JP2008151505A - インターフェロン療法の有効性判定方法及び判定用キット - Google Patents

Abstract

【課題】 Ｃ型肝炎患者におけるインターフェロン療法の有効性を事前に判定する。
【解決手段】 Ｃ型肝炎患者の体液中におけるマーカー物質の濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎患者に対してインターフェロン療法が有効であるか否かを判定する。マーカー物質の濃度を測定する方法としては、イオン交換体や金属キレート体を固定化した基板等の担体にマーカー物質を捕捉し、質量分析により行なうことができる。前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むインターフェロン療法の有効性判定用キットによれば、より簡便かつ迅速に、Ｃ型肝炎患者に対してインターフェロン療法が有効であるか否かを判定することができる。
【選択図】 図１

Description

本発明はインターフェロン療法の有効性判定方法及び判定用キットに関し、さらに詳細には、Ｃ型肝炎患者の体液中におけるマーカー物質の濃度を指標として、当該Ｃ型肝炎患者に対してインターフェロン療法が有効であるか否かを判定するインターフェロン療法の有効性判定方法、及び当該判定方法に用いるための判定用キットに関する。

Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ。以下、「ＨＣＶ」と略記する。）の感染により発病するウイルス性肝炎である。Ｃ型肝炎は特別な症状が起こることなく徐々に進行し、治療せずにおくと１０〜３０年かけて肝硬変、さらに肝癌へと移行することが多い。

Ｃ型肝炎の治療法として、従来より、インターフェロンの投与（インターフェロン療法）が行なわれている。インターフェロンはＨＣＶの増殖を抑える作用があり、治療が成功すれば、ＨＣＶは体内から消える。しかし、インターフェロンの単独投与（インターフェロン単独療法）が有効なＣ型肝炎患者は限定的であることがわかっている。そこで、インターフェロンと別の抗ウイルス剤であるリバビリンとの併用投与（インターフェロン・リバビリン併用療法）が開発され、インターフェロン単独療法に比較して高い効果をあげている。しかしながら、インターフェロン・リバビリン併用療法によっても治療効果が認められないＣ型肝炎患者はなお多い。

インターフェロンは、生体内で産生される生理活性物質の一つであり、抗ウイルス作用や抗ガン作用を有することが知られている。インターフェロンには、α、β、γの主要なサブタイプがあり、このうち、Ｃ型肝炎の治療に用いられているのはαとβである。インターフェロンαは筋肉注射で、インターフェロンβは静脈注射で主に投与され、Ｃ型肝炎に対する治療効果はほぼ同じといわれている。

一方、リバビリン（Ribavirin，1-β-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide）は、プリン骨格をもつ核酸アナログの一種であり、内服の抗ウイルス剤としてインフルエンザ、ヘルペス、麻疹等の治療に古くから用いられている。しかし、リバビリンの単独投与はＣ型肝炎の治療にほとんど効果がなく、リバビリンはインターフェロンと併用することでＨＣＶの排除効果を高める効果を発揮する。

インターフェロン療法によりＣ型肝炎の治療を行なう場合は、４０週程度の長期にわたる投与が必要である。しかし、インターフェロンには発熱、全身倦怠感、関節痛等の副作用があり、長期投与による患者の身体的負担は大きい。さらに、インターフェロンは高価な医薬であり、経済的負担も大きい。また、インターフェロン・リバビリン併用療法を行なう場合は、インターフェロン投与と同じ期間のリバビリン投与が必要であるが、リバビリンにも溶血を起こす副作用があり、患者の身体的・経済的負担はさらに大きい。そして、インターフェロン療法やインターフェロン・リバビリン併用療法による治療効果がないＣ型肝炎患者にとっては、これらの療法は副作用を引き起こすだけであり、何ら利益はない。したがって、Ｃ型肝炎患者に対するインターフェロン療法やインターフェロン・リバビリン併用療法の有効性を判定し、治療効果が期待できない患者をあらかじめ判別することが望ましい。

