KR20220136376A - 올리고뉴클레오티드의 특성을 분석하기 위한 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석의 용도 - Google Patents

올리고뉴클레오티드의 특성을 분석하기 위한 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석의 용도 Download PDF

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리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

본 개시는 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석을 사용하여 관심 올리고뉴클레오티드의 샘플을 특성화하는 방법을 제공한다.

Description

올리고뉴클레오티드의 특성을 분석하기 위한 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석의 용도
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2020년 1월 31일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/968,368호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
기술 분야
본 개시는 분자 생물학 및 치료제 분야에 관한 것이다.
참조에 의한 서열 목록의 통합
본원에 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 포맷 사본(파일명: REGE-020-001WO_SeqList_ST25.txt, 기록일: 2021년 1월 13일, 파일 크기 6킬로바이트).
안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이중 가닥 RNA(dsRNA)와 같은 치료 올리고뉴클레오티드는 대략 지난 30년에 걸쳐 임상 개발 중에 있다. 최근, 다수의 치료 올리고뉴클레오티드가 환자에게 투여되도록 미 식약청에 의해 승인되었다. 그러나, 치료 올리고뉴클레오티드를 포함하는 활성 약학적 성분(API) 및 완제의약품이 대상체에게 투여하기에 적합하기 위해서는 특정 품질 임계값을 반드시 충족해야 한다. 따라서, 당업계에는 올리고뉴클레오티드 조성물을 특성화하는 방법이 필요하다. 본 개시는 올리고뉴클레오티드 조성물을 높은 수준의 민감도 및 정밀도로 특성화하기 위한 추가적인 방법을 제공한다.
본 개시는 관심 올리고뉴클레오티드 집단을 포함하는 샘플을 특성화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 동일한 서열의 관심 올리고뉴클레오티드 집단을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 시료를 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석으로 처리하여, 관심 올리고뉴클레오티드의 집단에 상응하는 적어도 하나의 질량 분광분석도를 생성하는 단계; 및 (c) 관심 올리고뉴클레오티드의 집단에 상응하는 샘플 내 총 올리고뉴클레오티드의 백분율을 결정하는 단계를 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 샘플은 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 추가 집단을 포함하는 적어도 하나의 불순물을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 추가 집단은 관심 올리고뉴클레오티드의 단편화 산물 또는 합성 부산물을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 상기 방법은 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 추가 집단에 상응하는 질량 분광분석도를 생성하는 단계, 및 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 추가 집단에 상응하는 샘플 내 총 올리고뉴클레오티드의 백분율을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 또는 DNA-RNA 하이브리드이다. 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 헤어핀 또는 줄기-루프 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 15개 내지 100개 뉴클레오티드의 길이이다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 치료 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 치료 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), dsRNA, siRNA, 앱타머, 또는 마이크로RNA를 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 관심 올리고뉴클레오티드의 5’ 말단, 3’ 말단, 또는 둘 다에 존재한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 내부 핵염기에 대한 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 관심 올리고뉴클레오티드의 결합 친화도, 결합 특이성, 안정성, 약동학, 또는 독성에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 잠금 핵산(LNA), 포스포로티오에이트(PS) 결합, 말단 5’ 또는 3’ 포스페이트(PO), 5’ 메틸(5-Me) 변형, 2’-O-메틸(2’-O-Me) 변형, 2’-O-메톡시에틸(2’-MOE) 변형, 구속된 에틸(cET) 뉴클레오시드 유사체, 폴리에틸렌 조합(PEG), 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)를 포함한다. 일부 구현예에서, HILIC는 아세트산암모늄을 포함하는 이동상 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상은 70% 아세토니트릴(ACN) 중 15 mM 아세트산암모늄을 포함하는 제1 완충제 및 30% ACN 중 15 mM 아세트산암모늄을 포함하는 제2 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, HILIC는 포름산암모늄을 포함하는 이동상 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상은 70% 아세토니트릴(ACN) 중 15 mM 포름산암모늄을 포함하는 제1 완충제 및 30% ACN 중 15 mM 포름산암모늄을 포함하는 제2 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, HILIC 분리는 23℃ 내지 50℃의 컬럼 온도를 포함한다. 일부 구현예에서, HILIC 분리는 30℃의 컬럼 온도를 포함한다. 일부 구현예에서, HILIC는 3 μm의 평균 명목 입자 크기, 200 Å의 입자 기공 크기 중앙값, 2 mm의 내경, 150 mm의 컬럼 길이를 갖는 고상 컬럼을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 이온쌍 형성 역상 액체 크로마토그래피(IP-RPLC)를 포함한다. 일부 구현예에서, IP-RPLC는 헥사플루오로이소프로판올(HFIP) 및 5 mM N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA)을 포함하는 이동상 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상은 물 중 50 mM HFIP 및 5 mM DIEA를 포함하는 제1 완충제 및 아세토니트릴 중 50 mM HFIP 및 5 mM DIEA를 포함하는 제2 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, IP-RPLC는 1.7 μm의 평균 명목 입자 크기, 130 Å의 입자 기공 크기 중앙값, 100 mm의 컬럼 길이, 및 2.1 mm의 내경을 갖는 컬럼을 포함한다. 일부 구현예에서, IP-RPLC는 1.7 μm, Oligo-XT 100 Å, 50 x 2.1 mm 컬럼을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 질량 분광분석은 전기분무 이온화(ESI)를 포함한다. 일부 구현예에서, ESI는 나노-플로우 ESI를 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 샘플의 자외선(UV) 검출을 추가로 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 질량 분광분석은 탠덤 질량 분광분석(MS/MS)이다. 일부 구현예에서, MS/MS는 데이터 의존적 수집(DDA)을 포함한다. 일부 구현예에서, MS/MS는 관심 올리고뉴클레오티드의 집단, 올리고뉴클레오티드의 적어도 추가 집단, 또는 이들의 조합의 단편화를 포함한다. 일부 구현예에서, 단편화는 고에너지 충돌 해리(HCD)를 포함한다. 일부 구현예에서, HCD는 15% 내지 35%의 정규화된 충돌 에너지(NCE)를 포함한다. 일부 구현예에서, HCD는 20%의 NCE를 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 단계 (c)는 관심 올리고뉴클레오티드의 온전한 질량을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 추가 집단의 온전한 질량을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 질량 분광분석을 사용하여 관심 올리고뉴클레오티드의 구조를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 추가 집단의 구조를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 구조는 뉴클레오티드 서열, 변형, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 개시는 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: (a) 관심 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계; 및 (b) 본 개시의 방법을 사용하여 관심 올리고뉴클레오티드를 특성화하는 단계를 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 조성물 중 총 올리고뉴클레오티드의 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 98.5%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9%는 관심 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시는 본원에 기술된 방법을 사용하여 제조되거나 특성화된 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 치료를 필요로 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
제46항에 있어서, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
제46항에 있어서, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 조성물.
본 개시는 샘플을 특성화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: (a) 동일한 서열 및/또는 변형을 갖는 관심 올리고뉴클레오티드 집단을 포함하는 샘플, 및 올리고뉴클레오티드의 추가 집단을 포함하는 적어도 하나의 불순물을 제공하는 단계; (b) 샘플을 액체 크로마토그래피 및 탠덤 질량 분광분석(MS/MS)으로 처리하여 관심 올리고뉴클레오티드의 집단 및 올리고뉴클레오티드의 추가 집단에 상응하는 적어도 하나의 질량 분광분석도를 생성하는 단계로서, 액체 크로마토그래피는 (i) 제1 완충제가 70% 아세토니트릴(ACN) 중 15 mM 포름산암모늄 또는 아세트산암모늄을 포함하고 제2 완충제가 30% ACN 중 15 mM 포름산암모늄 또는 아세트산암모늄을 포함하는 이동상을 포함하는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC), 또는 (ii) 제1 완충제가 물 중 50 mM 헥사플루오로이소프로판올(HFIP) 및 5 mM N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA)을 포함하고 제2 완충제가 아세토니트릴 중 50 mM HFIP 및 5 mM DIEA를 포함하는 이온쌍 형성 역상 액체 크로마토그래피(IP-RPLC)를 포함하고; MS/MS는 15% 내지 35%의 정규화된 충돌 에너지(NCE)를 포함하는 고에너지 충돌 해리(HCD)를 사용하여 샘플 중 관심 올리고뉴클레오티드의 집단 및 올리고뉴클레오티드의 추가 집단의 단편화를 포함하는, 단계; 및 (c) 관심 올리고뉴클레오티드의 집단에 상응하는 샘플 내 총 올리고뉴클레오티드의 백분율을 결정하는 단계를 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 추가 집단은 관심 올리고뉴클레오티드의 단편화 산물 또는 합성 부산물을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 또는 DNA-RNA 하이브리드이다. 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 헤어핀 또는 줄기-루프 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 15개 내지 100개 뉴클레오티드의 길이이다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 치료 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 치료 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), dsRNA, siRNA, 앱타머, 또는 마이크로RNA를 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 관심 올리고뉴클레오티드의 5’ 말단, 3’ 말단, 또는 둘 다에 존재한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 내부 핵염기에 대한 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 관심 올리고뉴클레오티드의 결합 친화도, 결합 특이성, 안정성, 약동학, 또는 독성에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 잠금 핵산(LNA), 포스포로티오에이트(PS) 결합, 말단 5’ 또는 3’ 인산염(PO), 5’ 메틸(5-Me) 변형, 2’-O-메틸(2’-O-Me) 변형, 2’-O-메톡시에틸(2’-MOE) 변형, 구속된 에틸(cET) 뉴클레오시드 유사체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, HILIC 크로마토그래피는 30℃의 컬럼 온도를 포함한다. 일부 구현예에서, HILIC 크로마토그래피는 3 μm의 평균 명목 입자 크기, 200 Å의 입자 기공 크기 중앙값, 2 mm의 내경, 150 mm의 컬럼 길이를 갖는 고상 컬럼을 포함한다. 일부 구현예에서, IP-RPLC는 1.7 μm, Oligo-XT 100 Å, 50 x 2.1 mm 컬럼을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, MS/MS는 전기분무 이온화(ESI)를 포함한다. 일부 구현예에서, ESI는 나노-플로우 ESI를 포함한다. 일부 구현예에서, MS/MS는 데이터 의존적 수집(DDA)을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 샘플의 자외선(UV) 검출을 추가로 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 단계 (c)는 관심 올리고뉴클레오티드의 온전한 질량 및/또는 관심 올리고뉴클레오티드의 집단 및 올리고뉴클레오티드의 추가 집단의 구조를 결정하는 단계를 포함한다.
본 개시는 치료를 필요로 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 상기 방법은 본 개시의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시는 치료를 필요로 대상체를 치료하는 방법을 위한 의약을 제조하는 데 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 상기 방법은 본 개시의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 Phenomenex Luna-HILIC 컬럼과 아세트산암모늄을 이동상으로 사용해 포스포로티오에이트(PS) 변형된 올리고뉴클레오티드 및 미변형 올리고뉴클레오티드의 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피 및 자외선 검출(HILIC-UV)을 보여주는 일련의 크로마토그램이다.
도 2a는 상단에서 하단 방향으로, HILIC-UV 검출을 사용해 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(ODN) 오블리머센, 포스포로티오에이트 ODN 포르미비르센, 올리고 CMV-F, 올리고 M13-R, 올리고 SP6, 올리고 TRC-F, 올리고 T3, 및 올리고 T7을 보여주는 일련의 크로마토그램이다. MPA: 70% ACN 중 15 mM 아세트산암모늄; MPB: 30% ACN 중 15 mM 아세트산암모늄.
도 2b는 상단에서 하단 방향으로, HILIC-UV 검출을 사용해 포스포로티오에이트 ODN 오블리머센, 포스포로티오에이트 ODN 포르미비르센, 올리고 CMV-F, 올리고 M13-R, 올리고 SP6, 올리고 TRC-F, 올리고 T3, 및 올리고 T7을 보여주는 일련의 크로마토그램이다. MPA: 70% ACN 중 15 mM 포름산암모늄; MPB: 30% ACN 중 15 mM 포름산암모늄.
도 3a는 미변형 올리고 CMV-F 및 15 mM 아세트산암모늄 완충제 시스템을 사용하여 50℃, 40℃, 30℃, 및 23℃(좌측에서 우측으로 주요 피크가 정렬됨)에서 HILIC-UV 시스템의 분석 성능을 비교한 크로마토그램이다.
도 3b는 미변형 PS-올리고 오블리머센 및 15 mM 아세트산암모늄 완충제 시스템을 사용하여 50℃, 40℃, 30℃, 및 23℃(좌측에서 우측으로 주요 피크가 정렬됨)에서 HILIC-UV 시스템의 분석 성능을 비교한 크로마토그램이다.
도 4는 Waters Acquity Oligonucleotide BEH 컬럼을 이용한 PS-변형 올리고뉴클레오티드 및 미변형 올리고뉴클레오티드의 이온쌍 형성 역상 액체 크로마토그래피 및 자외선(IP-RPLC-UV) 검출을 보여주는 일련의 크로마토그램이다. 올리고뉴클레오티드는 위에서 아래로 다음과 같다: 포스포로티오에이트 ODN 포르미비르센 및 오블리머센, 올리고 CMV-F, M13-R, 올리고 SP6, 올리고 TRC-F, 올리고 T3, 및 올리고 T7.
도 5는 Waters Acquity UPLC 올리고뉴클레오티드 BEH C18 컬럼, 130Å, 1.7 μm, 2.1 mm x 100 mm를 이용해 20 pmol MasPrep OST 표준 올리고의 이온쌍 형성 역상 액체 크로마토그래피 및 UV 검출(IP-RPLC-UV) 분리를 보여주는 크로마토그램이다.
도 6은 Clarity 1.7 μm 올리고-XT 100 Å, LC 컬럼, 2.1 mm x 50 mm를 이용해 20 pmol MassPrep OST 표준 올리고의 IP-RPLC-UV 분리를 보여주는 크로마토그램이다.
도 7은 HILIC-DDA(친수성 상호작용 액체 크로마토그래피 및 데이터 의존적 수집 모드의 탠덤 질량 분광분석기)로 분석한 M13-R 올리고뉴클레오티드 샘플의 m/z(질량 대 전하) 비율(x축) 대 상대 풍부도(y축)를 나타내는 질량 스펙트럼이다. HILIC 이동상을 포름산암모늄, pH 약 3.2로 완충시켰다.
도 8은 HILIC-DDA로 분석한 M13-R 올리고뉴클레오티드(서열 번호 1) 샘플의 상대 존재비(y-축)에 대한 m/z 비율(x-축)을 보여주는 질량 스펙트럼이다. HILIC 이동상을 아세트산암모늄, pH 약 5.8로 완충시켰다.
도 9는 IPRP-LC-DDA(이온쌍 형성 역상 액체 크로마토그래피 및 데이터 의존적 수집 모드의 탠덤 질량 분광분석기)로 분석한 서열번호 1의 M13-R 올리고뉴클레오티드 샘플의 m/z 비율(x축) 대 상대 풍부도(y축)를 보여주는 플롯이다. IPRP 이동상은 10 초과의 pH를 갖는 DIEA(N,N-디이소프로필에틸아민)를 포함하였다.
도 10a는 M13-R 올리고뉴클레오티드 샘플의 질량 대 강도를 보여주는 플롯이다. 삽입된 표는 전장 M13-R의 이론상 질량과 관찰된 질량, 및 질량 오차를 백만분율(ppm) 단위로 제공한다.
도 10b는 전장 M13-R(기준) 및 뉴클레오티드 4~17에서 절단된 M13-R의 상대 풍부도를 보여주는 표이다. 절단 불순물의 상대 풍부도는 온전한 질량 분석에 의해 계산하였다. 샘플은 0.09% 4~17 뉴클레오티드 절단 산물 및 99.91% 기준 M13-R이었다.
도 11a는 CMV-F 올리고뉴클레오티드 샘플의 질량 대 강도를 보여주는 플롯이다. 삽입된 표는 전장 CMV-F의 이론상 질량과 관찰된 질량, 및 질량 오차를 ppm 단위로 제공한다.
도 11b는 전장 CMV-F(CMV-F 기준) 및 뉴클레오티드 5~21 및 1~19에서 절단된 CMV-F의 상대 풍부도를 보여주는 표이다. 절단 불순물의 상대 풍부도는 온전한 질량 분석에 의해 계산하였다. 샘플은 1.19% 5~21 뉴클레오티드 절단 산물, 7.49% 1~19 뉴클레오티드 절단 산물, 및 91.31% 기준이었다.
도 12a는 포스포로티오에이트(PS) 변형된 올리고뉴클레오티드 포르미비르센 샘플의 질량 대 강도를 보여주는 플롯이다. 삽입된 표는 전장 포르미비르센의 이론상 질량과 관찰된 질량, 및 질량 오차를 ppm 단위로 제공한다.
도 12b는 전장 포르미비르센(프로미비르센 기준) 및 뉴클레오티드 6~21, 4~21, 및 1~15에서 절단된 포르미비르센의 상대 풍부도를 보여주는 표이다. 절단 불순물의 상대 풍부도는 온전한 질량 분석에 의해 계산하였다. 샘플은 2.22% 6~21 뉴클레오티드 절단 산물, 0.50% 4~21 뉴클레오티드 절단 산물, 1.43% 1~15 뉴클레오티드 절단 산물, 및 95.86% 기준이었다.
도 13은 올리고뉴클레오티드의 탠덤 질량 분광분석(MS/MS) 단편화 체계를 보여주는 도면이다.
