CN115552034A

CN115552034A - 液相色谱法和质谱法用于表征寡核苷酸的用途

Info

Publication number: CN115552034A
Application number: CN202180016257.4A
Authority: CN
Inventors: 黄名; 邱海波; 徐晓滨; 李宁
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2020-01-31
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2022-12-30
Also published as: AU2021212195A1; US20210239663A1; JP2023512075A; CA3165815A1; WO2021155139A1; MX2022009416A; BR112022014992A2; IL295038A; EP4097256A1; KR20220136376A

Abstract

本公开提供了使用液相色谱法和质谱法来表征所关注寡核苷酸的样品的方法。

Description

液相色谱法和质谱法用于表征寡核苷酸的用途

相关申请交叉引用

本申请要求于2020年1月31日提交的美国临时专利申请序列号62/968,368的优先权的权益，所述美国临时专利申请在此通过引用以其整体并入。

技术领域

本公开涉及分子生物学和治疗学领域。

通过引用并入序列表

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背景技术

治疗性寡核苷酸，如反义寡核苷酸和双链RNA(dsRNA)，大约在过去三十年里一直处于临床开发中。近来，许多治疗性寡核苷酸已被食品和药品管理局(Food and Drugadministration)批准用于向患者施用。然而，活性药物成分(API)和药物产物，包含治疗性寡核苷酸，必须满足某些质量阈值，以适于向受试者施用。因此，本领域需要用于表征寡核苷酸组合物的方法。本公开提供了用于以高度灵敏度和精度来表征寡核苷酸组合物的另外的方法。

发明内容

本公开提供了表征包括所关注寡核苷酸的群体的样品的方法，所述方法包括：(a)提供样品，所述样品包括具有相同序列的所关注寡核苷酸的群体；(b)对所述样品进行液相色谱法和质谱法，由此产生与所述所关注寡核苷酸的群体相对应的至少一个质谱图；以及(c)确定所述样品中与所述所关注寡核苷酸的群体相对应的总寡核苷酸的百分比。

在本公开的方法的一些实施例中，所述样品进一步包括至少一种杂质，所述至少一种杂质包括至少一个另外的寡核苷酸的群体。在一些实施例中，所述另外的寡核苷酸的群体包括所述所关注寡核苷酸的碎片化产物或合成副产物。

在本公开的方法的一些实施例中，所述方法进一步包括产生与所述至少一个另外的寡核苷酸的群体相对应的质谱图，以及确定所述样品中与所述至少一个另外的寡核苷酸的群体相对应的总寡核苷酸的百分比。

在本公开的方法的一些实施例中，所述所关注寡核苷酸为脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或DNA-RNA杂交体。在一些实施例中，所述所关注寡核苷酸为单链的。在一些实施例中，所述所关注寡核苷酸为双链的。在一些实施例中，所述所关注寡核苷酸包括发夹结构或茎-环结构。在一些实施例中，所述所关注寡核苷酸的长度介于15个核苷酸与100个核苷酸之间。

在本公开的方法的一些实施例中，所述所关注寡核苷酸为治疗性寡核苷酸。在一些实施例中，所述治疗性寡核苷酸包括反义寡核苷酸(ASO)、dsRNA、siRNA、核酸适配体或微RNA。

在本公开的方法的一些实施例中，所述所关注寡核苷酸包括至少一个修饰。在一些实施例中，所述至少一个修饰位于所述所关注寡核苷酸的5'端、3'端或两者处。在一些实施例中，所述至少一个修饰包括对所述所关注寡核苷酸的至少一个内部核碱基的修饰。在一些实施例中，所述至少一个修饰影响所述所关注寡核苷酸的结合亲和力、结合特异性、稳定性、药代动力学或毒性。在一些实施例中，所述至少一个修饰包括锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯(PS)键、末端5'或3'磷酸酯(PO)、5'甲基(5-Me)修饰、2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)修饰、约束乙基(cET)核苷类似物、聚乙二醇(PEG)或其组合。

在本公开的方法的一些实施例中，所述液相色谱法包括亲水相互作用液相色谱法(HILIC)。在一些实施例中，所述HILIC包括流动相缓冲液，所述流动相缓冲液包括乙酸铵。在一些实施例中，所述流动相包括第一缓冲液和第二缓冲液，所述第一缓冲液包括含15mM乙酸铵的70％乙腈(ACN)，所述第二缓冲液包括含15mM乙酸铵的30％(ACN)。在一些实施例中，所述HILIC包括流动相缓冲液，所述流动相缓冲液包括甲酸铵。在一些实施例中，所述流动相包括第一缓冲液和第二缓冲液，所述第一缓冲液包括含15mM甲酸铵的70％乙腈(ACN)，所述第二缓冲液包括含15mM甲酸铵的30％(ACN)。在一些实施例中，HILIC分离包括介于23℃与50℃之间的柱温度。在一些实施例中，HILIC分离包括30℃的柱温度。在一些实施例中，所述HILIC包括具有平均标称粒径为3μm，中值颗粒孔径为

的固相，内径为2mm，并且长度柱为150mm的柱。

在本公开的方法的一些实施例中，所述液相色谱法包括离子配对反相液相色谱法(Ion-pairing Reversed-Phase Liquid Chromatography，IP-RPLC)。在一些实施例中，所述IP-RPLC包括流动相缓冲液，所述流动相缓冲液包括六氟异丙醇(HFIP)和5mM N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。在一些实施例中，所述流动相包括第一缓冲液和第二缓冲液，所述第一缓冲液包括含50mM HFIP和5mM DIEA的水溶液，所述第二缓冲液包括含50mM HFIP和5mM DIEA的乙腈。在一些实施例中，所述IP-RPLC包括具有平均标称粒径1.7μm、中值颗粒孔径

柱长度100mm和内径2.1mm的柱。在一些实施例中，所述IP-RPLC包括1.7μm Oligo-XT

50x 2.1mm柱。

在本公开的方法的一些实施例中，所述质谱法包括电喷雾电离(ESI)。在一些实施例中，所述ESI包括纳流ESI。

在本公开的方法的一些实施例中，所述液相色谱法进一步包括对所述样品的紫外(UV)检测。

在本公开的方法的一些实施例中，所述质谱法为串联质谱法(MS/MS)。在一些实施例中，所述MS/MS包括数据依赖性采集(DDA)。在一些实施例中，所述MS/MS包括对所述所关注寡核苷酸的群体、至少另外的寡核苷酸的群体或其组合的碎片化。在一些实施例中，所述碎片化包括更高能碰撞解离(HCD)。在一些实施例中，所述HCD包括15％到35％的归一化碰撞能量(NCE)。在一些实施例中，所述HCD包括20％的NCE。

在本公开的方法的一些实施例中，步骤(c)包括确定所述所关注寡核苷酸的完整质量。在一些实施例中，步骤(c)进一步包括确定所述至少一个另外的寡核苷酸的群体的完整质量。在一些实施例中，步骤(c)包括使用质谱法确定所述所关注寡核苷酸的结构。在一些实施例中，步骤(c)进一步包括确定所述至少一个另外的寡核苷酸的群体的结构。在一些实施例中，所述结构包含核苷酸序列、修饰或其组合。

本公开提供了制备包括所关注寡核苷酸的组合物的方法，所述方法包括：(a)合成所述所关注寡核苷酸；以及(b)使用本公开的所述方法表征所述所关注寡核苷酸。

在本公开的方法的一些实施例中，所述组合物中的总寡核苷酸的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％为所述所关注寡核苷酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括添加药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本公开提供了包括使用本文所述的方法制备或表征的所关注寡核苷酸的组合物。

本公开提供了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用本公开的组合物。

根据权利要求46所述的组合物，其在治疗有需要的受试者的方法中使用。

根据权利要求46所述的组合物，其用于制造用于治疗有需要的受试者的药物。

本公开提供了表征样品的方法，所述方法包括：(a)提供样品，所述样品包括具有相同序列和/或修饰的所关注寡核苷酸的群体以及至少一种杂质，所述至少一种杂质包括另外的寡核苷酸的群体；(b)对所述样品进行液相色谱法和串联质谱法(MS/MS)，其中所述液相色谱法包括：(i)包括流动相的亲水相互作用液相色谱法(HILIC)，其中第一缓冲液包括含15mM甲酸铵或乙酸铵的70％乙腈(ACN)，并且第二缓冲液包括含15mM甲酸铵或乙酸铵的30％ACN；或者(ii)包括流动相的离子配对反相液相色谱法(IP-RPLC)，其中第一缓冲液包括含50mM六氟异丙醇(HFIP)和5mM N,N-二异丙基乙胺(DIEA)的水溶液，并且第二缓冲液包括含50mM HFIP和5mM DIEA的乙腈；其中所述MS/MS包括使用更高能碰撞解离(HCD)对所述样品中的所述所关注寡核苷酸的群体和所述另外的寡核苷酸的群体的碎片化，所述HCD包括15％到35％的归一化碰撞能量(NCE)，由此产生与所述所关注寡核苷酸的群体和所述另外的寡核苷酸的群体相对应的至少一个质谱图；以及(c)确定所述样品中与所述所关注寡核苷酸的群体相对应的总寡核苷酸的百分比。