Ｃ型肝炎患者においてインターフェロン療法がＣ型肝炎の治療に有効か否かは、ウイルス側の要因と患者側の要因の２つが関与しているといわれている。ウイルス側の要因としては、ＨＣＶの遺伝子型とＨＣＶの量の関与が指摘されている。すなわち、ＨＣＶには複数の遺伝子型があり、遺伝子型が１ａ、１ｂのＨＣＶにはインターフェロンが効きにくく、それ以外の、例えば遺伝子型が２ａ、２ｂのＨＣＶにはインターフェロンが効きやすい。また、ＨＣＶの量が多いほどインターフェロンが効きにくい。そして、感染しているＨＣＶの遺伝子型をあらかじめ調べる（タイピング）ことによって、インターフェロン療法の有効性を判定する方法が提案されている（特許文献１)。一方、患者側の要因として、Ｃ型肝炎患者の一塩基多型（ＳＮＰ）によってインターフェロン療法の有効性を判定する方法も提案されている（特許文献２、特許文献３）。さらに、Ｃ型肝炎患者の肝臓におけるインターフェロンレセプターの発現量を指標として、インターフェロン療法の有効性を判定する方法も提案されている（特許文献４）。
特開２００１−２３８６８７号公報 特開２００３−３３９３８０号公報 特開２００４−２９８０１１号公報 特開２００１−１４９０７６号公報

しかし、上記した方法は全て、患者から採取した検体からＤＮＡやＲＮＡを調製する必要があり、操作が煩雑である。また、インターフェロンレセプターの発現量によって判別する方法は、検体として肝組織を採取する必要があり、侵襲を伴う。一方、インターフェロン療法が有効な患者か否かを判別できるマーカー物質があれば、患者から採取した体液中のマーカー物質の濃度を測定するだけで、インターフェロン療法の有効性を判定することができる。しかし、そのようなマーカー物質は見出されていない。

本発明の目的は、Ｃ型肝炎患者においてインターフェロン療法が有効な患者と有効でない患者を判別することができる体液中のマーカー物質を特定し、当該マーカー物質を用いてインターフェロン療法の有効性を判定する方法、及び当該方法を簡便に行なうためのキットを提供することにある。

本発明者らは、インターフェロン療法が有効でないＣ型肝炎患者に特異的なマーカー物質を検索すべく、同療法が有効であったＣ型肝炎患者と有効でなかったＣ型肝炎患者の体液中のタンパク質を質量分析計スペクトルにより網羅的に比較し、特異的なマーカー物質を検索した。その結果、同療法が有効であったＣ型肝炎患者と有効でなかったＣ型肝炎患者との間で、統計的に有意差のある複数のタンパク質を見出した。そして、当該タンパク質の体液中における濃度を指標として、Ｃ型肝炎患者におけるインターフェロン療法の有効性を判定することができることを見出した。さらに、当該判定方法を簡便に実施することができる判定用キットを構築し、本発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。

請求項１に記載の発明は、Ｃ型肝炎患者の体液中における下記マーカー物質（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎患者に対してインターフェロン療法が有効であるか否かを判定することを特徴とするインターフェロン療法の有効性判定方法である。
（ａ）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合せず、ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｂ）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合せず、ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｃ）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、有機溶媒で強陰イオン交換体に結合せず、ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８７０のイオンピークを生じるタンパク質。

本発明のインターフェロン療法の有効性判定方法は、Ｃ型肝炎患者の体液中におけるマーカー物質の濃度を指標とするものである。そして、マーカー物質として上記マーカー物質（ａ）〜（ｃ）のうちの少なくとも１つを用いる。本発明のインターフェロン療法の有効性判定方法によれば、通常の臨床検査と同様に、患者から採取した体液を検査材料としてインターフェロン療法の有効性を判定できるので、簡便かつ迅速である。ここで、「インターフェロン療法」には、インターフェロン単独療法の他に、インターフェロンと他の薬剤との併用療法、例えばインターフェロン・リバビリン併用療法を含むものとする。また、質量／電荷比の「約５８８０」、「約５８９０」、「約６８７０」とは、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、約５８８０は概ね５８８０±０．２％、約５８９０は概ね５８９０±０．２％、約６８７０は概ね６８７０±０．２％を指す。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。なお、マーカー物質（ａ）と（ｂ）は、インターフェロン療法が有効でないＣ型肝炎患者の体液において、高値を示す。また、マーカー物質（ｃ）は、インターフェロン療法が有効でないＣ型肝炎患者の体液において、低値を示す。

請求項２に記載の発明は、前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１に記載のインターフェロン療法の有効性判定方法である。

かかる構成により、検査材料を簡単に採取でき、より簡便かつ迅速にＣ型肝炎患者におけるインターフェロン療法の有効性を判定することができる。

請求項３に記載の発明は、質量分析により体液中における前記マーカー物質の濃度を測定することを特徴とする請求項１又は２に記載のインターフェロン療法の有効性判定方法である。

