CN101285105A

CN101285105A - 一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量检测方法和试剂盒

Info

Publication number: CN101285105A
Application number: CNA2008101045112A
Authority: CN
Inventors: 陆海英
Original assignee: Beijing Jiuzhou Shuangbo Pharmaceutical Sci & Tech Co Ltd
Current assignee: Nanjing Zhongxin Translational Medicine Institute Co., Ltd.
Priority date: 2008-04-21
Filing date: 2008-04-21
Publication date: 2008-10-15
Anticipated expiration: 2028-04-21
Also published as: CN101285105B

Abstract

本发明涉及“一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量检测方法和试剂盒”属于基因工程领域。一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量检测方法，包括PCR扩增反应体系，其特征在于：该PCR体系包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物位置在HBV基因组核苷酸序列1520－1580，下游引物位置在HBV基因组核苷酸序列1920－2000；探针位置在HBV基因组核苷酸序列1850－1900，探针两端分别连接荧光基团和淬灭基团。该方法敏感度高，检测线形范围宽且节省试剂的消耗。

Description

一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量检测方法及试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染可以引起慢性肝炎、肝硬化，甚至肝癌。我国HBV感染者约为1.2亿，慢性乙型病毒性肝炎(慢乙肝)患者约3500万，其中约20％的患者将发展为肝硬化，约5~10％的患者将发生肝癌。目前国内、外尚无根治慢乙肝的有效药物和方法，因此，HBV感染导致的慢性肝炎、肝硬化不仅严重地威胁我国人民的身心健康，而且还带来巨大的经济负担。研究HBV，寻找能彻底治疗慢乙肝的治疗方法一直是我国传染病学领域的重大攻关课题。

慢乙肝的难治性与HBV复制的特殊性密切相关，乙肝病毒进入肝细胞后，在肝细胞浆内脱去核衣壳，松弛环状DNA(relaxed circular virus DNA，RC-DNA)进入肝细胞核内，在酶的作用下，将短链补齐，即成为共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)。病毒以cccDNA为摸板，在细胞浆中合成含有HBV全部遗传信息的前基因组RNA和分子量不同的mRNA，再以前者为摸板先后合成HBV的正、负HBV链(Rc DNA)，并翻译各种病毒的结构蛋白，最后在胞浆的内质网内组装病毒，从而完成整个病毒的复制。在细胞浆中复制的新Rc DNA一方面可以合成新的乙肝病毒，另一方面可又进入细胞核，形成新的cccDNA。所以cccDNA有两个来源，一个是来源于血浆中的乙肝病毒，一个是来源于自身复制出来的Rc DNA。现有的抗病毒药物均是通过抑制或影响HBV DNA的合成而发挥其抗病毒作用，对HBVcccDNA作用极少，一旦停止治疗，HBV很快又以cccDNA为摸板开始病毒DNA的复制，造成肝细胞的持续炎症损伤，导致肝炎、肝硬化的发生。所以肝细胞核内一个稳定的cccDNA分子池是HBV持续复制、感染肝细胞的根源，cccDNA的问题是解决慢乙肝治疗的关键之所在，也是近年来乙型肝炎病毒研究的热点。

乙型肝炎治疗终点的选择还很困难，长期用药不仅费用昂贵，还会诱发病毒变异导致耐药等问题。目前，临床一般以HBV DNA小于10³拷贝/毫升、ALT恢复正常和HBeAg血清学转换为判断抗病毒治疗有效的标准，但是停药后大多数患者病情在1年内复发。因此，上述指标不是判断抗病毒治疗应答及安全停药的理想指标。研究发现，在抗病毒治疗结束时，持久应答者肝内cccDNA显著低于非持久应答者，而外周血HBV DNA水平在持久应答者与非持久应答者间无明显差异。以log cccDNA降到-0.8每个肝细胞为抗病毒治疗停药指征，其预测持久应答的敏感性为73％，特异性为78％，阳性率为56％，准确率为77％。以上结果提示，肝组织内cccDNA的含量与抗病毒治疗远期疗效密切相关，对于抗病毒治疗远期疗效的预测优于血清HBV DNA，有望成为判断慢性乙型肝炎抗病毒治疗终点的指标之一。cccDNA的检测除了可以指导抗病毒治疗，对病情的诊断也有参考意义，有学者在肝炎活动的慢乙肝患者外周血中检测到cccDNA，其与ALT的升高具有明显相关性，且早于ALT升高，因而，cccDNA可以作为乙型肝炎肝损伤的早期标志。

