JP2016506525A - 質量分析によるｃペプチド検出 - Google Patents

Abstract

試料中のＣペプチドの量を測定する方法が記載される。より詳細には、タンデム質量分析法または高分解能／高精度質量分析法と併用されたオンライン抽出方法を利用して、試料中のＣペプチドを検出および定量化する質量分析方法が記載される。本発明は、質量分析により試料中のＣペプチドの存在または量を検出する方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１２月２６日に出願された米国仮出願第６１／７４５，９７６号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本開示に組み込まれる。

本発明は、Ｃペプチドの定量的測定に関する。特定の態様において、本発明は、質量分析によるＣペプチドの定量的測定のための方法に関する。

本発明の背景技術の以下の記載は、単に本発明の理解を助けるものとして提供され、本発明に対する先行技術を記載または構成することを認めるものではない。

Ｃペプチドは、膵臓内のエンドサイトーシス小胞から放出される前の、プロインスリンのインスリンへの変換（切断を介した）のプロセスの一環として形成されるペプチドである。ヒトＣペプチドは、約３０２０．３ａｍｕの分子質量を有する。

Ｃペプチドは、細胞表面で受容体に結合し、Ｎａ＋、Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅおよび内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の刺激をもたらすシグナル伝達経路を活性化する。これらの酵素は両方とも、２型糖尿病において活性が低下する。Ｃペプチドはまた、動脈の筋肉層の修復においても機能する。

門脈のインスリン濃度は、末梢循環より２から１０倍高い範囲であり得るため、インスリンの代わりにＣペプチドレベルが、新たに診断された糖尿病患者において測定されることは多い。肝臓は、血漿からインスリンの約半分を取り出すが、これは被験者の栄養状態によって異なる。故に、Ｃペプチドは、直接インスリンを測定するよりインスリン状態の包括的な指標となり得る。１型糖尿病患者は、インスリンを効率的に産生することができず、したがってＣペプチドのレベルは低下するが、２型糖尿病患者におけるＣペプチドレベルは、典型的には正常であり、または上昇すらする。故に、Ｃペプチド測定は、１型糖尿病を２型糖尿病と区別するのに使用される。さらに、Ｃペプチドは、天然のインスリン産生中に形成されることから、インスリン療法を受けている患者においてＣペプチドを測定することは、患者が天然のインスリンをどれぐらい産生しているかを決定するのに役立つ可能性がある。

Ｃペプチド測定はまた、患者が多発性内分泌腫瘍症候群と関連したガストリノーマを有し得るかどうかを決定するのに使用することもできる。ガストリノーマを呈するかなりの数の多発性内分泌腫瘍症候群には、膵臓腺腫、副甲状腺腺腫、および下垂体腺腫も含まれる。ガストリノーマの存在と合わさったＣペプチドのより高いレベルは、胃以外の臓器が腫瘍を有している可能性があることを示唆する。Ｃペプチドはまた、インスリン乱用が疑われる患者、および多嚢胞性卵巣症候群を有する女性において評価して、インスリン抵抗性の程度を評価することもできる。

本発明は、質量分析により試料中のＣペプチドの存在または量を検出する方法を提供する。

本明細書に示された幾つかの実施形態は、タンデム質量分析を利用する。これらの実施形態の幾つかにおいて、方法は、（ａ）Ｃペプチドを含有することが疑われる試料を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供してＣペプチドが濃縮された画分を得るステップと、（ｂ）質量分析により検出し得る１種または複数のＣペプチドイオンを発生させるのに適した条件下で、濃縮されたＣペプチドをイオン化源に供するステップと、（ｃ）タンデム質量分析により１種または複数のＣペプチドイオンの量を決定するステップであって、決定されたイオンが、１００７．５±０．５の質量対電荷比を有するプリカーサーイオン、ならびに９２７．６±０．５、７８５．４±０．５、および６４６．１±０．５から成る質量対電荷比を有するイオンの群から選択される１種または複数の断片イオンを含むステップとを含む。これらの実施形態において、ステップ（ｃ）で決定された１種または複数のイオンの量は、試料中のＣペプチドの量に関連づけられ、例えば、試料中のＣペプチドの量を決定するのに使用される。幾つかの実施形態において、ＨＰＬＣは１−Ｄ ＨＰＬＣである。幾つかの実施形態において、９２７．６±０．５、７８５．４±０．５、および６４６．１±０．５から成る群から選択される２種以上の断片イオンの量は、ステップ（ｃ）で決定される。

タンデム質量分析を利用する他の実施形態において、方法は、（ａ）試料を１−Ｄ高速液体クロマトグラフィー（１−Ｄ ＨＰＬＣ）に供してＣペプチドが濃縮された画分を得るステップと、（ｂ）質量分析により検出し得る１種または複数のＣペプチドイオンを発生させるのに適した条件下で、Ｃペプチドが濃縮された画分をイオン化源に供するステップと、（ｃ）タンデム質量分析により１種または複数のＣペプチドイオンの量を決定するステップとを含む。これらの実施形態において、ステップ（ｃ）で決定されたイオンの量は、試料中のＣペプチドの量に関連づけられる。幾つかの実施形態において、ステップ（ｃ）で検出された１種または複数のイオンは、約１００７．５±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有するプリカーサーイオンを含む。幾つかの関連する実施形態において、ステップ（ｃ）で検出された１種または複数のイオンはさらに、約９２７．６±０．５、７８５．４±０．５、および６４６．１±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンから成る群から選択される１つまたは複数の断片イオンを含む。幾つかの関連する実施形態において、ステップ（ｃ）で検出された１種または複数のイオンは、約９２７．６±０．５、７８５．４±０．５、および６４６．１±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンの群から選択される２種以上の断片イオンを含む。

タンデム質量分析を利用する実施形態において、タンデム質量分析は、例えば、多重反応モニタリング、プリカーサーイオンスキャン、またはプロダクトイオンスキャンを含む当技術分野で公知の任意の方法により実施し得る。

幾つかの実施形態において、タンデム質量分析は、１００７．５±０．５０の質量対電荷比を有するプリカーサーイオンを１種または複数の断片イオンに断片化することを含む。特定の関連する実施形態において、１種または複数の断片イオンは、９２７．６±０．５、７８５．４±０．５、６４６．１±０．５、１４７．０±０．５、および２６０．３±０．５の質量対電荷比を有するイオンから成る群から選択される１種または複数のイオンを含む。他の関連する実施形態において、１種または複数の断片イオンは、９２７．６±０．５、７８５．４±０．５、６４６．１±０．５の質量対電荷比を有するイオンから成る群から選択される１種または複数のイオンを含む。２種以上の断片イオンの量が決定される実施形態において、量は、測定されたイオン量を試料中のＣペプチドの量に関連づけるために、当技術分野で公知の任意の数学的操作に供されてもよい。例えば、２種以上の断片イオンの量は、試料中のＣペプチドの量を決定する一環として合計されてもよい。

本明細書に示された幾つかの実施形態は、高分解能／高精度質量分析を利用する。これらの実施形態の幾つかにおいて、方法は、（ａ）Ｃペプチドを含有することが疑われる試料を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供してＣペプチドが濃縮された画分を得るステップと、（ｂ）質量分析により検出し得る１種または複数のＣペプチドイオンを発生させるのに適した条件下で、Ｃペプチドが濃縮された画分をイオン化源に供するステップと、（ｃ）高分解能／高精度質量分析により１種または複数のＣペプチドイオンの量を決定するステップとを含む。これらの実施形態において、ステップ（ｃ）で決定されたイオンの量は、試料中のＣペプチドの量に関連づけられる。

幾つかの実施形態において、高分解能／高精度分光分析は、１０，０００の分解能またはＦＷＨＭ（半値全幅）および５０ｐｐｍの質量精度で行われる。幾つかの実施形態において、高分解能／高精度質量分析計は、高分解能／高精度飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計である。幾つかの実施形態において、ＨＰＬＣは１−Ｄ ＨＰＬＣである。幾つかの実施形態において、ステップ（ｃ）で決定された１種または複数のイオンは、２＋または３＋の電荷を有するイオンを含む。幾つかの実施形態において、ステップ（ｃ）で決定された１種または複数のイオンは、約１００７．５±１および１５１０．３±１の範囲内の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンの群から選択されるイオンを含む。

幾つかの実施形態において、高分解能／高精度質量分析は、約１５，０００以上、約２０，０００以上、約２５，０００以上などの、約１０，０００以上の分解能（ＦＷＨＭ）で行われる。幾つかの実施形態において、高分解能／高精度質量分析は、約２０ｐｐｍ以下、約１０ｐｐｍ以下、約５ｐｐｍ以下、約３ｐｐｍ以下などの、約５０ｐｐｍ以下の精度で行われる。幾つかの実施形態において、高分解能／高精度質量分析は、約１０，０００以上の分解能（ＦＷＨＭ）、および約５０ｐｐｍ以下の精度で行われる。幾つかの実施形態において、分解能は約１５，０００を超え、精度は約２０ｐｐｍ以下である。幾つかの実施形態において、分解能は約２０，０００以上であり、精度は約１０ｐｐｍ以下であり、好ましくは分解能は約２０，０００以上であり、精度は約５ｐｐｍ以下であり、例えば、約３ｐｐｍ以下などである。

幾つかの実施形態において、高分解能／高精度質量分析は、オービトラップ質量分析計、飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計、またはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（時にフーリエ変換質量分析計として知られる）を用いて行われてもよい。

本明細書に記載された方法のいずれにおいても、試料は生体試料を含み得る。幾つかの実施形態において、生体試料は尿、血漿、または血清などの体液を含んでもよい。幾つかの実施形態において、生体試料は、成人男性もしくは女性、または若年男性もしくは女性由来などのヒト由来の試料を含んでもよく、若年は、１８歳未満、１５歳未満、１２歳未満、または１０歳未満である。ヒト試料は、疾患状態もしくは状態を診断もしくはモニターする、または疾患状態もしくは状態の処置の処置有効性をモニターするために分析されてもよい。幾つかの関連する実施形態において、本明細書に記載された方法は、ヒトから採取される場合、生体試料中のＣペプチドの量を決定するのに使用されてもよい。

