JP4197623B2 - インターフェロンの治療効果を予測するための新規多型マーカー、プライマー、プローブおよびインターフェロンの治療効果を予測する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターフェロンの治療効果を予測するための新規多型マーカー、プライマー、プローブおよびインターフェロンの治療効果を予測する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｃ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣＶ」と記す）の感染により生じるＣ型肝炎の多くは、やがて慢性Ｃ型肝炎を引き起こし、その一部は肝硬変を経て肝細胞癌へ進展する。このような進展を阻止するために、現在インターフェロン（以下「ＩＦＮ」と記す）療法が用いられている。しかしながら、ＩＦＮ療法によって完全著効を示す患者は全体の極僅かでしかなく、その一方で、ＩＦＮ療法は高価であり、またその治療には重篤な副作用が存在する。従って、ＩＦＮによる治療を開始する前に、その対象となる患者におけるＩＦＮ療法の効果を予測しておくことが重要である。
【０００３】
ＩＦＮ療法の効果を左右する因子は既に幾つかが明らかとなっている。例えば、ウイルス側の因子は、血中ウイルス量およびＨＣＶ遺伝子型のタイプなどであり、宿主側の因子は、ＩＦＮ受容体遺伝子、ＭｘＡ遺伝子およびＭＢＬ遺伝子の遺伝子多型のタイプや、患者の年齢および性別、罹患している期間並びに肝繊維化など肝臓病変の程度などである。
【０００４】
【非特許文献１】
齋藤英胤、多田慎一郎、石井裕正著「インターフェロン治療の最前線の知見」、株式会社メディカルレビュー社発行、２００２年１月３０日、p７１−７７
【０００５】
【非特許文献２】
Hidetsugu Saito, Shinichiro Tada, Hirotoshi Ebinuma, Kanji Wakabayashi, Tamako Takagi, Yoshimasa Saito, Nobuhiro Nakamoto, Satoshi Kurita, and Hiromasa Ishii, Journal of Cellular Biochemistry Supplement 36:191-200, (2001)
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上述のＩＦＮ療法の効果を左右する因子を各患者において特定しても、なお充分な予測ができないのが現状である。
【０００７】
従って、本発明の目的は、インターフェロンの治療効果を予測するための新規多型マーカー、プライマー、プローブおよびインターフェロンの治療効果を予測する方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上述の課題を解決するための手段は、本発明の側面に従うと、インターフェロン調節因子−１遺伝子のプロモーター領域の−５９７位に存在するＩＦＮの治療効果を予測するための多型マーカー；
インターフェロン調節因子−１遺伝子のプロモーター領域の−７２３位に存在するＩＦＮの治療効果を予測するための多型マーカー；
インターフェロン調節因子−１遺伝子のプロモーター領域の−５９７位または−７２３位に存在するＩＦＮの治療効果を予測するための多型マーカーの遺伝子型を決定するためのプライマーまたはプローブ；並びに、
ＨＣＶ２型感染者においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法であって、
（１）前記個体に由来するサンプルを得ること、
（２）（１）のサンプルについて、インターフェロン調節因子−１遺伝子プロモーター領域の少なくとも１のＳＮＰの遺伝子型を決定すること、および
（３）（２）で決定された遺伝子型からＩＦＮ療法の有効性の予測を行うこと、
を具備するＨＣＶ２型感染者においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法；
である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
１．ＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域の多型
本発明は、本発明者らがＩＦＮ療法の効果に影響を与える新規遺伝子多型、即ち、ＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域の−５９７位および−７２３位に存在する一塩基多型（以下「ＳＮＰ」と記す）を発見したことに基づく。これらの多型の型に依存して、特に、２型ＨＣＶ感染者におけるＩＦＮの治療効果を予測することが可能である。ここで用いる「インターフェロン」とは、インターフェロンαおよびβ（以下「ＩＦＮα／β」とも記す）を指す。
【００１０】
インターフェロン調節因子−１（以下「ＩＲＦ−１」と記す）は、対象におけるＩＦＮの作用に影響を与える重要な因子である。対象に投与されたＩＦＮは、一般的にウイルスに対して二相性に作用すると考えられている。即ち、投与されたＩＦＮ自身によるウイルスへの作用と、続いて生じる宿主細胞性免疫賦活作用によるウイルスへの作用である。双方の作用が充分であって初めてＩＦＮはウイルス学的に著効となる。ＩＲＦ−１は、これらの作用の何れにおいても重要な役割を担っている。
【００１１】
対象に投与されたＩＦＮは、細胞表面上の受容体に結合する。この結合により、Ｊａｋ ｋｉｎａｓｅによるＳＴＡＴ１のリン酸化が生じ、これにより転写因子であるＧＡＦ（gamma-activated factor）とＩＳＧＦ３（IFN stimulated gene factor 3）が形成される。ＩＳＧＦ３は、ＩＦＮ誘導遺伝子のＩＳＲＥに結合し、ＩＦＮ誘導遺伝子の転写を活性化する。また、ＧＡＦは、ＩＦＮ誘導遺伝子とＩＲＦ−１遺伝子の転写調節領域のＧＡＳに夫々結合し、ＩＦＮ誘導遺伝子の転写を活性化すると同時に、ＩＲＦ−１によるＩＦＮ誘導因子発現の増強を引き起こす。また、ＩＲＦ−１は、細胞障害性Ｔ細胞の賦活化作用にも重要な働きをしていると考えられている（非特許文献１を参照されたい）。
【００１２】
実施例において詳しく述べるように、本発明者らにより新たに見出されたＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の−５９７位および−７２３位に存在するＳＮＰは、上述のようなＩＲＦ−１の効果に大きな影響を与える多型である。
【００１３】
また、このＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の−５９７位および−７２３位に存在するＳＮＰは、公知のＩＲＦ−１遺伝子プロモーターの他の部位に存在する３つのＳＮＰ（Saito H. et al., J. Cell. Biochem.36, 191-200, 2001）と連鎖していることも本発明者らの解析により明らかになった。当該公知のＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の多型部位とは、以下の実施例に記載した本研究の−２９７位（当該Saito H.らの文献の−３００位に相当する）、−４０７位（当該Saito H.らの文献の−４１０位に相当する）、および−４１２位（当該Saito H.らの文献の−４１５位に相当する）である。
【００１４】
図１および図２には、受付番号ＡＣ０７９３２０でＧｅｎＢａｎｋに登録されているＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域の配列と、それに存在するＳＮＰｓ、即ち、本発明に従う新規ＳＮＰと上記公知のＳＮＰの存在する位置を示した。また図１および図２には、受付番号ＡＣ０７９３２０のＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域と、今回解析した３つの異なるタイプの遺伝子型を有する個体から得た塩基配列、ＩＲＦ−００４Ｇ、ＩＲＦ−０１２ＡおよびＩＲＦ００１Ｒを並べて示した。配列の左に示した記号は、サンプル番号であり、プロモーターＳＮＰｓをタイプ分けしたＧ、Ａ、Ｒ文字を列記した。
【００１５】
図１および図２において「−７２３」と「−５９７」と付した位置は、転写開始部位を１とした場合のその上流７２３番目と５９７番目の位置であり、この位置が本発明に従う新規多型部位である。−７２３位の多型の取り得る塩基は、アデニン（以下「ａ」と記す）またはグアニン（以下「ｇ」と記す）である。−５９７位の多型の取り得る塩基は、チミン（以下「ｔ」と記す）またはシトシン（以下「ｃ」と記す）である。また、「−４１２」、「−４０７」および「−２９７」と付した位置は、転写開始部位を１とした場合のその上流４１２番目、４０７番目および２９７番目の位置であり、これらは何れも従来公知の多型部位である。−４１２位の多型の取り得る塩基はｃまたはａである。−４０７位の多型の取り得る塩基はａまたはｇである。−２９７位の多型の取り得る塩基はａまたはｇである。図１および図２の配列表において「ｒ」と記載した場合、その位置の対立遺伝子の一方がａであり他方がｇであることを示す。同様に「ｙ」と記載した場合、その位置の対立遺伝子の一方がｔであり他方がｃであることを示し、「ｍ」と記載した場合には、対立遺伝子の一方がｃであり他方がａであることを示す。
【００１６】
ここで「遺伝子型」とは、全対立遺伝子、あるいは、注目している遺伝子座の遺伝子の存在状態を指す。「遺伝子座」とは、染色体、もしくは遺伝子地図上での遺伝子の位置を指す。例えば、互いに対立遺伝子である遺伝子の場合は同一の遺伝子座にある。「対立遺伝子」とは、相同染色体の相同な場所に位置し、機能的にも相同な遺伝子をいう。
【００１７】
本発明者らは、慢性Ｃ型肝炎の患者１５７人から得たＤＮＡを解析し、前述したように当該５つの多型は連鎖の関係にあり、それらの遺伝子型は３つのタイプに分類できることを明らかにした。ここでは便宜上、転写開始点から一番近い位置のＳＮＰである−２９７位の塩基に従ってタイプを表記すると、当該遺伝子型は、Ｇ型（ＧＧホモ）、Ａ型（ＡＡホモ）およびＲ型（ＡＧヘテロ）の３種である。当該５つのＳＮＰが互いに連鎖する様子は図３に示す通りである。即ち、Ｇ型の場合の夫々の対立遺伝子の塩基は、−２９７位ではＧＧ、−４０７位ではＧＧ、−４１２位ではＡＡ，−５９７位ではＣＣ、−７２３位ではＧＧである。Ｒ型の場合の夫々の対立遺伝子の塩基は、−２９７位ではＧＡ、−４０７位ではＧＡ、−４１２位ではＡＣ，−５９７位ではＣＴ、−７２３位ではＧＡである。Ａ型の場合の夫々の対立遺伝子の塩基は、−２９７位ではＡＡ、−４０７位ではＡＡ、−４１２位ではＣＣ，−５９７位ではＴＴ、−７２３位ではＡＡである。ここで図３中の「検体数」はサンプルを採取した患者１５７人における該当数である。
【００１８】
１５７例全体で見た場合は、ＩＲＦ−１の遺伝子型とＩＦＮの治療効果の間に有意な相互関係は認められなかった（図４を参照されたい）。図４に示す「ＳＲ」は著効、「ＮＲ」は非著効を示す。著効および非著効の何れの治療効果の場合も、Ｒタイプが最も多く、ついでＧタイプ、Ａタイプの順であり、治療効果別のＳＮＰｓの特徴は認められなかった。
【００１９】
２．ＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の遺伝子型とＩＦＮ治療効果との関係当該５つのＳＮＰの遺伝子型とＩＦＮ治療効果との関係を、Ｃ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣＶ」と記す）の遺伝子型別に図５に示す。図５は、慢性Ｃ型肝炎の患者１５７人について感染しているウイルス遺伝子型とＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の当該５つのＳＮＰの遺伝子型を調べた結果である。ＨＣＶ遺伝子型２型におけるＩＦＮ療法の効果は、完全著効例がＧ型で１０例（２９％）、Ｒ型で１９例（５６％）およびＡ型で５例（１５％）であった。一方、非著効例はＧ型で１４例（６６％）、Ｒ型で５例（２４％）およびＡ型で２例（１０％）であった。それに対して、ＨＣＶ遺伝子型１型においては、ＩＲＦ−１の遺伝子型とＩＦＮの治療効果の間に有意な相互関係は認められなかった（図５を参照されたい）。
【００２０】
また、ＨＣＶ遺伝子型１型に比して、ＨＣＶ遺伝子型２型はＲ型が少なくＧ型が多いという傾向も認められた（図５を参照されたい）。図５に示す通り、ＨＣＶ１型の著効も非著効もＲタイプが最も多く次いでＧタイプ、Ａタイプの順であり、それはＨＣＶ２型の著効例も同様の傾向を示した。ただ、ＨＣＶ２型の非著効においては、最も多いタイプがＧタイプで、ついでＲタイプ、Ａタイプの順であり、他とは異なる傾向を示した。この差を検証するために、Ｇ型かまたはそれ以外（Ｒ型かＡ型）という分類をして、ＨＣＶ遺伝子型別にカイ２乗検定を行なった（図６を参照されたい）。その結果、一方のＨＣＶ遺伝子型２型においては、完全著効例はＧ型が１０例（２９％）、Ｒ型もしくはＡ型が２４例（７１％）であり、非著効例はＧ型が１４例（６６％）、Ｒ型もしくはＡ型が７例（３４％）であること分かった。これは明らかに統計学的に有意な差である（ｐ＝０．００６７９７２）。
【００２１】
これらの結果から、ＨＣＶ遺伝子型２型が感染した患者は、Ｇ型であればＩＦＮ治療が効かない可能性が高く、Ｒ型やＡ型であれば著効する可能性が高いと判定することが可能である。即ち、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーターにおける互いに連鎖した５つの何れかのＳＮＰｓを調べることにより、遺伝子型２型のＨＣＶが感染した患者においけるＩＦＮ療法の治療効果が予測することが可能となった。
【００２２】
これまでの報告から、宿主側のＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域のＳＮＰ、即ち、−２９７位、−４０７位および−４１２位のＳＮＰの遺伝子型の違いによって、ＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域の二次構造に違いが生じ、それによって生じるプロモーター活性の違いによって、リンパ球からのＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０の分泌に違いがあることは明かとなっている（Saito H. et al., J. Cell. Biochem.36, 191-200, 2001）。しかしながら、実際のＩＦＮ治療の結果として、患者の遺伝子型と治療効果の相関を示したデータはなかった。また、宿主側のＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域のＳＮＰの遺伝子型の違いばかりではなく、更に感染しているＨＣＶの遺伝子型が明かとなって初めてＩＦＮの治療効果を予測できることが、本発明者らの研究から明らかとなった。このような知見は、ＩＦＮの治療効果を予測するための手段として非常に重要である。