도 14a는 2개의 대표적인 올리고뉴클레오티드 M13-R 및 TRC-F(각각 좌측 및 우측 패널)를 이용한 HILIC-MS/MS(탠덤 질량 분광분석)에 대한 상이한 고에너지 충돌 해리(HCD) 충돌 에너지에 대한 피크 면적(y축)을 보여주는 한 쌍의 플롯이다.
도 14b는 대표적인 올리고뉴클레오티드 TRC-F의 m/z (x축) 및 상대 풍부도를 보여주는 대표적인 HILIC-MS/MS 플롯이다.
도 15는 20의 HCD로 올리고뉴클레오티드 T7의 [M-4H]4-(m/z 1530.2549) 전구체를 단편화한 것을 보여주는 플롯이다.
도 16은 올리고 CMV-F의 나노-플로우 IPRP-LC-MS/MS에 의해 개선된 단편화 효율이 달성됨을 보여주는 한 쌍의 플롯이다.
도 17은 올리고 CMV-F의 나노-플로우 IPRP-LC-MS/MS에 의해 개선된 단편화 효율이 달성됨을 보여주는 한 쌍의 플롯이다.
도 18은 20의 HCD로 올리고 T7의 [M-8H]8-(m/z 898.0009) 전구체를 단편화한 것을 보여주는 플롯이다. 도 18에서의 올리고 서열은 T7 서열(서열번호 3)이다.
도 19a~19c는 포스포로티오에이트(PS) 올리고뉴클레오티드 변형에 기초한 단편 이온의 변환을 보여준다. 도 19c에서, 미변형 오블리머센 단편 및 변형된 오블리머센 단편의 전하 상태 및 상응하는 질량이 도시되어 있다.
도 20은 20의 HCD로 PS-변형된 올리고뉴클레오티드 오블리머센의 [M-4H]4-(m/z 1419.8799) 전구체를 단편화한 것을 보여주는 플롯이다.
본 발명자들은, 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 포함하여, 올리고뉴클레오티드 조성물이 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석을 사용하여 높은 정확도로 특성화될 수 있음을 발견하였다. 올리고뉴클레오티드 조성물은 보관 조건에 의해 도입되는 전장 올리고뉴클레오티드의 분해 산물 또는 올리고뉴클레오티드 합성으로부터 유래되고 변형 또는 뉴클레오티드 서열에서의 오류를 갖는 추가 생성물 등과 같은 불순물을 함유할 수 있다. 본원에 기술된 방법은 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드 조성물 중 이들 불순물의 동일성 및 풍부도를 결정하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 본 개시는 관심 올리고뉴클레오티드 집단을 포함하는 샘플을 특성화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: (a) 동일한 서열의 관심 올리고뉴클레오티드 집단을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; (b) 샘플을 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석으로 처리하여 관심 올리고뉴클레오티드에 상응하는 적어도 하나의 질량 분광분석도를 생성하는 단계; 및 (c) 관심 올리고뉴클레오티드 집단에 상응하는 샘플 내 총 올리고뉴클레오티드의 백분율을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플은 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 추가 집단을 포함하는 적어도 하나의 불순물을 추가로 포함하며, 이러한 추가 집단 또한 본원에 기술된 방법을 사용하여 분석된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 불순물에 상응하는 질량 분광분석도를 생성하는 단계, 및 적어도 하나의 불순물에 상응하는 샘플 내 총 올리고뉴클레오티드의 백분율을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플을 특성화하는 방법은: (a) 동일한 서열의 관심 올리고뉴클레오티드 집단 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플을 제공하는 단계로서, 불순물은 관심 올리고뉴클레오티드와 서열이 상이한 올리고뉴클레오티드의 추가 집단을 포함하는, 단계; (b) 샘플을 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석으로 처리하여 적어도 하나의 질량 분광분석도를 생성하는 단계; 및 (c) 관심 올리고뉴클레오티드 집단에 상응하는 샘플 내 총 올리고뉴클레오티드의 백분율을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 추가 집단은 관심 올리고뉴클레오티드의 단편화 산물 또는 합성 부산물 중 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (c)는 관심 올리고뉴클레오티드의 온전한 질량, 및 임의로 적어도 하나의 불순물에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드 집단에 상응하는 샘플 내 총 올리고뉴클레오티드의 백분율을 결정하는 단계는 질량 분광분석을 사용하여 관심 올리고뉴클레오티드의 구조 및 임의로 적어도 하나의 불순물에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 구조는 뉴클레오티드 서열, 변형, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 개시는 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 (a) 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용해 관심 올리고뉴클레오티드를 합성하여 관심 올리고뉴클레오티드 집단을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 및 (b) 본원에 기술된 방법을 사용해 관심 올리고뉴클레오티드 집단을 포함하는 샘플을 특성화하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기술된 방법에 의해 결정했을 때, 원하는 특성을 갖는 관심 올리고뉴클레오티드 집단을 포함하는 샘플을 선택하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 원하는 순도의 관심 올리고뉴클레오티드를 갖는 샘플을 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
본 개시는 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물, 및 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위해 상기 약학적 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
정의
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오티드", "올리고", "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", 및 "핵산"은 상호 교환적으로 사용되고, cDNA, 게놈 DNA, mRNA, 및 합성(예를 들어, 화학적으로 합성된) DNA 또는 RNA, 및 RNA 및 DNA의 키메라 또는 모방체를 포함하는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함한다. 상기 용어는 뉴클레오티드의 사슬을 지칭하되, 사슬의 길이는 무관하다. 핵산은 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 단일 가닥인 경우, 핵산은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 본 발명은 본 개시의 핵산, 뉴클레오티드 서열, 또는 폴리뉴클레오티드의 보체(전체 보체 또는 부분 보체일 수 있음)인 핵산을 추가로 제공한다.
이들 용어는 또한, 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 표준 인산디에스테르 결합 또는 다른 결합에 의해 공유 연결된 질소 헤테로시클릭 염기 또는 염기 유사체를 갖는 것들을 포함한다. 핵산에서, 백본은 당-인산디에스테르 결합, 펩티드-핵산(PNA) 결합(PCT 제WO 95/32305호), 포스포로티오에이트 결합, 메틸포스포네이트 결합, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 다양한 결합으로 이루어질 수 있다. 핵산 내 당 모이어티는 2’ 메톡시 및 2’ 할라이드(예: 2’-F) 치환과 같은 치환을 가진 리보오스, 데옥시리보오스, 또는 유사한 화합물일 수 있다. 질소 염기는 종래의 염기(A, G, C, T, U), 이의 유사체(예를 들어, 이노신; Adams (ed.) 등의 문헌[The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, 11th ed., 1992]), 퓨린 또는 피리미딘 염기(예를 들어, N4-메틸 데옥시가우노신, 데아자-퓨린 또는 아자-퓨린, 데아자-피리미딘 또는 아자-피리미딘, 다양한 화학적 위치 중 어느 하나에서 변경된 치환기 또는 대체 치환기를 갖는 피리미딘 또는 퓨린(예: 2-아미노-6-메틸아미노퓨린, O6-메틸구아닌, 4-티오-피리미딘, 4-아미노-피리미딘, 4-디메틸하이드라진-피리미딘, 및 O4-알킬-피리미딘), 또는 피라졸로 화합물, 예컨대 치환되지 않았거나 3-치환된 피라졸로[3,4-d]피리미딘(예를 들어 미국 특허 제5,378,825호, 제6,949,367호, 및 PCT 제WO 93/13121호 참조)일 수 있다. 핵산은, 백본이 하나 이상의 위치에서 질소 염기를 갖지 않는 "비염기성(abasic)" 위치를 포함할 수 있고(미국 특허 제5,585,481호), 예를 들어 하나 이상의 비염기성 위치는 별도의 올리고뉴클레오티드 서열을 함께 결합시키는 링커 영역을 형성할 수 있다. 핵산은 종래의 RNA 및 DNA에서 발견되는 것과 같은 종래의 당, 염기, 및 결합만을 포함하거나, 종래의 성분 및 치환(예를 들어 2’ 메톡시 백본에 의해 연결된 종래의 염기, 또는 종래의 염기와 하나 이상의 유사체의 혼합물을 함유하는 중합체)을 포함할 수 있다.
"올리고뉴클레오티드"는 임의의 길이의 핵산 중합체를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 1,000개 미만의 뉴클레오티드(nt)로 이루어지며, 길이가 약 5~200개 범위의 뉴클레오티드인 것들, 약 2 내지 5 nt의 하한 및 약 500 내지 900 nt의 상한을 갖는 것들, 또는 5 내지 15 nt의 하한 및 50 내지 500 nt의 상한을 갖는 것들, 또는 10 내지 20 nt의 하한 및 25 내지 150 nt의 상한을 갖는 것들을 포함한다.
"단리된 올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 서열이 유래되는 유기체의 자연 발생 게놈에서 바로 인접하는 뉴클레오티드 서열(5’ 말단에서 인접하는 서열 3’ 말단에서 인접하는 서열)과 바로 인접하지 않는 뉴클레오티드 서열(예: DNA 또는 RNA)을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는, 예를 들어 벡터 내에 통합되거나 다른 서열과는 독립적으로 별도의 분자(예를 들어 화학적 합성에 의해 생산된 올리고뉴클레오티드)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 이는 추가 폴리펩티드 또는 펩티드 서열을 암호화하는 하이브리드 핵산의 일부인 재조합 DNA도 포함한다. "단리된"은 제제가 기술적으로 순수한(균질한) 것을 의미하는 것이 아니라, 의도된 목적에 맞게 사용될 수 있는 형태로 핵산을 제공하기에 충분히 순수하다는 것을 의미한다.
올리고뉴클레오티드에 적용될 때의 용어 "단편"은 기준 핵산 또는 뉴클레오티드 서열에 비해 감소된 길이를 갖고, 기준 핵산 또는 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 거의 동일한(예를 들어, 90%, 92%, 95%, 98%, 99% 동일한) 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나, 본질적으로 이로 이루어지고/지거나, 이로 이루어지는 뉴클레오티드 서열을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 발명에 따른 이러한 핵산 단편은, 적절한 경우, 핵산 단편이 구성성분인 더 큰 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 단편은 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200개 이상의 연속 뉴클레오티드의 길이를 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하고/하거나, 본질적으로 이로 이루어지고/지거나, 이로 이루어질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자"는 mRNA, 안티센스 RNA, miRNA 등을 생산하는 데 사용될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 유전자는 기능성 단백질을 생산하는 데 사용될 수 있거나 사용되지 못할 수 있다. 유전자는 코딩 영역과 비-코딩 영역(예를 들어, 인트론, 조절 요소, 프로모터, 인핸서, 종결 서열, 및 5’ 및 3’ 미번역 영역) 둘 다를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "전령 RNA" 또는 "mRNA"는 유전자의 유전자 서열에 상응하는 RNA의 단일-가닥 분자를 지칭하며, 단백질을 합성하는 과정에서 리보솜에 의해 판독된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "상보적" 올리고뉴클레오티드는 표준 왓슨-크릭 상보성 규칙에 따라 염기쌍 형성이 가능한 것들이다. 구체적으로, 퓨린은 피리미딘과 염기쌍을 이루어, DNA의 경우 시토신과 쌍을 이룬 구아닌(G:C) 및 티민과 쌍을 이룬 아데닌(A:T)의 조합을 형성하거나, RNA의 경우 우라실과 쌍을 이룬 아데닌(A:U)의 조합을 형성하게 된다. 예를 들어, 서열 "A-G-T"는 상보적 서열 "T-C-A"에 결합한다. 2개의 올리고뉴클레오티드는, 각각이 서로에 대해 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 영역을 갖는 경우, 이들 각각이 서로에 대해 완전히 상보적이지 않더라도 서로 혼성화될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "상보적(complementary)" 또는 "상보성(complementarity)"은 허용 가능한 염 조건 및 온도 조건 하에서 올리고뉴클레오티드가 염기쌍 형성에 의해 자연적으로 결합하는 것을 지칭한다. 2개의 단일 가닥 분자 간의 상보성은, 뉴클레오티드의 일부만이 결합하는 "부분적" 상보성이거나, 단일 가닥 분자 사이에 총 상보성이 존재할 때 완전한 상보성일 수 있다. 핵산 가닥 간의 상보성의 정도는 핵산 가닥 간의 혼성화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 상보적인" 또는 "부분적으로 상보적인"은 2개의 핵산 서열이 이들의 뉴클레오티드의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%와 상보적인 것을 의미한다. 용어 "실질적으로 상보적인" 및 "부분적으로 상보적인"은 또한 2개의 핵산 서열이 당업계에 잘 알려져 있는 높은 엄중도 조건 하에서 혼성화될 수 있음을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "서열 동일성"은, 최적으로 정렬된 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 성분(예를 들어, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 정렬 윈도우 전체에 걸쳐 불변인 정도를 지칭한다. "동일성"은 다음에 기술된 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); and Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991).
비교 윈도우를 정렬하기 위한 최적의 서열 정렬은 당업자에게 잘 알려져 있다. 서열 동일성 백분율은 동일성 분율에 100을 곱한 값으로 표시된다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열의 비교는 전장 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부분에 대한 것, 또는 더 긴 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 것일 수 있다. 예를 들어, 동일성 백분율은 번역된 뉴클레오티드 서열의 경우 BLASTX 버전 2.0을 사용하고 폴리뉴클레오티드 서열의 경우 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정할 수 있다. 서열 동일성을 결정하기 위한 유용한 방법은 Martin J. Bishop(ed.)의 문헌[Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego (1994)], 및 Carillo, H. 및 Lipton, D.의 문헌[Applied Math 48:1073(1988)]에도 개시되어 있다. 서열 동일성을 결정하기 위한 컴퓨터 프로그램은 미국 국립 의학 도서관(Bethesda, Md. 20894)에 있는 National Center Biotechnology Information(NCBI)로부터 공개적으로 이용 가능한 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) 프로그램을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다; 참조 - BLAST Manual, Altschul 등의 NCBI, NLM, NIH; (Altschul 등의 문헌[J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]); 버전 2.0 이상의 BLAST 프로그램은 갭(결실 및 삽입)을 정렬에 도입할 수 있게 하며; 펩티드 서열의 경우, BLASTX를 사용해 서열 동일성을 결정할 수 있고; 폴리뉴클레오티드 서열의 경우, BLASTN을 사용하여 서열 동일성을 결정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "서열 동일성 백분율" 또는 "동일성 백분율"은 2개의 서열이 (적절한 뉴클레오티드 삽입, 결실, 또는 갭과 함께) 최적으로 정렬될 때, 시험("대상") 폴리뉴클레오티드 분자(또는 이의 상보적 가닥)와 비교했을 때 기준("쿼리") 폴리뉴클레오티드 분자(또는 이의 상보적 가닥)의 선형 폴리뉴클레오티드 서열에서 동일한 뉴클레오티드의 백분율을 지칭한다. 일부 구현예에서, "동일성 백분율"은 아미노산 서열에서 동일한 아미노산의 백분율을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한" 또는 "상응하는"은 2개의 핵산 서열이 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%의 서열 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 2개의 핵산 서열은 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로서 통합되도록 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로서 통합된다.
관심 올리고뉴클레오티드
본 개시는 본원에 기술된 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석 방법을 사용하여 특성화된 관심 올리고뉴클레오티드 및 관심 올리고뉴클레오티드 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 관심 올리고뉴클레오티드를 특성화하는 것은 특히, 관심 뉴클레오티드의 온전한 질량, 구조, 및 서열, 및 조성물 중 총 올리고뉴클레오티드, 즉 관심 올리고뉴클레오티드의 백분율을 결정하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 치료 올리고뉴클레오티드이다. 치료 올리고뉴클레오티드는, 전령 RNA(mRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 예컨대, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 및 마이크로RNA를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 치료 올리고뉴클레오티드는 대상체에게 투여되어 표적 유전자의 발현을 조절함으로써, 대상체의 질환 또는 장애를 치료한다. 대상체는 랫트, 마우스, 영장류, 및 인간과 같은 포유동물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 세포에서 세포 효소 RNase H에 대한 기질로서 mRNA를 표적화하여, 표적화된 mRNA의 특이적 분해를 유발하는 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 DNA 분자를 포함한다. 이론에 구속되고자 함이 없이, 이러한 단일 가닥 DNA 분자는 표적 RNA에 혼성화되어 DNA/RNA 혼성체의 RNase H 절단을 유도하는 것으로 여겨진다. 포스포디에스테르-연결 DNA 및 포스포로티오에이트-연결 DNA 모두는 내인성 RNase H를 활성화시켜 표적화된 RNA를 절단할 수 있다. 대안적으로, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 입체 장애를 통해, 즉 표적 mRNA의 번역 또는 스플라이싱을 물리적으로 차단함으로써 작용할 수 있다.