在本公开的方法的一些实施例中，所述另外的寡核苷酸的群体包括所述所关注寡核苷酸的碎片化产物或合成副产物。

在本公开的方法的一些实施例中，所述所关注寡核苷酸为脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或DNA-RNA杂交体。在一些实施例中，所述所关注寡核苷酸为单链的、双链的或其组合。在一些实施例中，所述所关注寡核苷酸包括发夹结构或茎-环结构。在一些实施例中，所述所关注寡核苷酸的长度介于15个核苷酸与100个核苷酸之间。

在本公开的方法的一些实施例中，所述HILIC色谱法包括30℃的柱温度。在一些实施例中，所述HILIC色谱法包括具有平均标称粒径为3μm，中值颗粒孔径为

的固相，内径为2mm，并且长度柱为150mm的柱。在一些实施例中，所述IP-RPLC包括1.7μm Oligo-XT

50x 2.1mm柱。

在本公开的方法的一些实施例中，所述MS/MS包括电喷雾电离(ESI)。在一些实施例中，所述ESI包括纳流ESI。在一些实施例中，所述MS/MS包括数据依赖性采集(DDA)。

在本公开的方法的一些实施例中，步骤(c)包括确定所述所关注寡核苷酸的群体和所述另外的寡核苷酸的群体的完整质量和/或结构。

本公开提供了用于在治疗有需要的受试者的方法中使用的组合物，所述方法包括施用本公开的所述组合物。

本公开提供了用于制造用于治疗有需要的受试者的方法的药物的组合物，所述方法包括施用本公开所述的组合物。

附图说明

图1是一系列色谱图，其示出了使用Phenomenex Luna-HILIC柱和含乙酸铵的流动相对硫代磷酸酯(PS)修饰的寡核苷酸和未经修饰的寡核苷酸进行的亲水相互作用液相色谱法紫外检测(HILIC-UV)。

图2A是使用HILIC-UV检测得到的一系列色谱图，其从顶部到底部示出了硫代磷酸寡核苷酸(ODN)奥利默森(Oblimersen)、硫代磷酸酯ODN福米韦生(Formivirsen)、寡核苷酸CMV-F、寡核苷酸M13-R、寡核苷酸SP6、寡核苷酸TRC-F、寡核苷酸T3和寡核苷酸T7。MPA：含15mM乙酸铵的70％ACN；MPB：含15mM乙酸铵的30％ACN。

图2B是使用HILIC-UV检测得到的一系列色谱图，其从顶部到底部示出了硫代磷酸酯ODN奥利默森、硫代磷酸酯ODN福米韦生、寡核苷酸CMV-F、寡核苷酸M13-R、寡核苷酸SP6、寡核苷酸TRC-F、寡核苷酸T3和寡核苷酸T7。MPA：含15mM甲酸铵的70％ACN；MPB：含15mM甲酸铵的30％ACN。

图3A是使用未经修饰的寡核苷酸CMV-F和15mM乙酸铵缓冲体系比较在50℃、40℃、30℃和23℃(从左到右排列的主峰)下HILIC-UV系统的分析性能的色谱图。

图3B是使用PS-寡核苷酸奥利默森和15mM乙酸铵缓冲体系比较在50℃、40℃、30℃和23℃(从左到右排列的主峰)下HILIC-UV系统的分析性能的色谱图。

图4是一系列色谱图，其示出了在Waters Acquity寡核苷酸BEH柱上对PS修饰的寡核苷酸和未经修饰的寡核苷酸进行的离子配对反相液相色谱法和紫外(IP-RPLC-UV)检测。从顶部到底部，寡核苷酸为：硫代磷酸酯ODN福米韦生和奥利默森、寡核苷酸CMV-F、M13-R、寡核苷酸SP6、寡核苷酸TRC-F、寡核苷酸T3和寡核苷酸T7。

图5是色谱图，其示出了在Waters Acquity UPLC寡核苷酸BEH C18柱

1.7μm、2.1mm x 100mm上对20pmol MassPrep OST标准寡核苷酸进行的离子配对反相液相色谱法-UV检测(IP-RPLC-UV)分离。

图6是色谱图，其示出了在Clarity 1.7μm Oligo-XT

LC柱2.1mm x 50mm上对20pmol MassPrep OST标准寡核苷酸进行的IP-RPLC-UV分离。

图7是示出了用HILIC-DDA(亲水性相互作用液相色谱法和串联质谱法的数据依赖性采集模式)分析的M13-R寡核苷酸样品的m/z(质荷比)(x轴)对相对丰度(y轴)的质谱。用pH为大约3.2的甲酸铵缓冲HILIC流动相。

图8是示出了用HILIC-DDA分析的M13-R寡核苷酸(SEQ ID NO:1)样品的m/z比(x轴)对相对丰度(y轴)的质谱。用pH为大约5.8的乙酸铵缓冲HILIC流动相。

图9为SEQ ID NO:1的M13-R寡核苷酸样品的m/z比(x轴)对相对丰度(y轴)的关系图，所述样品用IPRP-LC-DDA(离子配对反相液相色谱法和串联质谱法的数据依赖性采集模式)进行了分析。IPRP流动相包括pH大于10的DIEA(N,N-二异丙基乙胺)。

图10A是示出了M13-R寡核苷酸样品的质量对强度的绘图。插入表提供了全长M13-R的理论质量和观察到的质量以及以百万分率(ppm)为单位的质量误差。

图10B为表格，其示出了全长M13-R(参考)和在核苷酸4-17处截短的M13-R的相对丰度。通过完整质量分析计算截短杂质的相对丰度。样品为0.09％的4-17核苷酸截短产物和99.91％的参考M13-R。

图11A是示出了未经修饰的CMV-F寡核苷酸样品的质量对强度的绘图。插入表提供了全长CMV-F的理论质量和观察到的质量以及以ppm为单位的质量误差。

图11B是示出了全长CMV-F(CMV-F参考)和在核苷酸5-21和1-19处截短的CMV-F的相对丰度的表。通过完整质量分析计算截短杂质的相对丰度。样品为1.19％的5-21核苷酸截短产物、7.49％的1-19核苷酸截短产物和91.31％的参考。

图12A是示出了硫代磷酸酯(PS)修饰的寡核苷酸福米韦生样品的质量对强度的绘图。插入表提供了全长福米韦生的理论质量和观察到的质量以及以ppm为单位的质量误差。

图12B是示出了全长福米韦生(福米韦生参考)和在核苷酸6-21、4-21和1-15处截短的福米韦生的相对丰度的表。通过完整质量分析计算截短杂质的相对丰度。样品为2.22％的6-21核苷酸截短产物、0.50％的4-21核苷酸截短产物、1.43％的1-15核苷酸截短产物和95.86％的参考。

图13是寡核苷酸的串联质谱法(MS/MS)碎片化方案的图。

图14A是一对示出了使用两种代表性寡核苷酸M13-R和TRC-F(分别为左图和右图)进行的HILIC-MS/MS(串联质谱法)的不同较高能量的碰撞解离(HCD)碰撞能量的峰面积(y轴)的绘图。

图14B是代表性寡核苷酸TRC-F的示出了m/z(x轴)和相对丰度的代表性HILIC-MS/MS绘图。

图15是示出了用20的HCD对寡核苷酸T7的[M-4H]^4-(m/z 1530.2549)前体进行的碎片化的绘图。

图16是一对示出了通过寡核苷酸CMV-F的纳流IPRP-LC-MS/MS实现的碎片化效率提高的绘图。

图17是一对示出了通过寡核苷酸CMV-F的纳流IPRP-LC-MS/MS实现的碎片化效率提高的绘图。

图18是示出了用20的寡核苷酸HCD对T7的[M-8H]^8-(m/z 898.0009)前体进行的碎片化的绘图。图18中的寡核苷酸序列为T7序列(SEQ ID NO:3)。

图19A-19C示出了基于硫代磷酸酯(PS)寡核苷酸修饰的碎片离子的转化。在图19C中示出了未经修饰和经修饰的奥利默森碎片的电荷状态和对应质量。

图20是示出了用20的HCD对PS修饰的寡核苷酸奥利默森的[M-4H]^4-(m/z1419.8799)前体进行的碎片化的绘图。

具体实施方式

发明人发现，寡核苷酸组合物，包含包括经修饰的寡核苷酸的组合物，可以使用液相色谱法和质谱法以高度准确度表征。寡核苷酸组合物可以含有杂质，如由储存条件而引入的全长寡核苷酸的降解产物，或源于寡核苷酸合成的在核苷酸序列或修饰方面具有误差的另外的产物。本文所述的方法可以用于确定本文所述的寡核苷酸组合物中的这些杂质的身份和丰度。