【００２３】
３．多型マーカー
上述したようにＩＲＦ−１遺伝子プロモーターにおける互いに連鎖した５つのＳＮＰｓは、ＨＣＶに感染した患者、特に遺伝子型２型のＨＣＶに感染した患者においてＩＦＮ療法の治療効果を予測するための多型マーカーとして使用することが可能である。このような多型マーカーも本発明の範囲内である。本発明の多型マーカーは、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の−５９７位、−７２３位、−２９７位、−４０７位および−４１２位に存在する。
【００２４】
ここで使用される「多型マーカー」とは、問題となる位置に存在する多型の遺伝子型からＩＦＮの治療効果を予測するための指標として使用されるマーカーである。具体的には、対象より採取されたサンプル中に含まれる特定の核酸の特定の部位を示すが、当該部位を含む核酸断片であってもよい。また、当該多型部位を特定するために使用されるプローブおよびプライマーなどの核酸断片からなる検出手段も本発明の範囲内である。当該プローブおよびプライマーは、当該多型マーカーの遺伝子型を決定するために使用される手段である。当該プローブは、標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出することにより、当該多型マーカーの遺伝子型を決定できる核酸断片であればよく、詳細な条件は、それ自身公知の何れかの方法を利用して当業者が容易に選択することが可能である。当該プライマーは、標的核酸を鋳型として伸長または増幅反応を利用して当該多型マーカーの遺伝子型を決定できる核酸断片であればよく、詳細な条件は、それ自身公知の何れかの方法を利用して当業者が容易に選択することが可能である。また、これらのマーカーおよび検出手段は、ＩＦＮの治療効果を予測するために使用することが可能である。
【００２５】
４．インターフェロン療法の効果を予測する方法
本発明に従うと、ＩＦＮを投与されるべき個体においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法も提供される。
【００２６】
本発明によれば、ＩＦＮ療法の実施に先立って、ＩＮＦを投与されるべき個体、特に、ＨＣＶ感染者、より詳しくはＨＣＶ２型感染者において、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の−５９７位、−７２３位、−２９７位、−４０７位および−４１２位に存在する多型の少なくとも１の遺伝子型を決定することによって、当該個体においてＩＦＮ療法が有効であるかどうかを予測することができる。
【００２７】
即ち、本発明に従うと、ＨＣＶ２型感染者においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法であって、
（１）前記個体に由来するサンプルを得ること、
（２）（１）のサンプルについて、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の少なくとも１のＳＮＰの遺伝子型を決定すること、および
（３）（２）で決定された遺伝子型からＩＦＮ療法の有効性の予測を行うこと、
を具備するＨＣＶ２型感染者においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法が提供される。
【００２８】
また、本発明の態様に従うと、ＨＣＶ２型感染者においてＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の多型マーカーの遺伝子型がＧ型であればＩＦＮ治療が非著効である可能性が高いと予測され、Ｒ型やＡ型であれば著効する可能性が高いと予測されるＨＣＶ感染者においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法が提供される。
【００２９】
基本的には、当該ＨＣＶ２型感染者においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法は、次のように行ってもよい。
【００３０】
まず、実施者が、ＩＦＮを投与されるべき個体から血液サンプル等のサンプルを採取して予測を開始する。採取されたサンプルは、必要に応じて精製および抽出などの処理がなされた後で、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の多型マーカーの遺伝子型を少なくとも１つ決定する。このときに、ＩＦＮの治療効果を予測可能な他の多型マーカーや、感染しているＨＣＶの遺伝子型も決定してもよい。
【００３１】
次に、決定されたＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の多型マーカーの遺伝子型と当該個体の感染しているＨＣＶの遺伝子型から、ＩＦＮを投与されるべき個体におけるＩＦＮの治療効果を予測する。即ち、ＨＣＶ２型感染者においてＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の多型マーカーの遺伝子型がＧ型であればＩＦＮ治療が非著効である可能性が高いと予測され、Ｒ型やＡ型であれば著効する可能性が高いと予測される。
【００３２】
また、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の多型マーカーの遺伝子型を決定すると共に、ＩＦＮの治療効果を予測可能な他の多型マーカーの遺伝子型およびウイルスの遺伝子型を決定してもよい。それらを基にＨＣＶ２型感染者ばかりではなく、感染しているＨＣＶの遺伝子型が不明なＨＣＶ感染者においてＩＦＮの治療効果を予測してもよい。
【００３３】
ＩＦＮの治療効果を予測可能な他の多型マーカーの例は、以下の通りである。ウイルス側の因子は、血中のＨＣＶ量、罹患しているＨＣＶの遺伝子型である。ＨＣＶの血中量が多い患者ほどＩＦＮの効果は低く、１型より２型のＨＣＶに感染している患者の方が治療効果は高い（A.Tsubota et al., Hepatology 19, 1088-1094 1994）。宿主側の因子として、ＭＢＬ遺伝子の２箇所のＳＮＰや、ＭｘＡ遺伝子プロモーター領域のＳＮＰが知られている。マンノース結合レクチンをコードするＭＢＬ遺伝子の２箇所のＳＮＰがＸＢタイプの遺伝子型の患者はＹＡタイプの遺伝子型の患者より、ＩＦＮα／βの効き目が悪い（M.Matsushita et al.,J. Hepatology 29,695-700, 1998）。また、ＭｘＡタンパクをコードするＭｘＡ遺伝子プロモーター内に存在するＳＮＰもＣ型慢性肝炎患者のＩＦＮ治療の有効性に關係している(M. Hijikata et al., Intervirology 43, 124-127, 2000)。本発明の態様に従うと、これら従来のＩＦＮの治療効果を予測可能な多型マーカーの遺伝子型およびＨＣＶの遺伝子型の情報を、本発明のＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域の多型マーカーの遺伝子型の情報と共に考慮することによって、ＩＦＮを投与されるべき個体においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法も提供される。
【００３４】
ＩＦＮの治療効果を予測可能な多型マーカーの遺伝子型を決定する手段は、それ自身公知の何れの手段を用いておこなってよい。例えば、対象となる個体から得たサンプル、より、目的の核酸断片を含む核酸を調製し、塩基配列を決定すればよい。
【００３５】
本発明の態様に従う方法の対象となる「個体」は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、及びサルを含む任意の哺乳動物であり得るが、ヒトが最も好適な個体である。
【００３６】
ここで使用される「サンプル」とは、生物個体から採取した血液、血清、リンパ液および組織などの生物試料をいう。また、「サンプル」必要に応じて、生物試料をホモジネートおよび抽出等の必要な任意の前処理を行って得た試料であってもよい。このような前処理は、対象となる生物試料に応じて当業者によって選択され得るであろう。
【００３７】
生物試料から調製される目的の核酸断片を含む核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡなどから調製すればよい。例えば、対象からゲノムＤＮＡサンプルを準備する手段は、対象から得た末梢血中の白血球、単球、リンパ球および顆粒球等の血球細胞からフェノールクロロホルム法、塩析法または市販のキット等を用いて抽出する方法等、一般的に使用される何れの手段を用いて行うことが可能である。また、ｍＲＮＡを抽出する場合には、オリゴｄＴカラムにかけてもよい。
【００３８】
目的とする核酸断片の量が少ないときには、必要に応じて核酸断片を増幅する操作を行ってもよい。増幅操作は、例えば、逆転写ポリメラーゼ反応(RT-PCR)を含むポリメラーゼ連鎖反応（以下PCRと略記する）によって行い得る。
【００３９】
必要に応じて、抽出操作及び／又は増幅操作を行った後に、目的とする多型部位の遺伝子型を決定する。遺伝子型を決定する手段は、直接シークエンス法、ＳＳＣＰ法、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、特異的プライマー法および塩基配列検出用チップ等の一般的に使用される何れの手段を使用してもよい。
【００４０】
その他、多型の遺伝子型を決定する方法としては、ＰＣＲ−ＳＳＰ(PCR-specific sequence primers)法、ドットプロット法とＰＣＲを組み合わせたPCR-SSO（PCR-sequence specific oligonucleotide）法、及びＰＣＲ−ＳＳＣＰ法等の周知の方法を使用することもできるが、これらに限定されない。
【００４１】
なお、ドットブロット法とは、配列が既知のプローブを用いて、試料中に含まれる特定の配列をもった核酸鎖を検出する一つの方法である。この方法では、例えば基板上の有機薄膜に一本鎖核酸の試料を固定化し、次に蛍光物質等で標識した一本鎖のプローブの溶液をこの薄膜上の試料に接触させる。試料がプローブと相補的な配列を有していれば、プローブとハイブリダイズして二本鎖を形成するので、基板上に固定される。したがって、洗浄により未反応の核酸鎖を除去した後、プローブに付された標識を検出することにより、プローブに対して相補的な配列を有する試料核酸鎖を検出することができる。このようなドットプロット法において使用されるプローブであり、且つ本発明のＩＦＮの治療効果を予測するための多型マーカーの遺伝子型を検出するためのプローブも本発明として提供される。また、そのようなプローブを用いて、本発明のＩＦＮの治療効果を予測するための多型マーカーの遺伝子型を検出する方法も本発明の範囲に含まれる。更に、そのような核酸断片からなるプローブを具備することを特徴とする、ＩＦＮを投与すべき個体に対してＩＦＮ療法が有効であるかどうかを予測するための試験薬および塩基配列検出用チップも本発明の範囲に含まれる。
【００４２】
５．ＩＦＮ療法の有効性の判定の応用
また、ＩＦＮ療法の有効性の判定には、以下に説明するような手段を利用してもよい。即ち、本発明の方法は、本発明の新規多型とＩＦＮの治療効果との関係を数値化し、遺伝子の存在状態に基づき治療法の有効性を予測するための手段を利用してもよい。遺伝子の存在状態に基づき治療法の有効性を予測するための方法とは、本発明者らが既に提案している方法であり、詳しくは以下に説明する。
【００４３】
図７は本発明において使用され得る治療法有効性予測装置の全体構成を示す図である。図７に示すように、治療法有効性予測装置１００は、コンピュータ１０と、このコンピュータ１０と通信ネットワーク１１を介して接続された検体統計データベース１２から構成される。
【００４４】
コンピュータ１０は、入力装置１と、この入力装置１に接続された処理装置２と、この処理装置２に接続された有効性判定データベース３と、処理装置２に接続された出力装置４及び記憶媒体読取装置５から構成される。このコンピュータ１０は例えばパーソナルコンピュータにより実現される。コンピュータ１０は通信インタフェース（不図示）を介して通信ネットワーク１１に接続される。コンピュータ１０は、この通信インタフェースを介して通信ネットワーク１１との間でデータを送受信することができる。
【００４５】
処理装置２は、例えば処理装置に接続された記憶媒体読取装置５からＣＤ−ＲＯＭやＤＶＤ、磁気ディスクなどの記憶媒体６に記憶されたデータベース生成プログラムや有効性判定プログラムを読み取り、それらプログラムを実行する。これにより、処理装置２が前述した生成処理を行うデータベース生成手段２１や有効性判定処理を行う有効性判定手段２２として機能する。
【００４６】
データベース生成手段２１は、著効率算出処理、オッズ算出処理、χ２値算出処理、重み係数算出処理などを実行する。有効性判定手段２２は、遺伝子型情報入力処理、有効性判定処理などを実行する。
【００４７】
出力装置４は、処理装置２で処理された結果を表示し、あるいは処理結果を印字出力する。
【００４８】
図８を参照されたい。図８は、当該装置において使用される検体統計データベース（ＤＢ）の例を示した。検体統計データベース（ＤＢ）１２は、検体番号、複数のヒト遺伝子型識別情報及び有効性情報の各々がデータベースの各フィールドに検体毎に関連づけて、ウィルス遺伝子型毎に格納されている。検体番号は、検体としての患者を識別するための検体識別情報として用いられる番号である。ヒト遺伝子型識別情報は、患者の遺伝子型を識別する情報である。有効性情報は、その患者への治療の有効性（薬剤の投与であれば薬剤の有効性）を示す情報である。当該検体統計ＤＢ１２には、上述の本発明に従う新規多型マーカーを含むＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域に存在するＳＮＰに関する情報は含まれていないが、他の遺伝子と同様に当該検体統計ＤＢ１２に含ませることも、更なる検体統計ＤＢ１２を作成することも可能である。
【００４９】
図９を参照されたい。図９は、有効性判定データベース１３の例を示す。有効性情報は、「著効」あるいは「非著効」のいずれかで示される。
