CN108603226A

CN108603226A - 乙型肝炎病毒cccdna的定量测量

Info

Publication number: CN108603226A
Application number: CN201780011318.1A
Authority: CN
Inventors: 苏比希·詹恩; 雅明·D·斯蒂芬; 宋尉
Original assignee: Jbs Science Co
Current assignee: Jbs Science Co; JBS Science Inc
Priority date: 2016-02-15
Filing date: 2017-02-15
Publication date: 2018-09-28
Also published as: EP3417077A1; EP3417077A4; US20170233832A1; US10422013B2; JP2019515680A; WO2017142965A1

Abstract

乙型肝炎病毒(HBV)感染导致病毒基因组DNA进入宿主肝脏细胞中。该病毒松弛环状DNA(rcDNA)被转运到细胞核中并转化为共价闭合环状DNA(cccDNA)，所述共价闭合环状DNA作为病毒转录的模板。需要消除cccDNA来治愈HBV感染，这仍然是一个主要的治疗挑战。测量本文所述的cccDNA的稳健且灵敏的方法对于促进药物开发和监测疗法功效是有用的。设计一组引物与病毒DNA的亚硫酸氢钠处理组合，允许cccDNA的特异性扩增而不干扰rcDNA的扩增。该方法可用于进一步指导治疗发展，并提供一种监测经历抗病毒治疗的HBV感染患者的非侵入性的替代方法。

Description

乙型肝炎病毒CCCDNA的定量测量

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年2月15日提交的美国临时申请No.62/295,481的优先权，其内容在此通过引用以其整体并入本文。

以电子形式提交的序列表的参考

随同一起提交的以电子形式提交的序列表的内容，文件名cccDNA_SeqListing_PCT.txt，大小11,609字节；创建日期2017年2月15日，通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本公开一般涉及用于检测或定量(例如，乙型肝炎病毒(HBV)的)闭合共价环状DNA(cccDNA)的方法和试剂盒，并且更具体地涉及用于检测或定量HBV感染的生物样品中区别于松弛环状DNA(rcDNA或RC-DNA)的cccDNA的方法。

背景技术

HBV感染是全球公共卫生问题。全世界有2.4亿人长期感染HBV(Lavanchy和Kane2016)。感染HBV引起急性和慢性肝炎，导致肝硬化和肝细胞癌(Kew MC 2010)。

目前针对HBV感染的疗法是有限的，仅抑制病毒血症而不完全消除病毒，这主要是由于cccDNA的持久性所致(Tang,Yau等人2014)。疗法的停止导致大多数患者反弹，这表明存在导致持续感染的病毒残余物(Abdelhamed,Kelley等人2002)。在经历抗病毒疗法且不继续治疗的患者中，HBV可以自cccDNA中重新活化(Petersen J 2007)。为了监测肝脏中cccDNA的持久性，需要重复的肝脏活检，这对患者来说是危险的、不舒服的和昂贵的(Wu,Johnson等人2014，Zhong,Hu等人2014，Shi,Sun等人2015)。由于cccDNA特别是在肝脏损伤后也可以在血液中发现，其在血清或血浆中的检测允许评价抗病毒疗法的功效和肝脏损伤的程度，而无需借助肝脏活检(Wong,Yuen等人2004，Takkenberg,Zaaijer等人2009)。

在HBV感染后，病毒DNA被转移到感染的肝细胞的细胞核，其中rcDNA被释放到宿主细胞质中。病毒DNA最终被转运到核质中，在那里它被转化为cccDNA。假设作为微染色体，宿主细胞核中cccDNA的存在被用作为肝细胞核质中信使RNA的连续病毒体转录的模板(Levrero,Pollicino等人2009，Nassal 2015)。因此，cccDNA的持久性仍然是仍然具有发展晚期肝脏疾病的风险的慢性感染者中传统抗病毒疗法清除HBV的一个障碍。有趣的是，通过单独的常规抗病毒疗法清除HBV S-抗原(HBVsAg)的患者百分比很小，这表明可以消除cccDNA(Tavis,JE等人2013)。如果可以测量其cccDNA水平，这种"治愈的"群体可以停止终生的抗病毒疗法，这种疗法成本高且具有未知的副作用。因此，非常需要用于定量来自肝脏活组织或体液的cccDNA水平的灵敏且有特异性的方法来鉴定该"治愈的"群体。

消除cccDNA是在寻找治愈HBV感染的HBV药物开发研究的最终目标。非常需要一种用于定量cccDNA的灵敏且有特异性的方法。

发明概述

本公开提供了一种用于检测或定量含有cccDNA和非cccDNA的DNA样品中的闭合共价环状DNA(cccDNA)的方法和试剂盒。

在第一方面，公开了一种方法。该方法可以包括以下步骤：

i)处理DNA样品以消除经处理的DNA样品中的互补特征并从而防止双链DNA分子的两条链复性；和

ii)对经处理的DNA样品进行扩增测定，使得cccDNA能产生扩增的产物但非cccDNA不能产生扩增的产物。

在本文的DNA样品中，非cccDNA与cccDNA具有基本相同的DNA序列，但具有与cccDNA不同的形式(如松弛环状形式或rcDNA)。

DNA序列可以来自HBV，并因此DNA样品中的HBV DNA可以包括HBV基因组DNA的cccDNA形式和非cccDNA形式(如rc DNA或其它中间形式)。DNA序列也可以从其它物种获得，或者可以是人工序列。