因此，本公开提供了表征包括所关注寡核苷酸的群体的样品的方法，所述方法包括：(a)提供包括具有相同序列的所关注寡核苷酸的群体的样品；(b)对所述样品进行液相色谱法和质谱法，由此产生与所关注寡核苷酸相对应的至少一个质谱图；以及(c)确定所述样品中与所述所关注寡核苷酸的群体相对应的总寡核苷酸的百分比。

在一些实施例中，所述样品进一步包括至少一种杂质，所述至少一种杂质例如包括另外的寡核苷酸的群体，并且此另外的群体还使用本文所述的方法进行分析。在一些实施例中，所述方法进一步包括产生与至少一种杂质相对应的质谱图，以及确定所述样品中与所述至少一种杂质相对应的总寡核苷酸的百分比。

在一些实施例中，表征样品的方法包括(a)提供样品，所述样品包括具有相同序列的所关注寡核苷酸的群体以及至少一种杂质，所述至少一种杂质包括与所关注寡核苷酸的序列不同的另外的寡核苷酸的群体；(b)对所述样品进行液相色谱法和质谱法，由此产生至少一个质谱图；以及(c)确定所述样品中与所述所关注寡核苷酸的群体相对应的总寡核苷酸的百分比。在一些实施例中，另外的寡核苷酸的群体包括所关注寡核苷酸的一种或碎片化产物或合成副产物。

在一些实施例中，步骤(c)包括确定所关注寡核苷酸的完整质量，以及任选地，与至少一种杂质相对应的寡核苷酸。在一些实施例中，确定样品中与所关注寡核苷酸的群体相对应的总寡核苷酸的百分比包括使用质谱法确定所关注寡核苷酸，以及任选地，与至少一种杂质相对应的寡核苷酸的结构。在一些实施例中，所述结构包含核苷酸序列、修饰或其组合。

本公开进一步提供了制备包括所关注寡核苷酸的组合物的方法，所述方法包括：(a)使用本领域已知的任何合适的方法合成所关注寡核苷酸，由此提供包括所关注寡核苷酸的群体的样品；以及(b)使用本文所述的方法来表征包括所关注寡核苷酸的群体的样品。在一些实施例中，所述方法包括选择样品，所述样品包括如通过本文所述的方法所确定的具有期望特性的所关注寡核苷酸的群体。例如，所述方法可以包含选择具有期望纯度的所关注寡核苷酸的样品。

本公开进一步提供了包括所关注寡核苷酸的药物组合物，以及制备和使用所述药物组合物来治疗受试者的疾病或病症的方法。在一些实施例中，所述受试者是人。

定义

如本文所用，术语“寡核苷酸(oligonucleotide)”、“寡核苷酸(oligo)”、“多核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸”可互换使用并且涵盖RNA和DNA两者，包含cDNA、基因组DNA、mRNA和合成(例如，经化学合成的)DNA或RNA以及RNA和DNA的嵌合体或模拟物。所述术语是指核苷酸链，与链的长度无关。核酸可以是双链或单链的。在单链的情况下，核酸可以是有义链或反义链。本发明进一步提供了一种核酸，所述核酸为本公开的核酸、核苷酸序列或多核苷酸的补体(所述补体可以是完整补体或部分补体)。

这些术语还包含包括经修饰的核苷或核苷酸的寡核苷酸，例如通过标准磷酸二酯键或其它键共价连接的具有含氮杂环碱基或碱基类似物的那些寡核苷酸。在核酸中，骨架可以由多个键构成，所述多个键包含以下中的一种或多种：糖-磷酸二酯键、肽-核酸(PNA)键(PCT第WO 95/32305号)、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键或其组合。核酸的糖部分可以为核糖、脱氧核糖或具有如2'甲氧基和2'卤化物(如2'-F)取代等取代的类似化合物。含氮碱基可以是常规碱基(A、G、C、T、U)；其类似物(例如，肌苷；《核酸生物化学(Biochemistry ofthe Nucleic Acids)》,5-36,Adams等人,编辑,第11版,1992)；嘌呤碱基或嘧啶碱基的衍生物(例如，N⁴-甲基脱氧鸟苷、去氮杂嘌呤或氮杂嘌呤、去氮杂嘧啶或氮杂嘧啶)；在各个化学位置的任何化学位置处具有经改变的取代基或替代取代基的嘧啶或嘌呤，例如，2-氨基-6-甲基氨基嘌呤、O⁶-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶和O⁴-烷基-嘧啶；或吡唑并化合物，如未经取代的或3-取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶(例如，美国专利第5,378,825号、美国专利第6,949,367号和PCT第WO 93/13121号)。核酸可以包含“无碱基”位置，在所述位置中骨架在一个或多个位置处不具有含氮碱基(美国专利第5,585,481号)，例如，一个或多个无碱基位置可以形成将单独寡核苷酸序列连接在一起的连接子区。核酸可以仅包括在常规RNA和DNA中发现的常规糖、碱基和键或者可以包含常规组分和取代(例如，通过2'甲氧基骨架连接的常规碱基，或含有常规碱基和一种或多种类似物的混合物的聚合物)。

“寡核苷酸”可以指任何长度的核酸聚合物。在一些实施例中，寡核苷酸由少于1,000个核苷酸(nt)构成，包含长度的大小范围为约5-200个核苷酸的那些寡核苷酸，下限为约2nt到5nt并且上限为约500nt到900nt，或下限为5nt到15nt并且上限为50nt到500nt，或下限为10nt到20nt并且上限为25nt到150nt的那些寡核苷酸。

“分离的寡核苷酸”是指与其紧密接邻的核苷酸序列(一个位于5'端，并且一个位于3'端)在其所来源的生物体的天然存在的基因组中并不是紧密接邻的核苷酸序列(例如，DNA或RNA)。因此，所述术语包含，例如，并入到载体或作为独立于其它序列的单独分子存在的重组DNA(例如，通过化学合成产生的寡核苷酸)。其还包含作为编码另外的多肽或肽序列的混合核酸的一部分的重组DNA。“分离的”并不意味着制剂在技术上是纯的(同质的)，但其纯到足以提供呈其可以用于预期目的的形式的核酸。

如适用于寡核苷酸的术语“片段”将被理解为意指相对于参考核酸或核苷酸序列长度减小并且包括接邻核苷酸的与参考核酸或核苷酸序列相同或几乎相同(例如，90％、92％、95％、98％、99％相同)的核苷酸序列、基本上由所述核苷酸序列组成和/或由所述核苷酸序列组成的核苷酸序列。根据本发明的此核酸片段可以在适当的情况下包含在所述核酸片段作为成分的较大多核苷酸中。在一些实施例中，这些片段可以包括长度为核酸或核苷酸序列的至少约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、75个、100个、150个、200个或更多个连续核苷酸的寡核苷酸、基本上由所述寡核苷酸组成和/或由所述寡核苷酸组成。

如本文所用，术语“基因”是指能够被用来产生mRNA、反义RNA、miRNA等的核酸分子。基因能够或者可能不能够被用来产生功能性蛋白质。基因可以包含编码区和非编码区两者(如内含子、调控元件、启动子、增强子、终止序列以及5'和3'非翻译区)。

如本文所用，“信使RNA”或“mRNA”是指与基因的遗传序列相对应的单链RNA分子并且在合成蛋白质的过程中被核糖体读取。

如本文所用，“互补”寡核苷酸为能够根据标准沃森-克里克互补规则(standardWatson-Crick complementarity rules)进行碱基配对的那些寡核苷酸。具体地，嘌呤将与嘧啶碱基配对以形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)和在DNA的情况下腺嘌呤与胸腺嘧啶配对(A:T)，或者在RNA的情况下腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)的组合。例如，序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。应当理解，即使在两个寡核苷酸不是彼此完全互补的情况下两个寡核苷酸也可以彼此杂交，条件是每个寡核苷酸具有至少一个与另一个寡核苷酸基本上互补的区。

如本文所用，术语“互补”或“互补性”是指寡核苷酸在允许的盐和温度条件下通过碱基配对天然结合。两个单链分子之间的互补性可以是“部分的”，其中核苷酸中的仅一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在完全互补性时所述互补性可以是完全的。核酸链之间的互补性的程度对核酸链之间的杂交的效率和强度有显著影响。如本文所用，术语“基本上互补”或“部分互补”意指两个核酸序列的至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸是互补的。术语“基本上互补”和“部分互补”还可以意指两个核酸序列可以在高严格条件下杂交，并且这种条件是本领域众所周知的。

如本文所用，“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸或多肽序列在组分，例如核苷酸或氨基酸的整个比对窗口中不变的程度。“同一性”可以通过已知方法容易地计算，所述方法包含但不限于以下文献中描述的那些：《计算分子生物学(ComputationalMolecular Biology)》(Lesk,A.M.,编辑)纽约牛津大学出版社(Oxford UniversityPress,New York)(1988)；《生物计算：信息学和基因组计划(Biocomputing:Informaticsand Genome Projects)》(Smith,D.W.,编辑)纽约学术出版社(Academic Press,NewYork),(1993)；《序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data)》,第I部分(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.,编辑)新泽西胡玛纳出版社(Humana Press,NewJersey),(1994)；《分子生物学的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)》(von Heinje,G.,编辑)学术出版社(1987)；以及《序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)》(Gribskov,M.和Devereux,J.,编辑)纽约斯托克顿出版社(Stockton Press,NewYork),(1991)。