【００５０】
ヒト遺伝子型情報は、それぞれ２つあるいはそれ以上の情報で区別される。ウィルス遺伝子型情報も同様に、２つあるいはそれ以上の情報で区別される。例えばヒト遺伝子型のＭｘＡ−８８は、Ｇ／Ｔ、Ｔ／Ｔ及びＧ／Ｇの３種類の対立遺伝子型のいずれかに分類される。なお、対立遺伝子型による分類の他に対立ハプロタイプにより分類してもよい。図９に示す有効性判定データベース１３の例では、上述の本発明に従う新規多型マーカーを含むＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域に存在するＳＮＰに関する情報は当該含まれていないが、他の遺伝子と同様に当該有効性判定データベース１３に含ませることも、更なる有効性判定データベース１３を作成することも可能である。
【００５１】
有効性判定データベースは、複数のヒト遺伝子型重み係数の各々がデータベースの各フィールドに格納されている。以下の実施形態で、重み係数とは、治療の有効性に対してある遺伝子型が与える影響、すなわち治療の有効性に対する相関度を数値化したものである。
【００５２】
次に、データベース生成手段２１による有効性判定データベース３の作成方法について図１０のフローチャートに沿って説明する。
【００５３】
まず、検体統計データベース１２のヒト遺伝子型の各々に対する治療の著効率を算出する著効率算出処理を実行する（ｓ１）。具体的には、あるヒト遺伝子型に着目し、その遺伝子型の対立遺伝子型あるいは対立ハプロタイプの各々について、著効率を算出する。
【００５４】
例えばＭｘＡ−８８という遺伝子型に着目すると、その対立遺伝子型はＧ／Ｔ、Ｔ／Ｔ及びＧ／Ｇが存在する。この３種類の対立遺伝子型をＧ／Ｔ及びＴ／Ｔの第１の型と、Ｇ／Ｇの第２の型に類型化した場合、第１の型に属する全検体データのうち、著効であった検体データの割合を算出する。第１の型に属する検体のうちＸａ個が著効（ＳＲ）でＹａ個が非著効（ＮＲ）であった場合には、第１の型の著効率（ＳＲrate１）は、
ＳＲrate１＝１００×Ｘａ／（Ｘａ＋Ｙａ）（％）
となる。同様に、第２の型に属する検体のうちＸｂ個が著効（ＳＲ）でＹｂ個が非著効（ＮＲ）であった場合には、第２の型の著効率（ＳＲrate２）は、
ＳＲrate２＝１００×Ｘｂ／（Ｘｂ＋Ｙｂ）（％）
により求められる。このように、検体統計データベース１２の対立遺伝子型が２つ以上の型に分類されている場合、２つの型１，２に分類し、その型毎に著効率ＳＲrate１及びＳＲrate２を算出する。２つの型への分類は、治療の有効性に対する相関度が互いに差が生じるように分類するのが望ましい。より具体的には、２つの型の各々に対する著効率の差が大きくなるように分類するのが望ましい。以下では、この２つの型をそれぞれ「第１の型」及び「第２の型」と呼ぶ。
【００５５】
以上はＭｘＡ−８８を例に説明したが、他の遺伝子型、すなわちＭｘＡ−１２３、ＭＢＬ、ＬＭＰ７、ＩＦＮＡＲ１（ＧＴ）ｎ、ＩＦＮＡＲ１ Ｃ／Ｔなどについても同様の２つの型への分類、各型に対する著効率の算出を実行する。
【００５６】
また、本発明に従うＩＲＦ−１の場合も、同様に治療の著効率を算出する著効率算出処理を実行すればよい（例として実施例２を参照されたい）。
【００５７】
得られた著効率は、その型毎に図示しないデータベース（有効性判定データベース３でもよい）に格納される。
【００５８】
次に、オッズ算出処理を実行する（ｓ２）。オッズＯｋとは、２つの型の著効率のうち、大きい方の著効率を小さな方の著効率で除した数値であり、以下の式で示される。なお、ｋは、遺伝子型毎に付与される識別番号を示す。
【００５９】
Ｏｋ＝ＳＲrate１／ＳＲrate２ （ＳＲrate１＞ＳＲrate２の場合）
Ｏｋ＝ＳＲrate２／ＳＲrate１ （ＳＲrate１＜ＳＲrate２の場合）
ＳＲrate１＝ＳＲrate２の場合は、上記２式のいずれで定義してもよい。
【００６０】
以上の式により、すべての遺伝子型についてオッズＯｋを算出し、得られたオッズＯｋは図示しないデータベース（有効性判定データベース３でもよい）に格納される。
【００６１】
次に、χ２値算出処理を実行する（ｓ３）。以下、ｃｋ＝χ２と定義する。χ２値ｃｋは以下の式により算出される。
【００６２】
ｃｋ＝χ２＝（ｎ−１）ｓ２／σ２
ここで、確率変数はＸａ，Ｙａ，Ｘｂ，Ｙｂ、ｎは標本の大きさ、σ２は分散で、ｓ２は標本分散である。より具体的には、Ｘａ，Ｙａ，Ｘｂ，Ｙｂの各数値をカイ二乗検定の２×２分割表に代入することによりカイ二乗値χ２を得ることができる。
【００６３】
次に、オッズＯｋ及びχ２値に基づき、重み係数Ｓｋを算出する重み係数算出処理を実行する（ｓ４）。重み係数Ｓｋは、以下の式により算出される。
【００６４】
Ｓｋ＝（Ｏｋ−１）ｃｋ／２０。
【００６５】
次に、得られた重み係数Ｓｋに対する２つの型への符号割り当て処理を実行する（ｓ５）。重み係数Ｓｋは正の値をとる。正の符号＋は、著効率（ＳＲrate）の高い型に割り当てられ、負の符号は、著効率（ＳＲrate）の低い型に割り当てられる。具体的には、各遺伝子型における２つの型の著効率を比較し、大きな著効率を有する型に正の符号を割り当て、小さな著効率を有する型に負の符号を割り当てる。
【００６６】
このように符号割り当て処理を各遺伝子型について実行し、得られた重み係数Ｓｋ、−Ｓｋを有効性判定データベース３に格納する。
【００６７】
以上により、有効性判定データベース３の作成が終了する。
【００６８】
次に、有効性判定手段２２による有効性判定データベース３を用いた有効性判定処理について図１１のフローチャートに沿って説明する。
【００６９】
まず、被検体としての患者から、ヒト遺伝子型情報及びウィルス遺伝子型情報を得る（ｓ６１）。具体的には、個体に由来するサンプルを取得し、得られたサンプルをＤＮＡチップのセル内に注入し、セル内に固定化されたＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応を行わせる。ハイブリダイゼーション反応の後、バッファや挿入剤をセル内に充填し、セル内に固定された電極からの電気化学信号を検出する。この電気化学信号を信号処理することにより、ヒト遺伝子型情報及びウィルス遺伝子型情報を得ることができる。もちろん、他の手法によりこの被検体からの情報を取得してもよい。
【００７０】
次に、得られた被検体のヒト遺伝子型情報及びウィルス遺伝子型情報からなる被検体データを入力装置１を用いて入力する（ｓ６２）。
【００７１】
処理装置２は、入力された遺伝子型情報及びウィルス遺伝子型情報に基づき有効性の判定を行う（ｓ６３）。
【００７２】
具体的には、有効性判定プログラムが記憶媒体６から記憶媒体読取装置５により読み取られ、これにより処理装置２は有効性判定手段２２として機能する。有効性判定手段２２は、まず入力されたウィルス遺伝子型情報に対応するデータテーブルを有効性判定データベース３から読み出す（ｓ６３ａ）。そして、入力された遺伝子型に対応付けられた符号と重み係数を乗算することにより各々の遺伝子型についてヒト有効性予測個別値を得る（ｓ６３ｂ）。そして、得られた各々の遺伝子型についての有効性予測個別値を加算し、有効性予測加算値を算出する（ｓ６３ｃ）。
【００７３】
この有効性予測加算値の算出概念図を図１２に示す。図１２に示すように、入力された被検体データがＭｘＡ−８８、ＭｘＡ−１２３、ＭＢＬ、ＬＭＰ７、ＩＦＮＡＲ１（ＧＴ）ｎ、ＩＦＮＡＲ１ Ｃ／Ｔの順にＧ／Ｔ、Ｃ／Ｃ、ＹＡ、Ａ／Ａ、５／５、Ｔ／Ｔである場合、各々についてＭｘＡ−８８、ＭＢＬ、ＬＭＰ７、ＩＦＮＡＲ１（ＧＴ）ｎ、ＩＦＮＡＲ１ Ｃ／Ｔについては重み係数Ｓｋに＋１を乗算した値が割り当てられ、ＭｘＡ−１２３については重み係数Ｓｋに−１が乗算した値が割り当てられる。その結果、重み係数は図１２の通りとなる。この重み係数（有効性予測個別値）を加算すると、有効性個別加算値は（＋０．４１）＋（−０．４０）＋（＋０．２８）＋（＋０．０２）＋（＋０．２８）＋（＋０．００）＝０．５９となる。また、ＩＲＦ−１についても同様に被検体データとして入力してよく、それによって重み係数が割り当てられ、更に有効性個別加算値が得られる（例として実施例２を参照されたい）。しかし、重み係数は本数値に限定するものではなく、各因子の有効性の度合い（ｐ値等）や、新しく発見されたより有効な因子の加算等により随時変更することができる。
【００７４】
次に、処理装置２は、出力装置４に有効性判定結果として有効性予測加算値を出力する（ｓ６４）。主治医あるいは患者は、出力された有効性予測加算値に基づき、治療の有効性を予測し、その治療方法を選択するか否かを判断する際の参考に供することができる。一般に有効性予測加算値が高いほど、治療の有効性が高いが、感染したＨＣＶの遺伝子型等ヒトゲノムＳＮＰｓ以外の要因をも加味した判断基準を設けることが重要である。
【００７５】
よって、有効性の判定は、有効性予測加算値の算出に限定されない。例えば、有効性予測加算値に対応する各要因別の著効率を算出してもよい。
【００７６】
以上により、有効性判定データベース３の生成及びそれを用いた有効性判定は終了する。
【００７７】
以上のような治療法の有効性を予測するためのプログラム、データベース、システム及び方法は、本発明に好ましく利用することが可能である。
【００７８】
なお、本発明は上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合わせにより、種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。さらに、異なる実施形態にわたる構成要素を適宜組み合わせてもよい。
【００７９】
【実施例】
１．ＩＲＦ−１遺伝子とＩＦＮ療法の治療効果との関連性の確認
個々の患者について、感染しているＨＣＶの遺伝子型、ＩＲＦ−１遺伝子のプロモーターＳＮＰｓのタイプを決定し、これらの要因とＩＦＮ治療効果の関係を調べた。
【００８０】
１）概要
１５７例のＨＣＶ感染患者より採取した血液から、ＤＮＡおよびＲＮＡを抽出してサンプルとした。ＲＮＡ画分を用いてウイルスの遺伝子型判定を行ない、ＤＮＡ画分を用いてＩＲＦ−１遺伝子のプロモーターＳＮＰｓの解析を行なった。そして、これらの要因とＩＦＮ治療効果との関連性を調べた。
【００８１】
２）患者
患者の血液および肝組織による血液生化学的・組織学的な検査、さらに画像診断的検査によりＣ型慢性肝炎であると診断され、さらにＩＦＮ治療を経験しその治療効果が明らかとなった１５７例の患者の血液サンプルを本研究に使用した。なお、すべての患者に本研究の対象となることに関してのインフォームドコンセントを行なった。ＩＦＮ治療効果判定は、ＩＦＮ投与終了後６ヶ月の間に、血中のトランスアミナーゼが正常範囲にあり且つＨＣＶ ＲＮＡが陰性であった患者を完全著効と判定した。一方、治療によってＨＣＶの排除が起こらなかった、もしくは排除されたが投与終了後６ヶ月の間に再燃した、或いはＨＣＶの排除は起こったが投与終了後６ヶ月の間に血中のトランスアミナーゼが異常値を示した患者はすべて非著効と判定した。以上の判定基準により、全１５７例の患者は、完全著効５０例、非著効１０７例に判別された。
【００８２】
３）ＨＣＶ遺伝子型、およびＩＲＦ−１遺伝子プロモーターＳＮＰｓの解析
上述した１５７例のＩＦＮ治療前の血清を用いて、ＨＣＶ遺伝子型の解析を行なった。ＨＣＶ ＲＮＡの抽出にはＳｅｐａＧｅｎｅＲＶ−Ｒ（三光純薬社製）を用いた。その後、Ｍ−ＭＬＶ 逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。その後の増幅には、一定方向のプライマーを各遺伝子型に特異的な配列を持つ箇所に位置をずらして設計することにより、増幅する産物の長さに差を持たせ、電気泳動の移動度で遺伝子型判定が可能となるＰＣＲ法（Okamoto H. et al., J. Gen. Virol.73, 673-679, 1992, Chayama K. et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 8, 150-156, 1993）を用いて行なった。
【００８３】
また、全血より抽出したヒトゲノムＤＮＡを用いてＩＲＦ−１遺伝子のプロモーターＳＮＰｓ解析を行なった。ヒトゲノムＤＮＡの抽出には、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。
【００８４】
遺伝子解析を行なうための増幅には、ＧｅｎＢａｎｋ受け付け番号ＡＣ０７９３２０の配列に基づいてプライマ−を作成して用いた。解析する範囲は、プロモーター領域と考えられる範囲を網羅したおよそ950塩基の領域について行なった。プロモーター領域を予測する際の翻訳開始部位は、ＧｅｎＢａｎｋ受け付け番号Ｘ５３０９５に記載されたmajor transcriptional start位置を参考にした。より上流の配列を増幅するためのプライマ−はIRF-06(5'-gtatatctcccgaacgcagg-3')
とIRF-04(5'-gcttctctgaaccccttctc-3')を用い、下流の配列にはIRF-01(5'-cacgtcttgcctcgactaag-3')とIRF-03(5'-aggactgaaaccctcccttc-3')を用いた。増幅にはFastStart Taq DNA Polymerase(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)を用いた。なお、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分を４０サイクル行い、その前に９４℃で４分、後に７２℃７分の処理を行なった。
【００８５】
増幅が終了したサンプルは、その一部を電気泳動して生成産物のサイズなどの確認を終えた後、ExoSap(Amersham Biosciences社製)にて精製した。シークエンスの反応はMegaBACE ET Terminator(Amersham Biosciences社製)を用いて行い、解析にはMegaBACE1000 DNA Sequencing System(Amersham Biosciences社製)を用いて行なった。
【００８６】
４）結果
１５７サンプルすべてについて解析を行い、結果を図１にまとめた。ＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域には、６箇所のＳＮＰｓが発見された。そのうちの１箇所（−３８５位）は、１５７サンプルの約９０％がＧＧホモで、残りの約１０％の患者でＡＧヘテロ、ＡＡホモが見られたのみであった。このＳＮＰは治療効果と関連が見られなかったため除外した。残りの５ＳＮＰｓはすべて連鎖しており、図１に示す３種のタイプに分けられることがわかった。転写開始点から一番近い位置のＳＮＰである−２９７位の塩基によって表記すると、Ｇ型（ＧＧホモ）、Ａ型（ＡＡホモ）、Ｒ型（ＡＧヘテロ）の３種がある。５つのＳＮＰｓが互いに連鎖する様子は図３に示した。