タンデム質量分析または高分解能／高精度質量分析のどちらかを利用する実施形態において、試料は、イオン化前に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供されてもよい。

タンデム質量分析または高分解能／高精度質量分析のどちらかを利用する実施形態において、試料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムなどの分析カラムに供される前に、固相抽出（ＳＰＥ）カラムなどの抽出カラムに供されてもよい。幾つかの関連する実施形態において、抽出カラムは免疫精製カラム（すなわち、免疫親和性カラム）でない。幾つかの実施形態において、免疫精製は、該方法においていずれの時点でも使用されない。代替の実施形態において、Ｃペプチドは、免疫親和性抽出カラムなどの免疫精製法により試料から抽出される。

固相抽出カラム（ＳＰＥ）などの抽出カラム、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムなどの分析カラム、およびイオン化源の２つ以上を利用する実施形態において、これらの構成要素の２つ以上は、自動で試料を処理および分析し得るようにオンライン方式で接続されてもよい。

本明細書に示された方法のいずれにおいても、試料は、例えば血漿または血清を含む体液試料などの生体試料を含み得る。

質量分析（タンデムまたは高分解能／高精度のいずれでも）は、正イオンモードで行われてもよい。あるいは、質量分析は、負イオンモードで行われてもよい。例えば大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）またはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を含むさまざまなイオン化源が、Ｃペプチドをイオン化するのに使用されてもよい。幾つかの実施形態において、Ｃペプチドは、正イオンモードでＥＳＩによりイオン化される。

本明細書に示された任意の方法において、個別に検出し得る内部標準が試料中に提供されてもよく、この量もまた試料中で決定される。個別に検出し得る内部標準を利用する実施形態において、目的とする分析物および試料中に存在する内部標準の両方の全部または一部がイオン化されて、質量分析計で検出し得る複数のイオンを生成し、それぞれから生成された１種または複数のイオンが質量分析により検出される。これらの実施形態において、目的とする分析物から発生させたイオンの存在または量は、検出された内部標準イオンの量との比較により、試料中の目的とする分析物の量の存在に関連づけられ得る。

あるいは、試料中のＣペプチドの量は、１種または複数の外部参照標準に対する比較により決定し得る。例示的な外部参照標準には、Ｃペプチドまたはその同位体標識バリアントでスパイクされたブランク血漿または血清が含まれる。

幾つかの実施形態において、方法は、少なくとも約０．０４９ｎｇ／５０μＬから２５ｎｇ／５０μＬの範囲内のレベルでＣペプチドの検出に対し線形となる範囲を示す。

本明細書で使用されるとき、特に記載のない限り、単数形「１つ（種）の（ａ）」、「１つ（種）の（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、複数の言及を含む。故に、例えば、「タンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及は、複数のタンパク質分子を含む。

本明細書で使用されるとき、用語「精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、「精製（ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ）」、および「濃縮（ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ）」は、目的とする分析物（複数可）以外の全ての材料を試料から除去することを指すわけではない。そうではなく、これらの用語は、目的とする分析物の検出を妨げ得る試料中の他の成分と比べて、１種または複数の目的とする分析物の量を高める手順を指す。さまざまな手段による試料の精製は、１種または複数の妨害物質、例えば、質量分析による選択された親または娘イオンの検出を妨げ得るまたは妨げ得ない１種または複数の物質を相対的に減少させ得る。この用語が使用されるとき、相対的減少は、精製される材料中に目的とする分析物と共に存在するいずれかの物質が、精製により完全に除去されることを必要としない。

本明細書で使用されるとき、用語「免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」または「免疫精製する（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｙ）」は、１種または複数の目的とする分析物を濃縮するために、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含む抗体を利用する精製手順を指す。免疫精製は、当技術分野で周知である免疫精製方法のいずれかを用いて行ってもよい。多くの場合、免疫精製手順は、固体担体、例えばカラム、ウェル、チューブ、ゲル、カプセル、粒子等に結合、コンジュゲート、またはさもなければ付加された抗体を利用する。免疫精製には、本明細書で使用されるとき、当技術分野でしばしば免疫沈降と呼ばれる手順のほか、当技術分野でしばしば親和性クロマトグラフィーまたは免疫親和性クロマトグラフィーと呼ばれる手順が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用されるとき、用語「免疫粒子（ｉｍｍｕｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）」は、表面（粒子上および／または粒子中のいずれでも）に抗体が結合され、コンジュゲートされ、またはさもなければ付加されているカプセル、ビーズ、ゲル粒子等を指す。特定の好ましい実施形態において、免疫粒子は、セファロースまたはアガロースビーズである。代替の好ましい実施形態において、免疫粒子は、ガラス、プラスチックもしくはシリカビーズ、またはシリカゲルを含む。

本明細書で使用されるとき、用語「抗Ｃペプチド抗体」は、Ｃペプチドに対して親和性を有する任意のポリクローナルまたはモノクローナル抗体を指す。さまざまな実施形態において、Ｃペプチド以外の化学種に対するＣペプチド抗体の特異性は異なる可能性があり、例えば特定の好ましい実施形態において、抗Ｃペプチド抗体は、Ｃペプチドに特異的であり、故にＣペプチド以外の化学種に対する親和性がほとんどない、またはないのに対し、他の好ましい実施形態において、抗Ｃペプチド抗体は非特異的であり、故にＣペプチド以外の特定の化学種を結合する。

本明細書で使用されるとき、用語「試料」は、目的とする分析物を含有し得る任意の試料を指す。本明細書で使用されるとき、用語「体液」は、個体の身体から単離され得る任意の液体を意味する。例えば、「体液」には、血液、血漿、血清、胆汁、唾液、尿、涙、汗等が含まれ得る。特定の好ましい実施形態において、試料は、血漿または血清などのヒト由来の体液試料を含む。

本明細書で使用されるとき、用語「固相抽出」または「ＳＰＥ」は、溶液がその中または周囲を通過する固体（すなわち、固相）に対する、溶液（すなわち、移動相）に溶解または懸濁された成分の親和性の結果として、化学的混合物が成分に分離されるプロセスを指す。幾つかの例において、移動相が固相の中または周囲を通過するとき、移動相の望ましくない成分が固相により保持され得、移動相における分析物の精製をもたらす。他の例において、分析物が固相により保持され得、移動相の望ましくない成分が固相の中または周囲を通過し得るようにする。これらの例において、さらなる処理または分析のため、第２の移動相が、固相の保持された分析物を流出するのに次いで使用される。ＴＦＬＣを含むＳＰＥは、単一または混合モードメカニズムにより作動し得る。混合モードメカニズムは、同じカラム中でのイオン交換および疎水性保持を利用する。例えば、混合モードＳＰＥカラムの固相は、強陰イオン交換および疎水性保持を示し得、または強陽イオン交換および疎水性保持を示し得る。

一般には、分析物に対するＳＰＥカラム充填材料の親和性は、１つまたは複数の化学的相互作用または免疫親和性相互作用などのさまざまな機構のうち任意のものに起因し得る。幾つかの実施形態において、ＣペプチドのＳＰＥは、免疫親和性カラム充填材料を使用することなく行われる。すなわち、幾つかの実施形態においてインスリンは、免疫親和性カラムでないＳＰＥカラムにより試料から精製される。

本明細書で使用されるとき、用語「クロマトグラフィー」は、固定相液体または固定相固体の周囲または上を流れるときの化学物質の特異的分布の結果として、液体またはガスにより担持された化学的混合物が成分に分離されるプロセスを指す。

本明細書で使用されるとき、用語「液体クロマトグラフィー」または「ＬＣ」は、流体が微粉物質のカラムまたはキャピラリー通路を均一にしみ通るときの、流体溶液の１種または複数の成分の選択的遅延のプロセスを意味する。遅延は、バルク流体（すなわち、移動相）が固定相（複数可）に対して移動するとき、１つまたは複数の固定相とこの流体の間の混合物成分の分布によって生じる。「液体クロマトグラフィー」の例には、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）（高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）またはハイスループット液体クロマトグラフィーとして知られることもある）が含まれる。

本明細書で使用されるとき、用語「高速液体クロマトグラフィー」または「ＨＰＬＣ」（「高圧液体クロマトグラフィー」として知られることもある）は、固定相、典型的には高密度充填カラムを通して、加圧下で移動相を押し出すことにより分離度が向上する液体クロマトグラフィーを指す。用語「１−Ｄ高速液体クロマトグラフィー」または「１−Ｄ ＨＰＬＣ」は、伝統的な単一カラムＨＰＬＣを指す。用語「２−Ｄ高速液体クロマトグラフィー」は、分析物および分析物と同時に共溶出する任意の追加の種が、第１のＨＰＬＣカラムから異なる固定相を有する第２のＨＰＬＣカラムに向けられるように２つのＨＰＬＣカラムが使用される高速液体クロマトグラフィー法を指す。第２のＨＰＬＣカラムの固定相は、質量分析機器に分析物を導入する前に分析物および共溶出種が分離されるように選択される。２−Ｄ ＨＰＬＣは典型的には、１−Ｄ ＨＰＬＣと比べて実行時間に関してより費用がかかり、セットアップのさらなる複雑さを必要とするが、特に複合試料において、１−Ｄ ＨＰＬＣと比較して２−Ｄ ＨＰＬＣでより高い分析物純度が得られ得る。