在此，DNA样品可以从生物样品诸如组织或体液获得，并且体液可以是血清、血浆、血液、尿液或唾液。该方法和试剂盒可用于研究环境或临床环境中。

该方法和试剂盒可用于表征，诸如检测或定量DNA样品中的cccDNA。在HBV诊断、管理和预后领域的一个应用中，该方法和试剂盒可用于评估感染HBV的患者的肝脏损伤的严重程度，或者可用于监测感染HBV的患者中的抗病毒疗法的效率。

根据本公开的一些实施方案，该方法可以在步骤i)之前还包括从生物样品获得DNA样品的步骤。

本文中DNA样品可以从生物样品中获得、分离或提取，其可以通过任何标准方法进行，包括但不限于乙醇沉淀、苯酚-氯仿提取、微柱纯化或任何相关的可商购获得的试剂盒(如，Thermo FisherGenomic DNA试剂盒)。

根据该方法的一些实施方案，在步骤i)中，DNA样品可以用化学试剂处理，所述化学试剂被配置以改变经处理的DNA样品中的双链DNA分子的双链的序列并从而消除双链DNA分子的双链的互补特征。

如上所述的化学试剂可以通过引起脱氨基反应起作用，并且可以对特定核苷酸(如胞嘧啶)或非选择性(如腺苷和胞嘧啶)具有选择性。化学试剂可以是亚硝酸、亚硝酸钠、亚硝胺或亚硫酸氢钠。化学试剂可以通过在DNA分子的链上引起其它反应来起作用。

根据该方法的一些实施方案，用一对引物进行步骤ii)中的扩增测定，所述引物被配置为分别与DNA序列上的两个策略性位置退火并且一起被配置为能够从cccDNA产生扩增的产物但不能从非cccDNA产生扩增的产物。

在一些实施方案中，步骤ii)中的扩增测定可包括实时聚合酶链式反应(PCR)，其被配置为基于扩增的产物来定量cccDNA。

两个策略性位置可以分别位于非cccDNA中不连续链的已知不连续区域的两侧。因此，这对引物可以被配置为分别与经处理的DNA样品中的连续链的两个策略性位置退火，并从而从所述经处理的DNA样品中的连续链产生扩增的产物。

在其中DNA序列为HBV DNA的一些实施方案中，两个策略性位置可以位于rcDNA中HBV(-)链的不连续区的两侧，或者位于rcDNA中HBV(+)链的空位区中任一个的两侧。根据靶向HBV DNA的方法的一些实施方案，这对引物的正向引物可包含如SEQ ID NO:1-21中任一个所示的序列(参见表1)，并且这对引物的反向引物可包含如SEQ ID NO:22-28中任一个所示的序列(参见表1)。

根据该方法的一些其它实施方案，可以用探针进一步进行步骤ii)中的扩增测定，所述探针被配置为与经处理的DNA样品中的连续链退火但不与不连续链退火，并且被配置为允许对cccDNA进行定量。该探针可以分别在5'-端和3'-端处用荧光染料和荧光猝灭剂标记，其分别被配置为允许通过测量荧光强度来对cccDNA进行定量。

在其中DNA序列为HBV DNA的一些实施方案中，探针可包含如SEQ ID NO:29-31中任一个所示的序列(参见表1)。

表1.用于亚硫酸氢盐处理的DNA的引物(小写核苷酸是指人工标签序列)

在第二方面，公开了一种用于检测或定量DNA样品中的cccDNA的试剂盒，所述DNA样品含有cccDNA和与cccDNA具有基本相同的DNA序列且与cccDNA呈不同形式的非cccDNA。

该试剂盒包括化学试剂和一对引物。该化学试剂被配置为消除由其处理的DNA样品中的双链DNA分子的互补特征并从而防止双链DNA分子的两条链的复性。这对引物包括正向引物和反向引物，并且被配置为分别与DNA序列上的两个策略性位置退火，并且一起被配置为能够从cccDNA产生扩增的产物但不能从非cccDNA产生扩增的产物。

在该试剂盒的一些实施方案中，化学试剂包括以下四种试剂中的至少一种：亚硝酸、亚硝酸钠、亚硝胺和亚硫酸氢钠。

在该试剂盒中，两个策略性位置可以分别位于非cccDNA中不连续链的已知不连续区的两侧，并且这对引物可以被配置为分别与经处理的DNA样品中的连续链的两个策略性位置退火并从而从所述经处理的DNA样品中的连续链产生扩增的产物。

根据本公开的一些实施方案，该试剂盒还可以包括探针，其被配置为与经处理的DNA样品中的连续链退火但不与不连续链退火，并且被配置为允许对cccDNA进行定量。

探针可以分别在5'-端和3'-端用荧光染料和荧光猝灭剂标记。荧光染料可包括6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、FAM(5-羧基荧光素)、HEX(2',4',5',7'-四氯-6-羧基-4,7-二氯荧光素)或Cy5(菁-5)中的至少一种。荧光猝灭剂可包括6-羧基四甲基-罗丹明、TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)、BBQ(黑莓猝灭剂(BlackBerryQuencher))或BHQ3(黑洞猝灭剂3)中的至少一种。

该试剂盒还可包括DNA聚合酶、聚合酶缓冲液、dNTP或其组合。

根据本公开的一些实施方案，该试剂盒可以针对HBV进行定制。具体地，cccDNA包含乙型肝炎病毒(HBV)的ccDNA形式，并且非cccDNA包含乙型肝炎病毒(HBV)的松弛环状DNA(rcDNA)形式。