본 개시의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA(예를 들어, 표적 유전자에 의해 생산된 mRNA 또는 비암호화 RNA)의 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5 내지 50개의 뉴클레오티드 길이, 8 내지 50개의 뉴클레오티드 길이, 10 내지 40개의 뉴클레오티드 길이, 15 내지 40개의 뉴클레오티드 길이, 20 내지 30개의 뉴클레오티드 길이, 또는 18 내지 30개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 치료 올리고뉴클레오티드는 dsRNA 또는 siRNA이다. RNA 간섭(RNAi)은 이중-가닥 RNA(dsRNA)를 사용해 유전자 발현을 침묵화시키는 공정이다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, RNAi는 RNaseIII-유사 효소인 다이서(dicer)에 의해 긴 dsRNA를 짧은 간섭 RNA(siRNA)로 절단하는 것으로 시작된다. siRNA는 일반적으로 약 19 내지 28개의 뉴클레오티드, 또는 20 내지 25개의 뉴클레오티드, 또는 21 내지 22개의 뉴클레오티드 길이인 dsRNA이며, 종종 2-뉴클레오티드 3’ 오버행, 및 5’ 인산염 말단 및 3’ 하이드록실 말단을 함유한다. siRNA의 하나의 가닥은 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)로서 알려진 리보핵산단백질 복합체에 통합된다. RISC는 이러한 siRNA 가닥을 사용하여 통합된 siRNA 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 mRNA 분자를 식별한 다음, 이들 표적 mRNA를 절단하거나 이들의 번역을 억제한다. 따라서, RISC에 통합된 siRNA 가닥은 가이드 가닥 또는 안티센스 가닥으로서 알려져 있다. 패신저 가닥 또는 센스 가닥으로서 알려진 다른 하나의 siRNA 가닥은 siRNA로부터 제거되며, 표적 mRNA와 적어도 부분적으로 상동이다. 당업자는, 원칙적으로, siRNA의 가닥 중 어느 하나가 RISC에 통합되어 가이드 가닥으로서 기능할 수 있음을 인식할 것이다. 그러나, siRNA 설계(예: 안티센스 가닥의 5’ 말단에서 siRNA 이중가닥 안정성 감소)는 안티센스 가닥을 RISC에 혼입시키는 데 유리할 수 있다.
가이드 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA의 RISC-매개 절단은 해당 mRNA 및 이러한 mRNA에 의해 암호화된 상응하는 단백질의 정태 수준 감소로 이어진다. 대안적으로, RISC는 번역 억제를 통해 표적 mRNA를 절단하지 않고도 상응하는 단백질의 발현을 감소시킬 수도 있다. 다른 RNA 분자 및 RNA-유사 분자는 RISC와 상호 작용하여 유전자 발현을 침묵시킬 수도 있다. RISC와 상호작용할 수 있는 다른 RNA 분자의 예는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 단일-가닥 siRNA, 마이크로RNA(miRNA), 및 다이서-기질 27-량체 이중가닥을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "siRNA"는 달리 명시되지 않는 한 이중-가닥 간섭 RNA를 지칭한다. RISC와 상호작용할 수 있는 RNA-유사 분자의 예는 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드, 및/또는 하나 이상의 비-포스포디에스테르 결합을 함유하는 RNA 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 올리고뉴클레오티드는 siRNA 또는 dsRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA 또는 dsRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 가지며, 센스 및 안티센스 가닥은 적어도 19개의 뉴클레오티드로 이루어진 적어도 완벽에 가까운 연속 상보성 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA 또는 dsRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 가지며, 안티센스 가닥은 유전자 내 표적 서열에 대해, 적어도 19개의 뉴클레오티드로 이루어진 적어도 완벽에 가까운 연속 상보성의 영역을 포함하고, 센스 가닥은 유전자의 표적 서열에 대해, 적어도 19개의 뉴클레오티드로 이루어진 적어도 완벽에 가까운 연속 동일성의 영역을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA 또는 dsRNA는 mRNA 내에서 상응하는 표적 서열의 3’ 말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드를 제외한 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개의 뉴클레오티드와 각각 서열 상보성의 백분율을 갖거나, 이들과 서열 동일성의 백분율을 갖는 적어도 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 영역을 포함한다.
siRNA 및 dsRNA에 대한 표적 서열을 선택하는 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 Invitrogen, Dharmacon, Integrated DNA Technologies, Genscript, 또는 Proligo 웹사이트에서 웹 기반 설계 도구로서 제공되어 있다. 초기 검색 파라미터는 35% 내지 55%의 G/C 함량 및 19 내지 27개의 뉴클레오티드의 siRNA 길이를 포함할 수 있다. 표적 서열은 표적 mRNA의 코딩 영역 또는 5’ 또는 3’ 미번역 영역에 위치할 수 있다.
일부 구현예에서, 치료 올리고뉴클레오티드는 마이크로RNA이다. 마이크로RNA(miRNA)는 일반적으로 길이가 약 18 내지 약 25개의 뉴클레오티드인 비-단백질 코딩 RNA이다. 이들 miRNA는 표적 전사체의 트랜스에서 절단을 유도하여, 다양한 조절 및 발달 경로에 관여하는 표적 유전자의 발현을 부정적으로 조절한다. 많은 마이크로RNA 유전자(MIR 유전자)가 식별되었고, 데이터베이스(miRBase; microrna.sanger.ac.uk/sequences)에서 공개적으로 이용 가능하다. miRNA는 미국 특허 공개 제2005/0120415호 및 제2005/144669A1호에도 기술되어 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로서 통합된다.
miRNA를 암호화하는 유전자는 불완전한 줄기-루프 구조를 형성할 수 있는 70 내지 300 bp 길이의 일차 miRNA("pri-miRNA"로 지칭됨)를 생성한다. 단일 pri-miRNA는 하나 내지 여러 개의 miRNA 전구체를 함유할 수 있다. 동물의 경우, pri-miRNA는 RNaseIII 효소인 드로샤(Drosha) 및 그의 보조 인자인 DGCR8/파샤(Pasha)에 의해 핵에서 약 65 nt의 짧은 헤어핀 RNA(pre-miRNA)로 가공된다. 그런 다음, pre-miRNA를 세포질로 보내지는데, 여기서 pre-miRNA는 다른 RNaseIII 효소인 다이서(Dicer)에 의해 추가로 가공되어, 약 22 nt 크기의 miRNA/miRNA* 이합체(duplex)를 방출한다.
예시적이고 비제한적인 치료 RNA는 치료 안티센스 RNA, 예컨대 거대세포바이러스 망막염을 치료하는 데 사용될 수 있는 포미비르센(Fomiversen)(Vitravene??으로도 알려짐); 동형접합 가족성 고콜레스테롤혈증을 치료하는 데 사용될 수 있는 미포머센(Mipomersen)(Kynamro??); 척수성 근위축증을 치료하는 데 사용되는 뉴시너센(Nusinersen)(Spinraza®); 다발성 신경병증을 치료하는 데 사용되는 파티시란(Patisiran)(Onpattro®); 유전성 트랜스티레틴-매개 아밀로이드증을 가진 성인의 신경 손상을 치료하는 데 사용되는 이노테르센(Innotersen)(Tegsedi®); 뒤시엔느 근이영양증을 치료하는 데 사용되는 에테플러센(Eteplirsen)(Exondys 51®); 뒤시엔느 근이영양증 치료에 사용되는 골로디르센(Golodirsen)(Vyondys 53®); 및 급성 간성 포르피린증을 치료하는 데 사용되는 기보시란(Givosiran)(Givlaari®)을 포함한다. 추가의 치료 RNA는 노화 관련 황반 변성을 치료하는 데 사용될 수 있는 페갑타닙(Pegaptanib)(Mucagen®)을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 RNA는 개인맞춤화된다(즉, 단일 환자를 위해 개발되어 왔다). 고유한 개인맞춤형 치료 RNA의 예는 특이적 CLN7 돌연변이를 치료하기 위해 개발된 밀라센(Milasen)을 포함한다.
예시적이고 비제한적인 RNA 요법은 암 백신뿐만 아니라 감염성 질환용 백신을 포함한다. 예를 들어, 헵리사브-B(Heblisav-B®)는 재조합 B형 간염 백신이며, Moderna와 Pfizer 및 BioNTech는 모두 COVID-19를 유발하는 바이러스인 중증 급성 호흡기 증후군 2(SARS-CoV-2)에 대한 mRNA 백신을 개발하였다. mRNA는 mRNA 기반 유전자 요법에도 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "mRNA 발현을 조절하는 것"은, 예를 들어 mRNA 절단 및 분해를 통하거나 번역의 직접적인 억제를 통해 표적 mRNA가 단백질로 번역되는 것을 감소시키기에 충분한 양의 치료 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함한다. 표적 mRNA 또는 상응하는 단백질의 발현의 감소는 흔히 "녹다운(knock-down)"으로서 지칭되며, 비-표적화 대조군 RNA(예를 들어, 비-표적화 대조군 siRNA)의 투여 또는 발현 후에 존재하는 수준에 대해 상대적으로 보고된다. 녹-다운 또는 감소는 완전하거나 부분적일 수 있고, 어느 정도의 녹-다운은 본 개시의 올리고뉴클레오티드의 범위 내에 포함되는 것으로서 고려된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "억제" 또는 "감소" 또는 이의 문법적 변형은 명시된 수준 또는 활성이 적어도 약 15%, 25%, 35%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 감소하는 것 또는 줄어드는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 억제 또는 감소는 검출 가능한 활성에 영향을 거의 미치지 않거나 본질적으로 아무런 영향을 미치지 않는다(최대로도 유의미하지 않은 양, 예를 들어 약 10% 미만 또는 심지어 5% 미만).
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 치료 올리고뉴클레오티드가 아니다. 예를 들어, 본 개시의 관심 올리고뉴클레오티드는 세포의 시험관 내 조작 또는 표지에 사용되는 관심 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
올리고뉴클레오티드 변형
하나 이상의 변형된 핵염기를 포함하는 관심 올리고뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 이러한 변형된 핵염기는 올리고뉴클레오티드의 5’ 말단, 올리고뉴클레오티드의 3’ 말단에 있거나, 내부 핵염기이거나, 이들의 임의의 조합일 수 있다. 변형은 퓨린 또는 피리미딘일 수 있다. 변형은 아데닌(A), 시토신(C), 티민(T), 구아닌(G), 또는 우라실(U) 중 어느 하나이거나 이들의 조합일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵염기"는 DNA 또는 RNA에서 흔히 발견되고, 당에 연결된 퓨린 또는 피리미딘 염기로 이루어진 화합물(예: 아데노신)을 지칭한다. 뉴클레오시드는 당(리보오스 또는 데옥시리보오스)에 공유 부착되지만 인산염 기는 갖지 않는 질소성 염기를 포함한다. 뉴클레오티드는 질소성 염기, 당(리보오스 또는 데옥시리보오스), 및 1 내지 3개의 하나의 인산염 기를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 핵염기가 변형된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 관심 올리고뉴클레오티드가 30개 초과의 뉴클레오티드 길이인 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 30개 초과의 핵염기가 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 모든 핵염기가 변형된다. 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 하나의 핵염기, 예를 들어 5’ 또는 3’ 말단으로 흔히 지칭되는 말단 5’ 또는 3’ 핵염기가 변형된다.
일부 구현예에서, 관심 뉴클레오티드의 하나 이상의 핵염기의 변형은 관심 올리고뉴클레오티드의 결합 친화도, 결합 특이성(예를 들어 표적 mRNA에 대한 결합 특이성특이성), 안정성, 약동학, 또는 독성에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 독성은 간독성이다. 결합 친화도는 단일 생체분자(예: 단백질 또는 DNA)와 이의 리간드/결합 파트너 간의 결합 상호작용 강도를 지칭하는 반면, 결합 특이성은 관심 올리고뉴클레오티드가 다른 분자에 비해 하나의 분자에 우선적으로 결합하는 능력을 지칭한다.
일부 구현예에서, 변형된 관심 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 비독성 및 비돌연변이 유발성이다. 일부 구현예에서, 변형된 관심 올리고뉴클레오티드는 비-간독성이다.
일부 구현예에서, 세포에 도입된 변형된 올리고뉴클레오티드는 변형되지 않은 폴리뉴클레오티드와 비교했을 때, 세포에서 감소된 분해, 즉 증가된 안정성을 나타낼 수 있다.
본 개시의 올리고뉴클레오티드는 예컨대 당, 핵염기, 또는 인터뉴클레오시드 결합에 유용한 (예를 들어, 연결 인산염, 포스포디에스테르 연결, 포스포디에스테르 백본에 유용한) 임의의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 주요 홈(major groove), 또는 핵염기의 주요 홈면(major groove face은 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. (예를 들어, 주요 홈면 상의) 피리미딘 핵염기의 하나 이상의 원자는 임의 치환된 아미노, 임의 치환된 티올, 임의 치환된 알킬(예를 들어, 메틸 또는 에틸), 또는 할로(예를 들어, 클로로 또는 플루오로)로 대체되거나 치환될 수 있다. 소정의 구현예에서, 변형(예: 하나 이상의 변형)은 당 및 인터뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 결합 각각에 존재한다. 본 발명에 따른 변형은 리보핵산(RNA)이 데옥시리보핵산(DNA)으로 변형되는 것, 예를 들어, 리보푸라니실 고리의 2’OH가 2’H, 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 또는 이들의 혼종으로 치환되는 것일 수 있다. 추가적인 변형이 본원에 기술된다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 핵염기 유사체 또는 유도체(예: 이노신 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드)를 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 변경된 염기쌍 형성 능력을 갖거나 뉴클레아제에 대한 증가된 내성을 갖는 핵산을 제조하는 데 사용될 수 있다. dsRNA가 합성으로 생산될 때, 이노신, 5-메틸시토신, 6-메틸아데닌, 하이포크산틴 등과 같은 덜 흔한 염기가 안티센스, dsRNA, 및 리보자임 쌍 형성에 사용될 수도 있다. 예를 들어, 우리딘 및 시티딘의 C-5 프로핀 유사체를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 높은 친화도로 RNA에 결합하고, 유전자 발현의 강력한 안티센스 억제제인 것으로 나타났다. RNA의 리보오스 당기에서의 포스포디에스테르 백본에 대한 변형 또는 2’-하이드록시에 대한 변형과 같은 다른 변형이 이루어질 수도 있다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 뉴클레오티드의 당 모이어티 상에 위치한다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 핵산의 인산염 백본 상에 위치한다. 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드간 결합 인산염 잔기 중 적어도 하나 또는 전부가 메틸 포스폰산염, 메틸 포스포노티오에이트, 포스포로모폴리데이트, 포스포로피페라지데이트, 및 포스포라미데이트와 같은 변형된 인산염인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드간 가교 인산염 잔기 중 하나 걸러 하나는 기술된 바와 같이 변형될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 RNA이고, 뉴클레오티드 중 하나 또는 전부는 2’ 저급 알킬 모이어티(예: C1-C4, 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 에테닐, 프로필, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 및 이소프로필)를 함유하는 뉴클레오티드 서열이다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 잠금 핵산(LNA)을 포함한다. 용어 "잠금 핵산"(LNA)은 RNA 모방 당 형태로 잠긴 이환 푸라노오스 단위를 갖는 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드 단량체를 함유하는 핵산을 포함하며, 이환 푸라노오스 단위는 ssRNA, ssDNA, 또는 dsDNA의 상보적 서열에 대한 혼성화 친화도를 향상시킨다(Vester 등의 문헌[2004, Biochemistry 43(42):13233-41]을 참조하고, 그 내용은 참조로서 본원에 통합됨).