用于比对比较窗口的最佳序列比对是本领域的技术人员是众所周知的。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是与全长多核苷酸序列或其部分的比较或者与更长的多核苷酸序列的比较。例如，同一性百分比可以使用用于翻译的核苷酸序列的BLASTX2.0版和用于多核苷酸序列的BLASTN 2.0版来确定。用于确定序列同一性的可用方法还在《巨型计算机指南(Guide to Huge Computers)》(Martin J.Bishop,编辑,圣地亚哥学术出版社(Academic Press,San Diego),(1994))以及Carillo,H.和Lipton,D.(《应用数学(Applied Math)》48:1073(1988))中公开。用于确定序列同一性的计算机程序包含但不限于基本局部比对搜索工具(BLAST)程序，所述程序可从位于马里兰州贝塞斯达国家卫生研究所国家医学图书馆(National Library ofMedicine,National Institute of Health,Bethesda,Md.)的国家生物技术信息中心(National Center Biotechnology Information，NCBI),20894公开获得；参见《BLAST手册(BLAST Manual)》,Altschul等人,NCBI，NLM，NIH；(Altschul等人,《生物分子学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-410(1990))；BLAST程序的2.0版或更高版本允许将间隙(缺失和插入)引入到比对中；对于肽序列，可以使用BLASTX来确定序列同一性；并且对于多核苷酸序列，可以使用BLASTN来确定序列同一性。

如本文所用，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指在两个序列进行最佳比对(利用适当的核苷酸插入、缺失或间隙)时，相较于测试(“受试者”)多核苷酸分子(或其互补链)，相同核苷酸占参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列的百分比。在一些实施例中，“同一性百分比”可以指相同氨基酸占氨基酸序列的百分比。

如本文所用，术语“基本上相同”或“与...相对应”意指两个核酸序列具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性。在一些实施例中，两个核酸序列可以具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

本说明书中提及的所有公开、专利以及专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开、专利或专利申请被专门地且单独地指示通过引用并入。

所关注寡核苷酸

本公开提供了已使用本文所述的液相色谱法和质谱法方法进行表征的所关注寡核苷酸以及包括所关注寡核苷酸的群体的组合物。所关注寡核苷酸的表征包含，除其它外，确定所关注核苷酸的完整质量、结构和序列，以及组合物中作为所关注寡核苷酸的总寡核苷酸的百分比。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸为治疗性寡核苷酸。治疗性寡核苷酸包含但不限于信使RNA(mRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、双链RNA(dsRNA)，如小干扰RNA(siRNA)和微RNA。治疗性寡核苷酸被施用于受试者以调节靶基因的表达，由此治疗受试者的疾病或病症。受试者可以包含哺乳动物，如大鼠、小鼠、灵长类动物和人类。在一些实施例中，所述受试者是人。

如本文所用，“反义寡核苷酸”为靶向细胞中作为细胞酶RNA酶H的底物的mRNA并且由此导致靶向的mRNA特异性降解的寡核苷酸。在一些实施例中，反义寡核苷酸包括单链DNA分子。不希望受理论的束缚，认为此单链DNA分子与靶RNA杂交，从而诱导RNA酶H切割DNA/RNA杂交体。磷酸二酯和硫代磷酸酯两者连接的DNA可以激活内源性RNA酶H，由此切割靶向的RNA。可替代地，反义寡核苷酸可以通过空间位阻起作用，即通过物理地阻断靶mRNA的翻译或剪接。

本公开的反义寡核苷酸包括与靶RNA(例如，由靶基因产生的mRNA或非编码RNA)的序列互补或基本上互补的核苷酸。在一些实施例中，反义寡核苷酸的长度介于5个核苷酸与50个核苷酸之间，长度介于8个核苷酸与50个核苷酸之间，长度介于10个核苷酸与40个核苷酸之间，长度介于15个核苷酸与40个核苷酸之间，长度介于20个核苷酸与30个核苷酸之间或长度介于18个核苷酸与30个核苷酸之间。

在一些实施例中，治疗性寡核苷酸为dsRNA或siRNA。RNA干扰(RNAi)是使用双链RNA(dsRNA)以沉默基因表达的过程。虽然不希望受理论束缚，但RNAi开始于通过RNA酶III状酶dicer将较长dsRNA切割成小干扰RNA(siRNA)。siRNA是长度通常为约19个核苷酸到28个核苷酸，或20个核苷酸到25个核苷酸，或21个核苷酸到22个核苷酸，并且通常含有2-核苷酸3'突出端以及5'磷酸末端和3'羟基末端的dsRNA。siRNA的一条链被并入到被称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的核糖核蛋白复合体中。RISC使用此siRNA链来标识与并入的siRNA链至少部分互补的mRNA分子，并且然后切割这些靶mRNA或抑制所述靶mRNA的翻译。因此，被并入到RISC中的siRNA链被称为向导链或反义链。另一条siRNA链，被称为过客链或有义链，从siRNA中消除并且至少部分地与靶mRNA同源。本领域的技术人员将认识到，原则上，siRNA的任一条链都可以被并入到RISC中并且作为向导链起作用。然而，siRNA设计(例如，反义链的5'端处的siRNA双链体稳定性降低)可以有利于反义链并入到RISC中。

具有与向导链至少部分互补的序列的mRNA的RISC介导的切割导致所述mRNA和由此mRNA编码的对应蛋白质的稳态水平下降。可替代地，RISC还可以在不切割靶mRNA的情况下通过翻译抑制降低对应蛋白质的表达。其它RNA分子和RNA样分子也可以与RISC相互作用并且沉默基因表达。可以与RISC相互作用的其它RNA分子的实例包含短发夹RNA(shRNA)、单链siRNA、微RNA(miRNA)和dicer-底物27-mer双链体。除非另有说明，否则如本文所用的术语“siRNA”是指双链干扰RNA。可以与RISC相互作用的RNA样分子的实例包含含有一个或多个经化学修饰的核苷酸、一个或多个脱氧核糖核苷酸和/或一个或多个非磷酸二酯键的RNA分子。

在一些实施例中，治疗性寡核苷酸包括siRNA或dsRNA。在一些实施例中，siRNA或dsRNA具有有义链和反义链，并且有义链和反义链包括至少19个核苷酸具有至少接近完美接邻互补性的区。在一些实施例中，siRNA或dsRNA具有有义链和反义链，并且分别地，反义链包括至少19个核苷酸与基因中的靶序列具有至少接近完美接邻互补性的区，并且有义链包括至少19个核苷酸与基因的靶序列具有至少接近完美接邻同一性的区。在一些实施例中，siRNA或dsRNA包括至少13个、14个、15个、16个、17个或18个接邻核苷酸分别与mRNA内的对应靶序列的3'端的倒数13个、14个、15个、16个、17个或18个核苷酸具有序列互补性百分比或序列同一性百分比的区。

用于选择siRNA和dsRNA的靶序列的技术是本领域已知的，并且按基于web的设计工具，例如，英杰公司(Invitrogen)、Dharmacon公司(Dharmacon)、整合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)、金斯瑞公司(Genscript)或培瑞克公司(Proligo)网站提供。初始搜索参数可以包含介于35％与55％之间的G/C含量和介于19个核苷酸与27个核苷酸之间的siRNA长度。靶序列可以位于编码区或靶mRNA的5'或3'非翻译区中。

在一些实施方案中，治疗性寡核苷酸为微RNA。微RNA(miRNA)为非蛋白质编码的RNA，其长度通常介于约18个核苷酸到约25个核苷酸之间。这些miRNA引导靶转录本转译的直接切割，从而负向调控参与各种调控和发育通路的靶基因的表达。许多微RNA基因(MIR基因)已被标识并且使得可在数据库(miRBase；microrna.sanger.ac.uk/sequences)中公开获得。miRNA在美国专利公开2005/0120415和2005/144669A1中也进行了描述，所述文献的全部内容通过引用并入本文。

编码miRNA的基因产生长度为70bp到300bp的可能形成不完美茎环结构的初级miRNA(被称为“pri-miRNA”)。单个pri-miRNA可以含有一个到几个miRNA前体。在动物中，pri-miRNA在细胞核中被RNA酶III酶Drosha和其辅因子DGCR8/Pasha处理成约65nt的较短发夹RNA(pre-miRNA)。然后，pre-miRNA被输出到细胞质，在所述细胞质中，pre-miRNA被另一种RNA酶III酶Dicer进一步处理，从而释放大小为约22nt的miRNA/miRNA*双链体。

