针HLB1-P、KYB1-P各0.4μL，10μM的引物HLB1-F、HLB1-R、KYB1-F、KYB1-R、各0.8μL，柑橘病样cDNA模板3μL，其余用ddH2O补足至16μL。
7.如权利要求5所述的一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒的应用，其特征在于，所述数字PCR的反应条件为：96℃预变性10min；98℃，变性30s，60℃延伸2min，共进行40个循环；最后10℃停止反应。
8.如权利要求5所述的一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒的应用，其特征在于，所述扩增产物荧光信号的检测方式为读取FAM与VIC通道的荧光信号，通过QuantStudio™ 3D Digital PCR机载软件进行定量分析，计算靶标拷贝数。
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Comparison of droplet digital PCR and quantitative PCR assays for quantitative detection of Xanthomonas citri subsp citri;Zhao Yun et al;《PLOS ONE》;20160718;全文 *
Simultaneous detection of CTV,CEVd and HSVd using Arizona 861 S1 Citron and RT-PCR;Rocio Camps et al;《Cien Inv Agr》;20141231;255-261 *
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Assignee: Dongyuan County Shenlan Agricultural Technology Development Co.,Ltd.

Assignor: PLANT PROTECTION Research Institute GUANGDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

Contract record no.: X2022440000122

Denomination of invention: Dual detection kit for citrus decay virus and citrus split peel virus and its application

Granted publication date: 20190521

License type: Common License

Record date: 20220907