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 구속된 에틸 뉴클레오시드 유사체(cET), 예를 들어 2’-4’ cET 유사체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "구속된 에틸 뉴클레오티드" 또는 "cEt"는 4’-CH(CH3)-O-2’ 브릿지를 포함하는 이환 당 모이어티를 포함하는 잠금 핵산이다. 일부 구현예에서, 구속된 에틸 뉴클레오티드는 S 형태("S-구속된 에틸 뉴클레오티드" 또는 "S-cEt")이다. 일부 구현예에서, 구속된 에틸 뉴클레오티드는 R 형태("R-구속된 에틸 뉴클레오티드" 또는 "R-cEt")이다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 2’-O-메톡시-에틸(2’-MOE) 변형을 포함한다. 2’-MOE 염기는 종종 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 앱타머, 및 siRNA에 사용된다. 표준 RNA 염기와 비교하여, 2’-MOE 염기는 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 내성, 감소된 독성, 및 상보적 RNA에 대한 증가된 결합 친화도를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 2’-O-메틸(2’-O-Me) 변형을 포함한다. 2’-O-Me RNA는 tRNA 및 다른 짧은 RNA에서 발견되는 RNA의 자연 발생 변형이며, 전사후 변형으로서 발생한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 2’-O-메틸 RNA를 함유하도록 직접 합성될 수 있다. 이러한 변형은 RNA:RNA 이중체의 용융 온도 또는 결합 친화도(Tm)를 증가시킬 수 있지만, RNA:DNA 안정성에는 작은 변화만을 초래한다. 이는 단일 가닥 리보뉴클레아제에 의한 공격에 대하여 안정성을 증가시키며, DNA보다는 DNase에 대해 5 내지 10배 덜 민감할 수 있다. 일부 구현예에서, 2’O-Me는 동족 mRNA에 대한 안정성 및 결합 친화도를 증가시키기 위한 수단으로서 안티센스 올리고뉴클레오티드에 사용된다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 2’ 플루오로 변형을 포함한다. 2’ 플루오로 염기는, 결합 친화도(Tm)를 증가시키고, 고유 RNA와 비교했을 때 증가된 뉴클레아제 내성도 부여하는 불소 변형된 리보오스를 갖는다. 이들 변형은 리보자임 및 siRNA에 사용되어 혈청 또는 다른 생물학적 유체에서 안정성을 개선할 수 있다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 5-브로모-데옥시우리딘 변형을 포함한다. 5-브로모-데옥시우리딘은 광반응성 할로겐화 염기로서, 올리고뉴클레오티드에 혼입되어, UV 광에 노출될 때 올리고뉴클레오티드를 DNA, RNA, 또는 단백질에 가교 결합시킬 수 있다. 가교 결합은 308 nm의 광에서 최대로 효율적이다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 데옥시우리딘 변형을 포함한다. 데옥시우리딘(dU)은 DNA 올리고뉴클레오티드에서 데옥시티민(dT)으로 치환될 수 있다. 염기는, 올리고를 가닥 절단에 민감해지게 만드는 효소인 우라실-N-데글리코실라아제(UNG)에 의해 제거될 수 있다. 이러한 전략의 한 가지 일반적인 용도는 증폭된 DNA를 제거하고 교차 오염을 방지하는 것이다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 2,6-디아미노퓨린 (2-아미노-dA) 변형을 포함한다. 이러한 변형된 염기는 dT와 염기쌍을 이룰 때 3개의 수소 결합을 형성할 수 있고, 서열 맥락에 따라, 짧은 올리고뉴클레오티드의 용융 온도를 삽입당 1~2℃만큼 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 디데옥시-C 변형을 포함한다. 디데옥시시티딘(ddC)은 DNA 중합효소에 의한 3’ 연장을 방지하는 3’ 사슬 종결자이다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 데옥시이노신(dI) 변형을 포함한다. 2’-데옥시이노신은 자연 발생 염기로서, 엄밀하게는 보편적이지는 않지만, 4개의 표준 염기와 관련된 불일치(mismatch)보다 덜 불안정하다. dI와 데옥시아데노신(dA), 데옥시구아노신(dG), 데옥시시티딘(dC), 및 dT 간의 수소 결합 상호작용은 약하고 불균등하며, 그 결과 dI:dC > dI:dA > dI:dG > dI:dG > dI:dT의 일부 염기쌍 형성 편향이 존재한다. DNA 템플릿에 존재할 때, 데옥시이노신은 성장하는 초기 가닥에 DNA 중합효소에 의한 dC의 혼입을 우선적으로 유도한다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 하이드록시메틸 dC 변형을 포함한다. 이론에 구속되고자 함이 없이, 하이드록시메틸 dC가 후성적 조절에 역할을 하는 것으로 여겨진다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 역 dT를 포함한다. 역 dT는 올리고의 3’ 말단에 혼입되어, 3’ 엑소뉴클레아제에 의한 분해 및 DNA 중합효소에 의한 연장 모두를 억제하는 3’-3’ 결합을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 5-메틸 데옥시시티딘(5-메틸 dC) 변형을 포함한다. dC로 치환될 때 5-메틸 데옥시시티딘은 Tm을 삽입 당 많게는 0.5℃만큼 증가시키게 된다. 또한, CpG 모티프에서 5-메틸 dC의 존재는 올리고가 생체 내에서 투여되는 경우 달리 발생하는 원치 않는 면역 반응을 예방하거나 제한할 수 있다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 5-니트로인돌 변형을 포함한다. 5-니트로인돌은 범용 염기이다. 이는 임의의 특정 염기 쌍형성에 유리한 것은 아니지만(즉, 염기 특이적 수소 결합 형성을 뒷받침하지 않음), 염기 쌓임 상호작용(base stacking interaction)을 통해 이중체 안정성에 기여한다. 따라서, 이는 표준 염기들 간의 불일치만큼 이중체에 대한 불안정하지는 않다. 5-니트로인돌은 DNA 중합효소에 대한 주형으로서 사용될 때, 임의의 특정 염기의 무작위 혼입을 유도하고, 효소 가공성을 부분적으로 차단한다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 5-하이드록시부틸닐-2’-데옥시우리딘 변형을 포함한다. 5-하이드록시부틸-2’-데옥시우리딘은 올리고뉴클레오티드 용융 온도를 증가시키는 이중체-안정화 변형된 염기이다. 5-하이드록시부틸-2’-데옥시우리딘을 함유하는 올리고뉴클레오티드는, Taq 중합효소를 포함하는 중합효소에 의해 정상적으로 연장될 수 있고, 이는 5-하이드록시부틸-2’-데옥시우리딘을 낮은 복합도의 A-T 풍부한 서열을 위한 짧은 프라이머 또는 프로브를 설계하는 데 유용한 변형된 염기가 되게 한다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 8-아자-7-데아자구아노신 변형을 포함한다. 8-아자-7-데아자구아노신은 구아닌-풍부 서열과 결합된 자연 발생 비-왓슨-크릭 이차 구조를 제거하는 변형된 염기이다. 8-아자-7-데아자구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드는 Taq 중합효소를 포함하는 중합효소에 의해 정상적으로 연장될 수 있고, 이는 8-아자-7-데아자구아노신을 구아닌-풍부 프라이머 및 프로브를 설계하는 데 유용한 변형된 염기가 되게 한다. 또한, 표준 구아닌 염기와는 달리, 8-아자-7-데아자구아노신은 형광단을 퀀칭시키지 않아 프로브 성능을 잠재적으로 개선시킨다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 2-아미노퓨린 변형을 포함한다. 2-아미노퓨린은 올리고뉴클레오티드 내의 dA와 치환될 수 있다. 이는 자연적 형광 염기로서, 국소 환경에 민감하여 DNA 헤어핀의 구조와 역학을 모니터링하고 이중체의 염기 쌓임 상태를 검출하는 데 유용한 프로브가 되게 한다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 포스포로티오에이트 결합(PS)을 포함한다. 포스포로티오에이트(PS) 결합은 올리고뉴클레오티드의 인산염 백본에서 비-결합 산소를 황 원자로 치환한다. 이러한 변형은 뉴클레오티드간 결합이 뉴클레아제 분해에 대해 저항하게 한다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 결합은 올리고뉴클레오티드의 5’-말단 또는 3’-말단, 또는 둘 다에서 마지막 3~5개의 뉴클레오티드 사이에 도입되어 엑소뉴클레아제 분해를 억제할 수 있다. 대안적으로, 전체 올리고에 걸쳐 포스포로티오에이트 결합을 포함하면 엔도뉴클레아제에 의한 공격을 감소시킬 수도 있다. PS 결합은 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함될 수 있고, LNA 또는 2’-O-메틸 변형과 같은 다른 변형과 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 5’ 또는 3’ 말단 인산염(때때로 인산화 올리고뉴클레오티드로서 지칭됨)과 같은 인산염을 포함한다. 올리고가 DNA 리가아제를 위한 기질로서 사용되는 경우, 5’ 인산화가 필요하다. 3’ 인산화는 일부 3’-엑소뉴클레아제에 의한 분해를 억제하게 되고, DNA 중합효소에 의한 연장을 차단하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 이론에 구속되고자 함이 없이, 짧은 PEG 사슬을 올리고뉴클레오티드에 부착하면 올리고뉴클레오티드의 유전자 침묵화 능력에 영향을 미칠 수 있는 것으로 여겨진다.
하나 이상의 변형을 포함하는 임의의 치료 올리고뉴클레오티드는 본 개시의 범위에 포함되는 것으로 고려된다. 치료 올리고뉴클레오티드의 대표적이지만 비제한적인 예로서, FDA 승인 올리고뉴클레오티드 기반 약물의 화학적 변형에 대한 요약이 아래 표 1에 나타나 있다.
FDA 승인 올리고뉴클레오티드 약물의 화학적 변형 개요
약물 유형 변형 제약사
비트라벤 ASO 포스포로티오에이트화 Ionis Pharmaceuticals
마쿠젠 앱타머 PEG화, 2’-F, 2’-OMe Valeant Pharmaceuticals
키남로 ASO 포스포로티오에이트화, 2’-MOE Kastle Therapeutics
엑손디스 51 ASO 모폴리노 핵산 Sarepta Therapeutics
스핀라자 ASO 포스포로티오에이트화, 2’-MOE Biogen
헤플리사브-B CpG 올리고 포스포로티오에이트화 Dynavax Technologies
테그세디 ASO 포스포로티오에이트화, 2’-MOE Akcea Therapeutics
온파트로 siRNA 2’-MOE Alnylam Pharmaceuticals
표 2는 본원에 기술된 변형된 올리고뉴클레오티드에 통합된 변형된 핵염기에 대한 확장된 코드 라이브러리를 제공한다.
변형된 뉴클레오티드에 대한 확장된 코드 라이브러리
데옥시뉴클레오시드 일인산염 코드 분자식
*C C C9 H12 O5 N3 P S
*T T C10 H13 O6 N2 P S
*A A C10 H12 O4 N5 P S
*G G C10 H12 O5 N5 P S
*C(5me) + MOErC B C13 H20 O7 N3 P S
*T + MOErT D C13 H19 O8 N2 P S
*A + MOErA E C13 H18 O6 N5 P S
*G + MOErG F C13 H18 O7 N5 P S
*C(5me) H C10 H14 O5 N3 P S
*C + LNA I C12 H17 O6 N3 P S
*T + LNA J C12 H15 O7 N2 P S
*A + LNA K C12 H15 O5 N5 P S
*G + LNA L C12 H15 O6 N5 P S
*C + cEt M C13 H19 O6 N3 P S
*T + cEt N C13 H17 O7 N2 P S
*A + cEt O C13 H17 O5 N5 P S
*G + cEt P C13 H17 O6 N5 P S
5me: 5-메틸
MOEr: 2’-O-메톡시-에틸
LNA: 잠금 핵산
cEt: 구속된 에틸 뉴클레오시드 유사체
(*): 변형된 포스포로티오에이트 결합
올리고뉴클레오티드 합성
본 개시는 관심 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법 및 상기 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 방법은 (a) 관심 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계; 및 (b) 본 개시의 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석 방법을 사용하여 관심 올리고뉴클레오티드를 특성화하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기술된 방법에 의해 결정된 특정 특성(예: 순도)을 갖는 관심 올리고뉴클레오티드를 선택하는 단계를 포함한다.
관심 올리고뉴클레오티드 및 본 개시의 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물의 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 질환 또는 장애의 치료를 위해 대상체에게 투여하는 것과 같이, 추가로 하류에서 응용하기에 충분히 순수하다. 충분한 순도는, 예를 들어 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용해 관심 올리고뉴클레오티드를 합성하여 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 생산하고, 조성물 중 총 올리고뉴클레오티드, 즉 관심 올리고뉴클레오티드의 백분율을 검정하고, 조성물이 충분히 순수하지 않은 경우, 조성물을 폐기하거나 추가로 정제함으로써 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 본원에 기술된 것과 같은 적어도 하나의 변형을 포함한다.
관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물 내의 불순물로서, 본원에 기술된 방법을 사용하여 특성화될 수 있는 불순물은 관심 올리고뉴클레오티드의 단편 및 부정확한 합성 산물을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 생산된 분해 산물 또는 절단된 산물의 풍부도는 본원에 기술된 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 본원에 기술된 방법은 원하는 합성 산물의 서열에 비해 하나 또는 서열 불일치, 삽입, 또는 결실을 갖는 올리고뉴클레오티드, 및 원하는 변형과 다른 변형을 갖는 올리고뉴클레오티드의 존재 및/또는 풍부도를 결정하는 데 사용될 수 있다.
이론에 구속되고자 함이 없이, 액체 크로마토그래피는 전기영동도의 UV 가시화에 의해 알 수 있듯이, 샘플 내 올리고뉴클레오티드의 유형을 유형별로 분리하며(예를 들어 도 2a 내지 도 2b 참조), 피크는 관심 올리고뉴클레오티드 및 샘플 내 상이한 유형의 올리고뉴클레오티드 불순물(예컨대 관심 올리고뉴클레오티드의 절단 또는 분해 산물), 또는 합성 공정에 의해 생산된 다른 올리고뉴클레오티드에 상응한다. 관심 올리고뉴클레오티드에 상응하는 액체 크로마토그래피 피크 및 불순물에 상응하는 하나 이상의 피크의 온전한 질량 분석은 당업자가 이들 피크에 상응하는 샘플 내 올리고뉴클레오티드 유형, 예컨대 관심 올리고뉴클레오티드의 풍부도를 결정할 수 있게 한다. 온전한 질량 분석으로부터 쉽게 확인되지 않는 올리고뉴클레오티드의 서열, 질량, 및 변형에 있어서의 차이을 추가적으로 분리하고 특성화하기 위해, 액체 크로마토그래피에서 결정된 샘플 내 올리고뉴클레오티드의 유형을 HCD와 같은 방법을 사용하여 단편화하고, 탠덤 질량 분광분석을 통해 분석하여, 서열 및 변형을 포함하는 구조적 특성을 결정할 수 있다.
따라서, 본 개시는 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 조성물 중 올리고뉴클레오티드의 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 98.5%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9%가 관심 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 올리고뉴클레오티드의 적어도 98%가 관심 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 올리고뉴클레오티드의 적어도 99%가 관심 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 올리고뉴클레오티드의 적어도 98.5%가 관심 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 올리고뉴클레오티드의 적어도 99.9%가 관심 올리고뉴클레오티드이다. 조성물 중 올리고뉴클레오티드의 유형의 백분율은 질량%로서 기술될 수 있다. 대안적으로, 조성물 중 올리고뉴클레오티드의 유형의 백분율은 분자의 수에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시의 올리고뉴클레오티드를 합성하는 모든 적절한 방법은 본 개시의 범위에 포함되는 것으로 고려된다. 이들 방법은 고상 합성, 화학적 합성, 및 효소 반응을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 합성은 고상 합성을 포함한다. 포스포라미다이트 방법과 같은 고상 올리고뉴클레오티드 합성 방법은 일반적으로, 성장하는 올리고뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 순차적으로 첨가하는 화학 반응 사이클을 통해 3’에서 5’ 방향으로 고체 표면에 부착된 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 예를 들어, DNA의 경우, 5’ DMT(4, 4’ 디메톡시트리틸) 보호기를 갖는 3’ 뉴클레오시드가 고형 지지체에 부착하여 탈트리틸화한다. 탈트리틸화 후, 지지체 결합된 뉴클레오시드를 그 다음 염기와 반응시켜 활성화제(테트라졸 또는 유도체)와 혼합된 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체를 형성한다. 뉴클레오시드 포스포라미다이트의 디이소프로필아미노기는 활성화제에 의해 양자화되어, 양호한 이탈기로 변환된다. 이러한 이탈기는 이웃하는 인 원자 상의 지지체-결합 뉴클레오시드의 5’-하이드록실기에 의해 변위되고, 새로운 인-산소 결합이 형성되어, 지지체-결합 아인산염 트리에스테르가 생성된다. 다음으로, 5’ 히드록실기를 아세틸화하는 아세트산 무수물 및 N-메틸이미다졸(NMI)을 사용해 뉴클레오시드를 캡핑하여 미반응 5’ 히드록실기를 차단한다. 아인산염-트리에스테르는 물과 피리딘의 존재 하에 요오드 산화에 의해 안정한 (P(v)) 종으로 변환되고, 사이클은 반복된다.
RNA는 표준 고상 올리고뉴클레오티드 합성 프로토콜을 사용하여 합성될 수도 있다. 예를 들어, US20070123482A1 및 US20070213292A1을 참조하고, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
관심 올리고뉴클레오티드에 대한 변형은, 변형에 따라 합성 중에 혼입되거나, 합성 후에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드의 포스포로티오에이트 유도체는 합성 중에 혼입되어 포스포로티오에이트 결합을 생성하는 반면, 말단 인산염은 올리고뉴클레오티드의 합성 후에 효소 반응(인산화)을 통해 합성된 올리고뉴클레오티드에 첨가될 수 있다.
액체 크로마토그래피
본 개시는 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 특성화하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 액체 크로마토그래피를 포함한다. 액체 크로마토그래피는 단독으로 사용되거나 다른 방법과 조합하여 사용되어 샘플에서 분석물(예: 서열 및/또는 변형이 상이한 올리고뉴클레오티드)을 분리할 수 있다. 예를 들어, 샘플이 관심 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 경우, 액체 크로마토그래피는 관심 올리고뉴클레오티드를 불순물로부터 분리하는 데 사용될 수 있다. 이들 방법을 사용하여 검출되는 대표적인 불순물은 관심 올리고뉴클레오티드의 분해 산물, 및 관심 올리고뉴클레오티드의 합성 부산물을 포함한다. 액체 크로마토그래피 분리는 자외선 검출 또는 질량 분광분석과 같은 검출과 조합되어, 조성물에서 관심 올리고뉴클레오티드를 특성화하기 위한 분석 시스템을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 특히 본원에 기술된 것과 같은 관심 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 불순물을 포함하여, 샘플 내 올리고뉴클레오티드의 유형은 액체 크로마토그래피를 사용하여 분리된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "크로마토그래피"는 액체 또는 기체를 포함하는 화학 혼합물이 정지된 액상 또는 고상 주위로, 위로, 및/또는 이를 통해 흐를 때 화학적 엔티티의 차등 분포로 인해 여러 성분으로 분리되는 공정을 지칭한다. "액체 크로마토그래피" 또는 "LC"는 유체가 미세하게 구분된 물질의 컬럼을 통하거나 모세관 통로를 통해 균일하게 스며들 때, 유체 용액의 하나 이상의 성분을 선택적으로 지연시키는 공정을 지칭한다. 이러한 유체는 정지상(들)에 비해 상대적으로 이동하기 때문에, 지연은 하나 이상의 정지상과 벌크 유체(즉, 이동상) 사이에서 혼합물의 성분의 분포가 달라짐으로써 생긴다. 액체 크로마토그래피는 정상 액체 크로마토그래피(NPLC), 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC), 이온쌍 형성 역상 액체 크로마토그래피(IP-RPLC)를 포함하는 역상 액체 크로마토그래피(RPLC), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 고 난류 액체 크로마토그래피(HTLC), 및 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
"유지 시간"은 올리고뉴클레오티드와 같은 특정 분석물이 용리되기 전에 액체 크로마토그래피 기질에 의해 보유되는 시간의 길이를 지칭한다.
"고성능 액체 크로마토그래피" 또는 "HPLC"는 액체 크로마토그래피를 지칭하며, 여기서 분리의 정도는 정지상(일반적으로 조밀하게 충진된 컬럼)을 통한 압력 하에 이동상을 강제함으로써 증가된다.