本明細書で使用されるとき、用語「乱流液体クロマトグラフィー」または「ＴＦＬＣ」（高乱流液体クロマトグラフィーまたはハイスループット液体クロマトグラフィーとして知られることもある）は、分離を行うための土台として、アッセイされる材料のカラム充填を通じた乱流を利用するクロマトグラフィーの形態を指す。ＴＦＬＣは、質量分析による分析の前の、２種の不特定の薬物を含有する試料の調製において適用されている。例えば、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ８５４：２３〜３５頁（１９９９）を参照のこと；ＴＦＬＣをさらに説明している米国特許第５，９６８，３６７号、第５，９１９，３６８号、第５，７９５，４６９号、および第５，７７２，８７４号も参照のこと。当業者は、「乱流」を理解する。流体がゆっくりおよび滑らかに流れる場合、該流れは「層流」と呼ばれる。例えば、ＨＰＬＣカラムの中を通って低い流速で移動する流体は層流である。層流では、流体の粒子の動きは秩序正しく、粒子は概ねほぼ直線で移動する。より速い速度では、水の慣性は流体摩擦力に打ち勝ち、乱流が生じる。不規則境界と接していない流体は、摩擦により遅くなった、または不均一な表面により歪められた流体を「追い越す」。流体が乱れて流れているとき、流体は、流れが層流である場合より多くの「抗力」により渦巻いて（ｅｄｄｉｅｓ ａｎｄ ｗｈｉｒｌｓ）（すなわち渦で）流れる。流体流がいつ層流または乱流となるかの決定に役立つ多くの参考文献が利用し得る（例えば、「Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ Ｆｌｏｗ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ」、Ｐ．Ｓ． Ｂｅｒｎａｒｄ ＆ Ｊ．Ｍ． Ｗａｌｌａｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、（２０００）；「Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ Ｆｌｏｗ」、Ｊｅａｎ Ｍａｔｈｉｅｕ ＆ Ｊｕｌｉａｎ Ｓｃｏｔｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１））。

本明細書で使用されるとき、用語「ガスクロマトグラフィー」または「ＧＣ」は、試料混合物が気化され、液体または粒子状固体から成る固定相を含有するカラムの中を通って移動するキャリアガス（窒素またはヘリウムとして）の流れに注入され、固定相に対する化合物の親和性に従って該混合物の成分化合物に分離されるクロマトグラフィーを指す。

本明細書で使用されるとき、用語「大粒子カラム」または「抽出カラム」は、約５０μｍより大きい平均粒子径を含有するクロマトグラフィーカラムを指す。この文脈で使用されるとき、用語「約」は、±１０％を意味する。

本明細書で使用されるとき、用語「分析カラム」は、分析物の存在または量を決定し得るのに十分なカラムから溶出する、試料中の材料の分離を達成するのに十分なクロマトグラフィープレートを有するクロマトグラフィーカラムを指す。このようなカラムは、さらなる分析に供するための精製試料を得るために、保持されていない材料から保持された材料を分離または抽出するという一般的な目的を有する「抽出カラム」とは区別される場合が多い。この文脈で使用されるとき、用語「約」は、±１０％を意味する。好ましい実施形態において分析カラムは、直径約５μｍの粒子を含有する。

本明細書で使用されるとき、用語「オンライン」および「インライン」は、例えば「オンライン自動方式」または「オンライン抽出」で使用されるとき、オペレーターの介入を必要とせずに行われる手順を指す。対照的に、用語「オフライン」は本明細書で使用されるとき、オペレーターの手動介入を必要とする手順を指す。故に、試料が沈殿に供せられ、上清が次いでオートサンプラーに手動で充填される場合、沈殿および充填ステップは、この後のステップからオフラインである。方法のさまざまな実施形態において、１つまたは複数のステップは、オンライン自動方式で行ってもよい。

本明細書で使用されるとき、用語「質量分析」または「ＭＳ」は、化合物をその質量により同定するための分析手法を指す。ＭＳは、イオンをこの質量対電荷比、すなわち「ｍ／ｚ」に基づきフィルタし、検出し、および測定する方法を指す。ＭＳ技術は、一般には、（１）化合物をイオン化して荷電化合物を形成するステップ：および（２）荷電化合物の分子量を検出し、質量対電荷比を計算するステップを含む。化合物は、適切な手段によりイオン化および検出し得る。「質量分析計」は、一般には、イオン化装置、質量分析器およびイオン検出器を含む。一般に、目的とする１つまたは複数の分子がイオン化され、イオンはこの後、質量分析機器に導入され、ここでイオンは、磁場および電場の組み合わせのために、質量（「ｍ」）および電荷（「ｚ」）に依存する空間中の経路を辿る。例えば、「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆｒｏｍ Ｓｕｒｆａｃｅｓ」と題された米国特許第６，２０４，５００号；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題された米国特許第６，１０７，６２３号；「ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題された米国特許第６，２６８，１４４号；「Ｓｕｒｆａｃｅ-Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｆｏｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎａｌｙｔｅｓ」と題された米国特許第６，１２４，１３７号；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １９９９、２：２６４〜７６頁；およびＭｅｒｃｈａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２０００、２１：１１６４〜６７頁を参照のこと。

本明細書で使用されるとき、「高分解能／高精度質量分析」は、固有の化学イオンを確認するのに十分な確度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）および精度（ａｃｃｕｒａｃｙ）で荷電種の質量対電荷比を測定し得る質量分析器を用いて行われる質量分析を指す。固有の化学イオンは、このイオンからの個々の同位体ピークが容易に識別し得る場合のイオンに対して確認し得る。固有の化学イオンを確認するのに必要な特定の分解能および質量精度は、該イオンの質量および電荷状態により異なる。

本明細書で使用されるとき、用語「分解能」または「分解能（ＦＷＨＭ）」（「ｍ／Δｍ_50%」としても当技術分野で公知の）は、最大高さの５０％での質量ピークの幅（全幅半値、「ＦＷＨＭ」）で除した観察された質量対電荷比を指す。分解能の差の影響は、例えば、参照により本明細書に組み込まれている同時係属中の米国特許公開第２０１１／０１１１５１２号の図１Ａ〜Ｃに例示されている。

本明細書で使用されるとき、質量分析に関する「固有の化学イオン」は、単一の原子構成を有する単一のイオンを指す。単一のイオンは、一価または多価であってもよい。

本明細書で使用されるとき、質量分析に関する用語「精度（ａｃｃｕｒａｃｙ）」（または「質量精度（ｍａｓｓ ａｃｃｕｒａｃｙ）」）は、調べられるイオンの真のｍ／ｚからの機器応答の潜在的偏差を指す。精度は、典型的には１００万分の１（ｐｐｍ）で表される。質量精度の差の影響は、例えば、参照により本明細書に組み込まれている同時係属中の米国特許公開第２０１１／０１１１５１２号の図２Ａ〜Ｄに例示されている。

本発明の高分解能／高精度質量分析方法は、１０，０００を超える、１５，０００を超える、２０，０００を超える、２５，０００を超える、５０，０００を超える、１００，０００を超える、またはさらにこれを超えるＦＷＨＭで質量分析を行い得る機器で行われ得る。同様に、本発明の方法は、５０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１５ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満、３ｐｐｍ未満、またはさらにこれより小さい精度で質量分析を行い得る機器で行われ得る。これらの性能特性をし得る機器は、特定のオービトラップ質量分析器、飛行時間（「ＴＯＦ」）質量分析器、またはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析器を組み込んでもよい。好ましい実施形態において、該方法は、オービトラップ質量分析器またはＴＯＦ質量分析器を含む機器を用いて実施される。

用語「オービトラップ」は、外側の樽様電極および同軸内部電極から成るイオントラップを記載する。イオンは電極間の電場に接線方向に噴射され、イオンと電極の間の静電相互作用は、イオンが同軸内部電極の周りを回るときの遠心力と均衡が保たれるため、イオンはトラップされる。イオンが同軸内部電極の周りを回るとき、トラップされたイオンの軌道経路は、イオンの質量対電荷比に対する調和振動数で中心電極の軸に沿って振動する。軌道振動数の検出は、オービトラップを高精度（１〜２ｐｐｍまで低い）および高分解能（ＦＷＨＭ）（最大約２００，０００）を有する質量分析器として使用し得るようにする。オービトラップに基づく質量分析器は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，９９５，３６４号に詳細に記載されている。オービトラップ分析器の使用は、さまざまな分析物の定性および定量分析について報告されている。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１１８９３２号（２００７年１１月９日出願）；Ｂｒｅｄｅｈｏｆｔら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２００８、２２：４７７〜４８５頁；Ｌｅ Ｂｒｅｔｏｎら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２００８、２２：３１３０〜３６頁；Ｔｈｅｖｉｓら、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００８、２７：３５〜５０頁；Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２００８、４３：９０８〜１５頁；Ｓｃｈｅｎｋら、ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２００８、１：４１頁；およびＯｌｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００７、４：７０９〜１２頁を参照のこと。

本明細書で使用されるとき、用語「負イオンモードで作動」は、負イオンが発生され検出されるような質量分析方法を指す。用語「正イオンモードで作動」は本明細書で使用されるとき、正イオンが発生され検出されるような質量分析方法を指す。好ましい実施形態において、質量分析は正イオンモードで行われる。

本明細書で使用されるとき、用語「イオン化（ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）」または「イオン化（ｉｏｎｉｚｉｎｇ）」は、１つまたは複数の電子単位と等しい正味電荷を有する分析物イオンを発生させるプロセスを指す。負イオンは、１つまたは複数の電子単位の正味負電荷を有するものであり、一方正イオンは、１つまたは複数の電子単位の正味正電荷を有するものである。

本明細書で使用されるとき、用語「電子イオン化」または「ＥＩ」は、気相または蒸気相中の目的とする分析物が電子の流れと相互作用する方法を指す。電子と分析物との衝突は分析物イオンを生成し、これが次いで質量分析法に供され得る。