因此，正向引物可以包含如SEQ ID NO:1-21中任一个所示的序列(参见表1)，并且反向引物可以包含如SEQ ID NO:22-28中任一个所示的序列(参见表1)。

在一些优选的实施方案中，反向引物包含如SEQ ID NO:24所示的序列，并且正向引物包含如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:17所示的序列。

针对HBV的试剂盒的一些实施方案也可以包括探针，所述探针包含如SEQ ID NO:29-31中任一个所示的序列。

另一方面，本公开提供了一种在样品中可区别地检测cccDNA与rcDNA的方法。该方法包括：(a)用核苷酸转化试剂处理该样品；和(b)通过PCR程序检测cccDNA。

在该方法的一些实施方案中，核苷酸转化试剂将C残基转化为U残基。因此，核苷酸转化试剂可以是脱氨基剂(即引起核苷酸的脱氨基反应的化学试剂)。上述核苷酸转化试剂可以选自：亚硝酸、亚硝酸钠、亚硝胺、亚硫酸氢钠及其组合。

根据本公开的一些实施方案，PCR程序使用跨越不连续区的引物。该对引物可以被配置为分别与不连续区两侧的两个策略性位置退火，并且一起被配置为能够从cccDNA产生扩增的产物但不能从非cccDNA产生扩增的产物。

根据本公开的一些实施方案，PCR程序还使用探针，其中探针被配置为与连续链退火，但不与不连续链退火。

附图简述

图1描绘了通过经亚硫酸氢钠的脱氨基进行的胞嘧啶核苷酸至尿嘧啶核苷酸的分子转化。如所示，胞嘧啶的互补碱基配对核苷酸是鸟嘌呤，以及尿嘧啶的互补碱基配对核苷酸是腺嘌呤。

图2A-2G描绘了与文献中目前可获得的cccDNA PCR测定相比较的cccDNA PCR测定，被命名为"BS-cccDNA PCR测定"。

图3描绘了HBV cccDNA的检测。

图4A和4B显示了PCR所靶向的DR2区中HBV病毒的8种基因型(A-H)的多序列分析。

图5描绘了两个合成的DNA模板，其类似于目标区域中的亚硫酸氢盐转化的HBVDNA。

图6说明了在10⁵个拷贝的BS-rcDNA本底中，10⁸至10个拷贝的合成BS-cccDNA模板的两步BS-cccDNA的线性和灵敏度。

图7显示了在一步cccDNA测定中100拷贝的BS-cccDNA模板的灵敏度，以及在10⁵个拷贝的rcDNA本底中，10⁸至100个拷贝的合成BS-cccDNA的线性。

图8显示了亚硫酸氢盐处理(BS)不能显著地减少DNA靶区域的拷贝检测。

图9描绘了从感染HBV的患者的组织样品中检测到的HBV DNA的量。

发明详述

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所描述的方法和组合物相关的本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如本文所用，除非另有说明，否则下列术语和短语具有归属于它们的含义。

将通过显示的图详细描述各种实施方案。参考这些实施方案并不限制权利要求的范围。所提供的实例并不意味着限制本文的方法和权利要求的范围，而是描述权利要求的实施方案的示例用途。

如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式"一"、"一个"和"该"包括复数指示物，除非内容另有明确说明。因此，例如，提及"一种细胞"包括两个或更多个细胞的组合等。

如本文所用的术语"核苷酸序列"和"寡核苷酸"表示重复性的核酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)的聚合物，其能够通过Watson-Crick相互作用与互补序列进行碱基配对。该聚合物可以合成产生或源自生物来源。

术语"脱氧核糖核酸"和"DNA"是指重复性的脱氧核糖核酸的聚合物。

术语"核糖核酸"和"RNA"是指重复性的核糖核酸的聚合物。

术语"疾病"或"病症"在本文中可互换使用，并且是指身体状态或某些器官状态的任何改变，中断或扰乱功能执行和/或引起患者或与患者接触的人产生症状，如不适、功能障碍、痛苦或甚至死亡。疾病或病症还可以涉及犬瘟热、体衰、小病、微恙(malady)、病症、不健康、疾病、抱怨、身体不适或做作。

"基因"在本领域中是公知的，并且在本文中包括非编码区，诸如启动子或其它调节序列或近端非编码区。

生物样品可以包括整个组织，诸如活检样品。生物样品的其它实例包括生物流体，包括但不限于唾液、鼻咽液、血液，血浆、血清、胃肠液、胆汁、脑脊液、心包液、阴道液、精液、前列腺液、腹膜液、胸膜液、尿液、滑液、间质液、细胞内液或细胞质和淋巴液、支气管分泌物、粘液或玻璃体液或房水。生物样品还可包括培养基。在某些实施方案中，优选的生物流体是尿液。

术语"引物"定义一种寡核苷酸序列，其能够与互补的靶序列退火，从而形成部分双链区域作为起始点，聚合酶可以从该区域继续DNA延伸以产生互补链。

术语"诊断"意指存在异常或疾病状况或表型的任何方法、测定或适应症。诊断包括检测存在或不存在异常或疾病状况，并且可以是定性的或定量的。

术语"基因组"和"基因组的"是指源自任何活或非活生物体或单细胞的任何核酸序列(编码和非编码)。这些术语也适用于通过生物或人工影响的方式通过突变或重组可能产生的任何天然存在的变异。一个实例是人基因组，它由包装在染色体中的大约3×10⁹个碱基对DNA组成，其中有22对常染色体和1个异染色体对。

