JP2021073450A - 質量分析によるタモキシフェンおよびその代謝産物の定量化 - Google Patents

Abstract

【課題】質量分析により試料中のタモキシフェンおよびその代謝産物の量を検出する方法が提供される。【解決手段】いくつかの態様では、ノルエンドキシフェンの量を決定することを含み、いくつかの態様では、ノルエンドキシフェンおよびタモキシフェンの量を決定することを含む。いくつかの態様では、ノルエンドキシフェンおよび他のタモキシフェン代謝産物の量を決定することを含む。いくつかの態様では、本明細書中に提供する方法は、タモキシフェン、ノルエンドキシフェン、および他のタモキシフェン代謝産物の量を決定することを含む。【選択図】なし

Description

関連特許出願に対する相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年５月１２日に出
願された米国仮出願第６１／９９２，２１４号の優先権を主張する。

以下の本発明の背景の説明は、単に本発明を理解する際の補助として提供されるもので
あり、本発明の従来技術について記載するか、または本発明の従来技術を構成すると認め
られない。

タモキシフェンは、一次治療後のホルモン受容体陽性乳がん患者のための治療の標準物
質である。５〜１０年のタモキシフェン療法は、これらの患者において再発および死亡の
リスクを低減させる。それにもかかわらず、多くの患者が、多くの場合は薬物の不快な副
作用に起因して、彼らの完全な治療過程を完了させない。

タモキシフェンは、完全な有効性のために高度に活性なエンドキシフェンに変換される
プロドラッグである。タモキシフェンの、エンドキシフェンへの変換は、ＣＹＰ２Ｄ６（
２Ｄ６）における遺伝的変異などの遺伝的変異に依存した代謝経路による。２Ｄ６遺伝子
型判定は、タモキシフェンに対する応答および毒性を予測するために促進されてきたが、
個体のレベルとの直接的な関連については議論がある。

タモキシフェンに対する応答を予測する有効な方法が必要とされている。

本発明は、タンデム質量分析を含む質量分析による試料中のタモキシフェンおよびその
代謝産物の定量化に関する方法を提供する。

一態様では、質量分析により試料中のノルエンドキシフェンの量を決定する方法であっ
て、（ａ）前記ノルエンドキシフェンをイオン化して、質量分析により検出可能な１つま
たは複数のノルエンドキシフェンイオンを生じさせること、（ｂ）質量分析により工程か
らの該ノルエンドキシフェンイオン（ion(s)）の量を検出することを含み、検出される該
イオン（ion(s)）の量が、前記試料中のノルエンドキシフェンの量に関連する方法が提供
される。

一態様では、単回の質量分析アッセイにおいて試料中のタモキシフェンおよびその代謝
産物の量を決定する方法であって、（ａ）前記タモキシフェンおよび代謝産物をイオン化
して、質量分析により検出可能な１つまたは複数のイオンを生じさせること、（ｂ）質量
分析により工程からの該イオン（ion(s)）の量を検出することを含み、検出される該イオ
ン（ion(s)）の量が、前記試料中のタモキシフェンおよび代謝産物それぞれの量に関連す
る方法が提供される。

いくつかの実施形態では、前記代謝産物は、ノルエンドキシフェンを含む。いくつかの
実施形態では、前記代謝産物は、エンドキシフェンまたはＮ−デスメチル−４−ヒドロキ
シタモキシフェンを含む。いくつかの実施形態では、前記代謝産物は、４’−ヒドロキシ
タモキシフェンを含む。いくつかの実施形態では、前記代謝産物は、４−ヒドロキシタモ
キシフェンを含む。いくつかの実施形態では、前記代謝産物は、Ｎ−デスメチル−４’−
ヒドロキシタモキシフェンを含む。いくつかの実施形態では、前記代謝産物は、Ｎ−デス
メチルタモキシフェンを含む。いくつかの実施形態では、前記代謝産物は、ノルエンドキ
シフェン、エンドキシフェン、４’−ヒドロキシタモキシフェン、４−ヒドロキシタモキ
シフェン、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェン、およびＮ−デスメチル−
４’−ヒドロキシタモキシフェンからなる群から選択される代謝産物を含む。いくつかの
実施形態では、前記代謝産物は、ノルエンドキシフェン、エンドキシフェン、４’−ヒド
ロキシタモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロ
キシタモキシフェン、およびＮ−デスメチルタモキシフェンの任意の組合せを含む。いく
つかの実施形態では、前記代謝産物は、ノルエンドキシフェン、エンドキシフェン、４’
−ヒドロキシタモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、Ｎ−デスメチル−４’−
ヒドロキシタモキシフェン、およびＮ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンを
含む。いくつかの実施形態では、前記代謝産物は、ノルエンドキシフェン、エンドキシフ
ェン、４’−ヒドロキシタモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、Ｎ−デスメチ
ル−４’−ヒドロキシタモキシフェン、およびＮ−デスメチルタモキシフェンの任意の組
合せを含む。

一態様では、本明細書中に提供する方法は、タンパク質沈降を含む。いくつかの実施形
態では、本明細書中に提供する方法は、精製を含む。いくつかの実施形態では、前記精製
は、濾過を含む。いくつかの実施形態では、前記精製は、液体クロマトグラフィーを含む
。いくつかの実施形態では、前記液体クロマトグラフィーは、高圧液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）である。

いくつかの実施形態では、本明細書中に提供する方法は、内部標準の量を検出すること
を含む。いくつかの実施形態では、前記内部標準は、重水素化ノルエンドキシフェンであ
る。

いくつかの実施形態では、イオン化は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）によるもので
ある。いくつかの実施形態では、前記イオン化は、ポジティブイオンモードである。

いくつかの実施形態では、イオン化は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）による
ものである。いくつかの実施形態では、前記イオン化は、ポジティブイオンモードである
。

いくつかの実施形態では、前記試料は、血清試料である。

いくつかの実施形態では、質量分析は、タンデム質量分析である。

一態様では、タモキシフェンあるいは１つまたは複数のタモキシフェン代謝産物の量を
決定することにより患者におけるタモキシフェン応答を予測する方法が、本明細書中で提
供される。いくつかの実施形態では、大量の１つまたは複数のタモキシフェンまたはタモ
キシフェン代謝産物は、患者におけるタモキシフェンに対する陽性応答を示す。いくつか
の実施形態では、前記代謝産物は、ノルエンドキシフェンを含む。いくつかの実施形態で
は、前記代謝産物は、エンドキシフェンまたはＮ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシ
フェンを含む。いくつかの実施形態では、前記代謝産物は、４’−ヒドロキシタモキシフ
ェンを含む。いくつかの実施形態では、前記代謝産物は、４−ヒドロキシタモキシフェン
を含む。いくつかの実施形態では、前記代謝産物は、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシ
タモキシフェンを含む。いくつかの実施形態では、前記代謝産物は、Ｎ−デスメチルタモ
キシフェンを含む。いくつかの実施形態では、前記代謝産物は、ノルエンドキシフェン、
エンドキシフェン、４’−ヒドロキシタモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、
Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェン、およびＮ−デスメチル−４’−ヒド
ロキシタモキシフェンを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書中に提供する方法は、定量限界（ＬＯＱ）により測
定される感度を有する。いくつかの実施形態では、タモキシフェンの定量化方法は、５ｎ
ｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、タモキシフェンの定量化方
法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、タモキシフェン
の定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、タモ
キシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態
では、タモキシフェンの定量化方法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつか
の実施形態では、タモキシフェンの定量化方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有
する。

いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの定量化方法は、５ｎｇ／ｍ
Ｌ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの
定量化方法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デ
スメチルタモキシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつ
かの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の
定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの定量化方
法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル
タモキシフェンの定量化方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。

いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、５ｎｇ／
ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェ
ンの定量化方法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４
’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。
いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍ
Ｌ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェン
の定量化方法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４’
−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する
。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、１ｎｇ／
ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェ
ンの定量化方法は、０．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では
、４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、０．４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を
有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、０
．２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。

いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、５ｎｇ／ｍ
Ｌ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの
定量化方法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒ
ドロキシタモキシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつ
かの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の
定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方
法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシ
タモキシフェンの定量化方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの
実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の定量
限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は
、０．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシ
タモキシフェンの定量化方法は、０．４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの
実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、０．２ｎｇ／ｍＬ以下の
定量限界を有する。

いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキ
シフェン）の定量化方法は、５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態
では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の定量化方
法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル
−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以
下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモ
キシフェン（エンドキシフェン）の定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する
。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキ
シフェン）の定量化方法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態
では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の定量化方
法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメ
チル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の定量化方法は、１ｎｇ／ｍ
Ｌ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシ
タモキシフェン（エンドキシフェン）の定量化方法は、０．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界
を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（
エンドキシフェン）の定量化方法は、０．４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。

いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化
方法は、５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチ
ル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有
する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの定
量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デス
メチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界
を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェン
の定量化方法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−
デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の
定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキ
シフェンの定量化方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態で
は、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、０．５ｎｇ／ｍ
Ｌ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキ
シタモキシフェンの定量化方法は、０．４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。

いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの定量化方法は、５ｎｇ／ｍＬ以下の
定量限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの定量化方法は、４
ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの
定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエ
ンドキシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施
形態では、ノルエンドキシフェンの定量化方法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する
。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの定量化方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以
下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの定量化方法は
、１．２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシ
フェンの定量化方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では
、ノルエンドキシフェンの定量化方法は、０．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書中に提供する方法は、検出限界（ＬＯＤ）により測
定される感度を有する。いくつかの実施形態では、タモキシフェンの検出方法は、５ｎｇ
／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、タモキシフェンの検出方法は
、４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、タモキシフェンの検
出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、タモキシフ
ェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、タ
モキシフェンの検出方法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態
では、タモキシフェンの検出方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつ
かの実施形態では、タモキシフェンの検出方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する
。いくつかの実施形態では、タモキシフェンの検出方法は、０．６ｎｇ／ｍＬ以下の検出
限界を有する。

いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの検出方法は、５ｎｇ／ｍＬ
以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの検
出方法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメ
チルタモキシフェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実
施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界
を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの検出方法は、２ｎ
ｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフ
ェンの検出方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では
、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの検出方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。
いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの検出方法は、０．６ｎｇ／ｍ
Ｌ以下の検出限界を有する。

いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、５ｎｇ／ｍ
Ｌ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェン
の検出方法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−
ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつ
かの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の
検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方
法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキ
シタモキシフェンの検出方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの
実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の検出
限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は
、０．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキ
シタモキシフェンの検出方法は、０．４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの
実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、０．２ｎｇ／ｍＬ以下の
検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方
法は、０．１ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。

いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、５ｎｇ／ｍＬ
以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの検
出方法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロ
キシタモキシフェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実
施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界
を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、２ｎ
ｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフ
ェンの検出方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では
、４−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。
いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、０．５ｎｇ／ｍ
Ｌ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの
検出方法は、０．４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４−
ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、０．２ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。い
くつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、０．１ｎｇ／ｍＬ
以下の検出限界を有する。

いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキ
シフェン）の検出方法は、５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態で
は、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の検出方法は
、４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４
−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検
出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフ
ェン（エンドキシフェン）の検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつ
かの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン
）の検出方法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−
デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の検出方法は、１．５
ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒ
ドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の検出方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の検出限
界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン
（エンドキシフェン）の検出方法は、０．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつ
かの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン
）の検出方法は、０．４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、
Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の検出方法は、０
．２ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４
−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の検出方法は、０．１５ｎｇ／ｍＬ以
下の検出限界を有する。

いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方
法は、５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル
−４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する
。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方
法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル
−４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する
。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方
法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル
−４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有
する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの検
出方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメ
チル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、０．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界
を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェン
の検出方法は、０．４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。

いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの検出方法は、５ｎｇ／ｍＬ以下の検
出限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの検出方法は、４ｎｇ
／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの検出
方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキ
シフェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では
、ノルエンドキシフェンの検出方法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつか
の実施形態では、ノルエンドキシフェンの検出方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界
を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの検出方法は、１．２ｎｇ／
ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの検出方
法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシ
フェンの検出方法は、０．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。

本明細書中で使用する場合、「精製」または「精製すること」という用語は、目的の分
析物（analyte(s)）以外の試料由来の材料全てを除去することを指さない。代わって、精
製は、試料の１つまたは複数の他の構成成分に対して、目的の１つまたは複数の分析物の
量を富化させる手順を指す。精製は、本明細書中で使用する場合、全ての他のものからの
分析物の単離を必要としない。好ましい実施形態では、精製工程または手順を使用して、
１つまたは複数の干渉物質、例えば、該方法で使用される機器の操作に干渉する１つもし
くは複数の物質または質量分析による分析物イオンの検出に干渉し得る物質を除去するこ
とができる。

本明細書中で使用する場合、イオンの質量の測定を含まない定量的測定に関連して「約
」という用語は、表示値プラスまたはマイナス１０％を指す。

本明細書中で使用する場合、「実質的に全ての」という用語は、５０％を上回る、より
好ましくは６０％を上回る、より好ましくは７０％を上回る、より好ましくは８０％を上
回る、およびより好ましくは９０％を上回る任意の割合を指す。

本明細書中で使用する場合、「試料」という用語は、目的の分析物を含有し得る任意の
試料を指す。本明細書中で使用する場合、「体液または組織」という用語は、個体の身体
から単離することができる任意の液体または組織を意味する。例えば、「体液または組織
」は、血液、血漿、血清、胆汁、唾液、尿、涙、汗等を含んでもよい。固体組織が分析さ
れ得る場合、組織中に存在する任意の分析物を含有し得る液体分画を放出するように加工
処理してもよい。続いて、液体分画は、本明細書中に記載する方法が課せられ得る。

本明細書中で使用する場合、「サイズ分離技法」という用語は、分子の重量および形状
のいずれか１つまたは複数に基づいて試験試料から少なくとも１種の種の分離を可能にす
る任意の技法（物理的または化学的）を意味する。かかる技法の例として、濾過、クロマ
トグラフィー、および質量分析にある特定の態様が挙げられるが、それらに限定されない
。

本明細書中で使用する場合、「クロマトグラフィー」という用語は、液体または気体に
より運搬される化学混合物を、それらが固定液体または固体相付近を、その上を、および
／またはそれを通って流動する際に化学成分の差次的分配の結果として構成成分へ分離す
るプロセスを指す。

本明細書中で使用する場合、「液体クロマトグラフィー」または「ＬＣ」という用語は
、流体が微細物質のカラムに、またはキャピラリー通路に一様に浸透する際の、流体溶液
の１つまたは複数の構成成分の選択的遅延のプロセスを意味する。この流体が固定相（ph
ase(s)）に対して移動するため、遅延は、１つまたは複数の固定相とバルク流体（即ち、
移動相）との間の混合物の構成成分の分配に起因する。「液体クロマトグラフィー」とし
て、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）および高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）が挙げられる。

本明細書中で使用する場合、「高速液体クロマトグラフィー」または「ＨＰＬＣ」とい
う用語は、移動相を圧力下で、固定相、通常高密度充填カラムに通して送ることにより、
分離度が増大する液体クロマトグラフィーを指す。