本明細書で使用されるとき、用語「化学イオン化」または「ＣＩ」は、試薬ガス（例えばアンモニア）が電子衝突に供され、分析物イオンが試薬ガスイオンおよび分析物分子の相互作用により形成される方法を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「高速原子衝撃」または「ＦＡＢ」は、高エネルギー原子のビーム（多くの場合ＸｅまたはＡｒ）が非揮発性試料に衝突し、試料に含有された分子を脱離させイオン化する方法を指す。試験試料は、グリセロール、チオグリセロール、ｍ−ニトロベンジルアルコール、１８−クラウン−６クラウンエーテル、２−ニトロフェニルオクチルエーテル、スルホラン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミンなどの粘性の液体マトリックスに溶解される。化合物または試料に対する適切なマトリックスの選択は、経験的プロセスである。

本明細書で使用されるとき、用語「マトリックス支援レーザー脱離イオン化」または「ＭＡＬＤＩ」は、非揮発性試料がレーザー照射に曝され、これが試料中の分析物を、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、およびクラスター崩壊を含むさまざまなイオン化経路により脱離させイオン化する方法を指す。ＭＡＬＤＩに関して、試料は、分析物分子の脱離を促進するエネルギー吸収マトリックスと混合される。

本明細書で使用されるとき、用語「表面増強レーザー脱離イオン化」または「ＳＥＬＤＩ」は、非揮発性試料がレーザー照射に曝され、これが試料中の分析物を、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、およびクラスター崩壊を含むさまざまなイオン化経路により脱離させイオン化する別の方法を指す。ＳＥＬＤＩに関して、試料は典型的には、１種または複数の目的とする分析物を優先的に保持する表面に結合される。ＭＡＬＤＩと同様に、このプロセスも、イオン化を促進するためのエネルギー吸収材料を使用してもよい。

本明細書で使用されるとき、用語「エレクトロスプレーイオン化」または「ＥＳＩ」は、溶液が長さの短いキャピラリー管に沿って流され、該管の末端に高い正電位または負電位が印加される方法を指す。該管の末端に達する溶液は、溶媒蒸気中の極めて小さい溶液滴のジェットまたはスプレーへと気化（噴霧）される。液滴のこのミストは、蒸発室を通って流れる。液滴が小さくなるにつれて、電気の表面電荷密度は、同じ電荷間の天然の反発力がイオンおよび中性分子を放出させるような時点まで増加する。

本明細書で使用されるとき、用語「大気圧化学イオン化」または「ＡＰＣＩ」は、ＥＳＩと類似する質量分析方法を指す。しかし、ＡＰＣＩは、大気圧でプラズマ内に生じるイオン−分子反応によりイオンを生成する。プラズマは、スプレーキャピラリーと対電極の間の放電により維持される。次いでイオンは、典型的には一連の差動排気スキマーステージ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｍｐｅｄ ｓｋｉｍｍｅｒ ｓｔａｇｅｓ）を用いて質量分析器に抽出される。乾燥および予熱Ｎ₂ガスの対向流が、溶媒の除去を改善するために用いられてもよい。ＡＰＣＩにおける気相イオン化は、より極性の低い種を分析するのにＥＳＩより有効であり得る。

用語「大気圧光イオン化」または「ＡＰＰＩ」は本明細書で使用されるとき、分子Ｍのイオン化の機構が、分子イオンＭ＋を形成するための光子吸収および電子放出である質量分析の形態を指す。光子エネルギーは、典型的にはイオン化電位をわずかに上回るのみであるため、分子イオンは解離を受けにくい。多くの場合、クロマトグラフィーを必要とせずに試料を分析できてもよく、この場合、時間および費用が大幅に節約される。水蒸気またはプロトン性溶媒の存在下、分子イオンはＨを抽出してＭＨ＋を形成し得る。これは、Ｍが高いプロトン親和性を有する場合に生じる傾向がある。これは、Ｍ＋およびＭＨ＋の和は一定であるため、定量精度に影響を与えない。プロトン性溶媒中の薬物化合物は、通常、ＭＨ＋として観察されるのに対し、ナフタレンまたはテストステロンなどの非極性化合物は、通常、Ｍ＋を形成する。例えば、Ｒｏｂｂら、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ２０００、７２（１５）：３６５３〜３６５９頁を参照のこと。

本明細書で使用されるとき、用語「誘導結合プラズマ」または「ＩＣＰ」は、ほとんどの元素が霧化およびイオン化されるように十分に高温で、試料が部分的イオン化ガスと相互作用する方法を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「電界脱離」は、非揮発性試験試料がイオン化表面に置かれ、強電界を用いて分析物イオンを発生させる方法を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「脱離」は、表面からの分析物の除去および／または気相への分析物の移入を指す。レーザー脱離熱脱離（ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｔｈｅｒｍａｌ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）は、分析物を含有する試料がレーザーパルスにより気相へと熱的に脱離される手法である。レーザーは、金属床を備える特別に作製された９６ウェルプレートの背部に衝突する。レーザーパルスは金属床を加熱し、熱は試料を気相に移動させる。気相試料は、次いで質量分析計に引き込まれる。

本明細書で使用されるとき、用語「選択的イオンモニタリング」は、比較的狭い質量範囲内（典型的には約１質量単位）のイオンのみが検出される質量分析機器のための検出モードである。

本明細書で使用されるとき、「選択された反応モニタリング」として知られることもある「多重反応モード」は、プリカーサーイオンおよび１種または複数の断片イオンが選択的に検出される質量分析機器のための検出モードである。

本明細書で使用されるとき、用語「定量化の下限（ｌｏｗｅｒ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、「定量下限（ｌｏｗｅｒ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）」または「ＬＬＯＱ」は、測定が定量的に意味を持つようになるポイントを指す。このＬＯＱでの分析物反応は、２０％未満の相対標準偏差（ＲＳＤ％）および８５％〜１１５％の精度で同定し得、分散しておりおよび再現し得る。

本明細書で使用されるとき、用語「検出の限界」または「ＬＯＤ」は、測定値がこれに伴う不確実性より大きいポイントである。ＬＯＤは、値がその測定に伴う不確実性を超えているポイントであり、ゼロ濃度での平均のＲＳＤの３倍として定義される。

本明細書で使用されるとき、体液試料中の分析物の「量」は、一般には、試料の体積中で検出し得る分析物の質量を反映する絶対値を指す。しかし、量は、別の分析物量と比較した相対量も企図する。例えば、試料中の分析物の量は、試料中に通常存在する分析物の対照レベルまたは正常レベルより大きい量であってもよい。

用語「約」は、イオンの質量の測定を含まない定量的測定に関連して本明細書で使用されるとき、示された値プラスまたはマイナス１０％を指す。質量分析機器は、所与の分析物の質量の決定においてわずかに異なり得る。イオンの質量またはイオンの質量／電荷比との関連において用語「約」は、＋／-０．５原子質量単位を指す。

上記の本発明の概要は、非限定的であり、本発明の他の特徴および利点は、本発明の以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかとなろう。

可能性のあるＣペプチドプリカーサーイオンを示すフルスキャン質量スペクトルを示す図である。詳細は実施例３で論じられている。 約５０から１２００のｍ／ｚ範囲にわたる、約１００７．５±０．５０のｍ／ｚを有するＣペプチドプリカーサーイオンの断片化に関する例示的な断片化スペクトル（プロダクトイオンスキャン）を示す図である。詳細は実施例３で論じられている。 ＭＳ／ＭＳで測定されたスパイク模擬血清標準におけるＣペプチドの定量の直線性のプロットを示す図である。詳細は実施例４に記載されている。 ＭＳ／ＭＳで測定されたスパイクストリップ血清試料におけるＣペプチドの定量の直線性のプロットを示す図である。詳細は実施例４に記載されている。 図５（Ａ）〜（Ｃ）は、約５００から２０００、１００５〜１０４０、および１５１９〜１５２６のｍ／ｚ範囲にわたる、高分解能／高精度質量分析計をスキャンして収集されたＣペプチドおよびこのナトリウム付加物のイオン化の質量スペクトルを示す図である。詳細は実施例５で論じられている。 約１００５から１０１２のｍ／ｚ範囲にわたる、高分解能／高精度質量分析計をスキャンして収集された約１００７．５±０．５０を有するＣペプチドイオンの質量スペクトルを示す図である。詳細は実施例５で論じられている。 高分解能／高精度ＭＳで測定されたスパイク模擬血清標準におけるＣペプチドの定量の直線性のプロットを示す図である。詳細は実施例６に記載されている。 高分解能／高精度ＭＳで測定されたスパイクストリップ血清試料におけるＣペプチドの定量の直線性のプロットを示す図である。詳細は実施例６に記載されている。

試料中のＣペプチドの量を測定する方法が記載される。より詳細には、試料中のＣペプチドを検出および定量化する質量分析方法が記載される。方法は、質量分析（ＭＳ）の方法と組み合わされた、選択された分析物の精製を行うための固相抽出（ＳＰＥ）および／または液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を利用し得、これにより試料中のＣペプチドを検出および定量化するためのアッセイシステムを提供し得る。好ましい実施形態は、大規模臨床検査室での自動化されたＣペプチド定量化アッセイのための適用に特によく適している。

本発明の方法での使用に適した試験試料には、目的とする分析物を含有し得る任意の試験試料が含まれる。幾つかの好ましい実施形態において、試料は生体試料、すなわち、動物、細胞培養物、生物培養物等などの生物源から得られた試料である。特定の好ましい実施形態において、試料は、イヌ、ネコ、ウマ等などの哺乳動物から得られる。特に好ましい哺乳動物は、霊長類、最も好ましくは男性または女性ヒトである。好ましい試料は、血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、または組織試料などの体液、好ましくは血漿および血清を含む。このような試料は、例えば、患者、すなわち、疾患または状態の診断、予後、または処置のために臨床の場に現れる、生きた人間（男性または女性）から得られ得る。試料が生体試料を含む実施形態において、試料が生物源から得られた場合、該方法は、試料中のＣペプチドの量（すなわち、内因性試料中のＣペプチドの量）を決定するのに使用されてもよい。