かかる構成により、質量／電荷比のイオンピーク強度によってマーカー物質の濃度を測定することができる。

請求項４に記載の発明は、Ｃ型肝炎患者から体液を採取し、該体液又は体液成分を前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、前記マーカー物質を捕捉し、前記マーカー物質の濃度を測定することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のインターフェロン療法の有効性判定方法である。

本発明のインターフェロン療法の有効性判定方法においては、検査材料となる体液又は体液成分をマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を使用する。そして、該担体に体液又は体液成分を接触させて、体液又は体液成分に含まれるマーカー物質を、マーカー物質に対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉する。そして、担体上に捕捉されたマーカー物質の濃度を測定する。本発明のインターフェロン療法の有効性判定方法によれば、検査材料の取り扱いが容易であり、かつ捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、より正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清又は血漿が挙げられる。

請求項５に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は金属キレート体であることを特徴とする請求項４に記載のインターフェロン療法の有効性判定方法である。

本発明のインターフェロン療法の有効性判定方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体又は金属キレート体を用い、イオン交換基又は金属キレート体を介して検査材料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。イオン交換体又は金属キレート体は各種のものが入手容易であるので、本発明のインターフェロン療法の有効性判定方法においては、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができ、作業が容易である。

請求項６に記載の発明は、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項４又は５に記載のインターフェロン療法の有効性判定方法である。

本発明のインターフェロン療法の有効性判定方法では、平面部分を有する担体を用い、マーカー物質に対する親和性を有する物質は該平面部分の一部に固定化されている。かかる構成により、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の検査材料を処理することができ、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の検査材料からでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。

請求項７に記載の発明は、請求項１〜６のいずれかに記載のインターフェロン療法の有効性判定方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とするインターフェロン療法の有効性判定用キットである。

本発明のインターフェロン療法の有効性判定用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。かかる構成により、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。

請求項８に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は金属キレート体であることを特徴とする請求項７に記載のインターフェロン療法の有効性判定用キットである。

かかる構成により、マーカー物質をより確実に担体上に捕捉することができる。

本発明のインターフェロン療法の有効性判定方法によれば、インターフェロン療法が有効な患者と有効でない患者を、より簡便かつ迅速に判別することができる。その結果、当該療法が有効でないＣ型肝炎患者に対してインターフェロン療法を行なうことを、事前に防ぐことができる。

本発明のインターフェロン療法の有効性判定用キットによれば、インターフェロン療法が有効な患者と有効でない患者を、より簡便かつ迅速に判別することができる。

以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。

本発明のインターフェロン療法の有効性判定方法は、患者体液における下記マーカー物質（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１個の濃度を指標とする。
（ａ）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合せず、ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｂ）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合せず、ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｃ）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、有機溶媒で強陰イオン交換体に結合せず、ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８７０のイオンピークを生じるタンパク質。
これらのマーカー物質は、いずれもインターフェロン療法が有効である患者と有効でない患者との間で、体液中における濃度が有意に差があるタンパク質である。すなわち、マーカー物質（ａ）と（ｂ）は、インターフェロン療法が有効でない患者において有意に高値を示し、マーカー物質（ｃ）は、インターフェロン療法が有効でない患者において有意に低値を示す。

好ましくは、マーカー物質（ａ）又はマーカー物質（ｂ）と、マーカー物質（ｃ）とを組み合わせて使用する。すなわち、マーカー物質（ａ）又はマーカー物質（ｂ）と、マーカー物質（ｃ）とは挙動が逆（高値と低値）であるので、マーカー物質（ａ）又はマーカー物質（ｂ）と、マーカー物質（ｃ）とを組み合わせて使用することで、さらに正確にインターフェロン療法の有効性を判定できると考えられる。

本発明のインターフェロン療法の有効性判定方法における好ましい実施形態の一つは、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質を測定対象とすることである。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。本実施形態において用いることができる担体の例としては、ビーズ、金属、ガラス、樹脂等のような一般的なものの他、基板のような、平面部分を有する担体を用いることができる。基板を用いる場合は、その平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基板としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に親和性を有する物質を固定化した担体が挙げられる。なお「親和性」の例としては、イオン結合、金属キレート体とタンパク質中のヒスチジン残基等とのアフィニティ、若しくは疎水性相互作用等の化学的な作用の他、抗原と抗体、酵素と基質、ホルモンとレセプターのようなバイオアフィニティ、が挙げられる。

イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陽イオン交換体、陰イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体のいずれも用いることができるが、弱陽イオン交換体が好ましく用いられる。弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。