示例性的但非限制性的治疗性RNA包含治疗性反义RNA，如福米韦生(Formivirsen)(也被称为Vitravene^TM)，其可以用于治疗巨细胞病毒视网膜炎；米泊美生(Mipomerse)(Kynamro^TM)，其可以用于治疗纯合子性家族性高胆固醇血症的；诺西那生(Nusinersen)

其用于治疗脊髓性肌肉萎缩；帕替西朗(Patisiran)

其用于治疗多发性神经病；伊诺特森(Inotersen)

其用于治疗患有遗传性转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变的成人的神经损伤；依特普森(Eteplirsen)(Exondys

)，其用于治疗杜氏肌营养不良症；戈洛迪森(Golodirsen)(Vyondys

)，其用于治疗杜氏肌营养不良症；吉沃西兰(Givosiran)

其用于治疗急性肝卟啉症。另外的治疗性RNAs包含哌加他尼(Pegaptanib)

其可以用于治疗年龄相关的黄斑病变。

在一些实施例中，治疗性RNA是个性化的，即已针对单个患者开发。独特个性化治疗性RNA的实例包含米拉素(Milasen)，所述米拉素被开发用于治疗特定的CLN7突变。

示例性但非限制性RNA疗法包含癌症疫苗，以及用于传染病的疫苗。例如，Heblisav-

为重组乙型肝炎疫苗，并且莫德纳公司(Moderna)以及辉瑞和德国生物新技术公司(Pfizer and BioNTech)两者均已开发了针对严重急性呼吸综合征2(SARS-CoV-2)，即引起COVID-19的病毒的mRNA疫苗。mRNA还可以用于基于mRNA的基因疗法。

如本文所用，“调节mRNA表达”包含施用足以例如通过mRNA切割和降解或通过直接抑制翻译来减少靶mRNA到蛋白质的翻译的量的治疗性寡核苷酸。靶mRNA或对应蛋白质的表达减少通常被称为“敲低”，并且是相对于施用或表达非靶向对照RNA(例如，非靶向对照siRNA)之后存在的水平报告的。敲低或减少可以是完全的或部分的，并且任何程度的敲低都被设想为在本公开的寡核苷酸的范围内。

如本文所用，术语“抑制”或“减少”或其语法变体是指指定水平或活性降低或减少了至少约15％、25％、35％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、95％或更多。在一些实施例中，抑制或减少导致有很少的可检测到的活性或基本上没有可检测到的活性(至多，不显著的量，例如，少于约10％或甚至5％)。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸不是治疗性的。例如，本公开的所关注寡核苷酸包含用于体外操纵或标记细胞的所关注寡核苷酸。

寡核苷酸修饰

本文提供了包括一个或多个经修饰的核碱基的所关注寡核苷酸。此经修饰的核碱基可以位于寡核苷酸的5'端、寡核苷酸的3'端、内部核碱基或其任何组合处。修饰可以是对嘌呤或嘧啶进行的。修饰可以是对以下中的任一种进行的：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)或尿嘧啶(U)或其任何组合。

如本文所述，术语“核碱基”是指通常存在于DNA或RNA中，由与糖连接的嘌呤或嘧啶碱基组成的化合物(例如腺苷)。核苷包括与糖(核糖或脱氧核糖)共价连接但不具有磷酸酯基团的含氮碱基。核苷酸包括含氮碱基、糖(核糖或脱氧核糖)和一个到三个磷酸酯基团。

在一些实施例中，对所关注寡核苷酸的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核碱基进行修饰。在一些实施例，例如，所关注寡核苷酸的长度大于30个核苷酸的那些实施例中，可以对所关注寡核苷酸的多于30个核碱基进行修饰。在一些实施例中，对所关注寡核苷酸的所有核碱基进行修饰。在一些实施例中，对所关注寡核苷酸的一个核碱基，例如末端5'或3'核碱基，通常被称为5'或3'端进行修饰。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的一个或多个核碱基的修饰影响所关注寡核苷酸的结合亲和力、结合特异性(例如到靶mRNA)、稳定性、药代动力学或毒性。在一些实施例中，毒性为肝毒性。结合亲和力是指单个生物分子(例如蛋白质或DNA)与其配体/结合伴侣之间的结合相互作用的强度，而结合特异性是指所关注寡核苷酸能够优于其它分子与一个分子结合。