所选择的核酸序列或靶标核酸序列的扩增可以通过许多适合的方法进行。一般参见Kwoh等人,1990,Am.Blotechnol.Lab.8:14-25。已经描述了许多扩增技术，并且可以容易地进行调整以适应普通技术人员的特定需要。扩增技术的非限制性实例包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、基于转录的扩增、QP复制酶系统和NASBA(Kwoh等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1173-1177；Lizardi等人,1988,BioTechnology 6:1197-1202；Malek et；和Sambrook等人,1989,同上)。优选地，将使用PCR进行扩增。

聚合酶链式反应(PCR)根据已知技术进行(参见，如美国专利No.4,683,195；4,683,202；4,800,159；和4,965,188，其公开内容通过引用并入本文)。通常PCR涉及在杂合条件下处理核酸样品(如，在热稳定性DNA聚合酶存在下)，其中一种寡核苷酸引物用于待检测的特定序列的每条链。合成的每种引物的延伸产物与两条核酸链中的每一条互补，其中所述引物与特定序列的每条链充分互补以与其杂交。由每种引物合成的延伸产物也可以用作使用相同引物进一步合成延伸产物的模板。在足够轮数的延伸产物合成之后，分析样品以评估是否存在待检测的一条或多条序列。可以通过凝胶电泳后DNA的EtBr染色后可视化，或根据已知技术等使用可检测标记进行扩增的序列的检测。关于PCR技术的综述，参见PCRProtocols,A Guide to Methods and Amplifications,Michael等人编辑,Acad.Press,1990。

术语"表达"和"产生"在本文中同义使用，并且是指基因产物的生物合成。这些术语涵盖将基因转录成RNA。这些术语还涵盖将RNA翻译成一种或多种多肽，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。

术语"rcDNA"、"RC-DNA"或"松弛-环状DNA"涉及松弛环状的DNA，其是部分双链的、环状的但不是共价闭合的。(+)链与(-)链形成部分双链DNA，在3'端留下分子间长度可变化的空位(Guo,Jiang等人2007)。例如，HBV基因组可以以rcDNA的形式存在。在HBV基因组的情况下，rcDNA的(-)链的5'端可以与病毒P蛋白共价连接。

术语"cccDNA"或"共价闭合环状DNA"涉及一种形式的DNA，其是一种非整合的质粒样分子。它与rcDNA的不同之处在于没有(-)链不连续性，并且没有(+)链空位。例如，HBV基因组可以以cccDNA的形式存在。在HBV基因组的情况下，cccDNA可以是病毒RNA的模板并且负责子代病毒体的产生(Guo,Jiang等人2007，Nassal 2015)。

如本公开中详述的技术方法具有以下优点：如本文提供的程序能够通过去除HBV(-)链和(+)链的互补性在患者样品中仅检测和定量cccDNA，以及扩增由cccDNA但不是由rcDNA提供的连续HBV DNA序列。

本文公开了用于检测和定量任何来源的样品中的cccDNA的方法。在一些实施方案中，该样品可以是从患者获得的临床样品，诸如但不限于组织、血液、血清、血浆或可以获得的任何其它体液。在其它实施方案中，该样品可以是一种基于研究(诸如但不限于细胞培养和动物研究)的样品。

本公开提供了能够对cccDNA模板进行高度特异性和灵敏性定量和检测的方法。通过使用本文公开的方法，进行DNA的亚硫酸氢钠处理，从而将HBV基因组的互补(+)和(-)链转化为非互补链。图1描绘了亚硫酸氢钠通过脱氨基进行的胞嘧啶核苷酸至尿嘧啶核苷酸的分子转化。如图1所示，胞嘧啶的互补碱基配对核苷酸是鸟嘌呤，尿嘧啶的互补碱基配对核苷酸是腺嘌呤。

HBV DNA的两条链的此类分离使得能够设计链特异性PCR，其中选择引物以跨越含有rcDNA的(+)-链中的空位和rcDNA的(-)链的不连续性的区域，而该区域在cccDNA中是连续的。引物被设计为不与人基因组DNA重叠。然而，与先前的方法不同，经处理并保持彼此不互补的(+)和(-)链克服了单个引物的直链延伸的挑战，即产生可以彼此退火并随后形成与来自cccDNA的扩增子相同的扩增子的较短但重叠的产物。这一策略确实是cccDNA特异性PCR，其可以提供cccDNA与该病毒基因组DNA的其它形式诸如rcDNA之间的区别。

图2A-2G描绘了与文献中目前可获得的cccDNA PCR测定相比较，被称为"BS-cccDNA PCR测定"的上述cccDNA PCR测定的工作原理。

如图2A所示，cccDNA测量的"假阳性"来源于如改编自Nassal,M.2015(Nassal2015)的当前cccDNA PCR测定的rcDNA模板。如箭头所示，大多数当前的cccDNA PCR测定(或非BS cccDNA PCR测定)在DR1和DR2区域的任一侧设计了引物。如框图所示，由rcDNA产生的假阳性主要原因是单个引物的直链延伸，其产生更短但重叠的产物，所述产物可以彼此退火并随后扩增以形成与来自cccDNA的扩增子相同的扩增子。

图2B是导致C/T转化的亚硫酸氢盐处理(BS)的图示。右图中显示的一个实例表明，在亚硫酸氢盐处理后，如果经甲基化，则CpG位点处的胞嘧啶"C"保持为C。所有未甲基化的C，无论它们在DNA序列中的位置如何，都将被转换为U，U与T类似，与A互补。因此，结果是DNA序列的改变，其消除了DNA的正(+)和负(-)链的互补特征。