本明細書中で使用する場合、「質量分析」または「ＭＳ」という用語は、それらの質量
により化合物を同定するための分析技法を指す。ＭＳは、それらのｍ／ｚでイオンをフィ
ルタリング、検出および測定する方法を指す。ＭＳ技術は概して、（１）化合物をイオン
化して、荷電種（例えば、イオン）を形成させること、および（２）イオンの分子量を検
出して、それらのｍ／ｚを算出することを含む。化合物は、任意の適切な手段によりイオ
ン化および検出され得る。「質量分析計」は概して、イオン化装置およびイオン検出器を
含む。一般に、目的の１つまたは複数の分子がイオン化されて、続いて、イオンは質量分
析機器へ導入されて、そこで、磁場と電場の組合せに起因して、イオンは、質量（「ｍ」
）および電荷（「ｚ」）に依存している空間を辿る。例えば、「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒ
ｏｍｅｔｒｙ Ｆｒｏｍ Ｓｕｒｆａｃｅｓ」という表題の米国特許第６，２０４，５０
０号；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓ
ｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」という表題の同第６，１０７，６２３号；「ＤＮＡ Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」とい
う表題の同第６，２６８，１４４号；「Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏ
ｌａｂｉｌｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｆｏｒ Ｄｅｓｏｒｐ
ｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎａｌｙｔｅｓ」という表題の同第６
，１２４，１３７号；Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ
ａｎｄ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２：２６４−７６（１９９９）；およ
びＭｅｒｃｈａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
２１：１１６４−６７（２０００）を参照されたい。

本明細書中で使用する場合、「ポジティブイオンモードで作動すること」という用語は
、陽イオンが検出される質量分析法を指す。同様に、「ネガティブイオンモードで作動す
ること」という用語は、陰イオンが検出される質量分析法を指す。

本明細書中で使用する場合、「イオン化」または「イオン化すること」という用語は、
１つまたは複数の電子ユニットに等しい正味の電荷を有する分析物イオンを発生させるプ
ロセスを指す。陽イオンは、１つまたは複数の電子ユニットの正味の正電荷を有するもの
である。陰イオンは、１つまたは複数の電子ユニットの正味の負電荷を有するものである
。

本明細書中で使用する場合、「電子イオン化」または「ＥＩ」という用語は、気相また
は蒸気相中の目的の分析物が、電子流と相互作用する方法を指す。電子と分析物との衝突
は、分析物イオンを生じ、続いてそれが、質量分析技法に付され得る。

本明細書中で使用する場合、「化学的イオン化」または「ＣＴ」という用語は、試薬ガ
ス（例えば、アンモニア）が電子衝突にさらされて、試薬ガスイオンと分析物分子の相互
作用により、分析物イオンが形成される方法を指す。

本明細書中で使用する場合、「高速原子衝撃」または「ＦＡＢ」という用語は、高エネ
ルギー原子（多くの場合は、ＸｅまたはＡｒ）のビームが不揮発性試料に衝突して、試料
中に含有される分子を脱離およびイオン化する方法を指す。試験試料は、グリセロール、
チオグリセロール、ｍ−ニトロベンジルアルコール、１８−クラウン−６−クラウンエー
テル、２−ニトロフェニルオクチルエーテル、スルホラン、ジエタノールアミン、および
トリエタノールアミンなどの粘性液体マトリックス中に溶解される。化合物または試料に
適したマトリックスの選択は、経験的プロセスである。

本明細書中で使用する場合、「マトリックス支援レーザー脱離イオン化」または「ＭＡ
ＬＤＩ」という用語は、不揮発性試料をレーザー照射に曝露させて、それが、光イオン化
、プロトン化、脱プロトン化およびクラスター崩壊を含む各種イオン化経路により試料中
の分析物を脱離およびイオン化する方法を指す。ＭＡＬＤＩに関して、試料は、エネルギ
ー吸収マトリックスと混合して、それが、分析物分子の脱離を促進する。

本明細書中で使用する場合、「表面増強レーザー脱離イオン化」または「ＳＥＬＤＩ」
という用語は、不揮発性試料をレーザー照射に曝露させて、それが、光イオン化、プロト
ン化、脱プロトン化およびクラスター崩壊を含む各種イオン化経路により試料中の分析物
を脱離およびイオン化する別の方法を指す。ＳＥＬＤＩに関して、試料は通常、目的の１
つまたは複数の分析物を優先的に保持する表面に結合される。ＭＡＬＤＩと同様に、この
プロセスもまた、エネルギー吸収材料を用いて、イオン化を促進してもよい。

本明細書中で使用する場合、「エレクトロスプレーイオン化」または「ＥＳＩ」という
用語は、長さが短いキャピラリー管に沿って溶液を通過させて、その末端に高い正または
負電位が印加される方法を指す。管の末端に到達する溶液は、溶媒蒸気中の溶液の非常に
小さな液滴のジェットまたはスプレーへと気化（噴霧）される。液滴のこのミストは、蒸
発チャンバーを通って流れて、これがわずかに加熱されて、凝縮を防止して、溶媒を蒸発
させる。液滴がより小さくなるにつれて、同様の電荷間の自然の反発が、イオンならびに
中性分子を放出させるような時点まで、電子表面電荷密度は増加する。

本明細書中で使用する場合、「大気圧化学イオン化」または「ＡＰＣＩ」という用語は
、ＥＳＩに類似した質量分析法を指すが、ＡＰＣＩは、大気圧でプラズマ内に起こるイオ
ン−分子反応によりイオンを生じる。プラズマは、スプレーキャピラリーと対電極との間
での放電により維持される。次に、イオンは通常、一組の差動排気スキマーステージ（di
fferentially pumped skimmer stages）を用いて質量分析計へと抽出される。乾燥および
予熱Ｎ_２ガスの対向流を使用して、溶媒の除去を改善してもよい。ＡＰＣＩにおける気相
イオン化は、より極性が低い種を分析するのに、ＥＳＩよりも有効であり得る。

「大気圧光イオン化」または「ＡＰＰＩ」という用語は、本明細書中で使用する場合、
分子Ｍの光イオン化に関する機構が、光子吸収および電子放出分子であり、分子Ｍ＋を形
成する質量分析の形態を指す。光子エネルギーは通常、イオン化電位の少し上であるため
、分子イオンは解離を受けにくい。多くの場合、クロマトグラフィーを必要とせずに試料
を分析することが可能である可能性があり、したがって、大幅な時間と費用を節約する。
水蒸気またはプロトン性溶媒の存在下で、分子イオンはＨを抽出してＭＨ＋を形成し得る
。これは、Ｍが高いプロトン親和性を有する場合に起きる傾向がある。これは、Ｍ＋およ
びＭＨ＋の和が一定であるため、定量精度に影響を及ぼさない。プロトン性溶媒中の薬物
化合物は通常、ＭＨ＋として観察されるのに対して、ナフタレンまたはテストステロンな
どの非極性化合物は、通常Ｍ＋を形成する。Ｒｏｂｂ，Ｄ．Ｂ．，Ｃｏｖｅｙ，Ｔ．Ｒ．
ａｎｄ Ｂｒｕｉｎｓ，Ａ．Ｐ．（２０００）：例えば、Ｒｏｂｂ ｅｔ ａｌ．，Ａｔ
ｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｐｈｏｔｏｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：Ａｎ ｉｏ
ｎｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２（１５）：３６５
３−３６５９を参照されたい。

本明細書で使用する場合、「誘導結合プラズマ」または「ＩＣＰ」という用語は、ほと
んどの元素を微粒子化およびイオン化するのに十分高温で、試料を、部分的イオン化ガス
と相互作用させる方法を指す。