"초성능 액체 크로마토그래피" 또는 "UPLC"는 HPLC와 비교했을 때 속도, 민감도, 및 분해능이 향상된 액체 크로마토그래피 방법을 지칭한다. 일반적으로, UPLC는 직경이 2 μm 미만인 입자에 적용 가능하다. UPLC에서의 분리 및 정량화는 매우 높은 압력(최대 100 M Pa) 하에서 수행된다.
가스 크로마토그래피(GC)는 가스 컬럼 또는 금속 컬럼과 같은 컬럼을 통해 가스를 흘려 가스의 휘발성 및 액체 정지상과의 상호작용에 기초하여 화합물을 분리하는 분리 기술을 지칭한다. 담체 가스인 이동상은 일반적으로 헬륨과 같은 불활성 가스이거나 질소와 같은 비반응성 가스이다.
당업자는 상기 방법에 사용하기에 적합한 HPLC 기기 및 컬럼을 선택할 수 있다. 크로마토그래피 컬럼은 일반적으로 화학적 모이어티의 분리(즉, 분획화)를 용이하게 하기 위한 매질(즉, 충진 물질)을 포함한다. 매질은 미세 입자를 포함할 수 있는데, 미세 입자는 화학적 모이어티의 분리를 용이하게 하기 위해 다양한 화학적 모이어티와 상호 작용하는 결합된 표면을 포함한다.
소정의 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드와 같은 분석물은, 분석물이 컬럼 충진 물질에 의해 가역적으로 보유되는 반면 하나 이상의 다른 물질은 보유되지 않는 조건 하에, 샘플을 컬럼에 도포함으로써 정제될 수 있다. 이들 구현예에서, 분석물이 컬럼에 의해 보유되는 제1 이동상 조건이 사용될 수 있고, 보유되지 않은 물질이 세척된 후, 제2 이동상 조건이 후속적으로 사용되어 보유된 물질을 컬럼으로부터 제거할 수 있다. 대안적으로, 분석물은, 분석물이 하나 이상의 다른 물질과 비교하여 차동 속도로 용리되는 이동상 조건 하에서 샘플을 컬럼에 도포함으로써 정제될 수 있다. 이러한 절차는 샘플의 하나 이상의 다른 성분에 비해 하나 이상의 관심 분석물의 양을 풍부하게 할 수 있다.
일부 구현예에서, 분석 대상 샘플은 유입구 포트에서 컬럼에 도포되고, 용매 또는 용매 혼합물과 함께 용리되고, 토출구 포트에서 배출된다. 분석물, 예컨대 샘플 내 관심 올리고뉴클레오티드 또는 불순물을 용리하기 위해 상이한 용매 모드가 선택될 수 있다. 예를 들어, 액체 크로마토그래피는 구배 모드, 등용매 모드, 또는 다형(즉, 혼합) 모드를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, HPLC는 물 중 50 mM HFIP 및 5 mM DIEA로 이루어진 제1 이동상, 및 아세토니트릴 중 50 mM HFIP 및 5 mM DIEA로 이루어진 제2 이동상을 사용하는 C18 고상 컬럼이 구비된 분석 HPLC 시스템을 이용해 수행된다. 일부 구현예에서, 제1 이동상은 물 중 40~60 mM HFIP 및 3~15 mM DIEA를 포함하고, 제2 이동상은 아세토니트릴 중 40~60 mM HFIP 및 3~15 mM DIEA를 포함한다. 일부 구현예에서, HPLC는 70% 아세토니트릴 중 15 mM 완충제로 이루어진 제1 이동상 및 30% 아세토니트릴 중 15 mM 완충제로 이루어진 제2 이동상을 사용하는 가교 결합된 디올 고상 컬럼이 구비된 분석 HPLC 시스템을 이용해 수행된다. 일부 구현예에서, 제1 이동상은 70% 아세토니트릴 중 3~25 mM 완충제를 포함하고, 제2 이동상은 20~40% 아세토니트릴 중 3~25 mM 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충제는 아세트산암모늄 및 포름산암모늄으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 완충제는 아세트산암모늄이다.
샘플의 크로마토그래피 분리를 위해 수많은 컬럼 충진물을 이용할 수 있으며, 적절한 분리 프로토콜을 선택하는 것은 샘플 특성, 관심 분석물, 간섭 물질의 존재 및 그 특성 등에 따라 달라지는 경험적 과정이다. 상업적으로 이용 가능한 HPLC 컬럼은 극성 컬럼, 이온 교환(양이온 및 음이온) 컬럼, 소수성 상호작용 컬럼, 페닐 컬럼, C-2 컬럼, C-8 컬럼, C-18 컬럼, 및 극성 코팅된 다공성 중합체 컬럼을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)를 포함한다. HILIC은 극성 정지상을 이용해 작은 극성 화합물을 분리하는 데 사용될 수 있다. HILIC은 역상형 용리액이 포함된 친수성 고정상을 사용하며, 극성이 증가하는 순서로 분석물을 용리한다. HILIC에 적합한 이동상은 아세토니트릴(ACN)을 포함하지만, 물과 섞일 수 있는 임의의 비양성자성 용매가 사용될 수 있다. 아세트산암모늄 및 포름산암모늄과 같은 이온 첨가제가 이동상 pH 및 이온 강도를 조절하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 컬럼 치수는 1~3 mm 내경(ID) x 50~300 mm 길이이다. 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 HILIC을 포함한다. 일부 구현예에서, 컬럼은 3 μm(명목)의 평균 입자 크기 및 200 Å의 입자 기공 크기 중앙값을 갖는 가교된 디올 고상이다. 일부 구현예에서, 컬럼 치수는 2 mm 내경(ID) x 100 mm 길이이다. 일부 구현예에서, 컬럼 치수는 2 mm ID x 150 mm 길이이다. 일부 구현예에서, 컬럼은 Phenomenex Luna® 3 μm HILIC 200 Å, LC 컬럼 150 x 2 mm 또는 등가물이다(예를 들어, Phenomenex 카달로그 번호 00D-4449-B0 또는 등가물 참조).
일부 구현예에서, HILIC는 아세트산암모늄을 포함하는 완충제를 포함하는 이동상을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상은 50~80% 아세토니트릴(ACN) 중 3~25 mM 아세트산암모늄을 포함하는 제1 완충제 및 20~40% ACN 중 3~25 mM 아세트산암모늄을 포함하는 제2 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상은 70% 아세토니트릴(ACN) 중 15 mM 아세트산암모늄을 포함하는 제1 완충제 및 30% ACN 중 15 mM 아세트산암모늄을 포함하는 제2 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, HILIC는 포름산암모늄을 포함하는 완충제를 포함하는 이동상을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상은 50~80% 아세토니트릴(ACN) 중 3~25 mM 포름산암모늄을 포함하는 제1 완충제 및 20~40% ACN 중 3~25 mM 포름산암모늄을 포함하는 제2 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상은 70% 아세토니트릴(ACN) 중 15 mM 포름산암모늄을 포함하는 제1 완충제 및 30% ACN 중 15 mM 포름산암모늄을 포함하는 제2 완충제를 포함한다.
일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 이온쌍 형성 역상 액체 크로마토그래피(IP-RPLC)를 포함한다. IP-RPLC는 부분적으로 이온화된 유기 분석물의 유기 이온을 분리하기 위한 기술이다. IP-RPLC는 RPLC와 동일한 유형의 정지상 및 이동상을 사용하되, 이온쌍 시약이 이동상에 첨가된다. 이온쌍 시약은, 예를 들어 알킬설폰산염, 알킬황산염, 또는 알킬암모늄염일 수 있고, 이온 분석물의 유지 시간을 변화시킬 수 있다. IP-RPLC는 아미노산, 펩티드, 및 핵산을 포함하는 생체분자의 부류를 분리하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, HPLC 컬럼은 1.3~2.0 μm(명목)의 입자 크기 중앙값 및 100~200 Å의 입자 기공 크기 중앙값을 갖는 C18 고상을 갖는다. 일부 구현예에서, HPLC 컬럼은 1.7 μm(명목)의 입자 크기 중앙값 및 130 Å의 입자 기공 크기 중앙값을 갖는 C18 고상을 갖는다. 일부 구현예에서, 컬럼 치수는 2.1 mm ID x 100 mm 길이이다. (Waters ACQUITY UPLC 올리고뉴클레오티드 BEH C18 컬럼, 130Å, 1.7 μm, 2.1 mm X 100 mm, Waters 카달로그 번호 186003950 또는 등가물).
일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 이온쌍 형성 역상 액체 크로마토그래피(IP-RPLC)를 포함한다. 일부 구현예에서, IP-RPLC는 헥사플루오로이소프로판올(HFIP) 및 5 mM N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA)을 포함하는 완충제를 포함하는 이동상을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상은 물 중 40~60 mM HFIP 및 3~15 mM DIEA를 포함하는 제1 완충제 및 아세토니트릴 중 40~60 mM HFIP 및 3~15 mM DIEA를 포함하는 제2 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상은 물 중 50 mM HFIP 및 5 mM DIEA를 포함하는 제1 완충제 및 아세토니트릴 중 50 mM HFIP 및 5 mM DIEA를 포함하는 제2 완충제를 포함한다.
일부 구현예에서, IP-RPLC는 1.3~2.0 μm(명목)의 입자 크기 중앙값 및 100~200 Å의 입자 기공 크기 중앙값을 갖는 C18 고상을 갖는 HPLC 컬럼을 포함한다. 일부 구현예에서, IP-RPLC는 1.7 μm(명목)의 입자 크기 중앙값 및 130 Å의 입자 기공 크기 중앙값을 갖는 C18 고상을 갖는 HPLC 컬럼을 포함한다. 일부 구현예에서, 컬럼 크기는 2.1 mm ID x 100 mm 길이이다(예를 들어, Waters ACQUITY UPLC 올리고뉴클레오티드 BEH C18 컬럼, 130Å, 1.7 μm, 2.1 mm X 100 mm, Waters 카달로그 번호 186003950 또는 등가물 참조). 일부 구현예에서, IP-RPLC는 1.7 μm, Oligo-XT 100 Å, 50 x 2.1 mm 컬럼을 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어 HILIC 또는 IP-LPRC를 통한 액체 크로마토그래피 분리는 특정 온도에서 수행될 수 있다. 이러한 온도는, 예를 들어 15℃ 내지 75℃일 수 있다. 일부 구현예에서, 분리는 20℃ 내지 50℃에서 수행된다. 바람직한 구현예에서, 분리는 약 23℃, 약 30℃, 약 40℃, 또는 약 50℃에서 수행된다. 일부 구현예에서, HILIC 분리는 23 내지 50℃의 컬럼 온도를 포함한다. 일부 구현예에서, HILIC 분리는 30℃의 컬럼 온도를 포함한다.
액체 크로마토그래피 UV-가시광 분광법
본 개시는 액체 크로마토그래피를 통해 분리된 샘플 내 분석물, 예를 들어 관심 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 불순물을 검출하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 액체 크로마토그래피 방법에 의해 분리된 분석물은 자외선 및/또는 가시광을 사용하여 검출된다. 일부 구현예에서, 검출 시스템은 자외선-가시광 분광법(UV-Vis)이다. UV-Vis는 분자가 전자기 스펙트럼의 UV 및 가시광 영역에서 광을 흡수함에 따라 분자의 전자 전이를 프로브한다. 이중 결합과 단일 결합이 교번하는 확장된 시스템을 가진 모든 종은 UV 빛을 흡수하고 색상이 있는 모든 것은 가시광선을 흡수하므로 UV-vis 분광법을 광범위한 샘플에 적용할 수 있다. 기기와 관련하여, 광원은 일반적으로 UV 측정을 위한 수소 또는 중수소 램프 및 가시광 측정을 위한 텅스텐 램프이다. 이들 연속 광원의 파장은 프리즘 또는 격자 단색화장치(grating monochromator)와 같은 파장 분리기를 이용해 선택된다. 스펙트럼은 파장 분리기를 스캐닝함으로써 수득되며, 정량적 측정은 스펙트럼에서 또는 단일 파장에서 이루어질 수 있다. 다양한 UV-vis 분광분석 방법이 존재한다. 이들 방법은 분자 자외선/가시광, 흡수 분광법, 자외선 분광법, 자외선/가시광 흡수 분광법을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 임의의 적절한 UV-vis 검출 시스템은 본 개시의 범위에 포함되는 것으로 고려된다.
질량 분광분석
본 개시는 액체 크로마토그래피를 통해 분리된 샘플 내 분석물, 예를 들어 절단된 올리고뉴클레오티드와 같은 관심 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 불순물을 검출하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 질량 분광분석을 포함한다. 질량 분광분석 및 탠덤 질량 분광분석(MS/MS)은 치료적 응용예에 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열 및 변형에 주석을 달고 이를 성공적으로 식별하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 검출 시스템은 질량 분광분석(MS)이다. 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LC-MS)은 액체 크로마토그래피(예: 고성능 액체 크로마토그래피 또는 HPLC)의 물리적 분리 능력과 질량 분광분석(MS)의 질량 분석 능력을 결합한 분석 화학 기술이다. 액체 크로마토그래피는 다수의 성분이 포함된 혼합물(분석물)을 분리하는 반면, 질량 분광분석은 높은 분자 특이성 및 검출 민감도로 개별 성분의 구조적 동일성 및 수준을 제공한다.
액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석은 EP3143392에 기술되어 있으며, 그 내용은 본원에 참조로서 통합된다.
질량 분광분석은 질량 분광계를 사용해 수행되는데, 질량 분광계는 샘플을 이온화하고 추가 분석을 위한 하전된 분자를 생성하기 위한 이온 공급원을 포함한다. 다양한 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드 및 이의 성분, 예컨대 추가의 합성 산물 또는 분해 산물을 포함하는 조성물은 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 이온화될 수 있다. 다양한 MS 기술에 사용되는 이온화 공급원은 전자 이온화, 화학적 이온화, 전기분무 이온화(ESI), 광자 이온화, 대기압 화학 이온화(APCT), 광이온화, 대기압 광이온화(APPI), 고속 원자 충격(FAB)/액체 2차 이온화(LSIMS), 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(MALDI), 장 이온화, 장 탈착, 열분무/플라즈마분무 이온화, 표면 강화 레이저 탈착 이온화(SELDI), 유도 결합식 플라즈마(ICP), 입자 빔 이온화, 및 이온-이동성 분리(IMS)를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 당업자는, 이온화 방법의 선택이 측정 대상 분석물, 샘플의 유형, 검출기의 유형, 양 모드 대 음 모드의 선택 등에 기초하여 결정될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "질량 분광분석" 또는 "MS"는 화합물을 이들의 질량에 의해 식별하는 분석 기술을 지칭한다. MS는 이온의 질량 대 전하 비율(m/z)에 기초하여 이온을 여과하고, 검출하고, 측정하는 방법을 지칭한다. MS 기술은 일반적으로 화합물을 이온화하여 하전된 종(예를 들어, 이온)을 형성하는 단계 및 이온의 정확한 질량을 이들의 전하로 나눈 것(m/z로서 알려짐)을 검출하는 단계를 포함한다. 화합물은 임의의 적절한 수단에 의해 이온화되고 검출될 수 있다.
"질량 분광계"는 일반적으로 이온화 장치 및 이온 검출기를 포함한다. 일반적으로, 하나 이상의 관심 분자가 이온화되고, 이온은 후속하여 질량 분광사진 기기(mass spectrographic instrument) 내로 도입되는데, 여기서 이온은 자기장과 전기장의 조합으로 인해 질량("m")과 전하("z")에 의존적인 공간 내 경로를 따른다. 예를 들어 미국 특허 제6,204,500호; 제6,107,623호; 제6,268,144호; 및 제6,124,137호를 참조한다.
MS는 양이온과 음이온 둘 다를 생성하고 검출할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이온화(ionization 또는 ionizing)"는 하나 이상의 전자 단위와 동일한 순 전하를 갖는 분석물 이온을 생성하는 공정을 지칭한다. 양이온은 하나 이상의 전자 단위의 순 양전하를 갖는 것들이다. 음이온은 하나 이상의 전자 단위의 순 음전하를 갖는 것들이다. "전자 이온화" 또는 "EI" 방법에서, 기상 또는 증기상인 분석물이 전자의 흐름과 상호작용한다. 분석물에 대한 전자 충격에 의해 분석물 이온이 생성되면, 이를 질량 분광분석 기술로 처리할 수 있다. EI는 가스 크로마토그래피(GC) 방법 또는 액체 크로마토그래피 방법과 조합될 수 있다. "화학적 이온화" 또는 "CI"에서, 시약 가스(예: 암모니아)는 전자 충격을 거치며, 시약 가스 이온과 분석물 분자의 상호작용에 의해 분석물 이온이 형성된다. "고속 원자 충돌" 또는 "FAB"에서, 고 에너지 원자(종종 Xe 또는 Ar)의 빔은 비휘발성 샘플에 충격을 주여, 샘플에 함유된 분자를 탈착시키고 이온화시킨다. 일부 구현예에서, 시험 샘플은 글리세롤, 티오글리세롤, m-니트로벤질 알코올, 18-크라운-6 크라운 에테르, 2-니트로페이릴옥틸 에테르, 설포레인, 디에탄올아민 및 트리에탄올아민과 같은 점성 액체 매트릭스에 용해된다. 화합물 또는 샘플에 적절한 매트릭스를 선택하는 것은 경험적 과정이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화" 또는 "MALDI"는 비휘발성 샘플이 레이저 조사에 노출되는 방법을 지칭하는데, 이 방법은 광-이온화, 양성자화, 탈양성자화, 및 클러스터 붕괴를 포함하는 다양한 이온화 경로에 의해 샘플 내 분석물을 탈착하고 이온화한다. MALDI의 경우, 샘플은 에너지 흡수 매트릭스와 혼합되는데, 이는 분석물 분자의 탈착을 용이하게 한다. MALDI-TOF는 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화-비행 시간(MALDI-TOF) 질량 분광분석(MS)을 지칭한다. MALDI-TOF는 최대 약 15,000달톤의 화합물에 유용하다.