图2C显示自nt位置1556-1628的HBV DNA序列(GenBank登录号NC_003977)，其用于BS-cccDNA PCR测定设计和亚硫酸氢盐处理后改变的DNA序列，表明了正链和负链不再相互互补。

图2D显示了使用BS转化的正链序列进行的"BS-cccDNA"PCR测定设计。显示了正向引物、反向引物和TaqMan探针的位置(阴影)和序列。

图2E说明了'BS-cccDNA"与常规、当前或已发表的"cccDNA"PCR方法的示意图比较。该图说明了如果在不消除正链和负链的互补性(如通过亚硫酸氢盐处理)的情况下进行PCR，甚至如果引物设计位于rcDNA的正链中不连续的区域，则将产生可能的假阳性。

图2F通过cccDNA PCR在没有亚硫酸氢盐处理的情况下由rcDNA模板产生的假阳性的DNA序列，提供了进一步的详细说明。

图2G通过"BS-cccDNA"PCR测定(包括使用负链特异性和BS特异性引物和探针进行PCR扩增之前的DNA的亚硫酸氢盐处理)，分别由cccDNA模板和rcDNA模板产生的真阳性和真阴性的DNA序列，提供了另一种说明。用亚硫酸氢钠处理防止正向引物与(-)链退火，并因此特异性地扩增cccDNA而不是rcDNA。

图3描绘了根据本公开的一些实施方案的HBV cccDNA的检测。由图2E(和图2G)中的PCR扩增策略产生的互补扩增链与探针结合。当互补引物开始拷贝该扩增链时，遇到并消化探针，其从猝灭剂(BBQ)释放染料(FAM)。荧光的此类变化允许通过实时PCR进行定量检测。

图4A和4B显示了PCR所靶向的DR2区域中HBV病毒的8种基因型(A-H)的多序列分析。

图5描绘了两种合成的DNA模板，其类似于目标区域中的亚硫酸氢盐转化的HBVDNA。使用两条链，但其不是互补的并且是单链的。合成的BS-cccDNA模板包括两种DNA寡核苷酸，并且BS-rcDNA包括模拟负链的不连续性的3种DNA寡核苷酸。

该技术不依赖于酶促质粒安全性DNA酶预处理(Singh,Dicaire等人2004)，尽管如果需要，其可以组合使用。这种独立性是因为rcDNA的几乎完整的(+)链不能用作这种扩增反应的底物。经设计用于与(+)链空位重叠的亚硫酸氢盐处理区域的TaqMan探针确保了cccDNA的特异性定量。该方法还允许定量总HBV DNA，因为它不需要DNA酶或外切核酸酶，从而保持非cccDNA本底的完整性。

本文公开的方法适用于检测和/或定量任何来源的cccDNA，诸如但不限于来自乙型肝炎患者的血清，以评价肝脏损伤的严重性并评估抗病毒疗法的功效。

在经历抗病毒疗法且不继续治疗的患者中，HBV可以从cccDNA重新活化(PetersenJ 2007)。为了监测肝脏中cccDNA的持久性，需要重复的肝脏活检，这对患者来说是危险的、不舒服的和昂贵的(Wu,Johnson等人2014，Zhong,Hu等人2014，Shi,Sun等人2015)。由于cccDNA特别是在肝脏损伤后也可以在血液中发现，其在血清或血浆中的检测允许评价抗病毒疗法的功效和肝脏损伤的程度，而无需借助肝脏活检(Wong,Yuen等人2004，Takkenberg,Zaaijer等人2009)。

非常需要用于定量cccDNA的灵敏且有特异性的方法，尽管由于诸如每个细胞的cccDNA拷贝数低的因素，对于此类测定的开发已经被证明是困难的(Nassal 2015)。已经产生细胞系以增加每个细胞的cccDNA拷贝数(Singh,Dicaire等人2004)，允许通过DNA印迹检测(Liu,Campagna等人2013)。然而，DNA印迹不是从患者样品中检测cccDNA的合适方法。还通过设计靶向HBV DNA的(-)链重叠和(+)链空位区的引物来开发基于PCR的方法(He,Wu等人2002)。虽然这种方法可以选择性地用于HBV DNA，但它不能区分HBV基因组的cccDNA和rcDNA形式(Nassal 2015)。已描述了其它技术诸如滚动环状扩增和Invader技术，虽然无法获得真实且干净的量化(Wong,Yuen等人2004，Zhong,Hu等人2014，Nassal 2015)。

以前的研究表明，血清HBV cccDNA水平与慢性感染HBV患者的肝内cccDNA含量有很好的相关性(Li,Zhao等人2014)。因此，血清cccDNA检测可以用作肝内cccDNA水平的可靠且顺序监测，而不需要重复的肝脏活检。血清中cccDNA的定量检测将允许评价功效和指导抗病毒疗法(Chen,Sze等人2004)。虽然已经报道了用于检测HBV cccDNA的方法，但目前还没有用于cccDNA检测和定量的可商购获得的试剂盒。

一种可行的cccDNA检测方法对于开发抗HBV的新抗病毒药物、监测病毒进展和抗性以及发现肝外感染非常重要。大部分HBV药物发现工作旨在开发治愈而非抑制HBV的改良抗病毒药物(Ahmed,Wang等人2015，Kumar,Perez-del-Pulgar等人2016)。这将需要非常精确和灵敏的cccDNA检测方法，因为它以非常低的浓度(每个感染的肝脏的每个细胞平均0.1-1个拷贝)呈现。在接下来的几年中，经历抗病毒疗法的大部分HBV感染者也将从获得用于检测cccDNA的简易诊断方法中获益。