本明細書中で使用する場合、「電界脱離」という用語は、不揮発性試験試料がイオン化
表面に配置され、強電界を使用して、分析物イオンを発生させる方法を指す。

本明細書中で使用する場合、「脱離」という用語は、表面からの分析物の除去および／
または気相への分析物の移行を指す。

本明細書中で使用する場合、「定量限界」または「ＬＯＱ」という用語は、測定が定量
的に有意義になるポイントを指す。このＬＯＱでの分析物応答は、精度２０％および正確
度８０％〜１２０％で同定可能であり、離散しており、また再現性がある。

本明細書中に開示する方法のある特定の好ましい実施形態では、質量分析は、ポジティ
ブイオンモードで実施される。本明細書中に開示する方法のある特定の特に好ましい実施
形態では、質量分析は、ＥＳＩを用いて実施される。

他の好ましい実施形態では、別個に検出可能な内部標準が、試料中に供給される。

一実施形態では、該方法は、ＬＣと質量分析との組合せを包含する。別の好ましい実施
形態では、質量分析は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）である。

上述する本発明の概要は、非限定的であり、本発明の他の特徴および利点は、以下の本
発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。

患者試料中のタモキシフェンおよび／またはその代謝産物を定量的に測定する方法につ
いて記載する。この定量的測定は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技法の使用によって達成される。Ｌ
Ｃ−ＭＳ／ＭＳの使用に先立って、試料は、下記技法またはそのいずれか一部により調製
され得る。試料中のタモキシフェンおよび／またはその代謝産物の第１の精製は、タンパ
ク質精製、濾過またはクロマトグラフィーの使用によって実施され得る。

任意の適切なサイズ分離技法を利用し得るが、下記の例では、第１および第２のサイズ
分離技法がともに、分子量カットオフフィルターに通す濾過である。同様に、下記の実施
例で論述するように、同じフィルターを、第１のサイズ分離および第２のサイズ分離の両
方に使用することができるように、適切な分子量カットオフを有する分子量カットオフフ
ィルターを選択することが可能である。

ＬＣ、最も好ましくはＨＰＬＣは、単独で、または他の精製方法と組み合わせて、選択
した分析物を精製するのに利用され得る。この精製は、ＭＳ／ＭＳと組み合わせて、それ
により試験試料中の選択した分析を定量化するためのアッセイ系を提供する。続いて、試
料中の選択した分析物の量を使用して、元の試験試料中のタモキシフェンの量を決定する
。本明細書中に提供する定量化方法は、特異性を高めており、方法論的な問題（抗体干渉
などの）を受けにくい。

適切な試料は、目的の分析物を含有し得る任意の試験試料を含んでもよい。いくつかの
好ましい実施形態では、試料は、生物学的試料、即ち、動物、細胞培養物、臓器培養物等
などの任意の生物学的供給源から得られる試料である。ある特定の好ましい実施形態では
、試料は、イヌ、ネコ、ウマ等などの哺乳類動物から得られる。特に好ましい哺乳動物は
、霊長類、最も好ましくはヒトである。特に好ましい試料として、血液、血漿、血清、尿
、唾液、涙、脳脊髄液、または他の体液または組織試料が挙げられる。かかる試料は、例
えば患者、即ち疾患もしくは状態の診断、予後または治療に関する臨床背景にある生身の
人間から得られ得る。試験試料は好ましくは、患者、例えば血清または血漿から得られる
。

質量分析用の試料調製物
試料は、質量分析による分析に適している調製物を得るために加工処理または精製され
てもよい。かかる精製は通常、液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを含み
、また、多くの場合、クロマトグラフィーに先立って実施されるさらなる精製手順を含ん
でもよい。各種手順は、試料のタイプまたはクロマトグラフィーのタイプに応じて、この
目的で使用され得る。例として、濾過、遠心分離、それらの組合せ等が挙げられる。

濾過は、クロマトグラフィー用の試験試料、特に血清または血漿などの生物学的試験試
料を調製する１つの好ましい方法である。かかる濾過は、フィルターのカットオフよりも
大きい分子量を有する種を、フィルターのカットオフよりも小さい分子量を有する種と分
離するための分子量カットオフフィルターに通して、試験試料を濾過することにより実施
される。完全な（またはほぼ完全な）濾過後にフィルター上に残存する試験試料は、フィ
ルターのカットオフよりも小さい分子量を有する潜在的に干渉する種を実質的に含まない
。

質量分析解析に先立つ試料浄化のためのＨＰＬＣの使用を含む各種方法が記載されてい
る。例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｍｏｎ
ｉｔｏｒｉｎｇ ２２：６０８−１２（２０００）（血液試料の手動沈降、続く手動Ｃ１
８固相抽出、Ｃ１８分析用カラム上でのクロマトグラフィーのためのＨＰＬＣへの注入、
およびＭＳ／ＭＳ分析）；およびＳａｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃｓ ２２ Ｓｕｐｌ．Ｂ：Ｂ７１−Ｂ８５（２０００）（血液試料の手動沈降、続
く手動Ｃ１８固相抽出、Ｃ１８分析用カラム上でのクロマトグラフィーのためのＨＰＬＣ
への注入、およびＭＳ／ＭＳ分析）を参照されたい。当業者は、該方法における使用に適
しているＨＰＬＣ機器およびカラムを選択してもよい。クロマトグラフィーカラムは通常
、化学部分の分離（即ち、分画）を容易にするための媒質（即ち、充填材料）を含む。媒
質は、微小粒子を含んでもよい。粒子は、化学部分の分離を容易にするための各種化学部
分と相互作用する結合表面を含む。１つの適切な結合表面は、アルキル結合表面などの疎
水性結合表面である。アルキル結合表面は、Ｃ−４、Ｃ−８、またはＣ−１８結合アルキ
ル基、好ましくはＣ−８結合基を含んでもよい。クロマトグラフィーカラムは、試料を受
け取るための入口ポートおよび分画された試料を含む溶出物を排出させるための出口ポー
トを含む。

ある特定の実施形態では、目的の分析物がカラム充填材料により可逆的に保持される一
方で、１つまたは複数の他の材料は保持されない条件下で、試料をカラムにかけることに
より、分析物は精製され得る。これらの実施形態では、目的の分析物がカラムにより保持
される第１の移動相条件を用いることができ、続いて、第２の移動相条件は、保持されな
い材料がいったん洗い流されたら、保持された材料をカラムから除去するのに使用するこ
とができる。あるいは、目的の分析物が、１つまたは複数の他の材料と比較して、異なる
速度で溶出する移動相条件下で、試料をカラムにかけることにより、分析物は精製され得
る。かかる手順は、試料の１つまたは複数の他の構成成分に対して、目的の１つまたは複
数の分析物の量を富化させてもよい。

一実施形態では、分析されるべき試料は、入口ポートでカラムにかけられ、溶媒または
溶媒混合物で溶出されて、出口ポートで排出される。種々の溶媒モードは、目的の分析物
を溶出させることに関して選択され得る。例えば、液体クロマトグラフィーは、勾配モー
ド、定組成モード、またはポリタイピック（polytyptic）（即ち、混合）モードを使用し
て実施されてもよい。好ましい実施形態では、ＨＰＬＣは、移動相としてＨＰＬＣグレー
ド超純水中の０．２％ギ酸および１００％メタノール中の０．２％ギ酸を使用して、Ｃ８
固相を用いた分析用ＨＰＬＣシステムで実施される。

多数のカラム充填が、試料のクロマトグラフィー分離に利用可能であり、適切な分離プ
ロトコールの選択は、試料の特徴、目的の分析物、干渉物質の存在およびそれらの特徴等
に依存する経験的プロセスである。市販のＨＰＬＣカラムとして、極性、イオン交換（陽
イオンおよび陰イオンの両方）、疎水性相互作用、フェニル、Ｃ−２、Ｃ−８、Ｃ−１８
および多孔質ポリマーカラムの極性コーティングが挙げられるが、それらに限定されない
。