在一些实施例中，经修饰的所关注寡核苷酸基本上无毒性并且是非诱变性的。在一些实施例中，经修饰的所关注寡核苷酸是无肝毒性的。

在一些实施例中，引入到细胞中的经修饰的寡核苷酸可以展现出相比于未经修饰的多核苷酸在细胞中的降解减少，即稳定性增加。

本公开的寡核苷酸可以包含如对糖、核碱基或核苷间键(例如对连接磷酸酯、对磷酸二酯键、对磷酸二酯骨架)的任何可用修饰。例如，多核苷酸的大沟或核碱基的大沟面可以包括一个或多个修饰。嘧啶核碱基的一个或多个原子(例如，大沟面上的)可以被任选地取代的氨基、任选地取代的硫醇、任选地取代的烷基(例如，甲基或乙基)或卤基(例如，氯基或氟基)替代或取代。在某些实施例中，修饰(例如，一个或多个修饰)存在于糖和核苷间键或核苷酸键中的每一种中。根据本发明的修饰可以是核糖核酸(RNA)对脱氧核糖核酸(DNA)的修饰，例如，核糖呋喃酰基环(ribofuranysyl ring)的2'OH对2'H、苏氨酸核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其混合体的取代。本文描述了另外的实施例。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括核碱基类似物或衍生物(例如，肌苷或硫代磷酸酯核苷酸)。这种寡核苷酸可以用于例如制备改变碱基配对能力或增加对核酸酶的抗性的核酸。当合成地产生dsRNA时，也可以使用不太常见的碱基，如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等以进行反义、dsRNA和核酶配对。例如，含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的寡核苷酸已被示出以高亲和力与RNA结合，并且是基因表达的有效反义抑制剂。还可以进行其它修饰，如对磷酸二酯骨架或RNA的核糖糖基中的2'-羟基的修饰。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰位于核苷酸的糖部分上。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰位于核酸的磷酸酯骨架上。在一些实施例中，所关注寡核苷酸可以包含其中核苷酸间桥连磷酸酯残基中的至少一个或全部残基是经修饰的磷酸酯，如磷酸甲酯、硫代磷酸甲酯、磷酸吗啉酸酯、磷酸哌嗪酸酯和磷酰胺酯的核苷酸序列。例如，核苷酸间桥连磷酸酯残基中的每隔一个残基可以如本文所述进行修饰。在另一非限制性实例中，所关注寡核苷酸是作为核苷酸序列的双链RNA，在所述核苷酸序列中，核苷酸中的一个或全部核苷酸含有2'低级烷基部分(例如，C₁-C₄直链或支链的饱和或不饱和烷基，如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基和异丙基)。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括锁核酸(LNA)。术语“锁核酸”(LNA)包含含有一个或多个具有锁定在模拟糖构象的RNA中的双环呋喃糖单元的LNA核苷酸单体的核酸，所述双环呋喃糖单元增强对ssRNA、ssDNA或dsDNA中的互补序列的杂交亲和力(参见Vester等人,2004,《生物化学(Biochemistry)》43(42):13233-41，所述文献的内容通过引用并入本文)。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括约束乙基核苷类似物(cET)，例如2'-4'cET类似物。如本文所用，“约束乙基核苷酸”或“cEt”为包括包含4'-CH(CH3)-O-2'桥的双环糖部分的锁核酸。在一些实施例中，约束乙基核苷酸呈S构象(“S-约束乙基核苷酸”或“S-cEt”)。在一些实施例中，约束乙基核苷酸呈R构象(“R-约束乙基核苷酸”或“R-cEt”)。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括2'-O-甲氧基-乙基(2'-MOE)修饰。2'-MOE碱基通常用于反义寡核苷酸(ASO)、核酸适配体和siRNA。相比于标准RNA碱基，2'-MOE碱基可以增加对核酸酶降解的抗性，降低毒性并且增加与互补RNA结合的亲和力。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰。2'-O-Me RNA是在tRNA和其它小RNA中存在的RNA的以转录后修饰产生的天然存在的修饰。在一些实施例中，可以直接合成含有2'-O-甲基RNA的寡核苷酸。这种修饰可以增加RNA:RNA双链体的熔融温度或结合亲和力(Tm)，但引起RNA:DNA稳定性的仅很小的变化。这种修饰增加了相对于单链核糖核酸酶攻击的稳定性，并且受DNA酶影响的程度可以为受DNA影响的程度的1/5到1/10。在一些实施例中，2'O-Me在反义寡核苷酸中用作用于增加稳定性和与同源mRNA的结合亲和力的手段。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括2'氟基修饰。2'氟碱基具有氟修饰的核糖，相比于天然RNA，所述氟修饰的核糖增加结合亲和力(Tm)并且赋予增加的核酸酶抗性。这些修饰可以在核酶和siRNA中采用，以提高血清或其它生物流体中的稳定性。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括5-溴-脱氧尿苷修饰。5-溴-脱氧尿苷是可以并入到寡核苷酸中以使其在暴露于UV光的情况下与DNA、RNA或蛋白质交联的光活性卤化碱基。交联在308nm下的光下是最大程度地高效的。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括脱氧尿苷修饰。脱氧尿苷(dU)可以取代DNA寡核苷酸中的脱氧胸腺嘧啶(dT)。可以通过酶尿嘧啶-N-去糖基化酶(UNG)去除碱基，这使寡核苷酸易于受到链断开的影响。这种策略的一种常见用途是消除经扩增的DNA并防止交叉污染。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)修饰。这种经修饰的碱基在与dT碱基配对时可以形成三个氢键，并且可以在每次插入时将短寡核苷酸的熔融温度增加多达1-2℃，这取决于序列上下文。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括双脱氧基-C修饰。双脱氧胞苷(ddC)是阻止通过DNA聚合酶进行3'延伸的3'链终止剂。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括脱氧肌苷(dI)修饰。2'-脱氧肌苷为天然存在的碱基，其虽然不是真正通用的，但相比于涉及四个标准碱基的不匹配，其不稳定性较小。dI与脱氧腺苷(dA)、脱氧鸟苷(dG)、脱氧胞苷(dC)和dT之间的氢键相互作用弱且不平均，结果是dI确实存在某种碱基配对偏差：dC>dI:dA>dI:dG>dI:dT。当存在于DNA模板中时，脱氧肌苷优先地通过DNA聚合酶引导dC并入在生长的新生链中。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括羟甲基dC修饰。不希望受理论的约束，认为羟甲基dC在表观遗传调控中发挥作用。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括倒置的dT。倒置的dT可以并入在寡核苷酸的3'端处，从而形成抑制通过3'核酸外切酶进行的降解和通过DNA聚合酶进行的延伸两者的3'-3'连接。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括5-甲基脱氧胞苷(5-甲基dC)修饰。5-甲基脱氧胞苷在取代dC时每次插入将Tm增加多达0.5℃。另外，CpG基序中存在5-甲基dC可以防止或限制在体内施用寡核苷酸时以其它方式发生的不想要的免疫应答。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括5-硝基吲哚修饰。5-硝基吲哚是通用碱基。其不偏爱任何特定碱基配对(即，其不支持碱基特定的氢键形成)，但确实通过碱基堆积相互作用促进双链体稳定性。因此，其不会像标准碱基之间的不匹配那样使双链体不稳定。5-硝基吲哚在用作DNA聚合酶的模板时引导任何特定碱基的随机掺入，并且部分阻断酶进行性。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括5-羟基丁炔基-2'-脱氧尿苷修饰。5-羟基丁炔基-2'-脱氧尿苷是增加寡核苷酸的熔融温度的双链体稳定性经修饰的碱基。含有5-羟基丁炔基-2'-脱氧尿苷的寡核苷酸可以通过聚合酶，包含Taq聚合酶，正常延伸，从而使5-羟基丁炔基-2'-脱氧尿苷成为用于设计低复杂度、富含A-T的序列的短引物或探针的有用经修饰的碱基。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括8-氮杂-7-去氮杂鸟苷修饰。8-氮杂-7-去氮杂鸟苷是消除与富含鸟嘌呤的序列相关联的天然存在的非沃森和克里克二级结构的经修饰的碱基。含有8-氮杂-7-去氮杂鸟苷的寡核苷酸可以通过聚合酶，包含Taq聚合酶，正常延伸，从而使8-氮杂-7-去氮杂鸟苷成为用于设计富含鸟嘌呤的引物和探针的有用经修饰的碱基。此外，与标准鸟嘌呤碱基不同，8-氮杂-7-去氮杂鸟苷不会淬灭荧光团，从而潜在地提高探针性能。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括2-氨基嘌呤修饰。2-氨基嘌呤可以取代寡核苷酸中的dA。其为对局部环境敏感，从而使其成为用于监测DNA发夹的结构和动力学并且用于检测双链体的碱基堆积状态的有用探针的天然荧光碱基。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括硫代磷酸酯键(PS)。硫代磷酸酯(PS)键用硫原子取代寡核苷酸的磷酸酯骨架中的非桥连氧。这种修饰使核苷酸间键耐核酸酶降解。在一些实施例中，可以在寡核苷酸的5'端或3'端或两者处的最后3-5个核苷酸之间引入硫代磷酸酯键以抑制核酸外切酶降解。可替代地，在整个寡核苷酸中包含硫代磷酸酯键还可以减少内切酶的攻击。PS键可以包含在DNA或RNA寡核苷酸中，并且可以与其它修饰，如LNA或2'-O-甲基修饰组合。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括磷酸酯，如5'或3'末端磷酸酯(有时被称为磷酸化寡核苷酸)。5'磷酸化在使用寡核苷酸作为DNA连接酶的底物时需要。3'磷酸化将抑制某些3'-核酸外切酶的降解，并且可以用于阻断DNA聚合酶延伸。

在一些实施例中，所关注寡核苷酸的至少一个修饰包括聚乙二醇(PEG)。不希望受理论的约束，认为短PEG链与寡核苷酸的附接可能影响其基因沉默能力。

设想包括一个或修饰的任何治疗性寡核苷酸处于本公开的范围内。作为治疗性寡核苷酸的代表性但非限制性实例，FDA批准的基于寡核苷酸的药物的化学修饰的总结在以下表1中示出。

表1：FDA批准的寡核苷酸药物的化学修饰的总结

表2提供了并入到本文所述的经修饰的寡核苷酸中的经修饰的核碱基的扩展代码文库。

表2：经修饰的核苷酸的扩展代码文库

脱氧核苷酸单磷酸酯	代码	分子式
			*C	C	C9 H12 O5 N3 P S
*T	T	C10 H13 O6 N2 P S
			*A	A	C10 H12 O4 N5 P S
*G	G	C10 H12 O5 N5 P S
			*C(5me)+MOErC	B	C13 H20 O7 N3 P S
*T+MOErT	D	C13 H19 O8 N2 P S
			*A+MOErA	E	C13 H18 O6 N5 P S
*G+MOErG	F	C13 H18 O7 N5 P S
			*C(5me)	H	C10 H14 O5 N3 P S
*C+LNA	I	C12 H17 O6 N3 P S
			*T+LNA	J	C12 H15 O7 N2 P S
*A+LNA	K	C12 H15 O5 N5 P S
			*G+LNA	L	C12 H15 O6 N5 P S
*C+cEt	M	C13 H19 O6 N3 P S
			*T+cEt	N	C13 H17 O7 N2 P S
*A+cEt	O	C13 H17 O5 N5 P S
			*G+cEt	P	C13 H17 O6 N5 P S

5me：5-甲基

MOEr：2'-O-甲氧基-乙基

LNA：锁核酸；

cEt：约束乙基核苷类似物

(*)：经修饰的硫代磷酸酯键

合成寡核苷酸

本公开提供了制备所关注寡核苷酸以及包括所述所关注寡核苷酸的组合物的方法，所述方法包括(a)合成所述所关注寡核苷酸；以及(b)使用本公开的液相色谱法和质谱法方法表征所述所关注寡核苷酸。在一些实施例中，所述方法包括选择具有通过本文所述的方法确定的特定特征性，如纯度，的所关注寡核苷酸。

在本公开的所关注寡核苷酸和包括所关注寡核苷酸的组合物的一些实施例中，包括所关注寡核苷酸的组合物足够纯净以用于另外的下游应用，如施用于受试者以治疗疾病或病症。足够的纯度例如，可以通过如下实现：使用本领域已知的任何合适方法合成所关注寡核苷酸以产生包括所关注寡核苷酸的组合物；测定组合物中作为所关注寡核苷酸的总寡核苷酸的百分比；以及丢弃所述组合物或在所述组合物不足够纯净的情况下进一步纯化所述组合物。在一些实施例中，所关注寡核苷酸包括如本文所述的至少一个修饰。

包括可以使用本文所述的方法表征的所关注寡核苷酸的组合物中的杂质包含但不限于所关注寡核苷酸的片段和不正确的合成产物。例如，可以使用本文所述的方法检测通过寡核苷酸合成产生的降解产物或截短的产物的丰度。进一步地，本文所述的方法可以用于确定相对于期望合成产物的序列具有一个或序列不匹配、插入或缺失的寡核苷酸以及具有不同于期望修饰的修饰的寡核苷酸的存在和/或丰度。

不希望受理论的约束，液相色谱法按类型分离样品中的寡核苷酸的类型，如可以通过电泳图的UV可视化看到的(例如，参见图2A-2B)，并且峰与所关注寡核苷酸和样品中的寡核苷酸杂质，如所关注寡核苷酸的截短产物或降解产物或通过合成过程产生的其它寡核苷酸的不同类型相对应。与所关注寡核苷酸相对应的液相色谱法峰和与杂质相对应的一个或多个峰的完整质量分析将允许普通技术人员确定样品中与这些峰相对应的寡核苷酸，如所关注寡核苷酸的类型的丰度。为了进一步解析和表征根据完整质量分析并不明显的寡核苷酸的序列、质量和修饰方面的差异，根据液相色谱法确定的样品中的寡核苷酸的类型可以使用如HCD等方法进行碎片化，并且可以通过串联质谱法进行分析，以确定结构特性，包含序列和修饰。