金属キレート体を介してマーカー物質を捕捉する場合は、例えば、Ｃｕ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｎｉ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ａｌ³⁺、Ｆｅ³⁺、Ｇａ³⁺等の金属キレート体を固定化した担体を用いることができるが、Ｃｕ²⁺が特に好ましい。

疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。

本発明のインターフェロン療法の有効性判定方法において、体液中のマーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば特に制限はなく、例えば、質量分析を用いることができる。すなわち、質量分析によって生じる各マーカー物質由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもって各マーカー物質の量（濃度）を測定することができる。質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカー物質由来のイオンピークを特定することができる。さらに、２台の質量分析計を用いたＭＳ／ＭＳによれば、より正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。

特に好ましい実施形態では、担体として基板を用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）−飛行時間質量分析（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（以下、「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行うことにより、マーカー物質の濃度を測定する。本実施形態によれば、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、陽イオン交換基板、特に、弱陽イオン交換基板、並びに、金属イオン基板が好ましく用いられる。

質量分析以外の方法でマーカー物質の濃度を測定する方法としては、タンパク質の定量に一般的に用いられている方法が採用可能であり、各種のイムノアッセイ、液体クロマトグラフィー法、電気泳動法、ウエスタンブロット法等を使用することができる。

本発明のインターフェロン療法の有効性判定方法において使用する体液としては、血液が好ましく用いられる。すなわち、Ｃ型肝炎患者から採取した血液を検体とし、その血液から調製した血清又は血漿（体液成分）を検査材料とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。

本発明のインターフェロン療法の有効性判定方法によって実際にＣ型肝炎患者に対するインターフェロン療法の有効性を判定する手順の一例を、順を追って説明する。この例では、マーカー物質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）全ての濃度を並行して測定する。まず、被験者であるＣ型肝炎患者から血液を採取し、検査材料となる血清を調製する。次に、この血清をｐＨ９．０の条件でＱＡＥ等の強陰イオン交換樹脂に接触させる。このとき、マーカー物質（ａ）と（ｂ）は捕捉されずに素通りし、マーカー物質（ｃ）は捕捉される。ここで、素通り画分を確保する。次に、強陰イオン交換樹脂をｐＨ３．０の溶出液で洗浄し、さらに、有機溶媒で溶出する。このとき、有機溶媒で溶出した画分にマーカー物質（ｃ）が含まれるので、有機溶媒溶出画分を確保する。

まず、確保した素通り画分をＣＭ等の弱陽イオン交換体を固定化した基板に接触させ、次いで、ｐＨ４．０の条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（ａ）が基板上に捕捉される。また、確保した素通り画分を銅イオン結合金属キレート体を固定化した基板に接触させ、次いで、ｐＨ７．０かつ０．５Ｍ ＮａＣｌの条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（ｂ）が基板上に捕捉される。また、有機溶媒溶出画分をＣＭ等の弱陽イオン交換体を固定化した基板に接触させ、次いで、ｐＨ４．０の条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（ｃ）が基板上に捕捉される。最後に、各基板をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供し、検出される各マーカー物質のイオンピークの強度を測定する。そして、各イオンピーク強度を基準値と比較し、インターフェロン療法の有効性を判定する。

なお、上記の例の基準値としては、例えば、インターフェロン療法によりＨＣＶが消失した（効果があった）Ｃ型肝炎患者の血清と、インターフェロン療法によりＨＣＶが消失しなかった（効果がなかった）Ｃ型肝炎患者の血清を用いて、同様のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳをあらかじめ行い、両者を比較して設定したカットオフ値を採用することができる。

本発明のインターフェロン療法の有効性判定方法は、従来技術であるＨＣＶのタイピングやＳＮＰ解析と組み合わせて行ってもよい。

本発明のインターフェロン療法の有効性判定用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むものである。本発明のインターフェロン療法の有効性判定用キットにおける好ましい実施形態では、ＣＭ等の弱陽イオン交換体を固定化した基板、又は銅イオン等の金属キレート基板を含む。本実施形態によれば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるマーカー物質の濃度測定を簡便に行なうことができる。なお、本キット中には他の試薬類、例えば、標準物質、前処理用の各種緩衝液等を含めてもよい。