【００８７】
このうち３つのＳＮＰｓを報告している文献（Saito H. et al., J. Cell. Biochem.36, 191-200, 2001）とは、ＳＮＰｓの表記が異なっているが、本研究の−２９７位が文献の−３００位と、−４０７位が−４１０位と、−４１２位が−４１５位と、それぞれ対応するものと考えられる。さらに、同じ文献には述べられていないさらに上流の２ＳＮＰｓ（−５９７位、−７２３位）を新たに発見することができた。
【００８８】
次にこれら５つのＳＮＰｓとＩＦＮ治療効果との関係を調べ、結果を図４に示した。その結果、１５７例全体で見た場合には、Ｒ型（ＡＧヘテロ）が最も多く８１例（５２％）、ついでＧ型（ＧＧホモ）が５７例（３６％）、少ない型はＡ型（ＡＡホモ）で１９例（１２％）であった。これを、ＩＦＮ治療効果別に示すと、完全著効例ではＧ型１５例（３０％）、Ｒ型２９例（５８％）、Ａ型６例（１２％）、であり非著効例ではＧ型４２例（３９％）、Ｒ型５２例（４９％）、Ａ型１３例（１２％）であった。完全著効例と非著効例の間に有意な差は認められなかった。
【００８９】
同様に、ＩＦＮ治療効果に大きく影響を与えるとされているHCV遺伝子型別に、５つのＳＮＰｓとＩＦＮ治療効果との関係を調べた（図５）。ＨＣＶ遺伝子型１型においては、完全著効例ではG型５例（３１％）、Ｒ型１０例（６３％）、Ａ型１例（６％）、であり非著効例ではＧ型２７例（３２％）、Ｒ型４７例（５５％）、Ａ型１１例（１３％）で、１５７例全体で見た場合と同様に有意な傾向は認められなかった。対するＨＣＶ遺伝子型２型においては、完全著効例ではG型１０例（２９％）、Ｒ型１９例（５６％）、Ａ型５例（１５％）、であり非著効例ではＧ型１４例（６６％）、Ｒ型５例（２４％）、Ａ型２例（１０％）であった。ＨＣＶ遺伝子型１型に比して、２型はＲ型が少なくＧ型が多いという傾向が認められた。
【００９０】
この差を検証するために、Ｇ型かまたはそれ以外（Ｒ型かＡ型）という分類をして、ＨＣＶ遺伝子型別にカイ２乗検定を行なった（図６）。ＨＣＶ遺伝子型１型においては、完全著効例ではＧ型５例（３１％）、ＲもしくはＡ型が１１例（６９％）、であり非著効例ではＧ型２７例（３２％）、ＲもしくはＡ型が５８例（６８％）で、両者に有意な差は見られなかった（p=0.8008255）。
【００９１】
一方のＨＣＶ遺伝子型２型においては、完全著効例ではG型１０例（２９％）、Ｒ型もしくはＡ型２４例（７１％）、であり非著効例ではＧ型１４例（６６％）、Ｒ型もしくはＡ型７例（３４％）で、明らかに有意な差が認められた（p=0.0067972）。即ち、ＨＣＶ遺伝子型２型が感染した患者は、Ｇ型であればＩＦＮ治療が効かない可能性がたかく、Ｒ型やＡ型であれば著効する可能性が高いと考えられる。
【００９２】
以上の結果より、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーターにおける互いに連鎖した５つのＳＮＰｓを調べることで、遺伝子型２型のＨＣＶが感染した患者においては、ＩＦＮ療法の治療効果が予測可能であると示唆された。
【００９３】
２．ＩＲＦ−１遺伝子プロモーターＳＮＰｓによるＩＦＮ療法の治療効果判定の実際
測定したヒトゲノムＳＮＰｓ情報を、より効果的にかつ簡便にＩＦＮ治療効果予測に役立てるために、測定結果の数値化し判別関数によって結果の処理を行なうためのスコアリングシステムを構築した。
【００９４】
１）概要
ＩＦＮ治療効果を治療前に予め予測するために、本発明者はＩＲＦ−１以外にも、これまでにＭｘＡ遺伝子のプロモーター領域にある２ＳＮＰｓ（−１２３位、−８８位）他を報告してきた。それによると、ＭｘＡ−１２３位はＣＣホモであると非著効になりやすく、ＣＡヘテロかＡＡホモであれば完全著効になりやすい。また、ＭｘＡ−８８位は、ＧＧであると非著効になりやすく、ＧＴへテロかＴＴホモであると完全著効になりやすかった。
【００９５】
また、これらのＳＮＰｓ情報を数値化し、判別関数に代入することによって、簡便に治療効果予測をするスコアリング法も構築してきた。この方法に、今回のＩＲＦ−１の要因を加えることにより、判定効率がさらに高まるかどうかを調べた。
【００９６】
２）患者
患者の血液および肝組織による血液生化学的・組織学的な検査、さらに画像診断的検査により慢性Ｃ型肝炎であると診断され、さらにＩＦＮ治療を経験しその治療効果が明らかとなった１５７例のうち、ＨＣＶ遺伝子型２型が感染していた５５例を対象とし、患者の血液サンプルを本研究に使用した。なお、すべての患者に本研究の対象となることに関してのインフォームドコンセントを行なった。治療効果判定は、ＩＦＮ投与終了後６ヶ月の間に、血中のトランスアミナーゼが正常範囲にあり且つＨＣＶ ＲＮＡが陰性であった患者を完全著効と判定した。一方、治療によってＨＣVの排除が起こらなかった、もしくは排除されたが投与終了後６ヶ月の間に再燃した、或いはＨＣＶの排除は起こったが投与終了後６ヶ月の間に血中のトランスアミナーゼが異常値を示した患者はすべて非著効と判定した。以上の判定基準により、全５５例のＨＣＶ２型の患者は、完全著効３４例、非著効２１例に判別された。
【００９７】
３）ＩＲＦ−１遺伝子プロモーターＳＮＰｓの遺伝子解析
遺伝子解析を行なうための増幅には、ＧｅｎＢａｎｋ受け付け番号ＡＣ０７９３２０の配列に基づいてプライマ−を作成して用いた。解析する範囲は、プロモーター領域と考えられる範囲を網羅したおよそ９５０塩基領域について行なった。プロモーター領域を予測する際の翻訳開始部位は、ＧｅｎＢａｎｋ受け付け番号Ｘ５３０９５に記載されたmajor transcriptional start位置を参考にした。より上流の配列を増幅するためのプライマ−はＩＲＦ−０６(5'-gtatatctcccgaacgcagg-3'；配列番号４)とＩＲＦ−０４(5'-gcttctctgaaccccttctc-3'；配列番号５)を用い、下流の配列にはＩＲＦ−０１(5'-cacgtcttgcctcgactaag-3'；配列番号６)とＩＲＦ−０３(5'-aggactgaaaccctcccttc-3'；配列番号７)を用いた。増幅にはFastStart Taq DNA Polymerase(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)を用いた。なお、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分を４０サイクル行い、その前に９４℃で４分、後に７２℃７分の処理を行なった。
【００９８】
増幅が終了したサンプルは、その一部を電気泳動して生成産物のサイズなどの確認を終えた後、ExoSap(Amersham Biosciences社製)にて精製した。シークエンスの反応はMegaBACE ET Terminator(Amersham Biosciences社製)を用いて行い、解析にはMegaBACE1000 DNA Sequencing System(Amersham Biosciences社製)を用いて行なった。
【００９９】
４）結果
遺伝子を解析した結果、ＨＣＶ２型の完全著効例ではG型１０例（２９％）、Ｒ型１９例（５６％）、Ａ型５例（１５％）、であり非著効例ではＧ型１４例（６６％）、Ｒ型５例（２４％）、Ａ型２例（１０％）であった。また、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーターを２タイプに分類して解析すると、完全著効例ではG型１０例（２９％）、Ｒ型もしくはＡ型２４例（７１％）、であり非著効例ではＧ型１４例（６６％）、Ｒ型もしくはＡ型７例（３４％）で、明らかに有意な差が認められた（p=0.0067972）。
【０１００】
これを既存のスコアリングシステムに応用した。本発明者らが構築したスコアリングシステムにおいては、各ＳＮＰｓは数値化される。例えば、ＭｘＡ（−１２３）では、（ＣＣ，ＣＡ，ＡＡ）＝（−１、１、１）であり、ＭｘＡ（−８８）では、（ＧＧ，ＧＴ，ＴＴ）＝（−１、１、１）という数値化が可能である。各症例におけるこれらの数値と、ＩＦＮ治療効果を基に判別関数を作成した。判別関数の係数は通常の統計学の手法に従って決定した（参考文献：栗原孝次著「データの科学」放送大学教育振興会）。計算値が０以上であれば「完全著効する」、０以下であれば「非著効となる」と判定する。
【０１０１】
遺伝子型２型のＨＣＶが感染した５５例のＩＦＮ治療効果とＳＮＰｓの関係から、ＭｘＡ（−１２３）では、次のような判別関数が導き出された；
0.79(MxA-123) + 0.05。
【０１０２】
この判別関数によって０以上の数値を示し、「完全著効する」と判定された症例は２２例であり、実際に完全著効した症例の３４例のうち１２例の判定が誤りであった。よって誤り率は３５％ということになる。同様に同じ判別関数によって０以上の数値を示し、「非著効となる」と判定された症例は１５例であり、実際に非著効であった２１例のうち６例の判定が誤りであった。よって誤り率は２９％ということになる。
【０１０３】
同様に、ＭｘＡ（−８８）では、次のような判別関数が導き出された；
0.75(MxA-88) -0.01。
【０１０４】
この判別関数によって、「完全著効する」と判定された症例は２３例であり、実際に完全著効した症例３４例のうち１１例の判定が誤りであった。よって誤り率は３２％ということになる。同様に、「非著効となる」と判定された症例は１４例であり、実際に非著効であった症例２１例のうち７例の判定が誤りであった。よって誤り率は３２％ということになる。
【０１０５】
これら２要因を加えると、次のような判別関数が導き出された；
0.67(MxA-123) + 0.14(MxA-88) + 0.04。
【０１０６】
この判別関数によって、「完全著効する」と判定された症例は２２例であり、実際に完全著効した３４例のうち１２例の判定が誤りであった。よって誤り率は３５％ということになる。同様に、「非著効となる」と判定された症例は１５例であり、実際に非著効であった２１例のうち６例の判定が誤りであった。よって誤り率は２９％ということになる。
【０１０７】
同じことを、ＩＲＦ−１でも行なった。ＩＲＦ−１での数値化は、（ＣＣ，ＣＴ，ＴＴ）＝（−１、１、１）であった。これらの結果と各症例の治療効果との関係から、次のような判別関数が導き出された；
0.842(IRF-1) -0.0033。
【０１０８】
この判別関数によって、「完全著効する」と判定された症例は２４例であり、実際に完全著効した３４例のうち１０例の判定が誤りであった。よって誤り率は３０％ということになる。同様に、「非著効となる」と判定された症例は１４例であり、実際に非著効であった２１例のうち７例の判定が誤りであった。よって誤り率は３３％ということになる。
【０１０９】
同じ数値化により、ＭｘＡの２ＳＮＰｓとＩＲＦ−１を組み合わせると以下のような結果になった；
0.703(MxA-123)+0.754(IRF-1)+0.0177
0.661(MxA-88)+0.761(IRF-1)-0.0363
0.602(MxA-123)+0.109(MxA-88)+0.753(IRF-1)+0.0098。
【０１１０】
これらの３種の判別関数を用いた場合は、すべて同じ結果になった。即ち、「完全著効する」と判定された症例は２４例であり、実際に完全著効した３４例のうち１０例の判定が誤りであった。よって誤り率は３０％ということになる。同様に、「非著効となる」と判定された症例は１４例であり、実際に非著効であった２１例のうち７例の判定が誤りであった。よって誤り率は３３％ということになる。
【０１１１】
このような方法で、ＩＲＦ−１遺伝子のプロモーターＳＮＰｓを測定し、単独で又は既知の遺伝子からの情報と共に判別関数に代入することにより、簡便に治療効果予測に役立てることができる。
【０１１２】
【発明の効果】
本発明により、ＩＦＮ療法の有効性を予測するための新規多型、ＩＦＮ療法の有効性の予測方法が提供された。当該多型は、特に２型ＨＣＶ感染者におけるＩＦＮの治療効果を予測するために有用である。
【０１１３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーター配列を示す図。
【図２】 図２は、図１の続きでありＩＲＦ−１遺伝子プロモーター配列を示す図。
【図３】 ＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域に見つかった互いに連鎖する５ＳＮＰｓと１５７例の内訳を示す図。
【図４】 ＩＲＦ−１遺伝子プロモーターＳＮＰｓのタイプとＩＦＮ治療効果との関係を示す図。
【図５】 ＨＣＶ遺伝子型別にみたＩＲＦ−１遺伝子のプロモーターＳＮＰｓのタイプとＩＦＮ治療効果との関係を示す図。
【図６】 ＨＣＶ遺伝子型別にみたＩＲＦ−１遺伝子のプロモーターＳＮＰｓのタイプとＩＦＮ治療効果との関係を示す図。
【図７】 本発明において使用され得る治療法有効性予測装置の全体構成を示す図。
【図８】 本発明において使用され得る検体統計データベース（ＤＢ）の一例を示す図。
【図９】 本発明において使用され得る有効性判定データベースの一例を示す図。
【図１０】 本発明における有効性判定データベースの作成方法のフローチャートを示す図。
【図１１】 本発明における有効性判定処理のフローチャートを示す図。
【図１２】 本発明における有効性予測加算値の算出概念図。
【符号の説明】
１…入力装置、２…処理装置、３…有効性判定データベース、４…出力装置、５…記憶媒体読取装置、６…記憶媒体、１０…コンピュータ、１１…通信ネットワーク、１２…検体統計データベース
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターフェロンの治療効果を予測するための新規多型マーカー、プライマー、プローブおよびインターフェロンの治療効果を予測する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｃ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣＶ」と記す）の感染により生じるＣ型肝炎の多くは、やがて慢性Ｃ型肝炎を引き起こし、その一部は肝硬変を経て肝細胞癌へ進展する。このような進展を阻止するために、現在インターフェロン（以下「ＩＦＮ」と記す）療法が用いられている。しかしながら、ＩＦＮ療法によって完全著効を示す患者は全体の極僅かでしかなく、その一方で、ＩＦＮ療法は高価であり、またその治療には重篤な副作用が存在する。従って、ＩＦＮによる治療を開始する前に、その対象となる患者におけるＩＦＮ療法の効果を予測しておくことが重要である。