因此，本公开提供了制备包括所关注寡核苷酸的组合物的方法，其中组合物中至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的寡核苷酸为所关注寡核苷酸。在一些实施例中，组合物中至少98％的寡核苷酸为所关注寡核苷酸。在一些实施例中，组合物中至少99％的寡核苷酸为所关注寡核苷酸。在一些实施例中，组合物中至少98.5％的寡核苷酸为所关注寡核苷酸。在一些实施例中，组合物中至少99.9％的寡核苷酸为所关注寡核苷酸。组合物中寡核苷酸的类型的百分比可以被描述为质量百分比。可替代地，组合物中寡核苷酸的类型的百分比可以通过分子的数量确定。

在一些实施例中，制备包括所关注寡核苷酸的组合物的方法进一步包括添加医药上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

设想了本公开的合成寡核苷酸的所有合适方法均在本公开的范围内。这些方法包含但不限于固相合成、化学合成和酶反应。

在一些实施例中，合成包括固相合成。固相寡核苷酸合成方法，如亚磷酰胺方法，通常通过化学反应循环合成3'到5'方向中附接到固体表面的寡核苷酸，所述化学反应将核苷酸依次添加到生长的寡核苷酸中。例如，对于DNA，具有5'DMT(4,4'二甲氧基三苯甲基)保护基团的3'核苷附接到固体载体并且是脱三苯甲基化的。在脱三苯甲基化之后，载体结合的核苷与下一个碱基反应以形成核苷亚磷酰胺单体，所述单体与活化剂(四唑或衍生物)混合。核苷亚磷酰胺的二异丙胺基被激活剂质子化，并且由此被转化为良好离去基团。这种离去基团被其邻近磷原子上的载体结合的核苷的5'-羟基替代，并且新的磷-氧键形成，从而产生载体结合的亚磷酸三酯。接下来，使用乙酸酐和N-甲基咪唑(NMI)将核苷封端以阻断未经反应的5'羟基以使5'羟基乙酰化。在存在水和吡啶的情况下通过碘氧化在存在水和吡啶的情况下通过碘氧化将亚磷酸三酯转化为稳定(P(V))物种，并且重复所述循环。

RNA还可以使用标准固相寡核苷酸合成方案合成。参见例如US20070123482A1和US20070213292A1，所述文献的内容通过引用以其整体在此并入。

对所关注寡核苷酸的修饰可以在合成期间并入，或者可以在合成之后添加，这取决于修饰。例如，核苷酸的硫代磷酸酯衍生物可在合成期间并入以产生硫代磷酸酯键，而末端磷酸酯可以在寡核苷酸合成之后通过酶反应(磷酸化)添加到合成的寡核苷酸。

液相色谱法

本公开提供了用于表征包括所关注寡核苷酸的组合物的方法，所述方法包括液相色谱法。液相色谱法可以单独或与其它方法组合用于分离样品中的分析物(例如，在序列和/或修饰方面不同的寡核苷酸)。例如，当样品包括所关注寡核苷酸和一种或多种杂质时，液相色谱法可以用于将所关注寡核苷酸与杂质分离。使用这些方法检测到的代表性杂质包含所关注寡核苷酸的降解产物和由合成所关注寡核苷酸产生的副产物。液相色谱法分离可以与如紫外检测或质谱法等检测组合，由此提供用于表征组合物中的所关注寡核苷酸的测定系统。

在一些实施例中，样品中的寡核苷酸，包含尤其所关注寡核苷酸和如本文所述的一种或多种杂质的类型是使用液相色谱法分离的。

如本文所用，术语“色谱法”是指其中包括液体或气体的化学混合物由于化学实体在其围绕固定液相或固相流动、在固定液相或固相之上流动和/或流过固定液相或固相时的不同分布而被分离成组分的过程。“液相色谱法”或“LC”是指当流体均匀地渗透穿过细碎物质柱或穿过毛细管通道时选择性延迟流体溶液的一种或多种组分的过程。所述延迟是在此流体相对于固定相移动时由一种或多种固定相与体相流体(即，流动相)之间的混合物的组分的分布引起的。液相色谱法包含但不限于正相液相色谱法(NPLC)、亲水相互作用液相色谱法(HILIC)、反相液相色谱法(RPLC)，包含离子配对反相液相色谱法(IP-RPLC)、高效液相色谱法(HPLC)、高湍流液相色谱法(HTLC)和超高效液相色谱法(UPLC)。

“保留时间”是指如寡核苷酸等特定分析物在洗脱前被液相色谱法底物保留的时间长度。

“高效液相色谱法”或“HPLC”是指其中通过迫使流动相在压力下穿过固定相，通常穿过密集填充的柱增加分离的程度的液相色谱法。

“超高效液相色谱法”或“UPLC”是指相比于HPLC，具有增强的速度、灵敏度和分辨率的液相色谱法。通常，UPLC适用于直径小于2μm的颗粒。UPLC中的分离和定量是在极高的压力(至多100M Pa)下完成的。

气相色谱法(GC)是指使用穿过柱，如玻璃柱或金属柱的气流以基于挥发性和与液体固定相的相互作用来分离化合物的分离技术。流动相，即载气，通常是如氦气等惰性气体或如氮气等非反应性气体。

本领域的技术人员可以选择适于在方法中使用的HPLC仪器和柱。色谱柱通常包含用于促进化学部分的分离(即分馏)的介质(即，填充材料)。所述介质可以包含微细颗粒，所述微细颗粒包含与各种化学部分相互作用以促进化学部分的分离的键合的表面。

在某些实施例中，可以通过在分析物被柱填充材料可逆地保留，而一种或多种其它材料未被保留的条件下，向柱施涂样品来纯化分析物，例如所关注寡核苷酸。在这些实施例中，可以在分析物被柱保留的情况下采用第一流动相条件，并且随后可以采用第二流动相条件以在未保留的材料被洗涤穿过之后从柱中移除保留的材料。可替代地，可以通过在分析物以相比于一种或多种其它材料不同的速率洗脱的流动相条件下向柱施涂样品来纯化分析物。相对于样品的一种或多种其它组分，此类程序可以富集一种或多种所关注分析物的量。

在一些实施例中，将待分析的样品在入口端口处施涂于柱上，用溶剂或溶剂混合物洗脱，并且在出口端口处排放。可以选择不同的溶剂模式来洗脱分析物，如样品中的所关注寡核苷酸或杂质。例如，可以使用梯度模式、等度模式或多型(即混合)模式来执行液相色谱法。在一些实施例中，在具有C18固相的分析HPLC系统上使用含50mM HFIP和5mM DIEA的水溶液的第一流动相和含50mM HFIP和5mM DIEA的乙腈的第二流动相执行HPLC。在一些实施例中，第一流动相包括含40-60mM HFIP和3-15mM DIEA的水溶液，并且第二流动相包括含40-60mM HFIP和3-15mM DIEA的乙腈。在一些实施例中，在具有交联的二醇固相的分析HPLC系统上利用含15mM缓冲液的70％乙腈的第一流动相，和于含15mM缓冲液的30％乙腈的第二流动相执行HPLC。在一些实施例中，第一流动相包括含3-25mM缓冲液的70％乙腈，并且第二流动相包括含3-25mM缓冲液的20-40％乙腈。在一些实施例中，缓冲液选自由乙酸铵和甲酸铵组成的组。在一些实施例中，缓冲液为乙酸铵。

许多柱填料可用于样品的色谱分离，并且选择适当的分离方案是取决于样品特性、所关注分析物、干扰物质的存在和其特性等的经验过程。可商购获得的HPLC柱包含但不限于极性、离子交换(阳离子和阴离子两者)、疏水相互作用、苯基、C-2、C-8、C-18和多孔聚合物柱上的极性涂层。

在一些实施例中，液相色谱法包括亲水相互作用液相色谱法(HILIC)。HILIC可以用于分离极性固定相上的小极性化合物。HILIC使用具有反相类型洗脱液的亲水固定相，并且按极性增加的顺序洗脱分析物。适用于HILIC的流动相包含乙腈(ACN)，然而可以使用可与水混溶的任何非质子溶剂。可以使用如乙酸铵和甲酸铵等离子添加剂来调节流动相pH和离子强度。

在一些实施例中，柱尺寸为1-3mm内径(ID)x 50-300mm长度。在一些实施例中，液相色谱法包括HILIC。在一些实施例中，柱具有平均粒径为3μm(标称)并且中值颗粒孔径为

的交联的二醇固相。在一些实施例中，柱尺寸为2mm内径(ID)x 100mm长度。在一些实施例中，柱尺寸为2mm ID x 150mm长度。在一些实施例中，柱为飞诺美(Phenomenex)