以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

１．プロテインチップを用いた候補タンパク質の検索
インターフェロンα・リバビリン併用療法を受けたＣ型肝炎患者で、効果があった患者（ＣＲ）８名、及び、効果がなかった患者（ＮＲ）８名について、治療前の血清サンプルを収集した。治療効果の確認は、血中におけるＨＣＶ数を測定することにより行なった。各血清サンプル２０μＬに、変性バッファー（９Ｍ 尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））３０μＬを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各血清サンプルを強陰イオン交換樹脂カラム（Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｐｅｒ Ｄ、バイオセプラ社）にアプライした。次に、ｐＨ９．０の緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％（ｗ／ｖ）１−ｏ−Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。））、ｐＨ７．０の緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ５．０の緩衝液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ４．０の緩衝液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ３．０の緩衝液（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、及び有機溶媒（３３．３％イソプロピルアルコール、１６．７％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸からなる混合液）各２００μＬで順に溶出させ、画分１（ｐＨ９．０で溶出、素通り）、画分２（ｐＨ７．０で溶出）、画分３（ｐＨ５．０で溶出）、画分４（ｐＨ４．０で溶出）、画分５（ｐＨ３．０で溶出）、画分６（有機溶媒）の６つの画分を得た。

得られた各画分１０μＬをｐＨ４．０のプロテインチップ結合バッファー（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム）で１０倍希釈した後、陽イオン交換チップＣＭ１０（サイファージェン社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ７．０のプロテインチップ結合バッファー（１００ｍＭ リン酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ）で１０倍希釈した後、銅修飾チップＩＭＡＣ３０（サイファージェン社）に添加した。各プロテインチップを各結合バッファーで３回洗浄した後に脱イオン水で１回洗浄し、乾燥させた。次に、エネルギー吸収分子であるシナピン酸（ＳＰＡ）を添加し、プロテインチップリーダーＭｏｄｅｌ ＰＢＳ ＩＩｃ（サイファージェン社）を用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった。なお、測定分子量範囲（Ｍ／Ｚ）は、３０００〜２０００００の範囲で行なった。また、測定は２連で行い、Ｍ／Ｚの平均値を算出した。データ解析は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｉｐ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓ Ｄａｔａ Ｍａｇｎａｇｅｒ、及びＢｉｏｍａｒｋｅｒ Ｐａｔｔｅｒｎｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（いずれもサイファージェン社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規化処理を行なった後、シングルマーカー解析及び数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、プロテインチップの種類、画分の種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。これらのピークのうち、ＣＲとＮＲとの間で有意に強度が異なる複数のピークについて、ｐ値、ＲＯＣ面積、及びイオンピーク強度を算出した。その結果から、計３種のピークをピックアップした。

２．マーカー物質（ａ）の特定
陽イオン交換チップＣＭ１０（弱陽イオン交換体）を用い、画分１（ｐＨ９．０、素通り）についてＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が５８８０（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークは、治療が有効であったＣＲでは低値を示し、治療が有効でなかったＮＲにおいて高値を示した。図１（ａ）に、ＣＲとＮＲに分けてピーク強度をプロットしたグラフを示す。また、図１（ｂ）に、図１（ａ）の結果を、最大値、７５％値、中央値、２５％値、及び最小値で示したグラフを示す。さらに、図１（ｃ）に本ピークのＲＯＣ曲線を示す。なお、ＲＯＣ面積が１に近いほど（曲線が左上に寄るほど）その測定系の精度が高いことを示す。その結果、ピークのｐ値は０．０００１、ＲＯＣ面積は０．８９１であった。このように、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳに供すると質量／電荷比が約５８８０のピークを生じるタンパク質が、Ｃ型肝炎患者におけるインターフェロンα・リバビリン併用療法の有効性の指標となることがわかった。すなわち、Ｃ型肝炎患者の血清を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約５８８０のイオンピーク強度が基準値より高い場合、そのＣ型肝炎患者にはインターフェロンα・リバビリン併用療法は有効でないと判断することができる。

３．マーカー物質（ｂ）の特定
銅修飾チップＩＭＡＣ３０を用い、画分１（ｐＨ９．０、素通り）についてＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が５８９０（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークは、治療が有効であったＣＲでは低値を示し、治療が有効でなかったＮＲにおいて高値を示した。図２（ａ）に、ＣＲとＮＲに分けてピーク強度をプロットしたグラフを示す。また、図２（ｂ）に、図２（ａ）の結果を、最大値、７５％値、中央値、２５％値、及び最小値で示したグラフを示す。さらに、図２（ｃ）に本ピークのＲＯＣ曲線を示す。その結果、ピークのｐ値は０．００００５、ＲＯＣ面積は０．９３３であった。このように、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳに供すると質量／電荷比が約５８９０のピークを生じるタンパク質が、Ｃ型肝炎患者におけるインターフェロンα・リバビリン併用療法の有効性の指標となることがわかった。すなわち、Ｃ型肝炎患者の血清を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約５８９０のイオンピーク強度が基準値より高い場合、そのＣ型肝炎患者にはインターフェロンα・リバビリン併用療法は有効でないと判断することができる。