【０００３】
ＩＦＮ療法の効果を左右する因子は既に幾つかが明らかとなっている。例えば、ウイルス側の因子は、血中ウイルス量およびＨＣＶ遺伝子型のタイプなどであり、宿主側の因子は、ＩＦＮ受容体遺伝子、ＭｘＡ遺伝子およびＭＢＬ遺伝子の遺伝子多型のタイプや、患者の年齢および性別、罹患している期間並びに肝繊維化など肝臓病変の程度などである。
【０００４】
【非特許文献１】
齋藤英胤、多田慎一郎、石井裕正著「インターフェロン治療の最前線の知見」、株式会社メディカルレビュー社発行、２００２年１月３０日、p７１−７７
【０００５】
【非特許文献２】
Hidetsugu Saito, Shinichiro Tada, Hirotoshi Ebinuma, Kanji Wakabayashi, Tamako Takagi, Yoshimasa Saito, Nobuhiro Nakamoto, Satoshi Kurita, and Hiromasa Ishii, Journal of Cellular Biochemistry Supplement 36:191-200, (2001)
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上述のＩＦＮ療法の効果を左右する因子を各患者において特定しても、なお充分な予測ができないのが現状である。
【０００７】
従って、本発明の目的は、インターフェロンの治療効果を予測するための新規多型マーカー、プライマー、プローブおよびインターフェロンの治療効果を予測する方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上述の課題を解決するための手段は、本発明の側面に従うと、インターフェロン調節因子−１遺伝子のプロモーター領域の−５９７位に存在するＩＦＮの治療効果を予測するための多型マーカー；
インターフェロン調節因子−１遺伝子のプロモーター領域の−７２３位に存在するＩＦＮの治療効果を予測するための多型マーカー；
インターフェロン調節因子−１遺伝子のプロモーター領域の−５９７位または−７２３位に存在するＩＦＮの治療効果を予測するための多型マーカーの遺伝子型を決定するためのプライマーまたはプローブ；並びに、
ＨＣＶ２型感染者においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法であって、
（１）前記個体に由来するサンプルを得ること、
（２）（１）のサンプルについて、インターフェロン調節因子−１遺伝子プロモーター領域の少なくとも１のＳＮＰの遺伝子型を決定すること、および
（３）（２）で決定された遺伝子型からＩＦＮ療法の有効性の予測を行うこと、
を具備するＨＣＶ２型感染者においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法；
である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
１．ＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域の多型
本発明は、本発明者らがＩＦＮ療法の効果に影響を与える新規遺伝子多型、即ち、ＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域の−５９７位および−７２３位に存在する一塩基多型（以下「ＳＮＰ」と記す）を発見したことに基づく。これらの多型の型に依存して、特に、２型ＨＣＶ感染者におけるＩＦＮの治療効果を予測することが可能である。ここで用いる「インターフェロン」とは、インターフェロンαおよびβ（以下「ＩＦＮα／β」とも記す）を指す。
【００１０】
インターフェロン調節因子−１（以下「ＩＲＦ−１」と記す）は、対象におけるＩＦＮの作用に影響を与える重要な因子である。対象に投与されたＩＦＮは、一般的にウイルスに対して二相性に作用すると考えられている。即ち、投与されたＩＦＮ自身によるウイルスへの作用と、続いて生じる宿主細胞性免疫賦活作用によるウイルスへの作用である。双方の作用が充分であって初めてＩＦＮはウイルス学的に著効となる。ＩＲＦ−１は、これらの作用の何れにおいても重要な役割を担っている。
【００１１】
対象に投与されたＩＦＮは、細胞表面上の受容体に結合する。この結合により、Ｊａｋ ｋｉｎａｓｅによるＳＴＡＴ１のリン酸化が生じ、これにより転写因子であるＧＡＦ（gamma-activated factor）とＩＳＧＦ３（IFN stimulated gene factor 3）が形成される。ＩＳＧＦ３は、ＩＦＮ誘導遺伝子のＩＳＲＥに結合し、ＩＦＮ誘導遺伝子の転写を活性化する。また、ＧＡＦは、ＩＦＮ誘導遺伝子とＩＲＦ−１遺伝子の転写調節領域のＧＡＳに夫々結合し、ＩＦＮ誘導遺伝子の転写を活性化すると同時に、ＩＲＦ−１によるＩＦＮ誘導因子発現の増強を引き起こす。また、ＩＲＦ−１は、細胞障害性Ｔ細胞の賦活化作用にも重要な働きをしていると考えられている（非特許文献１を参照されたい）。
【００１２】
実施例において詳しく述べるように、本発明者らにより新たに見出されたＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の−５９７位および−７２３位に存在するＳＮＰは、上述のようなＩＲＦ−１の効果に大きな影響を与える多型である。
【００１３】
また、このＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の−５９７位および−７２３位に存在するＳＮＰは、公知のＩＲＦ−１遺伝子プロモーターの他の部位に存在する３つのＳＮＰ（Saito H. et al., J. Cell. Biochem.36, 191-200, 2001）と連鎖していることも本発明者らの解析により明らかになった。当該公知のＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の多型部位とは、以下の実施例に記載した本研究の−２９７位（当該Saito H.らの文献の−３００位に相当する）、−４０７位（当該Saito H.らの文献の−４１０位に相当する）、および−４１２位（当該Saito H.らの文献の−４１５位に相当する）である。
【００１４】
図１および図２には、受付番号ＡＣ０７９３２０でＧｅｎＢａｎｋに登録されているＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域の配列と、それに存在するＳＮＰｓ、即ち、本発明に従う新規ＳＮＰと上記公知のＳＮＰの存在する位置を示した。また図１および図２には、受付番号ＡＣ０７９３２０のＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域と、今回解析した３つの異なるタイプの遺伝子型を有する個体から得た塩基配列、ＩＲＦ−００４Ｇ、ＩＲＦ−０１２ＡおよびＩＲＦ００１Ｒを並べて示した。配列の左に示した記号は、サンプル番号であり、プロモーターＳＮＰｓをタイプ分けしたＧ、Ａ、Ｒ文字を列記した。
【００１５】
図１および図２において「−７２３」と「−５９７」と付した位置は、転写開始部位を１とした場合のその上流７２３番目と５９７番目の位置であり、この位置が本発明に従う新規多型部位である。−７２３位の多型の取り得る塩基は、アデニン（以下「ａ」と記す）またはグアニン（以下「ｇ」と記す）である。−５９７位の多型の取り得る塩基は、チミン（以下「ｔ」と記す）またはシトシン（以下「ｃ」と記す）である。また、「−４１２」、「−４０７」および「−２９７」と付した位置は、転写開始部位を１とした場合のその上流４１２番目、４０７番目および２９７番目の位置であり、これらは何れも従来公知の多型部位である。−４１２位の多型の取り得る塩基はｃまたはａである。−４０７位の多型の取り得る塩基はａまたはｇである。−２９７位の多型の取り得る塩基はａまたはｇである。図１および図２の配列表において「ｒ」と記載した場合、その位置の対立遺伝子の一方がａであり他方がｇであることを示す。同様に「ｙ」と記載した場合、その位置の対立遺伝子の一方がｔであり他方がｃであることを示し、「ｍ」と記載した場合には、対立遺伝子の一方がｃであり他方がａであることを示す。
【００１６】
ここで「遺伝子型」とは、全対立遺伝子、あるいは、注目している遺伝子座の遺伝子の存在状態を指す。「遺伝子座」とは、染色体、もしくは遺伝子地図上での遺伝子の位置を指す。例えば、互いに対立遺伝子である遺伝子の場合は同一の遺伝子座にある。「対立遺伝子」とは、相同染色体の相同な場所に位置し、機能的にも相同な遺伝子をいう。
【００１７】
本発明者らは、慢性Ｃ型肝炎の患者１５７人から得たＤＮＡを解析し、前述したように当該５つの多型は連鎖の関係にあり、それらの遺伝子型は３つのタイプに分類できることを明らかにした。ここでは便宜上、転写開始点から一番近い位置のＳＮＰである−２９７位の塩基に従ってタイプを表記すると、当該遺伝子型は、Ｇ型（ＧＧホモ）、Ａ型（ＡＡホモ）およびＲ型（ＡＧヘテロ）の３種である。当該５つのＳＮＰが互いに連鎖する様子は図３に示す通りである。即ち、Ｇ型の場合の夫々の対立遺伝子の塩基は、−２９７位ではＧＧ、−４０７位ではＧＧ、−４１２位ではＡＡ，−５９７位ではＣＣ、−７２３位ではＧＧである。Ｒ型の場合の夫々の対立遺伝子の塩基は、−２９７位ではＧＡ、−４０７位ではＧＡ、−４１２位ではＡＣ，−５９７位ではＣＴ、−７２３位ではＧＡである。Ａ型の場合の夫々の対立遺伝子の塩基は、−２９７位ではＡＡ、−４０７位ではＡＡ、−４１２位ではＣＣ，−５９７位ではＴＴ、−７２３位ではＡＡである。ここで図３中の「検体数」はサンプルを採取した患者１５７人における該当数である。
【００１８】
１５７例全体で見た場合は、ＩＲＦ−１の遺伝子型とＩＦＮの治療効果の間に有意な相互関係は認められなかった（図４を参照されたい）。図４に示す「ＳＲ」は著効、「ＮＲ」は非著効を示す。著効および非著効の何れの治療効果の場合も、Ｒタイプが最も多く、ついでＧタイプ、Ａタイプの順であり、治療効果別のＳＮＰｓの特徴は認められなかった。
【００１９】
２．ＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の遺伝子型とＩＦＮ治療効果との関係当該５つのＳＮＰの遺伝子型とＩＦＮ治療効果との関係を、Ｃ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣＶ」と記す）の遺伝子型別に図５に示す。図５は、慢性Ｃ型肝炎の患者１５７人について感染しているウイルス遺伝子型とＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の当該５つのＳＮＰの遺伝子型を調べた結果である。ＨＣＶ遺伝子型２型におけるＩＦＮ療法の効果は、完全著効例がＧ型で１０例（２９％）、Ｒ型で１９例（５６％）およびＡ型で５例（１５％）であった。一方、非著効例はＧ型で１４例（６６％）、Ｒ型で５例（２４％）およびＡ型で２例（１０％）であった。それに対して、ＨＣＶ遺伝子型１型においては、ＩＲＦ−１の遺伝子型とＩＦＮの治療効果の間に有意な相互関係は認められなかった（図５を参照されたい）。
【００２０】
また、ＨＣＶ遺伝子型１型に比して、ＨＣＶ遺伝子型２型はＲ型が少なくＧ型が多いという傾向も認められた（図５を参照されたい）。図５に示す通り、ＨＣＶ１型の著効も非著効もＲタイプが最も多く次いでＧタイプ、Ａタイプの順であり、それはＨＣＶ２型の著効例も同様の傾向を示した。ただ、ＨＣＶ２型の非著効においては、最も多いタイプがＧタイプで、ついでＲタイプ、Ａタイプの順であり、他とは異なる傾向を示した。この差を検証するために、Ｇ型かまたはそれ以外（Ｒ型かＡ型）という分類をして、ＨＣＶ遺伝子型別にカイ２乗検定を行なった（図６を参照されたい）。その結果、一方のＨＣＶ遺伝子型２型においては、完全著効例はＧ型が１０例（２９％）、Ｒ型もしくはＡ型が２４例（７１％）であり、非著効例はＧ型が１４例（６６％）、Ｒ型もしくはＡ型が７例（３４％）であること分かった。これは明らかに統計学的に有意な差である（ｐ＝０．００６７９７２）。
【００２１】
これらの結果から、ＨＣＶ遺伝子型２型が感染した患者は、Ｇ型であればＩＦＮ治療が効かない可能性が高く、Ｒ型やＡ型であれば著効する可能性が高いと判定することが可能である。即ち、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーターにおける互いに連鎖した５つの何れかのＳＮＰｓを調べることにより、遺伝子型２型のＨＣＶが感染した患者においけるＩＦＮ療法の治療効果が予測することが可能となった。
【００２２】
これまでの報告から、宿主側のＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域のＳＮＰ、即ち、−２９７位、−４０７位および−４１２位のＳＮＰの遺伝子型の違いによって、ＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域の二次構造に違いが生じ、それによって生じるプロモーター活性の違いによって、リンパ球からのＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０の分泌に違いがあることは明かとなっている（Saito H. et al., J. Cell. Biochem.36, 191-200, 2001）。しかしながら、実際のＩＦＮ治療の結果として、患者の遺伝子型と治療効果の相関を示したデータはなかった。また、宿主側のＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域のＳＮＰの遺伝子型の違いばかりではなく、更に感染しているＨＣＶの遺伝子型が明かとなって初めてＩＦＮの治療効果を予測できることが、本発明者らの研究から明らかとなった。このような知見は、ＩＦＮの治療効果を予測するための手段として非常に重要である。
【００２３】
３．多型マーカー
上述したようにＩＲＦ−１遺伝子プロモーターにおける互いに連鎖した５つのＳＮＰｓは、ＨＣＶに感染した患者、特に遺伝子型２型のＨＣＶに感染した患者においてＩＦＮ療法の治療効果を予測するための多型マーカーとして使用することが可能である。このような多型マーカーも本発明の範囲内である。本発明の多型マーカーは、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の−５９７位、−７２３位、−２９７位、−４０７位および−４１２位に存在する。