"표면 강화 레이저 탈착 이온화" 또는 "SELDI"는 비휘발성 샘플이 레이저 조사에 노출되는 또 다른 방법을 지칭하는데, 이 방법은 광이온화, 양성자화, 탈양성자화, 및 클러스터 붕괴를 포함하는 다양한 이온화 경로에 의해 샘플 내 분석물을 탈착하고 이온화한다. SELDI의 경우, 일반적으로 샘플은 하나 이상의 관심 분석물을 우선적으로 보유하는 표면에 결합된다. MALDI에서와 같이, 이 공정에도 에너지 흡수 물질을 사용하여 이온화를 용이하게 할 수 있다.
일부 구현예에서, 질량 분광분석은 전기분무 이온화(ESI)를 포함한다. 일부 구현예에서, ESI는 나노-플로우 ESI를 포함한다. 나노-플로우 ESI는 (규칙적인 HPLC의 경우 높은 마이크로리터/분 내지 낮은 밀리리터/분 범위와 반대로) 나노리터/분 범위에 있을 수 있는 유속을 지칭한다. 이는 미세 샘플 농도의 민감한 검출에 사용될 수 있다.
"전기분무 이온화" 또는 "ESI"는 용액이 짧은 길이의 모세관을 따라 전달되는 방법을 지칭하는데, 모세관의 단부에는 높은 양의 전위 또는 음의 전위가 인가된다. 모세관의 단부에 도달한 용액은 기화(분무)되어 용매 증기 중의 매우 작은 액적으로 이루어진 분출물 또는 분무가 된다. 이러한 액적 분무(mist)는 증발 챔버를 통해 흐르는데, 증발 챔버는 응결을 방지하고 용매를 증발시키기 위해 약간 가열된다. 액적이 작아지면 전기 표면 전하 밀도가 증가하는데, 이는 유사한 전하들 사이의 자연 반발로 인해 이온과 중성 분자가 방출될 때까지 증가한다.
"대기압 화학 이온화" 또는 "APCI"는 ESI와 유사한 질량 분광법을 지칭하지만; APCI는 대기압에서 플라즈마 내에서 발생하는 이온-분자 반응에 의해 이온을 생성한다. 플라즈마는 분무 모세관과 상대 전극 사이의 전기 방전에 의해 유지된다. 그런 다음, 이온은 일반적으로, 차등 펌핑된 스키머 스테이지 세트를 사용하여 질량 분석기 내로 추출된다. 건조하고 예열된 N2가스의 반대 흐름이 사용되어 용매의 제거를 개선할 수 있다. APCI에서의 기상 이온화는 덜 극성인 종을 분석하는 데 ESI보다 더 효과적일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "대기압 광이온화" 또는 "APPI"는 분자 M의 광이온화를 위한 메커니즘이 분자 M+를 형성하기 위한 광자 흡수 및 전자 방출인 질량 분광법의 형태를 지칭한다. 광자 에너지는 일반적으로 이온화 전위 바로 위에 있기 때문에, 분자 이온은 해리에 덜 민감하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유도 결합식 플라즈마" 또는 "ICP"는 대부분의 요소를 분무하고 이온화하기에 충분히 높은 온도에서 샘플을 부분적으로 이온화된 가스와 상호작용시키는 방법을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이온-이동성 분광분석법"은 때때로 "이온-이동성 분리" 또는 "IMS"로도 지칭되며, 충돌 가스 및 그 질량과 기상 이온의 상호 작용에 기초하여 기상 이온을 분리하는 분석 화학 방법을 지칭한다. 제1 단계에서, 이온 이동성 분광계를 사용하여 완충 가스를 통과하는 이온의 이동성에 따라 이온을 1000분의 1초 단위로 분리한다. 그런 다음, 제2 단계에서, 분리된 이온을 질량 분석기 내에 도입하는데, 여기서 이온의 질량 대 전하 비율을 100만분의 1초 단위로 결정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "장 탈착(field desorption)"은 비휘발성 시험 샘플을 이온화 표면 상에 배치하고, 강한 전기장을 사용하여 분석물 이온을 생성하는 방법을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "탈착"은 분석물을 표면에서 제거하는 것 및/또는 분석물이 기상으로 진입하는 것을 지칭한다.
올리고뉴클레오티드 조성물 또는 이의 성분을 이온화한 후, 이에 의해 생성된 하전된 이온을 분석하여 m/z를 결정할 수 있다. m/z를 결정하기에 적합한 분석기는 사중극자 분석기, 이온 트랩 분석기, 비행 시간 분석기, 푸리에-변환 이온 사이클로트론 공명(FTR) 분석기, 및 Orbitrap 분광계를 포함한다. 이온은 여러 검출 모드 중 하나를 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 선택적 이온 모니터링 모드(SIM)를 사용하면 선택된 이온만을 검출할 수 있고, 대안적으로, 스캐닝 모드, 예를 들어 다중 반응 모니터링(MRM) 또는 선택된 반응 모니터링(SRM)을 사용하면 다중 이온을 검출할 수 있다.
일부 구현예에서, m/z는 사중극자 분석기(기기)를 사용하여 결정된다. "사중극자" 또는 "사중극자 이온 트랩" 기기에서, 발진 무선 주파수 영역에 있는 이온은 전극들 사이에 인가된 DC 전위, RF 신호의 진폭, 및 m/z에 비례하는 힘을 경험한다. 전압 및 진폭은, 특정 m/z를 갖는 이온만이 사중극자의 길이를 이동하고 다른 모든 이온은 편향되도록 선택될 수 있다. 따라서, 사중극자 기기는 기기에 주입된 이온에 대한 "질량 필터" 및 "질량 검출기" 둘 다로서 작용할 수 있다. 비행 시간(ToF)에서, 이온은 접지 전극과 반발 전극을 사용하여 균질한 정전기장에서 가속된다. 동역학 에너지는 일정하게 유지되고, 이온은 장이 없는(field-free) ToF 튜브를 따라 이동한다. 동역학 에너지가 일정하기 때문에(KE=1/2MV^2), m/z가 더 작은 것들은 m/z가 더 큰 것들에 비해 더 큰 속도를 갖게 된다. "사중극자 비행 시간" 또는 "QTof" 질량 분광분석은 충돌 셀로서 기능하는 사중극자를 비행 시간 분석기와 페어링하는 질량 분광분석기를 사용하는 질량 분광분석 유형을 지칭한다. 이는 모든 이온에 대한 고분해능, 고질량 정확도 분석을 동시에 가능하게 한다. 예시적인 QTof 시스템에서, 샘플은 온라인 액체 크로마토그래피 시스템에 의해 전달되고 이온화된다. 그런 다음, 입자 빔은 이온 가이드를 통해 사중극자 내로 이동한 후 ToF 분석기로 전달된다.
일부 구현예에서, MS 기술은 "탠덤 질량 분광분석" 또는 "MS/MS"를 사용할 수 있다. 이 기술에서, 관심 분자로부터 생성된 전구체 이온(모 이온이라고도 함)은 MS 기구에서 여과될 수 있고, 이어서 전구체 이온은 단편화되어 하나 이상의 단편 이온(자 이온 또는 생성물 이온이라고도 함)을 수득하는데, 단편 이온은 제2 MS 절차에서 분석된다. 전구체 이온을 신중하게 선택함으로써, 특정 분석물에 의해 생성된 이온만이 단편화 챔버로 전달되고, 여기서 불활성 가스의 원자와 충돌시켜 단편 이온이 생성된다. 전구체 및 단편 이온 둘 다는 주어진 이온화/분획 조건 세트 하에서 재현 가능한 방식으로 생산되기 때문에, MS/MS 기술은 매우 강력한 분석 도구를 제공할 수 있다. 예를 들어, 여과/단편화의 조합은 간섭 물질을 제거하는 데 사용될 수 있고, 복잡한 시료에서 특히 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 단편화는 고에너지 충돌-유도 해리(HCD) 방법을 사용하여 달성되는데, 여기서 전구체 이온은 높은 속도로 가속되어 가스로 채워진 충돌 셀 내로 들어간다. HCD는 미국 특허 제8,148,677호에 기술되어 있으며, 그 내용은 본원에 참조로서 통합된다.
일반적으로, 충돌 에너지는 낮은 값에서 증가하므로, 관찰된 단편 이온의 수가 0의 초기 값에서 빠르게 증가하는 임계 에너지 또는 충돌 개시 에너지가 관찰될 것이다. 이러한 단편 이온의 생성은 충돌 에너지가 증가함에 따라 소정의 최대 값까지 증가하는 것으로 추가로 관찰된다. 최대치에 상응하는 것을 초과한 충돌 에너지의 추가 증가는 단편 수율의 감소에 상응하며, 이는 임의의 에너지에서 본질적으로 0 수율로 다시 감소한다. "정규화된 충돌 에너지"(NCE)는 주어진 m/z 비율에 대한 최적의 충돌 에너지와 비교한 충돌 에너지의 표현이다. NCE는 미국 특허 제8,278,620호에 기술되어 있으며, 그 내용은 본원에 참조로서 통합된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "최대 HCD"는 최대 수의 단편이 생성되는 HCD 에너지를 지칭한다. HCD 에너지는 최대 HCD(NCE)의 백분율, 예를 들어 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% HCD 등으로서 계산될 수 있다.
일부 구현예에서, 탠덤 질량 분광분석은 HCD를 사용한 단편화를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, HCD는 특정 NCE, 예를 들어 0% 내지 75%를 사용하여 달성된다. 일부 구현예에서, NCE는 10% 내지 50%, 예를 들어 10% 내지 25% 또는 15% 내지 20%이다. 일부 구현예에서, NCE는 20%이다.
일부 구현예에서, HPLC-MS/MS 시스템은 데이터 의존적 수집(DDA)에 의해 제어될 수 있다. 탠덤 질량 분광분석에서, 데이터-독립적 수집(DIA)은 선택된 m/z 범위 내의 모든 이온이 제2 단계에서 단편화되고 분석되는 분자 구조 결정 방법이다. 탠덤 질량 스펙트럼은 주어진 시간에 질량 분광계로 들어가는 모든 이온을 단편화하거나(광대역 DIA라고 함), m/z 범위를 순차적으로 단리하고 단편화함으로써 획득된다. 대안적으로, 데이터 의존적 수집(DDA)에서, 고정된 수의 전구체 이온이 선택되고 탠덤 질량 분광분석에 의해 분석된다. DDA는, 성분이 크로마토그래피 시스템에서 용리될 때 MS/MS 획득을 위한 이온을 실시간으로 선택할 수 있다. 내장된 알고리즘은 MS 탐사 스펙트럼(survey spectra)을 신속하게 조사할 수 있고, MS/MS 분석을 위해 공동-용리 전구체 이온은 임계 강도, 전하 상태, 미리 정의된 정확한 질량 포함/제외 목록, 또는 이들의 조합에 기초하여 선택될 수 있다. 각각의 스펙트럼에 대한 충돌 에너지는 전구체 전하 상태 및 m/z에 따라 최적화될 수 있다.
질량 분광계는 일반적으로 이온 스캔 스펙트럼 또는 질량 스펙트럼, 즉 주어진 범위에 걸친 특정 m/z(예를 들어, 400 내지 1600 m/z)를 갖는 각 이온의 상대 풍부도를 제공한다. 질량 스펙트럼은, 당업계에 공지된 수많은 방법에 의해 샘플 내 분석물(예를 들어 올리고뉴클레오티드 조성물의 성분)의 양과 관련될 수 있다. 예를 들어, 샘플링 및 분석 파라미터가 신중하게 제어된다는 점을 고려하면, 주어진 이온의 상대 풍부도(때때로 상대 강도로서 지칭됨)를 상대 풍부도를 원래 분자의 절대량으로 변환한 표와 비교할 수 있다. 대안적으로, 분자 표준을 샘플로 실행하고, 이들 표준으로부터 생성된 이온 신호에 기초하여 표준 곡선을 제작할 수 있다. 이러한 표준 곡선을 생성하고 사용하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 당업자는 적절한 내부 표준을 선택할 수 있다. 이온의 양을 원래 분자의 양과 관련시키는 다수의 다른 방법이 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다.
이온이 검출기와 충돌할 때 이온은 전자 펄스를 생성하는데, 이는 디지털 신호로 변환된다. 수집된 데이터는 컴퓨터로 전달되고, 컴퓨터는 단위 시간 당 이온 계수를 도표화한다. 특정 이온에 상응하는 피크 아래 면적 또는 이러한 피크의 진폭이 측정되고, 면적 또는 진폭은 올리고뉴클레오티드 조성물 내 관심 성분 또는 마커의 양과 상관된다. 소정의 구현예에서, 단편 이온(들) 및/또는 전구체 이온에 대한 곡선 아래 면적 또는 피크 진폭을 측정하여, 주어진 m/z를 갖는 분석물의 양을 결정한다. 전술한 바와 같이, 주어진 이온의 상대 풍부도(때때로 상대 강도로서 지칭됨) 또는 반응은 내부 분자 표준의 하나 이상의 이온의 피크에 기초하여 교정 표준 곡선을 사용하여 원래 분석물의 절대량으로 변환될 수 있다. 그런 다음, LC-MS에 의해 검출된 올리고뉴클레오티드 조성물 성분의 절대량은 원래 샘플에 존재했던 성분의 절대량으로 변환될 수 있다.
샘플 내 분석물, 예컨대 관심 올리고뉴클레오티드의 상대 풍부도를 결정하기 위한 방법은 온전한 질량 분석을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 온전한 질량 분석(intact mass analysis)은 분석물의 사전 분해 또는 단편화 없이 질량 분광분석(MS)에 의한 분석물의 총 분자량을 평가하는 것이다. 액체 크로마토그래피에 의해 결정했을 때 각 피크의 강도는 상응하는 분석물의 상대 풍부도를 나타낸다. 온전한 질량 분석을 수행하는 방법은 당업계에 알려져 있을 것이며, Protein Metrics Intact Mass?? 소프트웨어를 포함한다.
일부 구현예에서, m/z (질량을 전하로 나눈 것) 스펙트럼은 중성 질량(즉, 임의의 전하가 없는 종의 질량) 스펙트럼으로 디컨볼루션될 수 있다. 디콘볼루션 방법은 m/z 스펙트럼에서 이온의 전하를 추론한 다음, m/z 값에 적절한 z(전하) 값을 곱하고 전하 담체(일반적으로 양성자)의 질량을 차감함으로써 m/z 스펙트럼을 중성 질량 스펙트럼으로 변환하여 중성 질량을 결정한다. 전하는 m/z 스펙트럼 내 피크 간의 관계에 의해 추론된다. m/z 스펙트럼의 디컨볼루션은 미국 특허 제10,319,573호에 기술되어 있으며, 그 내용은 본원에 참조로서 통합된다.
적절한 LC-MS 기기 및 시스템은 당업자에게 알려져 있을 것이다.
약학적 조성물
본 개시는 본원에 기술된 방법을 사용하여 특성화된 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약학적 조성물이다.
관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물의 일부 구현예에서, 조성물은 질환 또는 장애의 치료를 위해 대상체에게 추가로 투여하기에 적합하다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 약학적 조성물의 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드는 본원에 기술된 것과 같은 적어도 하나의 변형을 포함한다.
따라서, 본 개시는 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 여기서 조성물 중 올리고뉴클레오티드의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 98.5%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9%가 관심 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 올리고뉴클레오티드의 적어도 95%는 관심 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 올리고뉴클레오티드의 적어도 98%가 관심 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 올리고뉴클레오티드의 적어도 99%가 관심 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 올리고뉴클레오티드의 적어도 99.5%가 관심 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 올리고뉴클레오티드의 적어도 99.9%가 관심 올리고뉴클레오티드이다. 조성물 중 올리고뉴클레오티드의 유형의 백분율은 질량%로서 기술될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 조성물 중 올리고뉴클레오티드의 유형의 백분율은 분자의 수에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
"약학적으로 허용 가능한"이란 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 물질, 즉, 독성과 같은 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않고 대상체에게 투여될 수 있는 물질을 의미한다.
본 개시의 약학적 조성물은 임의로 추가의 약제, 약학적 제제, 담체, 보조제, 분산제 등을 포함할 수 있다.
관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 약학적 담체로 투여되도록 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 예를 들어 Remington의 문헌[The Science And Practice of Pharmacy (9th Ed. 1995)] 참조. 본 개시에 따른 약학적 조성물의 제조에 있어서, 관심 올리고뉴클레오티드(이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 포함함)는 특히 허용 가능한 담체와 혼합된다. 담체는 고형분 또는 액체이거나 둘 다일 수 있고, 관심 올리고뉴클레오티드와 함께 단위 투여량 제형으로서, 예를 들어 관심 올리고뉴클레오티드의 0.01중량% 또는 0.5중량% 내지 95중량% 또는 99중량%를 함유할 수 있는 정제로서 제형화될 수 있다. 하나 이상의 관심 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 제형에 혼입될 수 있으며, 상기 제형은 잘 알려진 제약 기술 중 어느 하나에 의해 제조될 수 있다.