应该理解的是，上述实施方案仅仅是对许多和不同的实施方案的说明，这些实施方案可以构成本公开的原理的应用。在不脱离本公开的精神或范围的情况下，本领域技术人员可以容易地设计出此类其它实施方案，并且它们应被视为在本公开的范围内。

本申请中引用的所有参考文献都通过引用整体并入本申请。

通过以下非限制性实施例进一步说明本公开中描述的技术方法。

实施例1：如通过PCR检测的亚硫酸氢盐处理后的DNA的回收。

通过亚硫酸氢盐处理，使双链DNA的互补链不互补，所述亚硫酸氢盐处理将胞嘧啶核苷酸转化为尿嘧啶，如图2B所示。

在此，根据用于亚硫酸氢盐转化的制造商说明书，使用Qiagen Epitect亚硫酸氢盐转化试剂盒(Qiagen,CA)和Zymo Research EZ DNA Methylation Gold试剂盒(ZymoResearch,Zymo Research Corporation,CA)。来自人HCC组织样品的DNA经亚硫酸氢盐处理并在亚硫酸氢盐处理之前和之后用特定测定进行测试。通过运行靶向非亚硫酸氢盐处理的DNA区域和亚硫酸氢盐处理的DNA区域的测定，将组成型基因肌动蛋白上的区域用于比较(参见图8)。

图8显示了亚硫酸氢盐处理(BS)不会显著降低DNA靶区域的拷贝检测。对非亚硫酸氢盐处理的DNA和亚硫酸氢盐处理的DNA的肌动蛋白基因中的短产物进行扩增的引物进行比较，并且没有发现主要差异。来自感染HBV的患者的5种组织样品和5种血清样品用于这一比较。

对肌动蛋白基因进行亚硫酸氢盐处理之前和之后的比较表明，根据制造商说明书，亚硫酸氢盐处理回收率高，并且揭示了在本文所述的BS-cccDNA测定中使用的适用性。

实施例2：通过实时聚合酶链式反应(RT-PCR)进行DNA定量。

根据制造商说明书，使用LightCycler PCR仪器(Roche Biochemical,Germany)和LightCycler Probe Master Mix(Roche Biochemical,Germany)通过实时PCR定量总HBVDNA。用于亚硫酸氢盐处理的总HBV DNA的引物(正向，5'-TTATGTTAATGTTAATATGGGTTTAAA-3'；反向，5'-TTCTCTTCCAAAAATAAAACAA-3'；探针，5'-6FAM-TTAGATAATTATTG+TGG+T+T+T+TA+TA+T-BBQ 3')和连续稀释的HBV DNA质粒作为定量标准品用于定量。

为了定量亚硫酸氢盐转化的cccDNA，选择(+)链空位区内的引物(正向，5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTTGTYGGATYGTGTGTATTT-3'；反向，5'-AACRTTCACRATAATCTCCATAC-3')以防止rcDNA扩增。TaqMan探针5'6FAM-TTTTAT+T+T+T+T+G+TAY+G+TA-BBQ-3'用于检测扩增产物。

实施例3：通过实时PCR用于检测cccDNA的1步BS-cccDNA测定。

图7显示了在一步cccDNA测定中100拷贝的BS-cccDNA模板的灵敏度，以及在10⁵个拷贝的rcDNA本底中10⁸至100个拷贝的合成BS-cccDNA的线性。图5中描述的合成HBV模板的10倍连续稀释度范围为该测定的灵敏度和线性的100至10⁸个拷贝。数据表示为扩增曲线(顶部)和标准曲线(底部)。

使用引物组SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:24进行一步实时PCR。使用SEQ ID NO:29作为探针进行扩增产物的检测。人类甲基化的亚硫酸氢盐处理的DNA用作10,000个拷贝的阴性对照，并且没有可观察到的扩增。注意，10⁴个HMBS在类似于10个拷贝的cccDNA的cp值下被扩增，因此在10⁴个HMBS本底存在下，1步BS-cccDNA的检测的灵敏度或限制是100个拷贝。

以下方案使用利用10μl反应物和Roche DNA MasterGreen I系统的Roche实时PCR仪器。添加以下试剂：按顺序，5μl的2X LC探针的Master Mix(1X最终浓度)，1μl的PCR级的水，1μl的10uM的正向引物(SEQ ID NO:11，5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTTGTYGGATYGTGTGTATTT-3'；1μM最终浓度)，和1μl的10μM反向引物(SEQ ID NO:24，5'-AACRTTCACRATAATCTCCATAC-3'；1μM最终浓度)，和1μl的2μM探针(SEQ ID NO:29，5'-6FAM-TTTTAT+T+T+T+T+G+TAY+G+TA-BBQ-3'；0.2uM终浓度)。充分混合，并将9μl的该PCR反应物加入到1μl相应的DNA模板或样品中，以在Roche 96孔LightCycler 480板中达到总共10μl的终体积。在以下条件下运行RT-PCR反应：95℃5分钟，然后95℃10秒，52℃10秒，72℃10秒，45个循环，然后在40℃下冷却程序持续30秒。