一実施形態では、ＨＰＬＣカラムは、メジアン粒子サイズ５μｍ（公称）およびメジア
ン粒子孔サイズ１００Åを有するＣ８固相を有する。好ましい実施形態では、カラム寸法
は、直径１．０ｍｍ×長さ５０ｍｍである（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃｏｒｐ．Ｌｕｎａ
５μ Ｃ８（２） １００Å Ｎｅｗ Ｃｏｌｕｍｎ ５０ｘ１．０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏ
ｍｅｎｅｘ Ｃａｔ．Ｎｏ．００Ｂ−４２４９−Ａ０または等価体）。

クロマトグラフィー中に、材料の分離は、溶離液（「移動相」としても公知）の選択、
勾配溶出の選択および勾配条件、温度等などの変数により達成される。

質量分析による検出および定量化
様々な実施形態では、分析物は、当業者に公知の任意の方法によりイオン化され得る。
質量分析は、質量分析計を使用して実施され、それは、分画された試料をイオン化して、
さらなる分析のための荷電分子を創出するためのイオン源を含む。様々なＭＳ技法で使用
されるイオン源として、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン化（Ｅ
ＳＩ）、光子イオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオン
化（ＡＰＰＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）／液体二次イオン化（ＬＳＩＭＳ）、マトリッ
クス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電解イオン化、電解脱離、サーモスプレ
ー／プラズマスプレーイオン化、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、誘導結
合プラズマ（ＩＣＰ）および粒子ビームイオン化が挙げられるが、それらに限定されない
。イオン化方法の選択が、測定されるべき分析物、試料のタイプ、検出器のタイプ、ポジ
ティブ対ネガティブモードの選択等に基づいて決定され得ることは、当業者に理解されよ
う。

好ましい実施形態では、分析物は、分析物前駆体イオンを創出するエレクトロスプレー
イオン化（ＥＳＩ）によりイオン化される。関連する好ましい実施形態では、分析物前駆
体イオンは、ガス状態で存在、不活性衝突ガスは、アルゴンである。

試料がイオン化された後、それにより創出された正に帯電したイオンを分析して、ｍ／
ｚを決定し得る。ｍ／ｚを決定するのに適した分析器として、四重極分析器、イオントラ
ップ分析器、および飛行時間型分析器が挙げられる。イオンは、いくつかの検出モードの
うちの１つを使用して検出され得る。例えば、選択したイオンのみが、選択的イオンモニ
タリングモード（ＳＩＭ）を使用して検出されてもよく、あるいは多重イオンが、走査モ
ード、例えば多重反応モニタリング（ＭＲＭ）または選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を
使用して検出されてもよい。好ましい実施形態では、イオンは、ＳＲＭを使用して検出さ
れる。

好ましくは、ｍ／ｚは、四重極機器を使用して決定される。「四重極」または「四重極
イオントラップ」機器では、振動無線周波電磁界中のイオンは、電極間に印加したＤＣ電
位に比例した力、ＲＦシグナルの振幅、およびｍ／ｚを受ける。電圧および振幅は、特定
のｍ／ｚを有するイオンのみが、四重極の長さ方向を進むように選択され得る一方で、他
のイオン全てが偏向される。したがって、四重極機器は、機器へ注入されたイオンに関し
て「質量フィルター」および「質量検出器」の両方として作用し得る。

「タンデム試料分析」または「ＭＳ／ＭＳ」を用いることにより、ＭＳ技法の分解能を
高めてもよい。この技法では、目的の分子から生成する前駆体イオン（親イオンとも呼ば
れる）は、ＭＳ機器でフィルタリングされて、次に前駆体イオンは断片化を受けて、１つ
または複数の断片イオン（娘イオンまたは生成物イオンとも呼ばれる）を生じることがで
き、続いて１つまたは複数の断片イオンは、第２のＭＳ手順で分析される。前駆体イオン
の慎重な選択により、ある特定の分析物により生産されるイオンのみが、断片化チャンバ
ーへと移動して、そこで、不活性ガスの原子との衝突により、断片イオンが生じる。前駆
体および断片イオンの両方が、所定の組のイオン化／断片化条件下で再現可能な様式で生
産されるため、ＭＳ／ＭＳ技法は、極めて強力な分析ツールを提供し得る。例えば、ろ過
／断片化の組合せを使用して、干渉物質を排除してもよく、生物学的試料などの複雑試料
に特に有用であり得る。

さらに、飛行時間型分析器と連動したマトリックス支援レーザー脱離イオン化（「ＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦ」）などの、技術における最近の進歩により、非常に短いイオンパルスで
フェムトモルレベルでの分析物の分析が可能となる。飛行時間型分析器とタンデムＭＳと
を組み合わせる質量分析計もまた、当業者に周知である。さらに、多重質量分析工程は、
「ＭＳ／ＭＳ」として公知の方法で組み合わせてもよい。ＭＳ／ＭＳ／ＴＯＦ、ＭＡＬＤ
Ｉ／ＭＳ／ＭＳ／ＴＯＦ、またはＳＥＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳ／ＴＯＦ質量分析などの様々な
他の組合せを用いてもよい。

質量分析計は通常、使用者に、イオンスキャン、即ち所定の範囲（例えば、４００〜１
６００ａｍｕ）にわたる特定のｍ／ｚを用いた各イオンの相対存在量を提供する。分析物
アッセイの結果、即ち質量スペクトルは、当業者に公知の数多くの方法により元の試料中
の分析物の量に関連付けることができる。例えば、試料採取および分析パラメーターが慎
重に制御されることから、所定のイオンの相対存在量は、その相対存在量を元の分子の絶
対量に変換する表と比較することができる。あるいは、分子標準物質を試料とともに実行
し、それらの標準物質から発生するイオンに基づいて、標準曲線を構築することができる
。かかる標準曲線を使用して、所定のイオンの相対存在量を、元の分子の絶対量へ変換し
得る。ある特定の好ましい実施形態では、内部標準を使用して、タモキシフェンの量を算
出するための標準曲線を作成する。かかる標準曲線を作成および使用する方法は、当該技
術分野で周知であり、当業者は、適切な内部標準を選択することが可能である。イオンの
量を、元の分子の量に関連付ける数多くの他の方法が、当業者に周知である。

該方法の１つまたは複数の工程は、自動化された機械を使用して実施してもよい。ある
特定の実施形態では、１つまたは複数の精製工程は、オンラインで実施され、より好まし
くは、ＬＣ精製および質量分析工程は全て、オンライン様式で実施され得る。

ある特定の実施形態では、ＭＳ／ＭＳなどの技法を使用して、さらなる断片化のために
前駆体イオンを単離する。これらの実施形態では、衝突活性化解離（ＣＡＤ）を使用して
、さらなる検出のために断片イオンを発生させてもよい。ＣＡＤでは、前駆体イオンは、
不活性ガスとの衝突によりエネルギーを獲得し、続いて「単分子分解」と称されるプロセ
スにより、断片化を受ける。十分なエネルギーが、前駆体イオンに堆積されなくてはなら
ず、その結果、イオン内のある特定の結合が、振動エネルギーの増加に起因して破壊され
得る。代替的な実施形態では、電子移動解離（ＥＴＤ）を使用して、断片イオンを発生さ
せてもよい。ＥＴＤでは、ラジカル陰イオンを使用して、電子を、多数重なった帯電ペプ
チドまたはタンパク質陽イオンへ移動させて、ペプチド骨格に沿ったランダムな切断をも
たらす。