本発明はまた、Ｃペプチド定量アッセイのためのキットも企図する。Ｃペプチド定量アッセイのためのキットは、外部参照標準などの本明細書に提供された組成物を含むキットを含んでもよい。外部参照標準には、幾つかの態様において、Ｃペプチドまたはこの同位体標識バリアントでスパイクされたブランク血漿または血清が含まれる。例えば、キットは、少なくとも１つのアッセイに対して十分な量で包装材料および測定された量の同位体標識内部標準を含み得る。典型的には、キットは、Ｃペプチド定量アッセイで使用する包装試薬を使用するための、有形形態で記録された（例えば、紙または電子媒体上に含まれた）指示書も含むであろう。

本発明の実施形態において使用するための校正およびＱＣプールは、Ｃペプチドが本質的に非存在であることを条件として、意図された試料マトリックスと類似したマトリックスを用いて好ましくは調製される。

質量分光分析のための試料調製
質量分光分析のための調製において、Ｃペプチドは、例えば、液体クロマトグラフィー、濾過、遠心分離、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、キャピラリー電気泳動を含む電気泳動、免疫親和性分離を含む親和性分離、酢酸エチルまたはメタノール抽出を含む抽出方法、およびカオトロピック剤の使用または上記の任意の組み合わせ等を含む当技術分野で公知のさまざまな方法により、試料中の１種または複数の他の成分と比べて濃縮されてもよい。

質量分析の前に使用され得る試料精製の１つの方法は、目的とする分析物はカラム充填材料により可逆的に保持されるが、１種または複数の他の材料は保持されない条件下で、固相抽出（ＳＰＥ）カラムに試料を適用することである。この手法において、目的とする分析物がカラムにより保持される第１の移動相条件が使用され得、および、保持されない材料が洗い流された後に、保持された材料をカラムから除去するための第２の移動相条件がこの後に使用され得る。

幾つかの実施形態において、試料中のＣペプチドは、アルキル結合表面を含む充填材料を有するＳＰＥカラムに可逆的に保持されてもよい。例えば、幾つかの実施形態において、Ｃ−８オンラインＳＰＥカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．製Ｓｔｒａｔａ Ｃ−８オンラインＳＰＥカラム（２０ｍｍ×２．０ｍｍ）またはその同等物など）が、質量分析の前にＣペプチドを濃縮するのに使用されてもよい。幾つかの実施形態において、ＳＰＥカラムの使用は、洗浄溶液としてのＨＰＬＣグレード０．１％水性ギ酸、および溶出溶液としてのアセトニトリル中０．１％ギ酸の使用により行われる。

幾つかの実施形態において、Ｃペプチドは、いずれの免疫親和性法によっても精製されない。これらの実施形態の幾つかは、ＳＰＥカラムを利用する。これらの実施形態において、ＳＰＥカラムは免疫親和性カラムでない。

他の実施形態において、方法は、質量分析の前にＣペプチドを免疫精製するステップを含む。免疫精製ステップは、当技術分野で周知の任意の免疫精製方法を用いて行われうる。多くの場合、免疫精製手順は、固体担体、例えばカラム、ウェル、チューブ、カプセル、粒子等に結合され、コンジュゲートされ、固定化されまたはさもなければ付加された抗体を利用する。一般には、免疫精製方法は、（１）目的とする分析物を含有する試料を、分析物が抗体に結合するように抗体と共にインキュベートするステップ、（２）１つまたは複数の洗浄ステップを行うステップ、および（３）抗体から分析物を溶出するステップを含む。

特定の実施形態において免疫精製のインキュベーションステップは、溶液中で抗体なしで行われ、抗体はこの後、洗浄ステップの前に固体表面に結合または付加される。特定の実施形態においてこれは、抗Ｃペプチド抗体である１次抗体、および１次抗Ｃペプチド抗体に対する親和性を有する、固体表面に付加された２次抗体を用いて達成してもよい。代替の実施形態において１次抗体は、インキュベーションステップの前に固体表面に結合される。

適切な固体担体は、チューブ、スライド、カラム、ビーズ、カプセル、粒子、ゲル等を含むがこれらに限定されない。幾つかの好ましい実施形態において、固体担体は、例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート等などのマルチウェルプレートである。幾つかの実施形態において固体担体は、セファロースまたはアガロースビーズもしくはゲルである。抗体（例えば、抗Ｃペプチド抗体または２次抗体）が固体担体に結合され、付加され、固定化され、連結され得る、当技術分野で周知の多くの方法、例えば、共有または非共有結合吸着、親和性結合、イオン結合等がある。幾つかの実施形態において抗体は、ＣＮＢｒを用いて連結され、例えば抗体は、ＣＮＢｒ活性化セファロースに連結されてもよい。他の実施形態において、抗体は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ／Ｇ、またはタンパク質Ｌなどの抗体結合タンパク質を通じて固体担体に付加される。

免疫精製方法の洗浄ステップは、一般には、Ｃペプチドが、固体担体上の抗Ｃペプチド抗体に結合されたままであるように、固体担体を洗浄するステップを含む。免疫精製の溶出ステップは、一般には抗Ｃペプチド抗体へのＣペプチドの結合を破壊する溶液の添加を含む。例示的な溶出溶液には、有機溶液、食塩水、および高または低ｐＨ溶液が含まれる。

質量分析の前に使用されてもよい試料精製の別の方法は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）である。液体クロマトグラフィー法において、分析物は、１種または複数の他の材料と比較して、目的とする分析物が差動速度で溶出する移動相条件下で、クロマトグラフィー分析カラムに試料を適用して精製されてもよい。このような手順は、試料の１種または複数の他の成分と比べて、１種または複数の目的とする分析物の量を増大させ得る。

ＨＰＬＣを含む液体クロマトグラフィーの特定の方法は、比較的流速の低い層流技術に依存している。伝統的なＨＰＬＣ分析は、カラムの中を通る試料の層流が、試料から目的とする分析物を分離するための土台となるカラム充填に依存する。当業者は、このようなカラムでの分離は分配プロセスであり、Ｃペプチドに使用するのに適したＨＰＬＣを含むＬＣ機器およびカラムを選択し得ることを理解するであろう。クロマトグラフィー分析カラムは、典型的には、化学部分の分離（すなわち、分画）を促進するための媒体（すなわち、充填材料）を含む。媒体は、微細粒子を含み得る。粒子は、典型的には、化学部分の分離を促進するためにさまざまな化学部分と相互作用する結合表面を含む。１つの適切な結合表面は、アルキル結合表面またはシアノ結合表面などの疎水性結合表面である。アルキル結合表面は、Ｃ−４、Ｃ−８、Ｃ−１２、またはＣ−１８結合アルキル基を含み得る。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー分析カラムは一体型Ｃ−１８カラムである。クロマトグラフィー分析カラムは、試料を受け取るための入口、および分画試料を含む流出物を排出するための出口を含む。試料は、入口に直接供給されてもよく、またはオンラインＳＰＥカラムもしくはＴＦＬＣカラムなどのＳＰＥカラムから供給されてもよい。幾つかの実施形態において、試料がＳＰＥおよび／またはＴＦＬＣおよび／またはＨＰＬＣカラムに到達する前に試料中の微粒子およびリン脂質を除去するために、オンラインフィルターがＳＰＥカラムおよびまたはＨＰＬＣカラムの前に使用されてもよい。

１つの実施形態において、試料は、入口でＬＣカラムに適用され、溶媒または溶媒混合物と共に溶出され、および出口で排出されてもよい。種々の溶媒モードが、目的とする分析物（複数可）を溶出するために選択され得る。例えば、液体クロマトグラフィーは、勾配モード、アイソクラチックモード、または多型（すなわち混合）モードを用いて行ってもよい。クロマトグラフィー中、材料の分離は、溶離液（「移動相」としても知られる）、溶出モード、勾配条件、温度等の選択などの変数により影響される。

幾つかの実施形態において、試料中のＣペプチドはＨＰＬＣにより濃縮される。このＨＰＬＣは、一体型Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーシステム、例えば、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ．製Ｏｎｙｘ一体型Ｃ−１８カラム（５０×２．０ｍｍ）、または同等物により行われる１−Ｄ ＨＰＬＣであってもよい。特定の実施形態において、ＨＰＬＣは、洗浄溶液としてのＨＰＬＣグレード０．１％水性ギ酸、および溶出溶液としてのアセトニトリル中０．１％ギ酸を用いて行われる。

バルブおよびコネクター配管の慎重な選択により、２つ以上のクロマトグラフィーカラムは、いずれの手動ステップも必要とすることなく材料が次から次へと通過するように、必要に応じて接続されてもよい。好ましい実施形態において、バルブおよび配管の選択は、必要なステップを実行するように予めプログラムされたコンピュータにより制御される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムはまた、このようなオンライン方式で検出システム、例えば、ＭＳシステムにも接続される。故に、オペレーターは、試料のトレーをオートサンプラーに入れ得、残りのオペレーションはコンピュータ制御下で行われ、選択された全ての試料の精製および分析をもたらす。

幾つかの実施形態において、１種または複数の上記精製法は、複数の試料を同時処理し得るためにＣペプチドの精製に関して並行して使用されてもよい。幾つかの実施形態において、使用される精製法は、免疫親和性クロマトグラフィーなどの免疫精製法を含まない。