４．マーカー物質（ｃ）の特定
陽イオン交換チップＣＭ１０（弱陽イオン交換体）を用い、画分６（有機溶媒）についてＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が６８６９（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークは、治療が有効であったＣＲでは高値を示し、治療が有効でなかったＮＲにおいて低値を示した。図３（ａ）に、ＣＲとＮＲに分けてピーク強度をプロットしたグラフを示す。また、図３（ｂ）に、図３（ａ）の結果を、最大値、７５％値、中央値、２５％値、及び最小値で示したグラフを示す。さらに、図３（ｃ）に本ピークのＲＯＣ曲線を示す。その結果、ピークのｐ値は０．０００１、ＲＯＣ面積は０．８６７であった。このように、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳに供すると質量／電荷比が約６８７０のピークを生じるタンパク質が、Ｃ型肝炎患者におけるインターフェロンα・リバビリン併用療法の有効性の指標となることがわかった。すなわち、Ｃ型肝炎患者の血清を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約６８７０のイオンピーク強度が基準値より低い場合、そのＣ型肝炎患者にはインターフェロンα・リバビリン併用療法は有効でないと判断できる。

１枚の弱陽イオン交換チップＣＭ１０、１枚の銅修飾チップＩＭＡＣ３０、５００ｍＬの変性バッファー、５００ｍＬの溶出バッファー（ｐＨ７．０）、５００ｍＬの溶出バッファー（ｐＨ４．０）、１ｇのＳＰＡを１セットとして、インターフェロン療法の有効性判定用キットを構築した。本キットは、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって被検者の体液中のマーカー物質の濃度を測定し、インターフェロン療法の有効性を判定するためのものである。

質量／電荷比が５８８０（平均値）のイオンピークについての測定結果を表し、図１（ａ）は、ＣＲとＮＲに分けてピーク強度をプロットしたグラフであり、図１（ｂ）は、図１（ａ）の結果を、最大値、７５％値、中央値、２５％値、及び最小値で示したグラフであり、図１（ｃ）はＲＯＣ曲線を示す。 質量／電荷比が５８９０（平均値）のイオンピークについての測定結果を表し、図２（ａ）は、ＣＲとＮＲに分けてピーク強度をプロットしたグラフであり、図２（ｂ）は、図２（ａ）の結果を、最大値、７５％値、中央値、２５％値、及び最小値で示したグラフであり、図２（ｃ）はＲＯＣ曲線を示す。 質量／電荷比が６８６９（平均値）のイオンピークについての測定結果を表し、図３（ａ）は、ＣＲとＮＲに分けてピーク強度をプロットしたグラフであり、図３（ｂ）は、図３（ａ）の結果を、最大値、７５％値、中央値、２５％値、及び最小値で示したグラフであり、図３（ｃ）はＲＯＣ曲線を示す。

Claims (8)

1. Ｃ型肝炎患者の体液中における下記マーカー物質（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎患者に対してインターフェロン療法が有効であるか否かを判定することを特徴とするインターフェロン療法の有効性判定方法。
   （ａ）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合せず、ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８８０のイオンピークを生じるタンパク質、
   （ｂ）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合せず、ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８９０のイオンピークを生じるタンパク質、
   （ｃ）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、有機溶媒で強陰イオン交換体に結合せず、ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８７０のイオンピークを生じるタンパク質。
2. 前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１に記載のインターフェロン療法の有効性判定方法。
3. 質量分析により体液中における前記マーカー物質の濃度を測定することを特徴とする請求項１又は２に記載のインターフェロン療法の有効性判定方法。
4. Ｃ型肝炎患者から体液を採取し、該体液又は体液成分を前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、前記マーカー物質を捕捉し、前記マーカー物質の濃度を測定することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のインターフェロン療法の有効性判定方法。
5. 前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は金属キレート体であることを特徴とする請求項４に記載のインターフェロン療法の有効性判定方法。
6. 前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項４又は５に記載のインターフェロン療法の有効性判定方法。
7. 請求項１〜６のいずれかに記載のインターフェロン療法の有効性判定方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とするインターフェロン療法の有効性判定用キット。
8. 前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は金属キレート体であることを特徴とする請求項７に記載のインターフェロン療法の有効性判定用キット。

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