【００２４】
ここで使用される「多型マーカー」とは、問題となる位置に存在する多型の遺伝子型からＩＦＮの治療効果を予測するための指標として使用されるマーカーである。具体的には、対象より採取されたサンプル中に含まれる特定の核酸の特定の部位を示すが、当該部位を含む核酸断片であってもよい。また、当該多型部位を特定するために使用されるプローブおよびプライマーなどの核酸断片からなる検出手段も本発明の範囲内である。当該プローブおよびプライマーは、当該多型マーカーの遺伝子型を決定するために使用される手段である。当該プローブは、標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出することにより、当該多型マーカーの遺伝子型を決定できる核酸断片であればよく、詳細な条件は、それ自身公知の何れかの方法を利用して当業者が容易に選択することが可能である。当該プライマーは、標的核酸を鋳型として伸長または増幅反応を利用して当該多型マーカーの遺伝子型を決定できる核酸断片であればよく、詳細な条件は、それ自身公知の何れかの方法を利用して当業者が容易に選択することが可能である。また、これらのマーカーおよび検出手段は、ＩＦＮの治療効果を予測するために使用することが可能である。
【００２５】
４．インターフェロン療法の効果を予測する方法
本発明に従うと、ＩＦＮを投与されるべき個体においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法も提供される。
【００２６】
本発明によれば、ＩＦＮ療法の実施に先立って、ＩＮＦを投与されるべき個体、特に、ＨＣＶ感染者、より詳しくはＨＣＶ２型感染者において、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の−５９７位、−７２３位、−２９７位、−４０７位および−４１２位に存在する多型の少なくとも１の遺伝子型を決定することによって、当該個体においてＩＦＮ療法が有効であるかどうかを予測することができる。
【００２７】
即ち、本発明に従うと、ＨＣＶ２型感染者においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法であって、
（１）前記個体に由来するサンプルを得ること、
（２）（１）のサンプルについて、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の少なくとも１のＳＮＰの遺伝子型を決定すること、および
（３）（２）で決定された遺伝子型からＩＦＮ療法の有効性の予測を行うこと、
を具備するＨＣＶ２型感染者においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法が提供される。
【００２８】
また、本発明の態様に従うと、ＨＣＶ２型感染者においてＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の多型マーカーの遺伝子型がＧ型であればＩＦＮ治療が非著効である可能性が高いと予測され、Ｒ型やＡ型であれば著効する可能性が高いと予測されるＨＣＶ感染者においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法が提供される。
【００２９】
基本的には、当該ＨＣＶ２型感染者においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法は、次のように行ってもよい。
【００３０】
まず、実施者が、ＩＦＮを投与されるべき個体から血液サンプル等のサンプルを採取して予測を開始する。採取されたサンプルは、必要に応じて精製および抽出などの処理がなされた後で、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の多型マーカーの遺伝子型を少なくとも１つ決定する。このときに、ＩＦＮの治療効果を予測可能な他の多型マーカーや、感染しているＨＣＶの遺伝子型も決定してもよい。
【００３１】
次に、決定されたＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の多型マーカーの遺伝子型と当該個体の感染しているＨＣＶの遺伝子型から、ＩＦＮを投与されるべき個体におけるＩＦＮの治療効果を予測する。即ち、ＨＣＶ２型感染者においてＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の多型マーカーの遺伝子型がＧ型であればＩＦＮ治療が非著効である可能性が高いと予測され、Ｒ型やＡ型であれば著効する可能性が高いと予測される。
【００３２】
また、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーター領域の多型マーカーの遺伝子型を決定すると共に、ＩＦＮの治療効果を予測可能な他の多型マーカーの遺伝子型およびウイルスの遺伝子型を決定してもよい。それらを基にＨＣＶ２型感染者ばかりではなく、感染しているＨＣＶの遺伝子型が不明なＨＣＶ感染者においてＩＦＮの治療効果を予測してもよい。
【００３３】
ＩＦＮの治療効果を予測可能な他の多型マーカーの例は、以下の通りである。ウイルス側の因子は、血中のＨＣＶ量、罹患しているＨＣＶの遺伝子型である。ＨＣＶの血中量が多い患者ほどＩＦＮの効果は低く、１型より２型のＨＣＶに感染している患者の方が治療効果は高い（A.Tsubota et al., Hepatology 19, 1088-1094 1994）。宿主側の因子として、ＭＢＬ遺伝子の２箇所のＳＮＰや、ＭｘＡ遺伝子プロモーター領域のＳＮＰが知られている。マンノース結合レクチンをコードするＭＢＬ遺伝子の２箇所のＳＮＰがＸＢタイプの遺伝子型の患者はＹＡタイプの遺伝子型の患者より、ＩＦＮα／βの効き目が悪い（M.Matsushita et al.,J. Hepatology 29,695-700, 1998）。また、ＭｘＡタンパクをコードするＭｘＡ遺伝子プロモーター内に存在するＳＮＰもＣ型慢性肝炎患者のＩＦＮ治療の有効性に關係している(M. Hijikata et al., Intervirology 43, 124-127, 2000)。本発明の態様に従うと、これら従来のＩＦＮの治療効果を予測可能な多型マーカーの遺伝子型およびＨＣＶの遺伝子型の情報を、本発明のＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域の多型マーカーの遺伝子型の情報と共に考慮することによって、ＩＦＮを投与されるべき個体においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法も提供される。
【００３４】
ＩＦＮの治療効果を予測可能な多型マーカーの遺伝子型を決定する手段は、それ自身公知の何れの手段を用いておこなってよい。例えば、対象となる個体から得たサンプル、より、目的の核酸断片を含む核酸を調製し、塩基配列を決定すればよい。
【００３５】
本発明の態様に従う方法の対象となる「個体」は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、及びサルを含む任意の哺乳動物であり得るが、ヒトが最も好適な個体である。
【００３６】
ここで使用される「サンプル」とは、生物個体から採取した血液、血清、リンパ液および組織などの生物試料をいう。また、「サンプル」必要に応じて、生物試料をホモジネートおよび抽出等の必要な任意の前処理を行って得た試料であってもよい。このような前処理は、対象となる生物試料に応じて当業者によって選択され得るであろう。
【００３７】
生物試料から調製される目的の核酸断片を含む核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡなどから調製すればよい。例えば、対象からゲノムＤＮＡサンプルを準備する手段は、対象から得た末梢血中の白血球、単球、リンパ球および顆粒球等の血球細胞からフェノールクロロホルム法、塩析法または市販のキット等を用いて抽出する方法等、一般的に使用される何れの手段を用いて行うことが可能である。また、ｍＲＮＡを抽出する場合には、オリゴｄＴカラムにかけてもよい。
【００３８】
目的とする核酸断片の量が少ないときには、必要に応じて核酸断片を増幅する操作を行ってもよい。増幅操作は、例えば、逆転写ポリメラーゼ反応(RT-PCR)を含むポリメラーゼ連鎖反応（以下PCRと略記する）によって行い得る。
【００３９】
必要に応じて、抽出操作及び／又は増幅操作を行った後に、目的とする多型部位の遺伝子型を決定する。遺伝子型を決定する手段は、直接シークエンス法、ＳＳＣＰ法、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、特異的プライマー法および塩基配列検出用チップ等の一般的に使用される何れの手段を使用してもよい。
【００４０】
その他、多型の遺伝子型を決定する方法としては、ＰＣＲ−ＳＳＰ(PCR-specific sequence primers)法、ドットプロット法とＰＣＲを組み合わせたPCR-SSO（PCR-sequence specific oligonucleotide）法、及びＰＣＲ−ＳＳＣＰ法等の周知の方法を使用することもできるが、これらに限定されない。
【００４１】
なお、ドットブロット法とは、配列が既知のプローブを用いて、試料中に含まれる特定の配列をもった核酸鎖を検出する一つの方法である。この方法では、例えば基板上の有機薄膜に一本鎖核酸の試料を固定化し、次に蛍光物質等で標識した一本鎖のプローブの溶液をこの薄膜上の試料に接触させる。試料がプローブと相補的な配列を有していれば、プローブとハイブリダイズして二本鎖を形成するので、基板上に固定される。したがって、洗浄により未反応の核酸鎖を除去した後、プローブに付された標識を検出することにより、プローブに対して相補的な配列を有する試料核酸鎖を検出することができる。このようなドットプロット法において使用されるプローブであり、且つ本発明のＩＦＮの治療効果を予測するための多型マーカーの遺伝子型を検出するためのプローブも本発明として提供される。また、そのようなプローブを用いて、本発明のＩＦＮの治療効果を予測するための多型マーカーの遺伝子型を検出する方法も本発明の範囲に含まれる。更に、そのような核酸断片からなるプローブを具備することを特徴とする、ＩＦＮを投与すべき個体に対してＩＦＮ療法が有効であるかどうかを予測するための試験薬および塩基配列検出用チップも本発明の範囲に含まれる。
【００４２】
５．ＩＦＮ療法の有効性の判定の応用
また、ＩＦＮ療法の有効性の判定には、以下に説明するような手段を利用してもよい。即ち、本発明の方法は、本発明の新規多型とＩＦＮの治療効果との関係を数値化し、遺伝子の存在状態に基づき治療法の有効性を予測するための手段を利用してもよい。遺伝子の存在状態に基づき治療法の有効性を予測するための方法とは、本発明者らが既に提案している方法であり、詳しくは以下に説明する。
【００４３】
図７は本発明において使用され得る治療法有効性予測装置の全体構成を示す図である。図７に示すように、治療法有効性予測装置１００は、コンピュータ１０と、このコンピュータ１０と通信ネットワーク１１を介して接続された検体統計データベース１２から構成される。
【００４４】
コンピュータ１０は、入力装置１と、この入力装置１に接続された処理装置２と、この処理装置２に接続された有効性判定データベース３と、処理装置２に接続された出力装置４及び記憶媒体読取装置５から構成される。このコンピュータ１０は例えばパーソナルコンピュータにより実現される。コンピュータ１０は通信インタフェース（不図示）を介して通信ネットワーク１１に接続される。コンピュータ１０は、この通信インタフェースを介して通信ネットワーク１１との間でデータを送受信することができる。
【００４５】
処理装置２は、例えば処理装置に接続された記憶媒体読取装置５からＣＤ−ＲＯＭやＤＶＤ、磁気ディスクなどの記憶媒体６に記憶されたデータベース生成プログラムや有効性判定プログラムを読み取り、それらプログラムを実行する。これにより、処理装置２が前述した生成処理を行うデータベース生成手段２１や有効性判定処理を行う有効性判定手段２２として機能する。
【００４６】
データベース生成手段２１は、著効率算出処理、オッズ算出処理、χ２値算出処理、重み係数算出処理などを実行する。有効性判定手段２２は、遺伝子型情報入力処理、有効性判定処理などを実行する。
【００４７】
出力装置４は、処理装置２で処理された結果を表示し、あるいは処理結果を印字出力する。
【００４８】
図８を参照されたい。図８は、当該装置において使用される検体統計データベース（ＤＢ）の例を示した。検体統計データベース（ＤＢ）１２は、検体番号、複数のヒト遺伝子型識別情報及び有効性情報の各々がデータベースの各フィールドに検体毎に関連づけて、ウィルス遺伝子型毎に格納されている。検体番号は、検体としての患者を識別するための検体識別情報として用いられる番号である。ヒト遺伝子型識別情報は、患者の遺伝子型を識別する情報である。有効性情報は、その患者への治療の有効性（薬剤の投与であれば薬剤の有効性）を示す情報である。当該検体統計ＤＢ１２には、上述の本発明に従う新規多型マーカーを含むＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域に存在するＳＮＰに関する情報は含まれていないが、他の遺伝子と同様に当該検体統計ＤＢ１２に含ませることも、更なる検体統計ＤＢ１２を作成することも可能である。
【００４９】
図９を参照されたい。図９は、有効性判定データベース１３の例を示す。有効性情報は、「著効」あるいは「非著効」のいずれかで示される。
【００５０】
ヒト遺伝子型情報は、それぞれ２つあるいはそれ以上の情報で区別される。ウィルス遺伝子型情報も同様に、２つあるいはそれ以上の情報で区別される。例えばヒト遺伝子型のＭｘＡ−８８は、Ｇ／Ｔ、Ｔ／Ｔ及びＧ／Ｇの３種類の対立遺伝子型のいずれかに分類される。なお、対立遺伝子型による分類の他に対立ハプロタイプにより分類してもよい。図９に示す有効性判定データベース１３の例では、上述の本発明に従う新規多型マーカーを含むＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域に存在するＳＮＰに関する情報は当該含まれていないが、他の遺伝子と同様に当該有効性判定データベース１３に含ませることも、更なる有効性判定データベース１３を作成することも可能である。
【００５１】