幾つかの実施形態において、ＴＦＬＣは、質量分析の前にＣペプチドを精製するのに使用されてもよい。このような実施形態において、試料は、分析物を捕捉するＴＦＬＣカラムを用いて抽出されてもよい。分析物は、次いで溶出され、分析ＨＰＬＣカラムにオンラインで移される。例えば、試料抽出は、ＴＦＬＣ抽出カートリッジを用いて大きい粒子サイズ（５０μｍ）充填を用いて達成されてもよい。このカラムから溶出される試料は、次いで、質量分析の前のさらなる精製のために、ＨＰＬＣ分析カラムにオンラインで移されてもよい。これらのクロマトグラフィー手順に関わるステップは自動方式で連結されてもよいため、分析物の精製中におけるオペレーター関与の要求は最小化され得る。この特徴は、時間および費用の節約をもたらし得、オペレーターの誤る機会を排除し得る。

質量分析によるＣペプチドの検出および定量
質量分析は、分画試料をイオン化し、およびさらなる分析のために荷電分子を作製するためのイオン源を含む質量分析計を用いて行われる。さまざまな実施形態において、Ｃペプチドは、当業者に公知の任意の方法によりイオン化され得る。例えばＣペプチドのイオン化は、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、光子イオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、レーザーダイオード熱脱離（ＬＤＴＤ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、液体二次イオン化（ＬＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電場イオン化、電界脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）および粒子ビームイオン化により行ってもよい。当業者は、イオン化方法の選択は、測定される分析物、試料のタイプ、検出器のタイプ、正対負モードの選択等に基づき決定し得ることを理解するであろう。Ｃペプチドは、正または負モードでイオン化されてもよい。好ましい実施形態において、Ｃペプチドは、正イオンモードでＥＳＩによりイオン化される。

質量分析法において一般には、試料がイオン化された後、これにより作製された正または負に荷電されたイオンが分析されて、質量対電荷比（ｍ／ｚ）を決定し得る。ｍ／ｚを決定するためのさまざまな分析器には、四重極分析器、イオントラップ分析器、飛行時間分析器、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析器、およびオービトラップ分析器が含まれる。幾つかの例示的なイオントラップ方法は、Ｂａｒｔｏｌｕｃｃｉら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ２０００、１４：９６７〜７３頁に記載されている。

イオンは、幾つかの検出モードを用いて検出し得る。例えば、選択されたイオンが検出されてもよく（すなわち選択的イオンモニタリングモード（ＳＩＭ）を用いて）、またはあるいは、衝突誘起解離の結果生じる質量移行もしくは中性損失がモニターされてもよい（例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）または選択反応モニタリング（ＳＲＭ））。幾つかの実施形態では、質量対電荷比が四重極分析器を用いて決定される。「四重極」または「四重極イオントラップ」機器において、振動無線周波数電磁界中のイオンは、電極間で印加されるＤＣ電位、ＲＦ信号の振幅、および質量／電荷比に比例した力を受ける。電圧および振幅は、特定の質量／電荷比を有するイオンのみが四重極の長さを移動し、全ての他のイオンは偏向されるように選択されてもよい。故に、四重極機器は、機器に注入されたイオンに対する「質量フィルター」および「質量検出器」の両方の機能を果たし得る。

イオンが検出器と衝突するとき、イオンは、デジタル信号に変換される電子のパルスを生成する。得られたデータはコンピュータに送られ、コンピュータは時間に対する回収されたイオンの数をプロットする。得られた質量クロマトグラムは、伝統的なＨＰＬＣ−ＭＳ方法で生成されるクロマトグラムと類似する。特定のイオンに対応するピーク下の面積、すなわちこのようなピークの振幅が測定され得、目的とする分析物の量と関連づけられ得る。特定の実施形態において、断片イオン（複数可）および／またはプリカーサーイオンの曲線下の面積、あるいはピークの振幅が、Ｃペプチドの量を決定するために測定される。任意のイオンの相対存在量は、内部または外部分子標準の１つまたは複数のイオンのピークに基づく校正標準曲線を用いて、原分析物の絶対量に変換し得る。

特定の質量分析分析器を使用するＭＳ法の分解能を、「タンデム質量分析」または「ＭＳ／ＭＳ」により高めてもよい。この手法では、目的とする分子から発生されたプリカーサーイオン（親イオンとも呼ばれる）がＭＳ機器で濾過され得、プリカーサーイオンはこの後、断片化されて１種または複数の断片イオン（娘イオンまたは生成物イオンとも呼ばれる）をもたらし、該イオンが次いで第２のＭＳ手順において分析される。プリカーサーイオンの慎重な選択により、特定の分析物により生成されたイオンのみが断片化チャンバに移され、ここで不活性ガスの原子との衝突が断片イオンを生成する。プリカーサーイオンおよび断片イオンは両方とも、イオン化／断片化条件の所定のセット下で再現し得る方法で生成されるため、ＭＳ／ＭＳ法は、極めて強力な分析ツールを提供し得る。例えば、濾過／断片化の組み合わせは、妨害物質を排除するのに使用されてもよく、生体試料などの複合試料において特に有用であり得る。特定の実施形態において、多重四重極分析器（トリプル四重極機器などの）を備える質量分析機器が、タンデム質量分析を行うのに使用される。

ＭＳ／ＭＳ法を用いる特定の実施形態において、プリカーサーイオンがさらなる断片化のために単離され、衝突活性化解離（ＣＡＤ）が、さらなる検出のための断片イオンをプリカーサーイオンから発生させるのに使用される。ＣＡＤでは、プリカーサーイオンは、不活性ガスとの衝突を通じてエネルギーを得、この後、「単分子分解」と呼ばれるプロセスにより分解する。イオン内の特定の結合が、増加した振動エネルギーにより破られ得るように、十分なエネルギーがプリカーサーイオン中に堆積されなければならない。

幾つかの実施形態において、試料中のＣペプチドは、次のようにＭＳ／ＭＳを用いて検出および／または定量化される。試料を最初にＳＰＥに供し、次いで液体クロマトグラフィー（１−Ｄ ＨＰＬＣなどの好ましくはＨＰＬＣ）に供して、Ｃペプチドが試料中で濃縮され；クロマトグラフィー分析カラムからの液体溶媒の流れがＭＳ／ＭＳ分析器の加熱ネブライザー界面に入り；および溶媒／分析物混合物が、界面の加熱荷電管中で蒸気に変換される。これらのプロセス中に、分析物（すなわち、Ｃペプチド）がイオン化される。イオン、例えばプリカーサーイオンは、機器の開口部を通過し、最初の四重極に入る。四重極１および３（Ｑ１およびＱ３）は、質量対電荷比（ｍ／ｚ）に基づきイオンを選択（すなわち、それぞれＱ１およびＱ３における「プリカーサー」および「断片」イオンの選択）し得る質量フィルターである。四重極２（Ｑ２）は、イオンが断片化される衝突セルである。質量分析計の最初の四重極（Ｑ１）は、Ｃペプチドプリカーサーイオンのｍ／ｚにより分子を選択する。正しいｍ／ｚを有するプリカーサーイオンは衝突室（Ｑ２）に入り得るが、任意の他のｍ／ｚを有する望ましくないイオンは、該四重極の側面と衝突し、排除される。Ｑ２に入るプリカーサーイオンは、中性ガス分子（アルゴン分子などの）と衝突し断片化する。発生された断片イオンは四重極３（Ｑ３）に入り、Ｃペプチドの断片イオンが選択されるが、他のイオンは排除される。

方法は、正または負イオンモードのどちらかで行われるＭＳ／ＭＳを含み得る。幾つかの実施形態においてＭＳ／ＭＳは、正イオンモードで行われる。特定の実施形態において、Ｑ１は、約１００７．５±０．５のｍ／ｚを有するプリカーサーイオンを選択する。関連する実施形態において、Ｑ３は、約９２７．６±０．５、および／または７８５．４±０．５、および／または６４６．１±０．５のｍ／ｚを有する断片イオンを選択し得る。特定の実施形態において、単一断片イオンの相対存在量が測定され得る。あるいは、２種以上の断片イオンの相対存在量が測定され得る。これらの実施形態において、各断片イオンの相対存在量は、試料中の当初のＣペプチドを定量的に評価するために合計され得る。

特定の実施形態において使用され得るタンデム質量分析機器の代替的オペレーションモードには、プロダクトイオンスキャンおよびプリカーサーイオンスキャンが含まれる。オペレーションのこれらのモードの記載については、例えば、Ｅ． Ｍｉｃｈａｅｌ Ｔｈｕｒｍａｎら、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ-Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｔｒａｃｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ、第８章（Ａｍａｄｅｏ Ｒ． Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ-Ａｌｂａ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ２００５）（３８７頁）を参照のこと。

他の実施形態において、高分解能／高精度質量分析器は、本発明の方法によるＣペプチドの定量分析に使用されてもよい。許容し得るレベルの定量的結果を得るために、質量分析計は、目的とするイオンに対して約５０ｐｐｍ以下の精度で、１０，０００以上の分解能（ＦＷＨＭ）を示し得なければならない。好ましくは質量分析計は、１８，０００以上の分解能（ＦＷＨＭ）および約５ｐｐｍ以下の精度（２０，０００以上の分解能（ＦＷＨＭ）および約３ｐｐｍ以下の精度などの；２５，０００以上の分解能（ＦＷＨＭ）および約３ｐｐｍ以下の精度などの）を示す。Ｃペプチドイオンについて必要なレベルの性能を示し得る３つの例示的な分析器は、オービトラップ質量分析器、特定のＴＯＦ質量分析器、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析器である。

生物学的活性分子において見出される炭素、酸素、および窒素などの元素は、天然には幾つかの異なる同位体形態で存在する。例えば、ほとんどの炭素は¹²Ｃとして存在しているが、全ての自然発生炭素の約１％は¹³Ｃとして存在する。故に、少なくとも１つの炭素原子を含有する自然発生分子の何らかの画分は、少なくとも１つの¹³Ｃ原子を含有することになる。自然発生の元素同位体を分子に含むことは、複数の分子同位体形態を生じさせる。分子同位体形態の質量の差は、少なくとも１原子質量単位（ａｍｕ）である。これは、元素同位体は少なくとも１つの中性子が異なるためである（１つの中性子の質量≒１ａｍｕ）。分子同位体形態が多価状態にイオン化される場合、同位体形態間の質量の差異は、質量分析検出が質量対電荷比（ｍ／ｚ）に基づいているため識別するのが難しくなり得る。例えば、質量が１ａｍｕ異なる、両方とも５＋状態にイオン化された２つの同位体形態は、０．２しかｍ／ｚの差を示さないことになる。高分解能／高精度質量分析計は、高い多価イオン（±２、±３、±４、±５、またはこれ以上の電荷を有するイオンなどの）の同位体形態間を識別し得る。