实施例4：通过RT-PCR用于检测cccDNA的2步BS-cccDNA测定。

图6显示了2步BS-cccDNA测定的结果。图5中描述的合成HBV模板的10倍连续稀释度范围为该测定的灵敏度和线性的10至10⁸个拷贝。数据表示为扩增曲线(顶部)和标准曲线(底部)。对于第一步，使用引物组SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:24进行PCR扩增。对于第二步，使用第一步产物和引物组SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:24进行PCR。使用SEQ ID NO:29作为探针检测并定量扩增的产物。人类甲基化的亚硫酸氢盐处理的DNA用作10,000个拷贝的阴性对照，并且没有可观察到的扩增。

具体地，如下进行PCR反应：在0.5mL PCR微量离心管中组装含有15ul总体积的PCR反应物。使用QIAGEN HotStartPlusDNA聚合酶系统(QIAGEN,Valencia,Calif.)按顺序添加7.9ul的PCR级的水，1.5ul的10X PCR缓冲液(1x最终浓度)，1.5ul的2.5mM的dNTP(0.25mM最终浓度)，1μl的10uM正向引物(SEQ ID NO:17，5'-TTAYGYGGTTTTTTYGTTTGT-3'；1μΜ最终浓度)，1μl的10μM反向引物(SEQ ID NO:24，5'-AACRTTCACRATAATCTCCATAC-3'；1μΜ最终浓度)，和0.1ul的Taq聚合酶(最终浓度为0.033U)，以及1ul的相应DNA模板或样品。在以下PCR扩增条件下运行反应：95℃持续5分钟，然后95℃持续30秒，52℃持续30秒，72℃持续30秒，20个循环，然后在40℃下延长30秒。将PCR产物保持在4℃下，直到准备使用。

对于实时检测，使用实施例3中描述的相同程序进行步骤2反应，其中l ul的DNA模板输入来自前一步骤1，20个循环的扩增的产物，并且引物是1μl的10μM正向引物(SEQ IDNO:12，5'-GCTCTTCGTGGTGTGGTGTTTGTYGGATYGTGTGTATTT-3'；1μM最终浓度)和1μl的10μM反向引物(SEQ ID NO:24，5'-AACRTTCACRATAATCTCCATAC-3'；1μM最终浓度)。

实施例5：检测感染HBV的患者的肝脏活检中的cccDNA。

从感染HBV的患者获得HCC的肝脏组织活检，并将来自这些样品的分离的DNA进行亚硫酸氢盐处理。然后通过PCR测试亚硫酸氢盐处理的DNA的总HBV，并通过2步BS-cccDNA测定进行测试(参见图9)。

图9描绘了从感染HBV的患者的组织样品中检测到的HBV DNA的量。采用2步BS-cccDNA测定检测cccDNA，并显示随个体中HBV DNA变化的cccDNA量的变化。对于患者1和2，HBV DNA水平低于HBV测定的检测极限，即每个反应100个拷贝，但高灵敏度的cccDNA测定能够检测低水平的cccDNA。

总HBV DNA输入小于10⁵个拷贝，表明非cccDNA(包括rcDNA)不应通过两步cccDNA测定来检测。因此，来自该测定的扩增是HBV感染的肝脏组织样品中特异性cccDNA检测的明确证据。

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序列表

<110> JBS科学公司 (JBS Science Inc.)

苏比希·詹恩 (Jain, Surbhi)

雅明·D·斯蒂芬 (Steffen, Jamin D)

宋尉 (Song, Wei)

<120> 乙型肝炎病毒CCCDNA的定量测量

<130> JBS0011-1

<150> US 62/295,481

<151> 2016-02-15

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 含有来自HBV DNA的修饰的序列 (Containing modified sequence from HBVDNA)

<220>

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<223> T/C

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<212> DNA

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<223> HBV

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<223> T/C

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gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagtttgty ggatygtgtg tattt 55

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<223> T/C

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<222> (4)..(4)

<223> G/A

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> G/A

<400> 22

aacrttcacr ataatctcca tacta 25

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> HBV

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> G/A

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> G/A

<400> 23

aacrttcacr ataatctcca tact 24

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> HBV

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> G/A

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> G/A

<400> 24

aacrttcacr ataatctcca tac 23

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> HBV

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> G/A

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> G/A

<400> 25

aacrttcacr ataatctcca ta 22

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> HBV

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> G/A

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> G/A

<400> 26

aacrttcacr ataatctcca t 21

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> HBV

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> G/A

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> G/A

<400> 27

aacrttcacr ataatctcca 20

<210> 28

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> HBV

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> G/A

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> G/A

<400> 28

gctcttcgtg gtgtggtgaa crttcacrat aatctccata c 41

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> HBV

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 6-FAM

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> T/C

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> T/C

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> T/C

<220>

<221> misc_feature

<222> (35)..(35)

<223> BBQ

<400> 29

ttgtyggaty gtgtgtattt ygttttattt ttgta 35

<210> 30

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> HBV

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 6FAM

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> LNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> LNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> LNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> LNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> LNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> LNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> T/C

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> LNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> LNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> BBQ

<400> 30

ttttattttt gtaygta 17

<210> 31

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 6FAM

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> T/C

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> LNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> LNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> T/C

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> LNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> LNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> LNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> BBQ