要研究HBV cccDNA，首先必须掌握检测cccDNA的方法。由于cccDNA与Rc DNA的主要区别在它是完整的双链环状DNA，而后者的环有部分的缺失，而且平均每个被感染的肝细胞内仅含有10-25拷贝cccDNA分子，因此检测cccDNA具有一定的难度。以前对细胞内cccDNA的了解不多也就是因为缺少特异的检测手段。传统cccDNA检测方法为Souther blot法，操作繁琐，敏感性低，且不能准确定量，故难以在临床上应用。近20年来，由于PCR技术的出现和发展，我们可以通过针对Rc DNA缺少的核苷酸序列设计引物，从而达到特异扩增cccDNA的目的。目前cccDNA定量检测方法的研究在国外及香港开展得较多，但国内报道不多。本发明人一直从事上述方法的研究，曾发表过cccDNA定量检测方法的文章，但该方法的灵敏度不是很高，只有10³-10⁹拷贝/毫升，且序列标本DNA需要量为10ng/ml。

发明内容

针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量检测方法，稳定性好、灵敏度高以了解乙型肝炎病毒的复制情况，指导慢乙肝治疗方案的制定，评估抗病毒药物的疗效和判定抗病毒治疗的终点，以期实现cccDNA定量检测的临床应用。

同时本发明还提供一种使用该方法的试剂盒，以期真正实现cccDNA定量检测的临床应用。因此，该方法的建立有着极为重要的临床应用价值和开发前景。

一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量检测方法，包括PCR扩增反应体系，其特征在于：该PCR体系包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物位置在HBV基因组核苷酸序列1520--1580，下游引物位置在HBV基因组核苷酸序列1920-2000；探针位置在HBV基因组核苷酸序列1850--1900，探针两端分别连接荧光基团和淬灭基团。

所述PCR的上游引物序列为：5’-cacctctctttacgcggtct-3’；下游引物序列为：5’-atacgggtcaatgtccatgc-3’；探针序列为：FAM TTCAAGCCTCCAAGCTGT 5NFQ。

所述PCR扩增反应体系为：10ng DNA样本，2μl 10×dNTP和0.5U Taq DNA多聚酶，上、下游引物各25ng、探针25ng，总体积20μl。

PCR扩增反应条件为94℃预变性5min，94℃30s、60℃1min、72℃1min，循环35次，72℃延伸10min。

所述DNA样本来自血液或肝组织，模板总DNA浓度不低于5ng/μl。

一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量检测试剂盒，包括权利要求1或2所述的PCR扩增反应体系。

所述PCR扩增反应体系包括2μl 10×dNTP和0.5U Taq DNA多聚酶，上、下游引物、探针各25ng。

所述PCR扩增反应体系中检测的DNA样本来自血液或肝组织，模板总DNA浓度不低于5ng/μl。

所述PCR扩增反应条件为94℃预变性5min，94℃30s、60℃1min、72℃1min，循环35次，72℃延伸10min。

HBV cccDNA分子池是HBV持续复制、感染肝细胞的根源，也是慢乙肝抗病毒停药后病情反跳的重要原因之一，cccDNA定量扩增的难点在于区别cccDNA和rcDNA，两者在结构及理化特性上有着很大区别，这种不同是cccDNA特异性检测方法建立的基础。基于此，我们对比分析70条HBV A-G基因亚型序列，选择在基因保守区域设计引物和探针，使之具有更广泛的代表性。HBV DNA基因组正负链缺口之间间隔223bp，我们在两缺口之外的保守区域设计引物、探针，扩增片段大小约为370bp，保证了不同基因亚型的阳性检出率，同时实现了cccDNA与rcDNA的区别扩增，达到特异性扩增cccDNA的目的。

我们利用该方法对10²~10¹⁰拷贝/毫升的标准质粒进行检测，最低可以检测到10²拷贝/毫升，其上限能达到10¹⁰拷贝/毫升，表明该方法敏感度高，检测线形范围宽。对10⁶拷贝/毫升的标准质粒平行重复30次，Ct值为29.78±0.34，变异系数为1.06％，表明该方法有很好的重复性。目前，国内报道的cccDNA定量检测方法反应总体积为50ul，检测线性范围一般为1×10³~1×10⁹拷贝/毫升。而我们建立的方法反应体积为20ul，检测线形范围为1×10²~1×10¹⁰拷贝/毫升，即节省了试剂的消耗，也提高了检测方法的灵敏度。同时本发明所需的DNA模板浓度最低可以检测到5ng/μl.