自然発生の元素同位体のため、複数の同位体形態は典型的には、分子イオンごとに存在する（十分に感度が高い質量分析機器で分析される場合、それぞれが個別に検出し得る分光ピークを生じさせ得る）。複数の同位体形態のｍ／ｚ比および相対存在量は、分子イオンの同位体シグニチャを集合的に含む。幾つかの実施形態において、２つ以上の分子同位体形態のｍ／ｚ比および相対存在量が、調査中の分子イオンの同一性を確認するのに利用されてもよい。幾つかの実施形態において、１つまたは複数の同位体形態由来の質量分析ピークが、分子イオンを定量するのに使用される。幾つかの関連する実施形態において、１つの同位体形態由来の単一の質量分析ピークが、分子イオンを定量するのに使用される。他の関連する実施形態において、複数の同位体ピークが、分子イオンを定量するのに使用される。これらの後者の実施形態において、該複数の同位体ピークは、任意の適切な数学的処理に供されてもよい。幾つかの数学的処理は当技術分野で公知であり、複数のピーク下の面積を合計すること、または複数のピークからの応答を平均することを含むが、これらに限定されない。約１００７．５のｍ／ｚ範囲内でＣペプチドイオンのこのような複数の同位体形態を示す例示的スペクトルは、図６に見られる。例示的スペクトルに見られるように、さまざまな同位体形態由来のピークが、１００７．１７５０、１００７．５０９２、１００７．８３６２、１００８．１７４５、１００８．５０８１、１００８．８３５５に見られる。ただし、任意のイオンの同位体バリアントについて観察された正確な質量は、機器の変動のためわずかに異なり得ることに留意されたい。

幾つかの実施形態において、試料中のＣペプチドの量を定性的に評価するために、１種または複数のイオンの相対存在量が高分解能／高精度質量分析計を用いて測定される。幾つかの実施形態において、高分解能／高精度質量分析により測定される１種または複数のイオンは、多価Ｃペプチドイオンである。これらの多価イオンには、約１５１０．３（２＋イオン）および約１００７．３（３＋イオン）のｍ／ｚを有する１つまたは複数のイオンが含まれ得る。

高分解能オービトラップ分析器の使用は、さまざまな分析物の定性および定量分析に関して報告されている。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１１８９３２号（２００７年１１月９日出願）；Ｂｒｅｄｅｈｏｆｔら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２００８、２２：４７７〜４８５頁；Ｌｅ Ｂｒｅｔｏｎら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２００８、２２：３１３０〜３６頁；Ｔｈｅｖｉｓら、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００８、２７：３５〜５０頁；Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２００８、４３：９０８〜１５頁；Ｓｃｈｅｎｋら、ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２００８、１：４１頁；およびＯｌｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００７、４：７０９〜１２頁を参照のこと。

分析物アッセイの結果は、当技術分野で公知の多くの方法により、原試料における分析物の量と関連づけられ得る。例えば、サンプリングパラメーターおよび分析パラメーターが慎重に制御されるという条件で、任意のイオンの相対存在量は、この相対存在量を原分子の絶対量に変換する表と比較し得る。あるいは、外部標準が試料と共に流されてもよく、標準曲線が、これらの標準から発生されたイオンに基づき構築されてもよい。このような標準曲線を用いて、任意のイオンの相対存在量は、原分子の絶対量に変換し得る。特定の好ましい実施形態において、内部標準が、Ｃペプチドの量を計算するための標準曲線を生成するのに使用される。このような標準曲線を生成および使用する方法は、当技術分野で周知であり、当業者は、適切な内部標準を選択し得る。例えば、好ましい実施形態において同位体標識Ｃペプチドの１つまたは複数の形態が、内部標準として使用され得る。イオンの量を原分子の量に関連づけるための多くの他の方法は、当業者に周知であろう。

本明細書で使用されるとき、「同位体標識」は、質量分析法により分析される場合、非標識分子と比べて標識分子において質量シフトをもたらす。適切な標識の例には、重水素（²Ｈ）、¹³Ｃ、および¹⁵Ｎが含まれる。１つまたは複数の同位体標識は、１つまたは複数の位置で分子に組み込んでもよく、１つまたは複数の種類の同位体標識が、同じ同位体標識分子で使用され得る。

方法の１つまたは複数のステップは、自動機械を用いて行ってもよい。特定の実施形態において、１つまたは複数の精製ステップはオンラインで行われ、より好ましくは、精製および質量分析ステップの全てがオンライン方式で行われ得る。

以下の実施例は、本発明を例証するのに役立つ。これらの実施例は、方法の範囲を制限することを意図するものでは決してない。

試料調製
さまざまな量のヒトＣペプチドを含有する模擬血清試料は、線形応答を評価するために（実施例４で以下に論じる）、ヒトＣペプチドを模擬血清（０．００２％プロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中の４０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））にさまざまな濃度でスパイクして調製した。

Ｇｏｌｄｅｎ Ｗｅｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から入手した２回活性炭処理した血清にも、応答の直線性を評価するために（実施例４で以下に論じる）、ヒトＣペプチドをさまざまな濃度でスパイクした。

質量分析の前のＣペプチドの濃縮
上記調製したヒトＣペプチドスパイク模擬およびストリップ血清の試料注入は、Ａｒｉａ ＯＳ Ｖ １．６またはより新規のソフトウェアを用いてＣｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｒｉａ ＴＸ−４２０システムで行った。

５０μＬ試料を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．製Ｓｔｒａｔａ Ｃ−８オンラインＳＰＥカラム（２０ｍｍ×２．０ｍｍ）または同等のオンライン固相抽出カラムに導入した。固相抽出カラムはＣペプチドを保持したが、他の血清タンパク質および大分子を流出させた。

Ｃペプチドを、４０％アセトニトリル中０．１％ギ酸で抽出カラムから溶出し、分析カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ．製Ｏｎｙｘ一体型Ｃ１８分析カラム（５０×２．０ｍｍ）に添加した。ＨＰＬＣ勾配を分析カラムに適用して、試料中に含有された他の分析物からＣペプチドを分離した。移動相Ａは０．１％ギ酸水溶液であり、移動相Ｂはアセトニトリル中０．１％ギ酸であった。ＨＰＬＣ勾配は２４．０％有機勾配で開始し、約９０秒で３５．５％に勾配させた。

Ｃペプチドを定量するために、Ｃペプチド濃縮試料を次いでＭＳ／ＭＳまたは高分解能／高精度ＭＳもしくはＭＳ／ＭＳに供した。

タンデムＭＳによるＣペプチドの検出および定量
ＭＳ／ＭＳは、Ｔｈｅｒｍｏ ＴＳＱ Ｖａｎｔａｇｅ ＭＳ／ＭＳシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社製）を用いて行った。以下のソフトウェアプログラム（全てＴｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ製）を、本明細書に記載された実施例において使用した：ＴＳＱ Ｕｌｔｒａ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｖ １．４．１以降、Ｘｃａｌｉｂｕｒ Ｖ ２．０以降、およびＬＣＱｕａｎ Ｖ ２．５以降。分析カラムから出る液体溶媒／分析物は、ＭＳ／ＭＳ分析器の加熱ネブライザー界面に流れた。溶媒／分析物混合物を界面の加熱管中で蒸気に変換した。分析物を、ＥＳＩによりイオン化した。

イオンが最初の四重極（Ｑ１）に移動した。幾つかの可能性のあるＣペプチドプリカーサーイオンが、１００７．５、１５１０．３８のピークとしてＱ１で観察された。例示的なＱ１スペクトルは図１に見られる。１００７．５±０．５０のｍ／ｚを有する３価Ｃペプチドプリカーサーイオンを、断片化のために選択した。四重極２（Ｑ２）に入るイオンは、アルゴンガスと衝突して（２０Ｖの衝突細胞エネルギーで）イオン断片を発生させ、イオン断片はさらなる選択のために四重極３（Ｑ３）に移動させた。Ｑ３スキャン（プロダクトイオンスキャン）から収集した例示的な断片化スペクトルを図２に示す。以下の質量移行は、１００７．５±０．５０プリカーサーイオンの断片化に関して観察された。

観察された移行のうち、３つをＭＲＭモードでモニターし、定量分析のために合計した（１００７．５±０．５０のプリカーサーイオンから９２７．６±０．５０、７８５．４±０．５０、および６４６．１±０．５０）。定量は３つの質量移行をモニターして達成したが、定量は、最低１個の質量移行をモニターして達成してもよい。反対に、上記モニターした移行のいずれかを任意の組み合わせで置換または増大させるために、追加の質量移行を選択してもよい。

Ｃペプチドを定量するためのタンデムＭＳデータ分析
トリプル四重極タンデム質量分析計を用いた示された移行のモニターによるＣペプチド定量が、Ｃペプチドスパイク模擬血清試料およびスパイクストリップ血清試料で行われた。

アッセイにおけるＣペプチド検出の直線性を確立するために、幾つかのスパイク模擬血清標準およびスパイクストリップ血清試料を、約１ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にわたって分析した。スパイク模擬血清標準およびスパイクストリップ血清試料におけるＣペプチド検出に関するデータの直線性を示すグラフを、それぞれ図３および４に示す。Ｃペプチドの適合度（Ｒ²）は、模擬血清で０．９９８、およびストリップ血清で０．９９６と決定された。