<400> 31

tttgtyggat ygtgtg 16

Claims

1.用于检测或定量DNA样品中的闭合共价环状DNA(cccDNA)的方法，所述DNA样品含有cccDNA和与所述cccDNA具有基本上相同的DNA序列且与所述cccDNA呈不同形式的非cccDNA，所述方法包括：

i)处理DNA样品以消除经处理的DNA样品中的双链DNA分子的互补特征并从而防止双链DNA分子的两条链复性；和

ii)对所述经处理的DNA样品进行扩增测定，使得所述cccDNA能产生扩增的产物，但非cccDNA不能产生扩增的产物。

2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤i)中，所述DNA样品用化学试剂处理，所述化学试剂被配置为改变所述经处理的DNA样品中的所述双链DNA分子的两条链的序列并从而消除所述双链DNA分子的两条链的互补特征。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述化学试剂通过引起脱氨基反应起作用。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述脱氨基反应对于特定核苷酸是有选择性的。

5.如权利要求1所述的方法，其中步骤ii)中的所述扩增测定用一对引物进行，所述引物被配置为分别与所述DNA序列上的两个策略性位置退火并且一起被配置为能够从所述cccDNA产生扩增的产物，但不能从非cccDNA产生扩增的产物。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述两个策略性位置分别在所述非cccDNA中的不连续链的已知不连续区的两侧。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述引物对被配置为分别与所述经处理的DNA样品中的连续链的两个策略性位置退火，并从而从所述经处理的DNA样品中的连续链产生扩增的产物。

8.如权利要求7所述的方法，其中步骤ii)中的扩增测定包括实时聚合酶链式反应(PCR)，其被配置为基于所述扩增的产物定量所述cccDNA。

9.如权利要求7所述的方法，其中进一步用探针进行步骤ii)中的所述扩增测定，所述探针被配置为与所述经处理的DNA样品中的连续链退火，但不与不连续链退火，并且被配置为允许对所述cccDNA进行定量。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述探针分别在5'端和3'端处用荧光染料和荧光猝灭剂标记，其分别被配置为允许通过测量荧光强度来对所述cccDNA进行定量。

11.如权利要求1所述的方法，其中：

所述cccDNA包括乙型肝炎病毒(HBV)的cccDNA形式；以及

所述非cccDNA包括HBV的松弛环状DNA(rcDNA)形式。

12.如权利要求11所述的方法，其在步骤i)之前进一步包括：从生物样品获得所述DNA样品，其中所述生物样品是组织或体液。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述体液是血清、血浆、血液、尿液或唾液。

14.用于检测或定量DNA样品中的闭合共价环状DNA(cccDNA)的试剂盒，所述DNA样品含有cccDNA和与所述cccDNA具有基本上相同的DNA序列且与所述cccDNA呈不同形式的非cccDNA，所述试剂盒包括：

化学试剂，其被配置为消除由其处理的所述DNA样品中的双链DNA分子的互补特征并从而防止双链DNA分子的两条链的复性；和

一对引物，其包括正向引物和反向引物，并且被配置为分别与所述DNA序列上的两个策略性位置退火且一起被配置为能够从所述cccDNA产生扩增的产物但不能从所述非cccDNA产生扩增的产物。

15.如权利要求14所述的试剂盒，其中所述化学试剂包括亚硝酸、亚硝酸钠、亚硝胺或亚硫酸氢钠中的至少一种。

16.如权利要求14所述的试剂盒，其中：

所述两个策略性位置分别位于所述非cccDNA中不连续链的已知不连续区的两侧；和

所述引物对被配置为分别与所述经处理的DNA样品中的连续链的两个策略性位置退火并从而从连续链产生扩增的产物。

17.如权利要求16所述的试剂盒，其进一步包括探针，其中所述探针被配置为与所述经处理的DNA样品中的连续链退火但不与不连续链退火，并且被配置为允许对所述cccDNA进行定量。

18.如权利要求17所述的试剂盒，其中所述探针分别在5'端和3'端处用荧光染料和荧光猝灭剂标记。

19.如权利要求18所述的试剂盒，其中：

所述荧光染料包括6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、FAM(5-羧基荧光素)、HEX(2',4',5',7'-四氯-6-羧基-4,7-二氯荧光素)或Cy5(菁-5)中的至少一种；以及

所述荧光猝灭剂包括6-羧基四甲基-罗丹明、TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)、BBQ(黑莓猝灭剂)或BHQ3(黑洞猝灭剂3)中的至少一种。

20.如权利要求14所述的试剂盒，其中:

所述cccDNA包括HBV的cccDNA形式；和

所述非cccDNA包括HBV的rcDNA形式。

21.如权利要求20所述的试剂盒，其中所述正向引物包含如SEQ ID NO:1-21中任一个所示的序列。

22.如权利要求20所述的试剂盒，其中所述反向引物包含如SEQ ID NO:22-28中任一个所示的序列。

23.如权利要求22所述的试剂盒，其中所述反向引物是SEQ ID NO:24。

24.如权利要求23所述的试剂盒，其中所述正向引物是SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:17。

25.如权利要求20所述的试剂盒，其进一步包括探针，其中所述探针包含如SEQ ID NO:29-31中任一个所示的序列。

26.在样品中可区别地检测cccDNA与rcDNA的方法，所述方法包括：(a)用核苷酸转化试剂处理所述样品；和(b)通过PCR程序检测所述cccDNA。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述核苷酸转化试剂是脱氨基剂。

28.如权利要求26所述的方法，其中所述PCR程序使用跨越不连续区的一对引物。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述引物对被配置为分别与不连续区两侧上的两个策略性位置退火并且一起被配置为能够从所述cccDNA产生扩增的产物但不能从非cccDNA产生扩增的产物。

30.如权利要求28所述的方法，其中所述PCR程序进一步使用探针，其中所述探针被配置为与连续链退火，但不与不连续链退火。