本发明的cccDNA荧光定量检测方法具有广泛的代表性，特异性好，灵敏度高。目前，国内外尚无商品化的HBV cccDNA定量检测试剂盒，因此，根据本发明方法制成的检测试剂盒，将具有很好的临床应用价值和广阔的市场前景。

附图说明

图1：引物、探针位置示意图

即HBV(ayw亚型)基因结构示意图DR1：1826-1836 DR2：1592-1602。

其中→表示引物，表示探针。

图2：cccDNA特异性扩增原理示意图

图3：PCR产物电泳结果

L1为阴性对照，L2，L3，L4，L5为样品

图4：PCR产物测序结果

图5：检测曲线的建立

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

下列实施列中所用的引物及探针可从基因公司合成，所用试剂均采用常规方法配制，所用试剂原料也是市场购得，可用常规的荧光定量PCR仪进行定量检测。

实施例1

步骤1、采集样本

检测样本为乙肝患者的新鲜全血1-5ml，或肝活检组织，取样后冻存于-70℃。

步骤2、DNA提取

全血DNA提取采用普通市售全血DNA提取试剂盒，本发明采用北京三博远志生物技术有限责任公司的全血基因组DNA提取试剂盒，操作步骤按试剂盒说明书。肝组织DNA的提取采用普通市售的基因组DNA提取试剂盒，本发明用天为时代的基因组DNA提取试剂盒。

提取的DNA通过紫外分光光度计测260nm的OD值，计算浓度，调整浓度为不低于5ng/ul，4℃保存备用。

步骤3、引物探针的设计与合成

引物及探针的设计如图1。PCR扩增检测原理见图2

上游引物序列，5’-CACCTCTCTTTACGCGGTCT-3’(1529-1549)，下游引物，5’-ATACGGGTCAATGTCCATGC-3’(1920-1940)。

荧光探针序列位置在1850-1900之间，本发明的探针结构为FAM-TTCAAGCCTCCAAGCTGT-5NFQ。

引物、探针的合成由生物公司完成。

步骤4、PCR扩增检测

PCR体系：2μlDNA样本，2μl 10×dNTP和0.5U Taq DNA多聚酶，上、下游引物各1ul(25ng/ul)、探针各1μl(25ng/ul)，加无菌水至总体积20μl。

PCR程序：94℃，5min，94℃30s、60℃1min、72℃1min，循环35次，72℃延伸10min。取5ul PCR产物做琼脂糖电泳检测如图3，扩增条带为370bp，剩余产物送至生物公司测序，如图4。

步骤5，建立检测曲线

将经过检测验证的步骤4的PCR产物回收、纯化后连接至pGEM-Easy载体构成携带目的片段的质粒，转化、培养、大量提取质粒，质粒经PCR电泳检测为阳性后，用紫外分光光度计测定吸光值，换算出拷贝浓度，稀释成10²～10¹⁰拷贝/毫升4个梯度10²拷贝/毫升，10⁵拷贝/毫升，10⁸拷贝/毫升，10¹⁰拷贝/毫升，分别取这4个浓度梯度的质粒1ul作为模板，同时作一空白对照，采用步骤4的PCR体系和程序检测质粒。

检测结果表明，可检测的质粒浓度范围在10²~10¹⁰拷贝/毫升之间，见图5。

Claims

1、一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量检测方法，包括PCR扩增反应体系，其特征在于：该PCR体系包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物位置在HBV基因组核苷酸序列1520--1580，下游引物位置在HBV基因组核苷酸序列1920-2000；探针位置在HBV基因组核苷酸序列1850--1900，探针两端分别连接荧光基团和淬灭基团。

2、根据权利要求1所述的方法，所述PCR的上游引物序列为：5’-cacctctctttacgcggtct-3’；下游引物序列为：5’-atacgggtcaatgtccatgc-3’；探针序列为：FAM TTCAAGCCTCCAAGCTGT 5NFQ。

3、根据权利要求2所述的方法，所述PCR扩增反应体系为：10ng DNA样本，2μl10×dNTP和0.5U Taq DNA多聚酶，上、下游引物各25ng、探针25ng，总体积20μl。

4、根据权利要求3所述的方法，PCR扩增反应条件为94℃预变性5min，94℃30s、60℃ 1min、72℃ 1min，循环35次，72℃延伸10min。

5、根据权利要求3所述的方法，所述DNA样本来自血液或肝组织，模板总DNA浓度不低于5ng/μl。

6、一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量检测试剂盒，包括权利要求1或2所述的PCR扩增反应体系。

7、根据权利要求6所述试剂盒，所述PCR扩增反应体系包括2μl 10×dNTP和0.5U TaqDNA多聚酶，上、下游引物、探针各25ng。

8、根据权利要求7所述试剂盒，所述PCR扩增反应体系中检测的DNA样本来自血液或肝组织，模板总DNA浓度不低于5ng/μl。

9、根据权利要求8所述试剂盒，所述PCR扩增反应条件为94℃预变性5min，94℃30s、60℃ 1min、72℃ 1min，循环35次，72℃延伸10min。