特に好ましい実施形態では、分析物は、下記の通りにＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して検出
および／または定量化される。上述するように調製された分析物に富んだ試料をＬＣに付
す。クロマトグラフィーカラムからの液体溶媒流は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析器の加熱ネブ
ライザー界面へと進み、溶媒／分析物混合物は、界面の加熱チューブで蒸気へ変換される
。噴霧溶媒中に含有される分析物は、噴霧溶媒／分析物混合物へ大きな電圧を印加する界
面のコロナ放電針によりイオン化される。イオンは、機器の開口部を通過して、第１の四
重極へと進む。四重極１および３（Ｑ１およびＱ３）は、質量フィルターであり、それら
のｍ／ｚに基づいて、イオンの選択（即ち、「前駆体」および「断片」イオン）を可能に
する。四重極２（Ｑ２）は、衝突セルであり、そこでイオンは断片化を受ける。Ｑ１は、
前駆体イオンのｍ／ｚを用いてイオンを選択する。選択された前駆体イオンは、衝突チャ
ンバー（Ｑ２）へ通過するのが可能となる一方で、任意の他のｍ／ｚを有するイオンは、
Ｑ１の側面と衝突して、排除される。Ｑ２へと進む前駆体イオンは、中性アルゴンガス分
子との衝突により、衝突活性化解離（ＣＡＤ）で断片化を受けてもよい。あるいは、Ｑ２
へと進む前駆体イオンが、多数重なった帯電陽イオンである場合、それらは、電子移動解
離（ＥＴＤ）で断片化を受けてもよい。発生した断片イオンは、Ｑ３へと通過して、そこ
で、選択された断片イオンが収集される一方で、他のイオンは排除される。

当該技術分野で周知の標準的な方法を使用して、当業者は、Ｑ３における選択に使用さ
れ得る特定の前駆体イオンの１つまたは複数の断片イオンを同定することが可能である。
特異的な断片イオンは、類似した分子構造を有する他の分子により、相当量で形成されな
いものである。対比して、非特異的断片イオンは、所望の分析物以外の分子により形成さ
れるものである。適切な特異的断片イオンは、選択された分析物により形成される断片イ
オンがまた、類似した構造または特徴を有する他の分子により形成されるかどうかを決定
するのに様々な分子標準物質を試験することにより同定され得る。好ましくは、分析物イ
オンのｍ／ｚに相当するｍ／ｚを有するイオンに特異的な少なくとも１つの断片イオンが
同定される。

イオンが検出器と衝突するにつれ、それらは、デジタルシグナルへ変換される電子のパ
ルスを生じる。獲得データはコンピューターへ中継されて、コンピューターは、単位時間
当たりのイオン計数をプロットする。特定のイオンに相当するピーク下の面積、またはか
かるピークの振幅を測定して、面積または振幅が、目的の分析物の量と相関される。ある
特定の実施形態では、断片イオン（ion(s)）および／または前駆体イオンに関する曲線下
の面積、またはピークの振幅を測定して、ｍ／ｚを用いて分析物の量を決定する。上述す
るように、所定のイオンの相対存在量は、内部分子標準の１つまたは複数のイオンのピー
クに基づく較正標準曲線を使用して、元の分析物の絶対量へ変換され得る。続いて、ＬＣ
−ＭＳ／ＭＳにより検出される分析物の絶対量を、元の試験試料中に存在する分析物の絶
対量へ変換することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書中に提供する方法は、定量限界（ＬＯＱ）により測
定される感度を有する。いくつかの実施形態では、タモキシフェンの定量化方法は、５ｎ
ｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、タモキシフェンの定量化方
法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、タモキシフェン
の定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、タモ
キシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態
では、タモキシフェンの定量化方法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつか
の実施形態では、タモキシフェンの定量化方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有
する。

いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの定量化方法は、５ｎｇ／ｍ
Ｌ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの
定量化方法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デ
スメチルタモキシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつ
かの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の
定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの定量化方
法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル
タモキシフェンの定量化方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。

いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、５ｎｇ／
ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェ
ンの定量化方法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４
’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。
いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍ
Ｌ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェン
の定量化方法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４’
−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する
。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、１ｎｇ／
ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェ
ンの定量化方法は、０．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では
、４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、０．４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を
有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、０
．２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。

いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、５ｎｇ／ｍ
Ｌ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの
定量化方法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒ
ドロキシタモキシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつ
かの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の
定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方
法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシ
タモキシフェンの定量化方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの
実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の定量
限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は
、０．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシ
タモキシフェンの定量化方法は、０．４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの
実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、０．２ｎｇ／ｍＬ以下の
定量限界を有する。

いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキ
シフェン）の定量化方法は、５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態
では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の定量化方
法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル
−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以
下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモ
キシフェン（エンドキシフェン）の定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する
。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキ
シフェン）の定量化方法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態
では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の定量化方
法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメ
チル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の定量化方法は、１ｎｇ／ｍ
Ｌ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシ
タモキシフェン（エンドキシフェン）の定量化方法は、０．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界
を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（
エンドキシフェン）の定量化方法は、０．４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。

いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化
方法は、５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチ
ル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有
する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの定
量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デス
メチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界
を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェン
の定量化方法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−
デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の
定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキ
シフェンの定量化方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態で
は、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの定量化方法は、０．５ｎｇ／ｍ
Ｌ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキ
シタモキシフェンの定量化方法は、０．４ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。

いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの定量化方法は、５ｎｇ／ｍＬ以下の
定量限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの定量化方法は、４
ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの
定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエ
ンドキシフェンの定量化方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施
形態では、ノルエンドキシフェンの定量化方法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する
。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの定量化方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以
下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの定量化方法は
、１．２ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシ
フェンの定量化方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。いくつかの実施形態では
、ノルエンドキシフェンの定量化方法は、０．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書中に提供する方法は、検出限界（ＬＯＤ）により測
定される感度を有する。いくつかの実施形態では、タモキシフェンの検出方法は、５ｎｇ
／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、タモキシフェンの検出方法は
、４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、タモキシフェンの検
出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、タモキシフ
ェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、タ
モキシフェンの検出方法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態
では、タモキシフェンの検出方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつ
かの実施形態では、タモキシフェンの検出方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する
。いくつかの実施形態では、タモキシフェンの検出方法は、０．６ｎｇ／ｍＬ以下の検出
限界を有する。

いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの検出方法は、５ｎｇ／ｍＬ
以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの検
出方法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメ
チルタモキシフェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実
施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界
を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの検出方法は、２ｎ
ｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフ
ェンの検出方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では
、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの検出方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。
いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチルタモキシフェンの検出方法は、０．６ｎｇ／ｍ
Ｌ以下の検出限界を有する。

いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、５ｎｇ／ｍ
Ｌ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェン
の検出方法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−
ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつ
かの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の
検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方
法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキ
シタモキシフェンの検出方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの
実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の検出
限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は
、０．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキ
シタモキシフェンの検出方法は、０．４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの
実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、０．２ｎｇ／ｍＬ以下の
検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方
法は、０．１ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。

いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、５ｎｇ／ｍＬ
以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの検
出方法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロ
キシタモキシフェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実
施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界
を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、２ｎ
ｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフ
ェンの検出方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では
、４−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。
いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、０．５ｎｇ／ｍ
Ｌ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの
検出方法は、０．４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、４−
ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、０．２ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。い
くつかの実施形態では、４−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、０．１ｎｇ／ｍＬ
以下の検出限界を有する。

いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキ
シフェン）の検出方法は、５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態で
は、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の検出方法は
、４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４
−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検
出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフ
ェン（エンドキシフェン）の検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつ
かの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン
）の検出方法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−
デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の検出方法は、１．５
ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒ
ドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の検出方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の検出限
界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン
（エンドキシフェン）の検出方法は、０．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつ
かの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン
）の検出方法は、０．４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、
Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の検出方法は、０
．２ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４
−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）の検出方法は、０．１５ｎｇ／ｍＬ以
下の検出限界を有する。

いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方
法は、５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル
−４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する
。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方
法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル
−４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する
。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方
法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル
−４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有
する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの検
出方法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメ
チル−４’−ヒドロキシタモキシフェンの検出方法は、０．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界
を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェン
の検出方法は、０．４ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。

いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの検出方法は、５ｎｇ／ｍＬ以下の検
出限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの検出方法は、４ｎｇ
／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの検出
方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキ
シフェンの検出方法は、３ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では
、ノルエンドキシフェンの検出方法は、２ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつか
の実施形態では、ノルエンドキシフェンの検出方法は、１．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界
を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの検出方法は、１．２ｎｇ／
ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシフェンの検出方
法は、１ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。いくつかの実施形態では、ノルエンドキシ
フェンの検出方法は、０．５ｎｇ／ｍＬ以下の検出限界を有する。

下記実施例は、本発明を説明するのに役立つ。これらの実施例は、いかなる場合でも該
方法の範囲を限定するものと意図されない。

タモキシフェンおよびその代謝産物の決定
下記手順では、タモキシフェンおよびその代謝産物を、血清から抽出する。血清をフィ
ルタープレートへ添加して、次にアセトニトリル／ＩＳと混合した後、沈降物を形成させ
る。続いて、混合物を陽圧マニホールド上に配置させて、有機分画を収集プレートまで通
す。プレートに蓋をした後、ＭＳ／ＭＳ上への注入用の総合システム（Cohesive system
）上に配置させる。ＭＳは、ＡＰＣＩポジティブモードである。定量化は、特有の親−生
成物移行に基づく。類似した移行を有する分析物は、クロマトグラフィーで分離された。

使用する較正物質／標準物質
１２ポイント較正が、各分析物に使用される。最初に、１つの標準物質のみを作製し（
Ｓｔｄ−１２）、一連の希釈を実施して、残りの標準物質を生成させる。標準物質（＃１
２）は、−７０℃の冷凍庫から取り出して、解凍させるべきである。解凍しながら、１２
個の１２×７５ｍｍチューブにラベルをする。

ｓｔｄ−１２ ３．０ｍＬをチューブ１２へ添加する。この標準物質から、以下の表に
倣って、標準曲線を創出する。標準物質は、各アッセイを用いて作成されるべきである。
−６０〜−９０℃の冷凍庫中に最初の標準物質を戻す。

これらの分析物がいったん添加されたら、十分量のＢｉｏｃｅｌｌ血清を用いて２００
ｍＬにする。混合した後、１５ｍＬの遠心チューブへ分取する。ラベルをした（Ｓｔｄ−
１２）後、貯蔵用に−６０〜−９０℃の冷凍庫中にチューブを入れる。１年間安定である
。

標準物質標的濃度

備品および供給品

アッセイプラットフォーム
下記モジュールを含有するＴｈｅｒｍｏ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムをこのアッセイに
使用した：

予測値

参照範囲：
タモキシフェン：１２．５４〜２３３．０７ｎｇ／ｍＬ
Ｎ−デスメチルタモキシフェン：２．５９〜３７３．９６ｎｇ／ｍＬ
４’−ヒドロキシタモキシフェン：０．４〜６．３３ｎｇ／ｍＬ
４−ヒドロキシタモキシフェン：０．２４〜５．０５ｎｇ／ｍＬ
Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）：０．９３〜４
３．１９ｎｇ／ｍＬ
Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェン：１．１７〜１９．９５ｎｇ／ｍＬ

分析的測定範囲（ＡＭＲ）
タモキシフェン：１．４７〜１５００ｎｇ／ｍＬ
Ｎ−デスメチルタモキシフェン：１．４７〜１５００ｎｇ／ｍＬ
４’−ヒドロキシタモキシフェン：０．２〜２００ｎｇ／ｍＬ
４−ヒドロキシタモキシフェン：０．２〜２００ｎｇ／ｍＬ
Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）：０．３９〜４
００ｎｇ／ｍＬ
Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェン：０．３９〜４００ｎｇ／ｍＬ

精度：アッセイ間（アッセイの期間）および内（１日）の精度研究を、低、中および高対
照を使用して実施した。分析物は全て、バリデーションの期間にわたって１２％未満の変
動係数を示した。

干渉物質：軽度または中程度の黄疸および脂質血症試料は許容可能である。溶血性試料は
、それらが試料調製中にフィルターを詰まらせるため許容不可能である。極めて溶血され
た黄疸および脂質血症試料は許容不可能である。

臨床的感度（ＬＯＱ）：
タモキシフェン：１．４７ｎｇ／ｍＬ
Ｎ−デスメチルタモキシフェン：１．４６ｎｇ／ｍＬ
４’−ヒドロキシタモキシフェン：０．２ｎｇ／ｍＬ
４−ヒドロキシタモキシフェン：０．２ｎｇ／ｍＬ
Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）：０．３９ｎｇ
／ｍＬ
Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェン：０．３９ｎｇ／ｍＬ

タモキシフェンおよびその代謝産物アッセイのバリデーション
この報告には、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるタモキシフェンおよびその５つの主要な第１相
代謝産物に関するバリデーションの詳細な概要が含まれる。アッセイは、研究室で開発し
た試験である。

方法：タモキシフェンおよびその５つの主要な第１相代謝産物（Ｎ−デスメチルタモキシ
フェン、Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン、Ｎ−デスメチル−４’−ヒド
ロキシタモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、および４’−ヒドロキシタモキ
シフェン）を血清から抽出する。抽出は、タンパク質沈降、続く濾過である。次に、分析
および定量化をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより実施する。

研究室で開発した試験（ＬＤＴ）に関する精度研究
実行内精度：低、中および高対照を１回の実行内で分析した（１０）。ＱＣは全て、合
格基準内に収まった（変動係数 ２０％未満）。

総精度：総精度は、バリデーションプロセス中のアッセイ全てに関するＱＣ実行全てに基
づいた。合格判定は、変動係数 ２０％未満に基づいた。ＱＣは全て、この判断基準内に
収まった。

分析的感度（検出限界）
検出限界（ＬＯＤ）：検出限界（ＬＯＤ）は、低プール（分析物全てを含有する）を取り
出して、続いて最低観察可能レベルにまで段階的に希釈する（１：２）ことにより実施し
た。直線性が、定量限界（ＬＯＱ）のレベル以下で継続すると仮定すると、以下の値が、
最低定量化可能濃度であろう。この実験を５日にわたって実施した。
タモキシフェン：０．５９ｎｇ／ｍＬ
Ｎ−デスメチルタモキシフェン：０．５９ｎｇ／ｍＬ
４’−ヒドロキシタモキシフェン：０．１ｎｇ／ｍＬ
Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェン：０．５ｎｇ／ｍＬ
４−ヒドロキシタモキシフェン：０．１ｎｇ／ｍＬ
Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）：０．１５ｎｇ
／ｍＬ

定量限界（ＬＯＱ）：ＬＯＱに関する合格基準は、変動係数 ２０％未満である最低濃度
として定義される。ＬＯＱを決定するために、中レベル標準物質を、１：２に段階的に希
釈した。
タモキシフェン：１．５ｎｇ／ｍＬ
Ｎ−デスメチルタモキシフェン：１．５ｎｇ／ｍＬ
４’−ヒドロキシタモキシフェン：０．４ｎｇ／ｍＬ
Ｎ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェン：０．４ｎｇ／ｍＬ
４−ヒドロキシタモキシフェン：０．２ｎｇ／ｍＬ
Ｎ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）：０．４ｎｇ／
ｍＬ