본 개시의 약학적 조성물의 비제한적인 예는 경구 투여, 직장 투여, 구강 내 (예를 들어 설하) 투여, 질 투여, 비경구 (예: 피하, 골격근을 포함하는 근육내, 심근, 횡격막 근육 및 평활근, 피내, 정맥 내, 복강내) 투여, 국소 (즉, 피부 및 점막 표면, 기도 표면 포함) 투여, 비강 내 투여, 경피 투여, 관절내 투여, 두개내 투여, 경막내 투여, 및 흡입 투여, 문맥내 전달에 의해 간 투여, 직접 장기 주사(예를 들어, 간내 투여, 사지 투여, 중추 신경계 전달을 위한 뇌 또는 척수내 투여, 췌장내 투여, 또는 종양내 또는 종양을 둘러싼 조직 내 투여)에 적합한 것들을 포함한다. 임의의 주어진 경우에 가장 적합한 경로는 치료 중인 병태의 성질 및 중증도 및 사용 중인 특정 약학적 조성물의 성질에 따라 달라질 것이다. 일부 구현예에서, 전신 투여와 관련된 임의의 이상반응을 피하기 위해 조성물을 국부적으로 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 국소 투여는 원하는 치료 부위에 직접 주사함으로써, 원하는 치료 부위와 가까운 부위에서의 정맥 내 (예를 들어, 치료 부위에 혈액을 공급하는 혈관 내) 도입함으로써 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 허혈성 조직에 국소적으로 전달될 수 있다. 소정의 구현예에서, 조성물은 서방형 제형, 예를 들어 서방형 데포의 형태일 수 있다.
주입의 경우, 담체는 일반적으로 발열원이 없는 멸균수, 발열원이 없는 인산염 완충 식염수 용액, 정균수, 또는 Cremophor EL[R](BASF, Parsippany, N.J.)과 같은 액체일 것이다. 다른 투여 방법의 경우, 담체는 고형분 또는 액체일 수 있다.
경구 투여의 경우, 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 및 분말과 같은 고형 투여 형태로 투여되거나, 엘릭서, 시럽, 및 현탁액과 같은 액체 투여 형태로 투여될 수 있다. 약학적 조성물은 불활성 성분 및 분말화된 담체, 예컨대 포도당, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 전분, 셀룰로오스 또는 셀룰로오스 유도체, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 사카린 나트륨, 탈쿰(talcum), 탄산마그네슘 등과 함께 젤라틴 캡슐에 캡슐화될 수 있다. 경구 투여용 액체 투여 형태는 환자의 수용도를 증가시키도록 착색제 및 향미제를 함유할 수 있다.
구강 내(설하) 투여에 적합한 약학적 조성물은, 일반적으로 수크로오스와 아카시아 또는 트라가칸스인 가향된 염기에 화합물을 포함하는 캔디(lozenge); 및 젤라틴과 글리세린 또는 수크로스와 아카시아와 같은 불활성 염기에 화합물을 포함하는 향정(pastilles)을 포함한다.
약학적 조성물은 비강 투여용으로 제형화되거나, 달리 임의의 적절한 수단에 의해 대상체의 폐에 투여될 수 있는데, 예를 들어 대상체가 흡입하는, 화합물을 포함하는 호흡 가능한 입자의 에어로졸 현탁액에 의해 투여될 수 있다. 호흡 가능한 입자는 액체 또는 고형분일 수 있다. 용어 "에어로졸"은 세기관지 또는 비강으로 흡입될 수 있는 임의의 가스-매개 현탁상을 포함한다.
비경구 투여에 적합한 본 개시의 약학적 조성물은 화합물의 멸균 수성 및 비수성 주사 용액을 포함하며, 이러한 제제는 바람직하게는 의도된 수용자의 혈액과 등장성이다. 이들 제제는 항산화제, 완충제, 세균발육저지제(bacteriostats), 및 의도된 수용자의 혈액과 조성물을 등장화시키는 용질을 함유할 수 있다. 수성 및 비수성 멸균 현탁제는 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있다. 조성물은 단위/투여량 또는 다중-투여량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 식염수 또는 주사용수를 첨가하기만 하면 되는 냉동-건조된(동결건조된) 상태로 보관될 수 있다.
즉석 주사 용액 및 현탁액은 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 멸균 분말, 과립, 및 정제로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 주사 가능한 안정한 멸균 조성물은 밀봉된 용기에 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. 관심 올리고뉴클레오티드는 동결건조물 형태의 염으로서 제공될 수 있는데, 이는 적절한 약학적으로 허용 가능한 담체와 재구성되어 대상체에게 주입하기에 적합한 액체 조성물을 형성할 수 있다.
치료 방법
본 개시는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 방법을 사용하여 특성화된 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
치료 올리고뉴클레오티드, 예컨대 본원에 기술된 것과 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드, dsRNA, siRNA, 앱타머, 마이크로RNA, 또는 mRNA의 투여에 의해 치료될 수 있는 임의의 질환 또는 장애는 본 개시의 범위에 포함되는 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, 치료 올리고뉴클레오티드는 본원에 기술된 것과 같은 적어도 하나의 변형을 포함한다.
치료 뉴클레오티드를 사용해 치료할 수 있는 질환 또는 장애는 표적 유전자의 조절 또는 감소를 통해 치료할 수 있는 질환 또는 장애를 포함한다. 여기에는 유전 질환 및 암이 포함된다. 치료 올리고뉴클레오티드를 사용해 치료할 수 있는 예시적인 질환 및 장애는 망막염, 황반 변성, 동형접합성 가족성 고콜레스테롤혈증, 뒤시엔느 근이영양증, 고 투여량 화학요법 및 자가 골수 이식 후에 발생하는 중증 간정맥-폐쇄성 질환(sVOD), 척수근 위축증(SMA), 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 및 모세혈관확장성 운동실조증을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 또 다른 예로서, 치료 올리고뉴클레오티드로 치료 가능할 것으로 여겨지는 추가 질환은 암(예를 들어 폐암, 결장 암종, 췌장 암종, 악성 신경교종, 및 악성 흑색종을 포함함), 당뇨병, 및 염증성 질환(예: 염증 성분으로 인한 천식, 관절염, 및 장염)을 포함한다.
본 개시는 대상체에서 질환 또는 장애를 예방하거나, 질환 또는 장의의 중증도를 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 방법을 사용하여 특성화된 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법을 사용하여 특성화된 올리고뉴클레오티드 백신은 감염성 질환 또는 암의 중증도를 감소시키거나 예방하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 "치료적 유효량"은 대상체에게 약간의 개선 또는 이점을 제공하는 양이다. 대안적으로 언급된 "치료적 유효량"은 대상체에서 적어도 하나의 임상 증상을 약간 완화, 경감, 또는 감소를 제공하게 될 (예를 들어, 암의 경우, 종양 부담의 감소, 추가 종양 성장의 예방, 전이의 예방, 또는 생존 시간의 증가를 제공하게 될) 양이다. 당업자는, 약간의 이점이 대상체에게 제공되는 한, 치료 효과가 반드시 완전하거나 치유적이어야 하는 것은 아님을 이해할 것이다.
"치료(treat, treating, 또는 treatment)"라는 용어는, 대상체의 병태의 중증도가 감소되거나 적어도 부분적으로 개선되거나 변경되고 적어도 하나의 임상 증상이 약간 완화, 경감, 또는 감소되는 것을 의도한다.
키트 및 제조 물품
본 개시는 본원에 기술된 방법을 사용하여 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 조성물을 특성화하기 위한 키트 및 제조 물품을 제공한다.
일부 구현예에서, 키트는 완충제, 시약, 대조군 샘플, 및 사용 방법에 대한 지침을 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 질환 또는 장애의 치료를 위한 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 투여 형태, 및 사용 지침을 포함한다.
다음의 실시예는 본 발명의 청구범위의 범위를 제한하도록 의도된 것이 아니라, 오히려 특정 구현예를 예시하도록 의도된다. 당업자에게 발생하는 예시적인 방법의 임의의 변형은 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 청구된 본 발명의 각각의 양태에 대한 여러 구현예 및 요소가 있으며, 상이한 요소의 모든 조합이 본원에서 예상되므로, 본원에서 예시된 특정 조합은 청구된 바와 같이 본 발명의 범주에서 제한으로서 해석되어서는 안된다. 특정 요소가 제거되거나 조합으로 이용 가능한 요소의 군에 추가되는 경우, 요소의 군은 이러한 변화를 통합한 것으로 해석되어야 한다.
실시예
실시예 1: 변형된 올리고뉴클레오티드 및 미변형 올리고뉴클레오티드의 HILIC-UV 검출
작은 미변형 올리고뉴클레오티드 및 변형된 올리고뉴클레오티드를 분리하는 소수성 상호작용 액체 크로마토그래피 및 자외선 검출(HILIC-UV)의 능력을 분석하였다.
도 1은 대표적인 미변형 올리고뉴클레오티드 및 변형된 올리고뉴클레오티드의 HILIC-UV 분석을 나타내며, 이의 서열 및 변형은 아래 표 3에 기술되어 있다. 표 3의 맞춤형 올리고뉴클레오티드를 IDTDNA로부터 주문하였다.
HILIC-UV는 Phenomenex Luna 3 μm HILIC 200 Å, LC 컬럼, 150 x 2 mm를 사용하여 수행하였다. 크로마토그래피는 0.25 mL/분의 유속으로 수행하였다. 이동상 용매 A(MPA)는 70% 아세토니트릴(ACN) 중 15 mM 아세트산암모늄이었다. 이동상 용매 B(MPB)는 30% ACN 중 15 mM 아세트산암모늄이었다. 도 1은 HILIC-UV가 대표적인 변형된 올리고뉴클레오티드 및 미변형 올리고뉴클레오티드를 분리할 수 있음을 보여준다.
실시예에 사용된 맞춤형 올리고뉴클레오티드
서열번호 명칭 서열 (5’에서 3’ 방향) 분자량 (Da)
1 M13 역방향 (M13-R) CAGGAAACAGCTATGAC (서열번호 1) 5212.5
2 SP6 ATTTAGGTGACACTATAG (서열번호 6) 5537.7
3 T7 TAATACGACTCACTATAGGG (서열번호 3) 6125.1
4 T3 GCAATTAACCCTCACTAAAGG (서열번호 7) 6383.2
5 CMV 정방향 (CMV-F) CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG (서열번호 8) 6552.3
6 TRC-F CAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGA (서열번호 2) 7794.2
7 오블리머센 T*C*T*C*C*C*A*G*C*G*T*G*C*G*C*C*A*T (서열번호 5) 5684.6
8 포르미비르센 나트륨 G*C*G*T*T*T*G*C*T*C*T*T*C*T*T*C*T*T*G*C*G (서열번호 9) 6682.4
(*)는 포스포로티오에이트 결합(PS)을 나타낸다.
도 2a 및 2b는 표 3의 대표적인 미변형 올리고뉴클레오티드 및 변형된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 2개의 HILIC 완충제 시스템 간의 분석 성능을 비교한 것을 보여준다. 도 2a에서, MPA 및 MPB는 각각 70% 및 30% ACN 중 15 mM 아세트산암모늄으로 수행하였다. 도 2b에서, MPA 및 MPB는 각각 70% 및 30% ACN 중 15 mM 포름산암모늄으로 수행하였다. 15 mM 아세트산암모늄을 완충제로서 선택하였다.
도 3a 및 도 3b는 올리고뉴클레오티드 미변형 CMV-F 및 포스포로티오에이트(PS) 변형된 오블리머센을 사용하여 상이한 컬럼 온도의 분석 성능을 비교한 것을 보여준다. 23℃, 30℃, 40℃, 및 50℃의 컬럼 온도를 검정하였다. 30℃를 컬럼 온도로서 선택하였다.
실시예 2: 변형된 올리고뉴클레오티드 및 미변형 올리고뉴클레오티드의 IP-RPLC-UV 검출
이온쌍 형성 역상 액체 크로마토그래피 및 자외선 검출(IP-RPLC-UV)이 작은 미변형 올리고뉴클레오티드 및 변형된 올리고뉴클레오티드를 분리하는 능력을 검정하였다.
도 4는 대표적인 미변형 올리고뉴클레오티드 및 변형된 올리고뉴클레오티드의 IP-RPLC-UV 분석을 나타내며, 이의 서열 및 변형은 아래 표 3에 기술되어 있다. IP-RPLC-UV 검출은 Waters Acquity 올리고뉴클레오티드 BEH 컬럼을 사용하여 수행하였다. 도 4는 IP-RPLC-UV가 대표적인 변형된 올리고뉴클레오티드 및 미변형 올리고뉴클레오티드를 분리할 수 있음을 보여준다.
IP-RPLC-UV는 도 5 및 도 6에 도시된 바와 같이, 혼합된 올리고뉴클레오티드로 이루어진 샘플도 분리할 수 있다. IP-RPLC-UV를 사용해 MasPrep OST 표준을 분석하였다(순서는 아래 표 4에 제공됨).
도 5에서, 혼합된 MassPrep OST 표준을 Waters Acquity Oligonucleotide BEH 컬럼을 이용해 수행하였다. 유속 및 컬럼 온도는 0.25 mL/분(60℃이었다. MPA는 물 중 50 mM 헥사플루오로이소프로판올(HFIP) 및 5 mM N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA)이었다. MPB는 아세토니트릴 중 50 mM HFIP 및 5 mM DIEA였다. 컬럼은 ACQUITY UPLC 올리고뉴클레오티드 BEH C18 컬럼, 130Å, 1.7 μm, 2.1 mm x 100 mm였다.
도 6에서, 혼합된 MassPrep OST 표준을 IP-RPLC-UV를 사용하여 Phenomenex Oligo-XT 컬럼 상에서 실행하였다. 유속 및 컬럼 온도는 0.25 mL/분(60℃이었다. MPA는 물 중 50 mM HFIP 및 5 mM DIEA였다. MPB는 아세토니트릴 중 50 mM HFIP 및 5 mM DIEA였다. 컬럼은 Clarity® 1.7 μm 올리고-XT 100 Å, LC 컬럼 2.1 mm x 50 mm였다.
Waters MassPrep OST 올리고뉴클레오티드 표준 혼합물
서열번호 명칭 서열 (5’에서 3’ 방향) 분자량 (Da)
9 15-nt TTTTT TTTTT TTTTT (서열번호 10) 4500.99
10 20-nt TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT (서열번호 11) 6021.98
11 25-nt TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT (서열번호 12) 7542.96
12 30-nt TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT (서열번호 13) 9063.95
13 35-nt TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT (서열번호 14) 10584.93
실시예 3: 올리고뉴클레오티드의 액체 크로마토그래피 및 탠덤 질량 분광분석 특성화
액체 크로마토그래피(HILIC 또는 IP-RPLC) 및 탠덤 질량 분광분석(MS/MS)을 사용해 이온화 후 미변형 올리고뉴클레오티드 M13-R의 샘플 중 전하(z)가 상이한 전구체 이온을 검출하였다.
도 7은 pH 약 3.2의 포름산암모늄 이동상을 이용한 HILIC에 이어지는 데이터 의존적 수집(DDA) MS/MS를 도시한다. 도 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 이들 조건 하에서, z = 4-올리고 전구체 이온 및 z = 3-올리고 전구체 이온이 우세하다.
도 8은 pH 약 5.8의 아세트산암모늄 이동상을 이용한 HILIC에 이어지는 DDA MS/MS를 도시한다. 도 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 이들 조건 하에서, z = 4-올리고 전구체 이온 및 z = 3-올리고 전구체 이온이 우세하다.
도 9는 DIEA 이동상(10 초과의 pH)을 이용한 IP-RPLC에 이어지는 DDA MS/MS를 도시한다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 이들 조건 하에서M13-R의 z = 9-전구체 이온, 8-전구체 이온, 및 7-전구체 이온이 우세하다.
실시예 4: 미변형 올리고뉴클레오티드의 온전한 질량 분석
PMI Intact 소프트웨어를 사용하여 미변형 올리고뉴클레오티드 M13-R(도 10a 및 10b) 및 미변형 올리고뉴클레오티드 CMV-F(도 11a 및 11b)의 온전한 질량; 및 온전한 M13-R 및 CMV-F 올리고뉴클레오티드 대 올리고뉴클레오티드 샘플 중 절단 순도의 백분율을 계산하였다.
이러한 동일한 접근법은 변형된 올리고뉴클레오티드, 예컨대 그 서열이 표 5에 제시된 상용 올리고뉴클레오티드 약물을 특성화하는 데 사용될 수 있다.
서열과 분자식이 알려진 상용 올리고뉴클레오티드 약물을 사용하여 기존 템플릿으로 시험하기
명칭 서열 PMI-Intact에서 변환된 서열 MW 계산
Skyline PMI-Intact
뉴시너센 MOErT*MOErC(5me)*MOErA*MOErC(5me)*MOErT*MOErT*MOErT*MOErC(5me)*MOErA*MOErT*MOErA*MOErA*MOErT*MOErG*MOErC(5me)*MOErT*MOErG*MOErG (서열번호 15) DBEBDDDBEDEEDFBDFF (서열번호 15) 7127.2 Da 7127.20 Da
이노테르센 MOErT*MOErC(5me)*MOErT*MOErT*MOErG*G*T*T*A*C(5me)*A*T*G*A*A*MOErA*MOErT*MOErC(5me)*MOErC(5me)*MOErC(5me) (서열번호 16) DBDDFGTTAHATGAAEDBBB (서열번호 16) 7183.1 Da 7183.12 Da
미포머센 MOErG*MOErC(5me)*MOErC(5me)*MOErT*MOErC(5me)*A*G*T*C(5me)*T*G*C(5me)*T*T*C(5me)*MOErG*MOErC(5me)*MOErA*MOErC(5me)*MOErC(5me) (서열번호 17) FBBDBAGTHTGHTTHFBEBB (서열번호 17) 7177.2 Da 7177.15 Da
AZD4785 (단종) G(cEt)*C(cEt)*T(cEt)*A*T*T*A*G*G*A*G*T*C*T(cEt)*T(cEt)*T(cEt) (서열번호 18) LIJATTAGGAGTCJJJ (서열번호 18) 5411.4 Da 5411.44 Da
도 12a 및 12b는 온전한 질량 분석이 포르미비르센의 온전한 질량을 계산하는 데 사용될 수 있음을 보여주며, 샘플 내 온전한 포르미비르센 및 포르미비르센 절단 산물의 백분율을 보여준다. 코드 및 변형에 대한 설명은 표 2를 참조한다.