有効性判定データベースは、複数のヒト遺伝子型重み係数の各々がデータベースの各フィールドに格納されている。以下の実施形態で、重み係数とは、治療の有効性に対してある遺伝子型が与える影響、すなわち治療の有効性に対する相関度を数値化したものである。
【００５２】
次に、データベース生成手段２１による有効性判定データベース３の作成方法について図１０のフローチャートに沿って説明する。
【００５３】
まず、検体統計データベース１２のヒト遺伝子型の各々に対する治療の著効率を算出する著効率算出処理を実行する（ｓ１）。具体的には、あるヒト遺伝子型に着目し、その遺伝子型の対立遺伝子型あるいは対立ハプロタイプの各々について、著効率を算出する。
【００５４】
例えばＭｘＡ−８８という遺伝子型に着目すると、その対立遺伝子型はＧ／Ｔ、Ｔ／Ｔ及びＧ／Ｇが存在する。この３種類の対立遺伝子型をＧ／Ｔ及びＴ／Ｔの第１の型と、Ｇ／Ｇの第２の型に類型化した場合、第１の型に属する全検体データのうち、著効であった検体データの割合を算出する。第１の型に属する検体のうちＸａ個が著効（ＳＲ）でＹａ個が非著効（ＮＲ）であった場合には、第１の型の著効率（ＳＲrate１）は、
ＳＲrate１＝１００×Ｘａ／（Ｘａ＋Ｙａ）（％）
となる。同様に、第２の型に属する検体のうちＸｂ個が著効（ＳＲ）でＹｂ個が非著効（ＮＲ）であった場合には、第２の型の著効率（ＳＲrate２）は、
ＳＲrate２＝１００×Ｘｂ／（Ｘｂ＋Ｙｂ）（％）
により求められる。このように、検体統計データベース１２の対立遺伝子型が２つ以上の型に分類されている場合、２つの型１，２に分類し、その型毎に著効率ＳＲrate１及びＳＲrate２を算出する。２つの型への分類は、治療の有効性に対する相関度が互いに差が生じるように分類するのが望ましい。より具体的には、２つの型の各々に対する著効率の差が大きくなるように分類するのが望ましい。以下では、この２つの型をそれぞれ「第１の型」及び「第２の型」と呼ぶ。
【００５５】
以上はＭｘＡ−８８を例に説明したが、他の遺伝子型、すなわちＭｘＡ−１２３、ＭＢＬ、ＬＭＰ７、ＩＦＮＡＲ１（ＧＴ）ｎ、ＩＦＮＡＲ１ Ｃ／Ｔなどについても同様の２つの型への分類、各型に対する著効率の算出を実行する。
【００５６】
また、本発明に従うＩＲＦ−１の場合も、同様に治療の著効率を算出する著効率算出処理を実行すればよい（例として実施例２を参照されたい）。
【００５７】
得られた著効率は、その型毎に図示しないデータベース（有効性判定データベース３でもよい）に格納される。
【００５８】
次に、オッズ算出処理を実行する（ｓ２）。オッズＯｋとは、２つの型の著効率のうち、大きい方の著効率を小さな方の著効率で除した数値であり、以下の式で示される。なお、ｋは、遺伝子型毎に付与される識別番号を示す。
【００５９】
Ｏｋ＝ＳＲrate１／ＳＲrate２ （ＳＲrate１＞ＳＲrate２の場合）
Ｏｋ＝ＳＲrate２／ＳＲrate１ （ＳＲrate１＜ＳＲrate２の場合）
ＳＲrate１＝ＳＲrate２の場合は、上記２式のいずれで定義してもよい。
【００６０】
以上の式により、すべての遺伝子型についてオッズＯｋを算出し、得られたオッズＯｋは図示しないデータベース（有効性判定データベース３でもよい）に格納される。
【００６１】
次に、χ２値算出処理を実行する（ｓ３）。以下、ｃｋ＝χ２と定義する。χ２値ｃｋは以下の式により算出される。
【００６２】
ｃｋ＝χ２＝（ｎ−１）ｓ２／σ２
ここで、確率変数はＸａ，Ｙａ，Ｘｂ，Ｙｂ、ｎは標本の大きさ、σ２は分散で、ｓ２は標本分散である。より具体的には、Ｘａ，Ｙａ，Ｘｂ，Ｙｂの各数値をカイ二乗検定の２×２分割表に代入することによりカイ二乗値χ２を得ることができる。
【００６３】
次に、オッズＯｋ及びχ２値に基づき、重み係数Ｓｋを算出する重み係数算出処理を実行する（ｓ４）。重み係数Ｓｋは、以下の式により算出される。
【００６４】
Ｓｋ＝（Ｏｋ−１）ｃｋ／２０。
【００６５】
次に、得られた重み係数Ｓｋに対する２つの型への符号割り当て処理を実行する（ｓ５）。重み係数Ｓｋは正の値をとる。正の符号＋は、著効率（ＳＲrate）の高い型に割り当てられ、負の符号は、著効率（ＳＲrate）の低い型に割り当てられる。具体的には、各遺伝子型における２つの型の著効率を比較し、大きな著効率を有する型に正の符号を割り当て、小さな著効率を有する型に負の符号を割り当てる。
【００６６】
このように符号割り当て処理を各遺伝子型について実行し、得られた重み係数Ｓｋ、−Ｓｋを有効性判定データベース３に格納する。
【００６７】
以上により、有効性判定データベース３の作成が終了する。
【００６８】
次に、有効性判定手段２２による有効性判定データベース３を用いた有効性判定処理について図１１のフローチャートに沿って説明する。
【００６９】
まず、被検体としての患者から、ヒト遺伝子型情報及びウィルス遺伝子型情報を得る（ｓ６１）。具体的には、個体に由来するサンプルを取得し、得られたサンプルをＤＮＡチップのセル内に注入し、セル内に固定化されたＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応を行わせる。ハイブリダイゼーション反応の後、バッファや挿入剤をセル内に充填し、セル内に固定された電極からの電気化学信号を検出する。この電気化学信号を信号処理することにより、ヒト遺伝子型情報及びウィルス遺伝子型情報を得ることができる。もちろん、他の手法によりこの被検体からの情報を取得してもよい。
【００７０】
次に、得られた被検体のヒト遺伝子型情報及びウィルス遺伝子型情報からなる被検体データを入力装置１を用いて入力する（ｓ６２）。
【００７１】
処理装置２は、入力された遺伝子型情報及びウィルス遺伝子型情報に基づき有効性の判定を行う（ｓ６３）。
【００７２】
具体的には、有効性判定プログラムが記憶媒体６から記憶媒体読取装置５により読み取られ、これにより処理装置２は有効性判定手段２２として機能する。有効性判定手段２２は、まず入力されたウィルス遺伝子型情報に対応するデータテーブルを有効性判定データベース３から読み出す（ｓ６３ａ）。そして、入力された遺伝子型に対応付けられた符号と重み係数を乗算することにより各々の遺伝子型についてヒト有効性予測個別値を得る（ｓ６３ｂ）。そして、得られた各々の遺伝子型についての有効性予測個別値を加算し、有効性予測加算値を算出する（ｓ６３ｃ）。
【００７３】
この有効性予測加算値の算出概念図を図１２に示す。図１２に示すように、入力された被検体データがＭｘＡ−８８、ＭｘＡ−１２３、ＭＢＬ、ＬＭＰ７、ＩＦＮＡＲ１（ＧＴ）ｎ、ＩＦＮＡＲ１ Ｃ／Ｔの順にＧ／Ｔ、Ｃ／Ｃ、ＹＡ、Ａ／Ａ、５／５、Ｔ／Ｔである場合、各々についてＭｘＡ−８８、ＭＢＬ、ＬＭＰ７、ＩＦＮＡＲ１（ＧＴ）ｎ、ＩＦＮＡＲ１ Ｃ／Ｔについては重み係数Ｓｋに＋１を乗算した値が割り当てられ、ＭｘＡ−１２３については重み係数Ｓｋに−１が乗算した値が割り当てられる。その結果、重み係数は図１２の通りとなる。この重み係数（有効性予測個別値）を加算すると、有効性個別加算値は（＋０．４１）＋（−０．４０）＋（＋０．２８）＋（＋０．０２）＋（＋０．２８）＋（＋０．００）＝０．５９となる。また、ＩＲＦ−１についても同様に被検体データとして入力してよく、それによって重み係数が割り当てられ、更に有効性個別加算値が得られる（例として実施例２を参照されたい）。しかし、重み係数は本数値に限定するものではなく、各因子の有効性の度合い（ｐ値等）や、新しく発見されたより有効な因子の加算等により随時変更することができる。
【００７４】
次に、処理装置２は、出力装置４に有効性判定結果として有効性予測加算値を出力する（ｓ６４）。主治医あるいは患者は、出力された有効性予測加算値に基づき、治療の有効性を予測し、その治療方法を選択するか否かを判断する際の参考に供することができる。一般に有効性予測加算値が高いほど、治療の有効性が高いが、感染したＨＣＶの遺伝子型等ヒトゲノムＳＮＰｓ以外の要因をも加味した判断基準を設けることが重要である。
【００７５】
よって、有効性の判定は、有効性予測加算値の算出に限定されない。例えば、有効性予測加算値に対応する各要因別の著効率を算出してもよい。
【００７６】
以上により、有効性判定データベース３の生成及びそれを用いた有効性判定は終了する。
【００７７】
以上のような治療法の有効性を予測するためのプログラム、データベース、システム及び方法は、本発明に好ましく利用することが可能である。
【００７８】
なお、本発明は上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合わせにより、種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。さらに、異なる実施形態にわたる構成要素を適宜組み合わせてもよい。
【００７９】
【実施例】
１．ＩＲＦ−１遺伝子とＩＦＮ療法の治療効果との関連性の確認
個々の患者について、感染しているＨＣＶの遺伝子型、ＩＲＦ−１遺伝子のプロモーターＳＮＰｓのタイプを決定し、これらの要因とＩＦＮ治療効果の関係を調べた。
【００８０】
１）概要
１５７例のＨＣＶ感染患者より採取した血液から、ＤＮＡおよびＲＮＡを抽出してサンプルとした。ＲＮＡ画分を用いてウイルスの遺伝子型判定を行ない、ＤＮＡ画分を用いてＩＲＦ−１遺伝子のプロモーターＳＮＰｓの解析を行なった。そして、これらの要因とＩＦＮ治療効果との関連性を調べた。
【００８１】
２）患者
患者の血液および肝組織による血液生化学的・組織学的な検査、さらに画像診断的検査によりＣ型慢性肝炎であると診断され、さらにＩＦＮ治療を経験しその治療効果が明らかとなった１５７例の患者の血液サンプルを本研究に使用した。なお、すべての患者に本研究の対象となることに関してのインフォームドコンセントを行なった。ＩＦＮ治療効果判定は、ＩＦＮ投与終了後６ヶ月の間に、血中のトランスアミナーゼが正常範囲にあり且つＨＣＶ ＲＮＡが陰性であった患者を完全著効と判定した。一方、治療によってＨＣＶの排除が起こらなかった、もしくは排除されたが投与終了後６ヶ月の間に再燃した、或いはＨＣＶの排除は起こったが投与終了後６ヶ月の間に血中のトランスアミナーゼが異常値を示した患者はすべて非著効と判定した。以上の判定基準により、全１５７例の患者は、完全著効５０例、非著効１０７例に判別された。
【００８２】
３）ＨＣＶ遺伝子型、およびＩＲＦ−１遺伝子プロモーターＳＮＰｓの解析
上述した１５７例のＩＦＮ治療前の血清を用いて、ＨＣＶ遺伝子型の解析を行なった。ＨＣＶ ＲＮＡの抽出にはＳｅｐａＧｅｎｅＲＶ−Ｒ（三光純薬社製）を用いた。その後、Ｍ−ＭＬＶ 逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。その後の増幅には、一定方向のプライマーを各遺伝子型に特異的な配列を持つ箇所に位置をずらして設計することにより、増幅する産物の長さに差を持たせ、電気泳動の移動度で遺伝子型判定が可能となるＰＣＲ法（Okamoto H. et al., J. Gen. Virol.73, 673-679, 1992, Chayama K. et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 8, 150-156, 1993）を用いて行なった。
【００８３】
また、全血より抽出したヒトゲノムＤＮＡを用いてＩＲＦ−１遺伝子のプロモーターＳＮＰｓ解析を行なった。ヒトゲノムＤＮＡの抽出には、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。
【００８４】
遺伝子解析を行なうための増幅には、ＧｅｎＢａｎｋ受け付け番号ＡＣ０７９３２０の配列に基づいてプライマ−を作成して用いた。解析する範囲は、プロモーター領域と考えられる範囲を網羅したおよそ950塩基の領域について行なった。プロモーター領域を予測する際の翻訳開始部位は、ＧｅｎＢａｎｋ受け付け番号Ｘ５３０９５に記載されたmajor transcriptional start位置を参考にした。より上流の配列を増幅するためのプライマ−はIRF-06(5'-gtatatctcccgaacgcagg-3')
とIRF-04(5'-gcttctctgaaccccttctc-3')を用い、下流の配列にはIRF-01(5'-cacgtcttgcctcgactaag-3')とIRF-03(5'-aggactgaaaccctcccttc-3')を用いた。増幅にはFastStart Taq DNA Polymerase(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)を用いた。なお、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分を４０サイクル行い、その前に９４℃で４分、後に７２℃７分の処理を行なった。
【００８５】
増幅が終了したサンプルは、その一部を電気泳動して生成産物のサイズなどの確認を終えた後、ExoSap(Amersham Biosciences社製)にて精製した。シークエンスの反応はMegaBACE ET Terminator(Amersham Biosciences社製)を用いて行い、解析にはMegaBACE1000 DNA Sequencing System(Amersham Biosciences社製)を用いて行なった。
【００８６】
４）結果
１５７サンプルすべてについて解析を行い、結果を図１にまとめた。ＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域には、６箇所のＳＮＰｓが発見された。そのうちの１箇所（−３８５位）は、１５７サンプルの約９０％がＧＧホモで、残りの約１０％の患者でＡＧヘテロ、ＡＡホモが見られたのみであった。このＳＮＰは治療効果と関連が見られなかったため除外した。残りの５ＳＮＰｓはすべて連鎖しており、図１に示す３種のタイプに分けられることがわかった。転写開始点から一番近い位置のＳＮＰである−２９７位の塩基によって表記すると、Ｇ型（ＧＧホモ）、Ａ型（ＡＡホモ）、Ｒ型（ＡＧヘテロ）の３種がある。５つのＳＮＰｓが互いに連鎖する様子は図３に示した。
【００８７】
このうち３つのＳＮＰｓを報告している文献（Saito H. et al., J. Cell. Biochem.36, 191-200, 2001）とは、ＳＮＰｓの表記が異なっているが、本研究の−２９７位が文献の−３００位と、−４０７位が−４１０位と、−４１２位が−４１５位と、それぞれ対応するものと考えられる。さらに、同じ文献には述べられていないさらに上流の２ＳＮＰｓ（−５９７位、−７２３位）を新たに発見することができた。
【００８８】