高分解能／高精度ＭＳによるＣペプチドの検出
高分解能／高精度ＭＳは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＴＯＦ ＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。このシステムは、高分解能／高精度ＭＳが可能なＱＴＯＦ ＭＳ分析器を使用する。機器は、Ｃペプチドの測定中に約１０，０００ ＦＷＨＭの分解能、および約５０ｐｐｍの質量精度を示す。

イオン化は、正イオンモードでＥＳＩ源により行う。多価Ｃペプチドイオンは、１５１０．３±０．５０（２＋イオンに関して）、および１００７．５±０．５０（３＋イオンに関して）のｍ／ｚで観察された。約５００から２０００、１００５〜１０４０、および１５１９〜１５２６、ｍ／ｚの範囲にわたる、Ｃペプチドイオンを示す例示的な高分解能／高精度スペクトルは、それぞれ図５Ａ〜５Ｃに見られる。

Ｃペプチドを定量するために、１００７．５±０．５０のｍ／ｚを有するイオンについてデータを収集した。予測した天然同位体分布の相対存在量を確認するために、このイオンの高分解能スキャンを収集し、使用した。約１００５から１０１２の範囲にわたる例示的な高分解能／高精度スペクトルを図６に示す。

Ｃペプチドの定量のための高分解能／高精度ＭＳデータ分析
高分解能／高精度質量分析計を用いた示された移行のモニターによるＣペプチド定量が、Ｃペプチドスパイク模擬血清試料およびスパイクストリップ血清試料で行われた。

アッセイにおけるＣペプチド検出の直線性を確立するために、幾つかのスパイク模擬血清標準およびスパイクストリップ血清試料を、約３．９ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ（スパイク模擬血清）および約３１．２５ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ（スパイクストリップ血清）の濃度範囲にわたって分析した。スパイク模擬血清標準およびスパイクストリップ血清試料におけるＣペプチド検出に関するデータの直線性を示すグラフを、それぞれ図７および８に示す。Ｃペプチドの適合度（Ｒ²）は、スパイク模擬血清で０．９９８、およびスパイクストリップ血清で０．９９６と決定された。

本明細書に言及および引用された論文、特許、および特許出願、および全ての他の文書および電子的に利用し得る情報の内容は、個々の刊行物が、参照により組み込まれることを具体的および個別に示される場合と同じ程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。出願者らは、上記論文、特許、ならびに特許出願、または他の物理的および電子的文書からの全ての材料ならびに情報を、本出願に物理的に組み込む権利を保有する。

本明細書に例証的に記載された方法は、本明細書に詳細には開示されていない任意の構成要素（複数可）、制限（複数可）の非存在下で適切に実行し得る。故に、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等は、拡大的におよび限定することなく解釈されるべきである。さらに、本明細書に使用されている用語および発現は、限定の用語ではなく説明の用語として使用されており、このような用語および発現の使用において、示され記載された特徴またはその部分のいかなる同等物も排除する意図はない。請求された本発明の範囲内でさまざまに変更し得ることが認識される。故に、本発明は、好ましい実施形態および任意の特徴により詳細に開示されているが、本明細書に開示された、これらに具体化された本発明の選択的特徴、変更および変形形態が当業者により用いられ得ること、このような変更および変形形態は、本発明の範囲内であると見なされることが理解されるべきである。

本発明は、本明細書で広く包括的に記載されている。包括的開示に含まれるより狭義の種および下位概念の群のそれぞれも、本方法の一部を形成する。これは、切り取られた材料が本明細書に具体的に引用されているか否かに関わりなく、属から任意の発明の主題を取り除く但し書きまたは消極的限定を含む、本方法の包括的記載を含む。

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。さらに、本方法の特徴または態様がマーカッシュ群に関して記載される場合、当業者は本発明がこれにより、該マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの下位群に関しても記載されると認識するであろう。

Claims (35)

1. タンデム質量分析により試料中のＣペプチドの量を決定する方法であって、
   （ａ）Ｃペプチドを含有することが疑われる試料を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供してＣペプチドが濃縮された画分を得るステップと、
   （ｂ）質量分析により検出し得る１種または複数のＣペプチドイオンを発生させるのに適した条件下で、濃縮されたＣペプチドをイオン化源に供するステップと、
   （ｃ）タンデム質量分析により１種または複数のＣペプチドイオンの量を決定するステップであって、前記決定されたイオンが、１００７．５±０．５の質量対電荷比を有するプリカーサーイオン、ならびに９２７．６±０．５、７８５．４±０．５、および６４６．１±０．５から成る質量対電荷比を有するイオンの群から選択される１種または複数の断片イオンを含むステップと
   を含み、
   ステップ（ｃ）で決定されたイオンの量が、前記試料中のＣペプチドの量に関連づけられる、方法。
2. 前記ＨＰＬＣが１−Ｄ ＨＰＬＣである、請求項１に記載の方法。
3. 前記イオン化源がエレクトロスプレー（ＥＳＩ）イオン化源である、請求項１に記載の方法。
4. 試料がＨＰＬＣの前に固相抽出（ＳＰＥ）に供される、請求項１に記載の方法。
5. 前記ＳＰＥおよびＨＰＬＣがオンライン処理で行われる、請求項４に記載の方法。
6. 前記試料が生体試料を含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記試料がヒト由来である、請求項１に記載の方法。
8. 前記試料が体液試料を含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記試料が血漿または血清を含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記１種または複数の断片イオンが、９２７．６±０．５、７８５．４±０．５、および６４６．１±０．５から成る群から選択される２種以上の断片イオンを含む、請求項１に記載の方法。
11. ステップ（ｃ）で決定された前記イオンを試料中のＣペプチドの量に関連づけるステップが、前記２種以上の断片イオンの量を合計するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
12. タンデム質量分析により試料中のＣペプチドの量を決定する方法であって、
    （ａ）Ｃペプチドを含有することが疑われる試料を１−Ｄ高速液体クロマトグラフィー（１−Ｄ ＨＰＬＣ）に供してＣペプチドが濃縮された画分を得るステップと、
    （ｂ）質量分析により検出し得る１種または複数のＣペプチドイオンを発生させるのに適した条件下で、Ｃペプチドが濃縮された画分をイオン化源に供するステップと、
    （ｃ）タンデム質量分析により１種または複数のＣペプチドイオンの量を決定するステップと
    を含み、
    ステップ（ｃ）で決定されたイオンの量が、前記試料中のＣペプチドの量に関連づけられる、方法。
13. ステップ（ｃ）で検出された前記１種または複数のイオンが、約１００７．５±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有するプリカーサーイオンを含む、請求項１２に記載の方法。
14. ステップ（ｃ）で検出された１種または複数のイオンが、約９２７．６±０．５、７８５．４±０．５、および６４６．１±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンの群から選択される１種または複数の断片イオンを含む、請求項１２に記載の方法。
15. ステップ（ｃ）で検出された１種または複数のイオンが、約９２７．６±０．５、７８５．４±０．５、および６４６．１±０．５の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンの群から選択される２種以上の断片イオンを含む、請求項１２に記載の方法。
16. ステップ（ｃ）で決定された前記イオンを試料中のＣペプチドの量に関連づけるステップが、前記２種以上の断片イオンの量を合計するステップを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記イオン化源がエレクトロスプレー（ＥＳＩ）イオン化源である、請求項１２に記載の方法。
18. 試料が１−Ｄ ＨＰＬＣの前に固相抽出（ＳＰＥ）に供される、請求項１２に記載の方法。
19. 前記ＳＰＥおよびＨＰＬＣがオンライン処理で行われる、請求項１８に記載の方法。
20. 前記試料が生体試料を含む、請求項１２に記載の方法。
21. 前記試料がヒト由来である、請求項１２に記載の方法。
22. 前記試料が体液試料を含む、請求項１２に記載の方法。
23. 前記試料が血漿または血清を含む、請求項１２に記載の方法。
24. 高分解能／高精度質量分析により試料中のＣペプチドの量を決定する方法であって、
    （ａ）Ｃペプチドを含有することが疑われる試料を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供してＣペプチドが濃縮された画分を得るステップと、
    （ｂ）質量分析により検出し得る１種または複数のＣペプチドイオンを発生させるのに適した条件下で、Ｃペプチドが濃縮された画分をイオン化源に供するステップと、
    （ｃ）高分解能／高精度質量分析により１種または複数のＣペプチドイオンの量を決定するステップと
    を含み、
    ステップ（ｃ）で決定されたイオンの量が、前記試料中のＣペプチドの量に関連づけられる、方法。
25. 前記高分解能／高精度質量分析が、１０，０００のＦＷＨＭおよび５０ｐｐｍの質量精度で行われる、請求項２４に記載の方法。
26. 前記高分解能／高精度質量分析計が、高分解能／高精度飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計である、請求項２４に記載の方法。
27. 前記ＨＰＬＣが１−Ｄ ＨＰＬＣである、請求項２４に記載の方法。
28. ステップ（ｃ）で決定された前記１種または複数のイオンが、約１００７．５±０．５および１５１０．３±０．５０の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンの群から選択されるイオンを含む、請求項２４に記載の方法。
29. 前記イオン化源がエレクトロスプレー（ＥＳＩ）イオン化源である、請求項２４に記載の方法。
30. 試料がＨＰＬＣの前に固相抽出（ＳＰＥ）に供される、請求項２４に記載の方法。
31. 前記ＳＰＥおよびＨＰＬＣがオンライン処理で行われる、請求項２５に記載の方法。
32. 前記試料が生体試料を含む、請求項２４に記載の方法。
33. 前記試料がヒト由来である、請求項２４に記載の方法。
34. 前記試料が体液試料を含む、請求項２４に記載の方法。
35. 前記試料が血漿または血清を含む、請求項２４に記載の方法。