실시예 5: 탠덤 질량 분광분석을 위한 고에너지 충돌 해리(HCD) 충돌 에너지의 최적화
제1 탠덤 질량 분광계(MS1)로부터 나오는 특정 m/z-비율의 이온을 선택한 다음, 고에너지 충돌 해리(HCD)에 의해 더 작은 단편 이온으로 분할하였다. 그런 다음, 이들 단편을 제2 질량 분광계(MS2) 내로 도입하고, m/z에 따라 단편을 분리하고 검출하였다.
인산염 백본을 따라 올리고뉴클레오티드 단편은 5’ 말단(a-B, b, 및 d)을 함유하는 이온 세트 및 3’ 말단(w 및 y)을 함유하는 다른 이온 세트를 생성한다. DNA 올리고는 가장 풍부한 단편으로서 a-B 및 w 이온을 생성한다. RNA 올리고는 y 및 d-H2O 이온의 생산에 유리하다. (McLuckey 등의 문헌[JASMS, 1992, 3: 60-70 및 도 13] 참조).
HILIC-MS/MS를 위한 HCD 충돌 에너지를 도 14a 및 도 14b에 도시된 바와 같이 최적화하였다. 15~20%의 HCD NCE를 대부분의 올리고뉴클레오티드 서열에 대한 최적의 충돌 에너지로서 결정하였다.
올리고뉴클레오티드 T7의 [M-4H]4- 이온 전구체(m/z 1530.2549) 및 [M-8H]8- 이온 전구체의 예시적인 단편화는 도 15 및 도 18에 각각 도시되어 있다. 각각의 경우에 20%의 HCD를 사용하였다. 도 18에서, DNA 내 T의 3’측(C-O)에서의 단편화는 흔히 부재하지만; T의 5’측(P-O)에서의 단편화는 강한 신호를 생성한다.
나노-플로우 전기분무 이온화(ESI)는 유속이 더 낮은 플로우 스플리터(flow splitter)를 사용한다. 플로우 스플리터는 샘플을 분리하기 위한 나노-플로우 전기분무 이온화를 달성하는 데 사용하였다. 도 16 및 도 17은 단편화 효율이 나노-플로우 IP-RPLC-MS/MS에 의해 추가로 개선될 수 있음을 보여준다.
실시예 6: 포스포로티오에이트(PS) 변형된 올리고뉴클레오티드의 단편화
탠덤 질량 분광분석법(실시예 5 참조)은 변형된 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라 미변형 올리고뉴클레오티드를 분석하는데 사용될 수 있다. 도 19a, 19b, 및 19c는 오블리머센 단편의 계산된 질량을 보여준다. 도 20은 20%의 HCD로 생성된 단편화된 오블리머센 [M-4H]4- 이온 전구체(m/z 1419.8799)의 예시적인 질량 스펙트럼을 도시한다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. HUANG, Ming QIU, Haibo XU, Xiaobin LI, Ning <120> USE OF LIQUID CHROMATOGRAPHY AND MASS SPECTROMETRY TO CHARACTERIZE OLIGONUCLEOTIDES <130> REGE-020/001WO 181937-2305 <150> 62/968,368 <151> 2020-01-31 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 Reverse oligo <400> 1 caggaaacag ctatgac 17 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRC-F oligo <400> 2 caaggctgtt agagagataa ttgga 25 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 Oligo <400> 3 taatacgact cactataggg 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> unmodified Oblimersen <400> 4 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oblimersen oligo with modifications <220> <221> phosphorothioate <222> (2)..(18) <223> * indicates a phosphorothioate linkage <400> 5 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP6 oligo <400> 6 atttaggtga cactatag 18 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T3 oligo <400> 7 gcaattaacc ctcactaaag g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV forward primer <400> 8 cgcaaatggg cggtaggcgt g 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Formivirsen oligo <220> <221> phosphorothioate <222> (2)..(21) <223> * indicates phosphorothioate linkage <400> 9 gcgtttgctc ttcttcttgc g 21 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> polyT nucleotide <400> 10 tttttttttt ttttt 15 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> poly(T) oligo <400> 11 tttttttttt tttttttttt 20 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> poly(T) oligo <400> 12 tttttttttt tttttttttt ttttt 25 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> poly(T) oligo <400> 13 tttttttttt tttttttttt tttttttttt 30 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> poly(T) oligo <400> 14 tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttt 35 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nusinersen oligo <220> <221> MOEr <222> (1)..(18) <223> 2'-O-methoxy-ethyl (MOEr) modification <220> <221> 5me <222> (2)..(2) <223> 5-methyl modification <220> <221> * <222> (2)..(18) <223> * indicates phosphorothioate linkage <220> <221> 5me <222> (4)..(4) <223> 5-methyl modification <220> <221> 5me <222> (8)..(8) <223> 5-methyl modification <220> <221> 5me <222> (15)..(15) <223> 5-methyl modification <400> 15 tcactttcat aatgctgg 18 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inotersen <220> <221> MOEr <222> (1)..(5) <223> 2'-O-methoxy-ethyl (MOEr) modification <220> <221> * <222> (2)..(20) <223> * indicates phosphorothioate linkage <220> <221> 5me <222> (2)..(2) <223> 5-methyl modification <220> <221> 5me <222> (10)..(10) <223> 5-methyl modification <220> <221> MOEr <222> (16)..(20) <223> 2'-O-methoxy-ethyl (MOEr) modification <220> <221> 5me <222> (18)..(20) <223> 5-methyl modification <400> 16 tcttggttac atgaaatccc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mipomersen <220> <221> MOEr <222> (1)..(5) <223> 2'-O-methoxy-ethyl (MOEr) modification <220> <221> 5me <222> (2)..(3) <223> 5-methyl modification <220> <221> * <222> (2)..(20) <223> * indicates phosphorothioate linkage <220> <221> 5me <222> (5)..(5) <223> 5-methyl modification <220> <221> 5me <222> (9)..(9) <223> 5-methyl modification <220> <221> 5me <222> (12)..(12) <223> 5-methyl modification <220> <221> 5me <222> (15)..(15) <223> 5-methyl modification <220> <221> MOEr <222> (16)..(20) <223> 2'-O-methoxy-ethyl (MOEr) modification <220> <221> 5me <222> (17)..(17) <223> 5-methyl modification <220> <221> 5me <222> (19)..(20) <223> 5-methyl modification <400> 17 gcctcagtct gcttcgcacc 20 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AZD4785 <220> <221> cET <222> (1)..(3) <223> constrained ethyl nucleoside analog <220> <221> * <222> (2)..(16) <223> * indicates phosphorothioate linkage <220> <221> cET <222> (14)..(16) <223> constrained ethyl nucleoside analog <400> 18 gctattagga gtcttt 16

Claims (71)

  1. 관심 올리고뉴클레오티드 집단을 포함하는 샘플을 특성화하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a. 동일한 서열의 관심 올리고뉴클레오티드 집단을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    b. 샘플을 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석으로 처리하여 관심 올리고뉴클레오티드 집단에 상응하는 적어도 하나의 질량 분광분석도를 생성하는 단계; 및
    c. 관심 올리고뉴클레오티드 집단에 상응하는 샘플 내 총 올리고뉴클레오티드의 백분율을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 샘플은 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 추가 집단을 포함하는 적어도 하나의 불순물을 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 추가 집단은 관심 올리고뉴클레오티드의 단편화 산물 또는 합성 부산물을 포함하는, 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 방법은 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 추가 집단에 상응하는 질량 분광분석도를 생성하는 단계, 및 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 추가 집단에 상응하는 샘플 내 총 올리고뉴클레오티드의 백분율을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 올리고뉴클레오티드는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 또는 DNA-RNA 혼종인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥인, 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥인, 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 올리고뉴클레오티드는 헤어핀 또는 줄기-루프 구조를 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 올리고뉴클레오티드의 길이는 15 내지 100개의 뉴클레오티드인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 올리고뉴클레오티드는 치료 올리고뉴클레오티드인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 치료 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), dsRNA, siRNA, 앱타머, 또는 마이크로RNA를 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형을 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 관심 올리고뉴클레오티드의 5’ 말단, 3’ 말단, 또는 둘 다에 존재하는, 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 내부 핵염기에 대한 변형을 포함하는, 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 관심 올리고뉴클레오티드의 결합 친화도, 결합 특이성, 안정성, 약동학, 또는 독성에 영향을 미치는, 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 잠금 핵산(LNA), 포스포로티오에이트(PS) 결합, 말단 5’ 또는 3’ 인산염(PO), 5’ 메틸(5-Me) 변형, 2’-O-메틸(2’-O-Me) 변형, 2’-O-메톡시에틸(2’-MOE) 변형, 구속된 에틸(cET) 유사체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 크로마토그래피는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 또는 이온쌍 형성 역상 액체 크로마토그래피(IP-RPLC)를 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, HILIC는 아세트산암모늄을 포함하는 이동상 완충제를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 이동상은 70% 아세토니트릴(ACN) 중 15 mM 아세트산암모늄을 포함하는 제1 완충제 및 30% ACN 중 15 mM 아세트산암모늄을 포함하는 제2 완충제를 포함하는, 방법.
  20. 제17항에 있어서, HILIC는 포름산암모늄을 포함하는 이동상 완충제를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 이동상은 70% 아세토니트릴(ACN) 중 15 mM 포름산암모늄을 포함하는 제1 완충제 및 30% ACN 중 15 mM 포름산암모늄을 포함하는 제2 완충제를 포함하는, 방법.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, HILIC 분리는 23 내지 50℃의 컬럼 온도를 포함하는, 방법.
  23. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, HILIC 분리는 30℃의 컬럼 온도를 포함하는, 방법.
  24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, HILIC는 3 μm의 평균 명목 입자 크기, 200 Å의 입자 기공 크기 중앙값, 2 mm의 내경, 150 mm의 컬럼 길이를 갖는 고상 컬럼을 포함하는, 방법.
  25. 제17항에 있어서, IP-RPLC는 헥사플루오로이소프로판올(HFIP) 및 5 mM N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA)을 포함하는 이동상 완충제를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 이동상은 물 중 50 mM HFIP 및 5 mM DIEA를 포함하는 제1 완충제 및 아세토니트릴 중 50 mM HFIP 및 5 mM DIEA를 포함하는 제2 완충제를 포함하는, 방법.
  27. 제17항, 제25항, 또는 제26항 중 어느 한 항에 있어서, IP-RPLC는 1.7 μm의 평균 명목 입자 크기, 130 Å의 입자 기공 크기 중앙값, 100 mm의 컬림 길이, 및 2.1 mm의 내경을 갖는 컬럼을 포함하는, 방법.
  28. 제17항, 제25항, 또는 제26항 중 어느 한 항에 있어서, IP-RPLC는 1.7 μm, 올리고-XT 100 Å, 50 x 2.1 mm 컬럼을 포함하는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 질량 분광분석은 전기분무 이온화(ESI)를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, ESI는 나노-플로우 ESI를 포함하는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 크로마토그래피는 샘플의 자외선(UV) 검출을 추가로 포함하는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 질량 분광분석은 탠덤 질량 분광분석(MS/MS)인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, MS/MS는 데이터 의존적 수집(DDA)을 포함하는, 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, MS/MS는 관심 올리고뉴클레오티드의 집단, 올리고뉴클레오티드의 적어도 추가 집단, 또는 이들의 조합의 단편화를 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 단편화는 고에너지 충돌 해리(HCD)를 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, HCD는 15% 내지 35%의 정규화된 충돌 에너지(NCE)를 포함하는, 방법.
  37. 제35항에 있어서, HCD는 20%의 정규화된 충돌 에너지(NCE)를 포함하는, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 관심 올리고뉴클레오티드의 온전한 질량을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 제2항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 추가 집단의 온전한 질량을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 질량 분광분석을 사용해 관심 올리고뉴클레오티드의 구조를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제2항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 추가 집단의 구조를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 구조는 뉴클레오티드 서열, 변형, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  43. 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a. 관심 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계; 및
    b. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 관심 올리고뉴클레오티드를 특성화하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 조성물 중 총 올리고뉴클레오티드의 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 98.5%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9%는 관심 올리고뉴클레오티드인, 방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 방법은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
  47. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제46항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  48. 제46항에 있어서, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  49. 제46항에 있어서, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 조성물.
  50. 샘플을 특성화하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a. 동일한 서열 및/또는 변형을 가진 관심 올리고뉴클레오티드 집단, 및 올리고뉴클레오티드의 추가 집단을 포함하는 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    b. 샘플을 액체 크로마토그래피 및 탠덤 질량 분광분석(MS/MS)으로 처리하여 관심 올리고뉴클레오티드 집단 및 올리고뉴클레오티드의 적어도 추가 집단에 상응하는 적어도 하나의 질량 분광분석도를 생성하는 단계로서,
    액체 크로마토그래피는 다음을 포함하고:
    i. 제1 완충액은 70% 아세토니트릴(ACN) 중 15 mM 포름산암모늄 또는 아세트산암모늄을 포함하고, 제2 완충액은 30% ACN 중 15 mM 포름산암모늄 또는 아세트산암모늄을 포함하는 이동상을 포함하는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC), 또는
    ii. 제1 완충액은 물 중 50 mM 헥사플루오로이소프로판올(HFIP) 및 5 mM N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA)을 포함하고, 제2 완충액은 아세토니트릴 중 50 mM HFIP 및 5 mM DIEA를 포함하는 이동상을 포함하는 이온쌍 형성 역상 액체 크로마토그래피(IP-RPLC);
    MS/MS는 15% 내지 35%의 정규화된 충돌 에너지(NCE)를 포함하는 고에너지 충돌 해리(HCD)를 사용하여 샘플에서 관심 올리고뉴클레오티드의 집단 및 올리고뉴클레오티드의 추가 집단를 단편화하는 것을 포함하는, 단계; 및
    c. 관심 올리고뉴클레오티드 집단에 상응하는 샘플 내 총 올리고뉴클레오티드의 백분율을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 추가 집단은 관심 올리고뉴클레오티드의 단편화 산물 또는 합성 부산물을 포함하는, 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 관심 올리고뉴클레오티드는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 또는 DNA-RNA 혼종인, 방법.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 이들의 조합인, 방법.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 올리고뉴클레오티드는 헤어핀 또는 줄기-루프 구조를 포함하는, 방법.
  55. 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 올리고뉴클레오티드의 길이는 15 내지 100개의 뉴클레오티드인, 방법.
  56. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 올리고뉴클레오티드는 치료 올리고뉴클레오티드인, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 치료 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), dsRNA, siRNA, 앱타머, 또는 마이크로RNA를 포함하는, 방법.
  58. 제50항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형을 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 관심 올리고뉴클레오티드의 5’ 말단, 3’ 말단, 또는 둘 다에 존재하는, 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 내부 핵염기에 대한 변형을 포함하는, 방법.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 관심 올리고뉴클레오티드의 결합 친화도, 결합 특이성, 안정성, 약동학, 또는 독성에 영향을 미치는, 방법.
  62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 잠금 핵산(LNA), 포스포로티오에이트(PS) 결합, 말단 5’ 또는 3’ 인산염(PO), 5’ 메틸(5-Me) 변형, 2’-O-메틸(2’-O-Me) 변형, 2’-O-메톡시에틸(2’-MOE) 변형, 구속된 에틸(cET) 유사체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  63. 제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, HILIC 크로마토그래피는 30℃의 컬럼 온도를 포함하는, 방법.
  64. 제50항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, HILIC 크로마토그래피는 3 μm의 평균 명목 입자 크기, 200 Å의 입자 기공 크기 중앙값, 2 mm의 내경, 150 mm의 컬럼 길이를 갖는 고상 컬럼을 포함하는, 방법.
  65. 제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, IP-RPLC는 1.7 μm, 올리고-XT 100 Å, 50 x 2.1 mm 컬럼을 포함하는, 방법.
  66. 제50항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, MS/MS는 전기분무 이온화(ESI)를 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, ESI는 나노-플로우 ESI를 포함하는, 방법.
  68. 제50항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 크로마토그래피는 샘플의 자외선(UV) 검출을 추가로 포함하는, 방법.
  69. 제50항 내지 제68항에 있어서, MS/MS는 데이터 의존적 수집(DDA)을 포함하는, 방법.
  70. 제50항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 관심 올리고뉴클레오티드의 온전한 질량 및/또는 관심 올리고뉴클레오티드의 집단 및 올리고뉴클레오티드의 추가 집단의 구조를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  71. 관심 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a. 관심 올리고뉴클레오티드를 합성하여 관심 올리고뉴클레오티드의 집단을 포함하는 샘플을 생성하는 단계; 및
    b. 제50항 내지 제70항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 샘플을 특성화하는 단계를 포함하는, 방법.
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