次にこれら５つのＳＮＰｓとＩＦＮ治療効果との関係を調べ、結果を図４に示した。その結果、１５７例全体で見た場合には、Ｒ型（ＡＧヘテロ）が最も多く８１例（５２％）、ついでＧ型（ＧＧホモ）が５７例（３６％）、少ない型はＡ型（ＡＡホモ）で１９例（１２％）であった。これを、ＩＦＮ治療効果別に示すと、完全著効例ではＧ型１５例（３０％）、Ｒ型２９例（５８％）、Ａ型６例（１２％）、であり非著効例ではＧ型４２例（３９％）、Ｒ型５２例（４９％）、Ａ型１３例（１２％）であった。完全著効例と非著効例の間に有意な差は認められなかった。
【００８９】
同様に、ＩＦＮ治療効果に大きく影響を与えるとされているHCV遺伝子型別に、５つのＳＮＰｓとＩＦＮ治療効果との関係を調べた（図５）。ＨＣＶ遺伝子型１型においては、完全著効例ではG型５例（３１％）、Ｒ型１０例（６３％）、Ａ型１例（６％）、であり非著効例ではＧ型２７例（３２％）、Ｒ型４７例（５５％）、Ａ型１１例（１３％）で、１５７例全体で見た場合と同様に有意な傾向は認められなかった。対するＨＣＶ遺伝子型２型においては、完全著効例ではG型１０例（２９％）、Ｒ型１９例（５６％）、Ａ型５例（１５％）、であり非著効例ではＧ型１４例（６６％）、Ｒ型５例（２４％）、Ａ型２例（１０％）であった。ＨＣＶ遺伝子型１型に比して、２型はＲ型が少なくＧ型が多いという傾向が認められた。
【００９０】
この差を検証するために、Ｇ型かまたはそれ以外（Ｒ型かＡ型）という分類をして、ＨＣＶ遺伝子型別にカイ２乗検定を行なった（図６）。ＨＣＶ遺伝子型１型においては、完全著効例ではＧ型５例（３１％）、ＲもしくはＡ型が１１例（６９％）、であり非著効例ではＧ型２７例（３２％）、ＲもしくはＡ型が５８例（６８％）で、両者に有意な差は見られなかった（p=0.8008255）。
【００９１】
一方のＨＣＶ遺伝子型２型においては、完全著効例ではG型１０例（２９％）、Ｒ型もしくはＡ型２４例（７１％）、であり非著効例ではＧ型１４例（６６％）、Ｒ型もしくはＡ型７例（３４％）で、明らかに有意な差が認められた（p=0.0067972）。即ち、ＨＣＶ遺伝子型２型が感染した患者は、Ｇ型であればＩＦＮ治療が効かない可能性がたかく、Ｒ型やＡ型であれば著効する可能性が高いと考えられる。
【００９２】
以上の結果より、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーターにおける互いに連鎖した５つのＳＮＰｓを調べることで、遺伝子型２型のＨＣＶが感染した患者においては、ＩＦＮ療法の治療効果が予測可能であると示唆された。
【００９３】
２．ＩＲＦ−１遺伝子プロモーターＳＮＰｓによるＩＦＮ療法の治療効果判定の実際
測定したヒトゲノムＳＮＰｓ情報を、より効果的にかつ簡便にＩＦＮ治療効果予測に役立てるために、測定結果の数値化し判別関数によって結果の処理を行なうためのスコアリングシステムを構築した。
【００９４】
１）概要
ＩＦＮ治療効果を治療前に予め予測するために、本発明者はＩＲＦ−１以外にも、これまでにＭｘＡ遺伝子のプロモーター領域にある２ＳＮＰｓ（−１２３位、−８８位）他を報告してきた。それによると、ＭｘＡ−１２３位はＣＣホモであると非著効になりやすく、ＣＡヘテロかＡＡホモであれば完全著効になりやすい。また、ＭｘＡ−８８位は、ＧＧであると非著効になりやすく、ＧＴへテロかＴＴホモであると完全著効になりやすかった。
【００９５】
また、これらのＳＮＰｓ情報を数値化し、判別関数に代入することによって、簡便に治療効果予測をするスコアリング法も構築してきた。この方法に、今回のＩＲＦ−１の要因を加えることにより、判定効率がさらに高まるかどうかを調べた。
【００９６】
２）患者
患者の血液および肝組織による血液生化学的・組織学的な検査、さらに画像診断的検査により慢性Ｃ型肝炎であると診断され、さらにＩＦＮ治療を経験しその治療効果が明らかとなった１５７例のうち、ＨＣＶ遺伝子型２型が感染していた５５例を対象とし、患者の血液サンプルを本研究に使用した。なお、すべての患者に本研究の対象となることに関してのインフォームドコンセントを行なった。治療効果判定は、ＩＦＮ投与終了後６ヶ月の間に、血中のトランスアミナーゼが正常範囲にあり且つＨＣＶ ＲＮＡが陰性であった患者を完全著効と判定した。一方、治療によってＨＣVの排除が起こらなかった、もしくは排除されたが投与終了後６ヶ月の間に再燃した、或いはＨＣＶの排除は起こったが投与終了後６ヶ月の間に血中のトランスアミナーゼが異常値を示した患者はすべて非著効と判定した。以上の判定基準により、全５５例のＨＣＶ２型の患者は、完全著効３４例、非著効２１例に判別された。
【００９７】
３）ＩＲＦ−１遺伝子プロモーターＳＮＰｓの遺伝子解析
遺伝子解析を行なうための増幅には、ＧｅｎＢａｎｋ受け付け番号ＡＣ０７９３２０の配列に基づいてプライマ−を作成して用いた。解析する範囲は、プロモーター領域と考えられる範囲を網羅したおよそ９５０塩基領域について行なった。プロモーター領域を予測する際の翻訳開始部位は、ＧｅｎＢａｎｋ受け付け番号Ｘ５３０９５に記載されたmajor transcriptional start位置を参考にした。より上流の配列を増幅するためのプライマ−はＩＲＦ−０６(5'-gtatatctcccgaacgcagg-3'；配列番号４)とＩＲＦ−０４(5'-gcttctctgaaccccttctc-3'；配列番号５)を用い、下流の配列にはＩＲＦ−０１(5'-cacgtcttgcctcgactaag-3'；配列番号６)とＩＲＦ−０３(5'-aggactgaaaccctcccttc-3'；配列番号７)を用いた。増幅にはFastStart Taq DNA Polymerase(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)を用いた。なお、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分を４０サイクル行い、その前に９４℃で４分、後に７２℃７分の処理を行なった。
【００９８】
増幅が終了したサンプルは、その一部を電気泳動して生成産物のサイズなどの確認を終えた後、ExoSap(Amersham Biosciences社製)にて精製した。シークエンスの反応はMegaBACE ET Terminator(Amersham Biosciences社製)を用いて行い、解析にはMegaBACE1000 DNA Sequencing System(Amersham Biosciences社製)を用いて行なった。
【００９９】
４）結果
遺伝子を解析した結果、ＨＣＶ２型の完全著効例ではG型１０例（２９％）、Ｒ型１９例（５６％）、Ａ型５例（１５％）、であり非著効例ではＧ型１４例（６６％）、Ｒ型５例（２４％）、Ａ型２例（１０％）であった。また、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーターを２タイプに分類して解析すると、完全著効例ではG型１０例（２９％）、Ｒ型もしくはＡ型２４例（７１％）、であり非著効例ではＧ型１４例（６６％）、Ｒ型もしくはＡ型７例（３４％）で、明らかに有意な差が認められた（p=0.0067972）。
【０１００】
これを既存のスコアリングシステムに応用した。本発明者らが構築したスコアリングシステムにおいては、各ＳＮＰｓは数値化される。例えば、ＭｘＡ（−１２３）では、（ＣＣ，ＣＡ，ＡＡ）＝（−１、１、１）であり、ＭｘＡ（−８８）では、（ＧＧ，ＧＴ，ＴＴ）＝（−１、１、１）という数値化が可能である。各症例におけるこれらの数値と、ＩＦＮ治療効果を基に判別関数を作成した。判別関数の係数は通常の統計学の手法に従って決定した（参考文献：栗原孝次著「データの科学」放送大学教育振興会）。計算値が０以上であれば「完全著効する」、０以下であれば「非著効となる」と判定する。
【０１０１】
遺伝子型２型のＨＣＶが感染した５５例のＩＦＮ治療効果とＳＮＰｓの関係から、ＭｘＡ（−１２３）では、次のような判別関数が導き出された；
0.79(MxA-123) + 0.05。
【０１０２】
この判別関数によって０以上の数値を示し、「完全著効する」と判定された症例は２２例であり、実際に完全著効した症例の３４例のうち１２例の判定が誤りであった。よって誤り率は３５％ということになる。同様に同じ判別関数によって０以上の数値を示し、「非著効となる」と判定された症例は１５例であり、実際に非著効であった２１例のうち６例の判定が誤りであった。よって誤り率は２９％ということになる。
【０１０３】
同様に、ＭｘＡ（−８８）では、次のような判別関数が導き出された；
0.75(MxA-88) -0.01。
【０１０４】
この判別関数によって、「完全著効する」と判定された症例は２３例であり、実際に完全著効した症例３４例のうち１１例の判定が誤りであった。よって誤り率は３２％ということになる。同様に、「非著効となる」と判定された症例は１４例であり、実際に非著効であった症例２１例のうち７例の判定が誤りであった。よって誤り率は３２％ということになる。
【０１０５】
これら２要因を加えると、次のような判別関数が導き出された；
0.67(MxA-123) + 0.14(MxA-88) + 0.04。
【０１０６】
この判別関数によって、「完全著効する」と判定された症例は２２例であり、実際に完全著効した３４例のうち１２例の判定が誤りであった。よって誤り率は３５％ということになる。同様に、「非著効となる」と判定された症例は１５例であり、実際に非著効であった２１例のうち６例の判定が誤りであった。よって誤り率は２９％ということになる。
【０１０７】
同じことを、ＩＲＦ−１でも行なった。ＩＲＦ−１での数値化は、（ＣＣ，ＣＴ，ＴＴ）＝（−１、１、１）であった。これらの結果と各症例の治療効果との関係から、次のような判別関数が導き出された；
0.842(IRF-1) -0.0033。
【０１０８】
この判別関数によって、「完全著効する」と判定された症例は２４例であり、実際に完全著効した３４例のうち１０例の判定が誤りであった。よって誤り率は３０％ということになる。同様に、「非著効となる」と判定された症例は１４例であり、実際に非著効であった２１例のうち７例の判定が誤りであった。よって誤り率は３３％ということになる。
【０１０９】
同じ数値化により、ＭｘＡの２ＳＮＰｓとＩＲＦ−１を組み合わせると以下のような結果になった；
0.703(MxA-123)+0.754(IRF-1)+0.0177
0.661(MxA-88)+0.761(IRF-1)-0.0363
0.602(MxA-123)+0.109(MxA-88)+0.753(IRF-1)+0.0098。
【０１１０】
これらの３種の判別関数を用いた場合は、すべて同じ結果になった。即ち、「完全著効する」と判定された症例は２４例であり、実際に完全著効した３４例のうち１０例の判定が誤りであった。よって誤り率は３０％ということになる。同様に、「非著効となる」と判定された症例は１４例であり、実際に非著効であった２１例のうち７例の判定が誤りであった。よって誤り率は３３％ということになる。
【０１１１】
このような方法で、ＩＲＦ−１遺伝子のプロモーターＳＮＰｓを測定し、単独で又は既知の遺伝子からの情報と共に判別関数に代入することにより、簡便に治療効果予測に役立てることができる。
【０１１２】
【発明の効果】
本発明により、ＩＦＮ療法の有効性を予測するための新規多型、ＩＦＮ療法の有効性の予測方法が提供された。当該多型は、特に２型ＨＣＶ感染者におけるＩＦＮの治療効果を予測するために有用である。
【０１１３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＩＲＦ−１遺伝子プロモーター配列を示す図。
【図２】 図２は、図１の続きでありＩＲＦ−１遺伝子プロモーター配列を示す図。
【図３】 ＩＲＦ−１遺伝子のプロモーター領域に見つかった互いに連鎖する５ＳＮＰｓと１５７例の内訳を示す図。
【図４】 ＩＲＦ−１遺伝子プロモーターＳＮＰｓのタイプとＩＦＮ治療効果との関係を示す図。
【図５】 ＨＣＶ遺伝子型別にみたＩＲＦ−１遺伝子のプロモーターＳＮＰｓのタイプとＩＦＮ治療効果との関係を示す図。
【図６】 ＨＣＶ遺伝子型別にみたＩＲＦ−１遺伝子のプロモーターＳＮＰｓのタイプとＩＦＮ治療効果との関係を示す図。
【図７】 本発明において使用され得る治療法有効性予測装置の全体構成を示す図。
【図８】 本発明において使用され得る検体統計データベース（ＤＢ）の一例を示す図。
【図９】 本発明において使用され得る有効性判定データベースの一例を示す図。
【図１０】 本発明における有効性判定データベースの作成方法のフローチャートを示す図。
【図１１】 本発明における有効性判定処理のフローチャートを示す図。
【図１２】 本発明における有効性予測加算値の算出概念図。
【符号の説明】
１…入力装置、２…処理装置、３…有効性判定データベース、４…出力装置、５…記憶媒体読取装置、６…記憶媒体、１０…コンピュータ、１１…通信ネットワーク、１２…検体統計データベース
Claims (2)
- Ｃ型肝炎ウイルス２型感染者においてインターフェロン療法の有効性を予測する方法であって、
（１）個体から採取されたサンプルについて、インターフェロン調節因子−１遺伝子プロモーター領域の転写開始部位を１とした場合のその上流５９７番目の位置および／または７２３番目の位置の一塩基多型の遺伝子型を決定すること、および
（２）（１）で決定された遺伝子型からインターフェロン療法の有効性の予測を行うこと、
を具備するＣ型肝炎ウイルス２型感染者においてインターフェロン療法の有効性を予測する方法。 - （１）において、更に、前記インターフェロン調節因子−１遺伝子プロモーター領域の転写開始部位を１とした場合のその上流２９７位番目の位置、４０７番目の位置および４１２位番目の位置からなる群より少なくとも１つ選択される一塩基多型の遺伝子型を決定する請求項１に記載の方法。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2003091971A JP4197623B2 (ja) | 2003-03-28 | 2003-03-28 | インターフェロンの治療効果を予測するための新規多型マーカー、プライマー、プローブおよびインターフェロンの治療効果を予測する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP2003091971A JP4197623B2 (ja) | 2003-03-28 | 2003-03-28 | インターフェロンの治療効果を予測するための新規多型マーカー、プライマー、プローブおよびインターフェロンの治療効果を予測する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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