正確度
公知の標準物質の回収率：血清に分析物全てを特定濃度まで添加して、抽出した後、三重
反復で分析した。ミックスは全て、各分析物の線形および治療範囲を網羅するように添加
された。

干渉研究
合格基準：潜在的な干渉物質に起因する差は、許容可能であるとみなされるにはＴＥａ／
４以下であるべきである。

溶血干渉：低および高プールに、溶血したＲＢＣを、低、中および高濃度で添加した。試
料を四重反復で抽出した。溶血は、タモキシフェンまたは測定される代謝産物の干渉を示
さなかった。しかしながら、中および高溶血試料からの濾過の困難性に起因して、軽度に
溶血した試料のみが許容されるべきである。

脂質血症干渉：低および高プールに、脂質血症試料を、低、中および高濃度で添加した。
試料を四重反復で抽出した。脂質血症試料は、タモキシフェンまたは測定される代謝産物
の干渉を示さなかった。

ビリルビン干渉：低および高プールに、ビリルビンを、低、中および高濃度で添加した。
試料を四重反復で抽出した。ビリルビンを添加した試料は、タモキシフェンまたは測定さ
れる代謝産物の干渉を示さなかった。

ノルエンドキシフェンアッセイのバリデーション
この報告には、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるノルエンドキシフェンに関するバリデーション
の詳細な概要が含まれる。アッセイは、研究室で開発した試験である。

ノルエンドキシフェンを、タンパク質沈降、続く濾過を使用して血清から抽出する。次に
、分析および定量化をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより実施する。

研究室で開発した試験（ＬＤＴ）に関する精度研究
実行内精度：低、中および高対照（ｎｇ／ｍＬ）を１回の実行内で分析した（１０）。
ＱＣは全て、合格基準内に収まった（変動係数 ２０％未満）。

総精度：総精度は、バリデーションプロセス中のアッセイ全てに関するＱＣ実行全てに基
づいた。合格判定は、変動係数 ２０％未満に基づいた。ＱＣは全て、この判断基準内に
収まった。

検出限界（ＬＯＤ）：ノルエンドキシフェン＝１．２ｎｇ／ｍＬ

定量限界（ＬＯＱ）：ノルエンドキシフェン＝１．２ｎｇ／ｍＬ

正確度
公知の標準物質の回収率：血清に分析物全てを特定濃度まで添加して、抽出した後、四重
反復で分析した。ミックスは全て、各分析物の線形および治療範囲を網羅するように添加
された。

干渉研究
合格基準：潜在的な干渉物質に起因する差は、許容可能であるとみなされるにはＴＥａ／
４以下であるべきである。

溶血干渉：低および高プールに、溶血したＲＢＣを、低、中および高濃度で添加した。試
料を四重反復で抽出した。溶血は、ノルエンドキシフェンの干渉を示さなかった。しかし
ながら、中および高溶血試料からの濾過の困難性に起因して、軽度に溶血した試料のみが
許容されるべきである。

脂質血症干渉：低および高プールに、脂質血症試料を、低、中および高濃度で添加した。
試料を四重反復で抽出した。脂質血症試料は、ノルエンドキシフェンの干渉を示さなかっ
た。公知の標準物質の回収率：血清に分析物全てを特定濃度まで添加して、抽出した後、
四重反復で分析した。ミックスは全て、各分析物の線形および治療範囲を網羅するように
添加された。

ビリルビン干渉：低および高プールに、ビリルビンを、低、中および高濃度で添加した。
試料を四重反復で抽出した。ビリルビンを添加した試料は、ノルエンドキシフェンの干渉
を示さなかった。

臨床的定量化および応答研究
実施例１〜実施例３の標準的な操作プロトコールを使用して、患者試料中のタモキシフ
ェンおよびその代謝産物を定量化して、タモキシフェン応答に相関させた。

さらなる臨床的定量化および応答研究
実施例１〜実施例３の標準的な操作プロトコールを使用して、患者試料中のタモキシフ
ェンおよびその代謝産物を定量化して、タモキシフェン応答に相関させた。

本明細書中で言及または引用した論文、特許、特許出願および全ての他の文書および電
子的に利用可能な情報の内容は、それぞれの刊行物が、参照により組み込まれるように具
体的におよび個々に示されたかのように同程度にそれらの全体が参照により組み込まれる
。出願人らは、この出願に、任意のかかる論文、特許、特許出願、または他の物理的およ
び電子文書からのあらゆる材料および情報を物理的に組み込む権利を保有する。

本明細書中で例示的に記載する方法は、本明細書中で具体的に開示されない任意の要素
（単数または複数）、限定（単数または複数）の非存在下で適切に実施され得る。したが
って、例えば、「を含む」、「を包含する」、「を含有する」等の用語は、広く、かつ限
定なく解釈されるはずである。さらに、本明細書中で用いる用語および表現は、説明に用
語として使用されており、限定の用語としては使用されておらず、示され、また記載され
る特徴の任意の等価体またはそれらの一部を排除するかかる用語および表現の使用の意図
はなく、特許請求される本発明の範囲内で、様々な変更が可能であることが認識される。
したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意の特徴により具体的に開示されてき
たが、本明細書中に開示する具体化された本発明の変更および変動が当業者により行われ
てもよいこと、およびかかる変更および変動が、本発明の範囲内であるとみなされること
は理解されるべきである。

本発明は、本明細書中で広範に、かつ包括的に記載されてきた。包括的な開示内に収ま
るより狭い種および亜属分類それぞれもまた、該方法の一部を成す。これは、削除される
材料が本明細書中で具体的に列挙されても列挙されなくても、属から任意の主題を除去す
る条件または負の限定付きで該方法の包括的な説明を包含する。

他の実施形態は、下記特許請求の範囲内に存在する。さらに、該方法の特徴および態様
が、マーカッシュ群の用語で記載されており、本発明はまた、それによりマーカッシュ群
の任意の個々の成員または成員の亜群の用語で記載されることが、当業者に理解されよう
。

Claims (10)

1. 単回の質量分析アッセイにおいてヒト試料中のタモキシフェンおよびＮ−デスメチルタモキシフェンの量を決定する方法であって、
   （ａ）前記試料を液体クロマトグラフィーにより精製すること、
   （ｂ）前記タモキシフェンおよびＮ−デスメチルタモキシフェンをイオン化して、質量分析により検出可能な１つまたは複数のイオンを生じさせること、
   （ｃ）質量分析により工程（ｂ）からの前記イオンの量を検出することを含み、ここで検出される前記イオンの量が、前記試料中のタモキシフェンおよびＮ−デスメチルタモキシフェンの各量に関連し、
   タモキシフェンおよびＮ−デスメチルタモキシフェンについて１．５ｎｇ／ｍＬ以下の定量限界を有する、方法。
2. 工程（ａ）の前に、タンパク質沈降をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 工程（ａ）の前に、濾過をさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記液体クロマトグラフィーが、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である、請求項１に記載の方法。
5. 前記液体クロマトグラフィーが、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）である、請求項１に記載の方法。
6. 内部標準の量を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記イオン化が、ポジティブイオンモードである、請求項１に記載の方法。
8. 前記試料が、血清または血漿試料である、請求項１に記載の方法。
9. 前記質量分析が、タンデム質量分析である、請求項１に記載の方法。
10. ノルエンドキシフェン、エンドキシフェン、４’−ヒドロキシタモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、およびＮ−デスメチル−４’−ヒドロキシタモキシフェンからなる群から選択される代謝産物の量を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。