3μm HILIC

LC柱150x 2mm或等效物(参见例如飞诺美目录号00D-4449-B0或等效物)。

在一些实施例中，HILIC包括流动相，所述流动相包括缓冲液，所述缓冲液包括乙酸铵。在一些实施例中，流动相包括第一缓冲液和第二缓冲液，所述第一缓冲液包括含3-25mM乙酸铵的50-80％乙腈(ACN)，所述第二缓冲液包括含3-25mM乙酸铵的20-40％(ACN)。在一些实施例中，所述流动相包括第一缓冲液和第二缓冲液，所述第一缓冲液包括含15mM乙酸铵的70％乙腈(ACN)，所述第二缓冲液包括含15mM乙酸铵的30％(ACN)。在一些实施例中，所述HILIC包括流动相，所述流动相包括缓冲液，所述缓冲液包括甲酸铵。在一些实施例中，所述流动相包括第一缓冲液和第二缓冲液，所述第一缓冲液包括含3-25mM甲酸铵的50-80％乙腈(ACN)，所述第二缓冲液包括含3-25mM甲酸铵的20-40％(ACN)。在一些实施例中，所述流动相包括第一缓冲液和第二缓冲液，所述第一缓冲液包括含15mM甲酸铵的70％乙腈(ACN)，所述第二缓冲液包括含15mM甲酸铵的30％(ACN)。

在一些实施例中，液相色谱法包括离子配对反相液相色谱法(IP-RPLC)。IP-RPLC是用于分离有机离子和部分电离的有机分析物的技术。IP-RPLC使用与RPLC相同类型的固定相和流动相，其中向流动相添加离子对试剂。离子对试剂可以为例如烷基磺酸盐、烷基硫酸盐或烷基铵盐，并且其可以改变离子分析物的保留时间。IP-RPLC可以用于分离生物分子的类别，包含氨基酸、肽和核酸。

在一些实施例中，HPLC柱具有中值粒径为1.3-2.0μm(标称)并且中值颗粒孔径为100-

的C18固相。在一些实施例中，HPLC柱具有中值粒径为1.7μm(标称)并且中值颗粒孔径为

的C18固相。在一些实施例中，柱尺寸为2.1mm ID x 100mm长度。(WatersACQUITY UPLC寡核苷酸BEH C18柱，

1.7μm，2.1mm X 100mm，Waters目录号：186003950或等效物)。

在一些实施例中，液相色谱法包括离子配对反相液相色谱法(IP-RPLC)。在一些实施例中，IP-RPLC包括流动相，所述流动相包括缓冲液，所述缓冲液包括六氟异丙醇(HFIP)和5mM N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。在一些实施例中，所述流动相包括第一缓冲液和第二缓冲液，所述第一缓冲液包括含40-60mM HFIP和3-15mM DIEA的水溶液，所述第二缓冲液包括含40-60mM HFIP和3-15mM DIEA的乙腈。在一些实施例中，所述流动相包括第一缓冲液和第二缓冲液，所述第一缓冲液包括含50mM HFIP和5mM DIEA的水溶液，所述第二缓冲液包括含50mM HFIP和5mM DIEA的乙腈。

在一些实施例中，IP-RPLC包括具有中值粒径为1.3-2.0μm(标称)并且中值颗粒孔径为100-

的C18固相的HPLC柱。在一些实施例中，IP-RPLC包括具有中值粒径为1.7μm(标称)并且中值颗粒孔径为

的C18固相的HPLC柱。在一些实施例中，柱尺寸为2.1mmID x 100mm长度(参见例如Waters ACQUITY UPLC寡核苷酸BEH C18柱，

1.7μm，2.1mm X 100mm，Waters目录号186003950或等效物)。在一些实施例中，所述IP-RPLC包括1.7μm Oligo-XT

50x 2.1mm柱。

在一些实施例中，例如通过HILIC或IP-LPRC进行的液相色谱分离可以在特定温度下进行。此温度可以介于例如15℃与75℃之间。在一些实施例中，分离在20℃与50℃之间进行。在一优选实施例中，分离在约23℃、约30℃、约40℃或约50℃下进行。在一些实施例中，HILIC分离包括介于23℃与50℃之间的柱温度。在一些实施例中，HILIC分离包括30℃的柱温度。

液相色谱法-UV可见光谱法

本公开提供了检测样品中的已通过液相色谱法分离的分析物，例如所关注寡核苷酸和一种或多种杂质，的方法。

在一些实施例中，通过本文所述的液相色谱法方法分离的分析物使用紫外和/或可见光检测。在一些实施例中，所述检测系统为紫外-可见光谱法(UV-Vis)。UV-Vis探测分子在其吸收电磁光谱的UV和可见区中的光时的电子跃迁。任何具有交替双键和单键的扩展体系的物种将吸收UV光并且有颜色的任何东西吸收可见光，这使得UV-可见光谱法适用于广泛的样品。关于仪器，光源通常是用于UV测量的氢或氘灯，以及用于可见测量的钨灯。这些连续光源的波长是用如棱镜或光栅单色仪等波长分离器选择的。通过扫描波长分离器获得光谱，并且可以从光谱中或者以单个波长进行定量测量。存在多种UV-vis光谱法方法。这些方法包含但不限于分子紫外/可见、吸收光谱法、紫外光谱法、紫外/可见吸收光谱法。设想了任何合适的UV-vis检测系统在本公开的范围内。

质谱法

本公开提供了检测样品中的已通过液相色谱法分离的分析物，例如所关注寡核苷酸和如截短的寡核苷酸的一种或多种杂质的方法。这些方法包含质谱法。质谱法和串联质谱法(MS/MS)可以用于注释和成功标识用于治疗应用的寡核苷酸的序列和修饰。

在一些实施例中，检测系统为质谱法(MS)。液相色谱法-质谱法(LC-MS)是将液相色谱法(例如，高效液相色谱法或HPLC)的物理分离能力与质谱法(MS)的质量分析能力组合的分析化学技术。液相色谱法分离具有多种组分(分析物)的混合物，而质谱法提供具有高分子特异性和检测灵敏度的单独组分的结构标识和水平。

液相色谱法和质谱法在EP3143392中描述，所述文献的内容通过引用并入本文。

质谱法使用质谱仪进行，所述质谱仪包含用于对样品进行电离并且产生带电分子以供进一步分析的离子源。在各个实施例中，包括所关注寡核苷酸和其组分的组合物，如另外的合成或降解产物可以通过本领域的技术人员已知的任何方法电离。用于各种MS技术的电离源包含但不限于电子电离、化学电离、电喷雾电离(ESI)、光子电离、大气压化学电离(APCT)、光电离、大气压光电离(APPI)、快原子轰击(FAB)/液体二次电离(LSIMS)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场电离、场解吸、热喷雾/等离子体喷雾电离、表面增强激光解吸电离(SELDI)、电感耦合等离子体(ICP)、粒子束电离和离子迁移分离(IMS)。本领域的技术人员将理解，电离方法的选择可以基于待测量的分析物、样品的类型、检测器的类型、正模式对负模式的选择等来确定。

如本文所用，术语“质谱法”或“MS”是指通过其质量标识化合物的分析技术。MS是指基于离子的质荷比(m/z)过滤、检测和测量离子的方法。MS技术通常包含对化合物进行电离以形成带电物种(例如，离子)并且检测离子的确切质量除以其电荷，被称为m/z。可以通过任何合适的方式对化合物进行电离和检测。

“质谱仪”通常包含离子仪和离子检测器。通常，对一种或多种所关注分子进行电离，并且随后将离子引入到质谱仪器中，在所述质谱仪器中，由于磁场和电场的组合，离子在空间中遵循某个路径，所述路径取决于质量(“m”)和电荷(“z”)。参见，例如美国专利第6,204,500号；第6,107,623号；第6,268,144号；以及第6,124,137号。

MS可以产生和检测正离子和负离子两者。如本文所用，术语“电离(ionization)”或“电离(ionizing)”是指产生具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的那些离子。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的那些离子。在“电子电离”或“EI”方法中，呈气相或汽相的分析物与电子流相互作用。电子与分析物的碰撞产生分析物离子，所述分析物离子然后可以经受质谱仪技术。EI可以与气相色谱法(GC)或液相色谱法方法组合。在“化学电离”或“CI”中，试剂气体(例如氨)经受电子撞击，并且分析物离子通过试剂气体离子和分析物分子的相互作用形成。在“快原子轰击”或“FAB”中，高能原子(通常是Xe或Ar)的束撞击非挥发性样品，从而使样品中含有的分子解吸和电离。在一些实施例中，将测试样品溶解于粘性液体基质中，所述粘性液体基质如甘油、硫代甘油、间硝基苄基醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯辛醚、环丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。选择化合物或样品的适当基质是经验过程。

如本文所用，术语“基质辅助激光解吸电离”或“MALDI”是指将非挥发性样品暴露于激光辐照的方法，所述方法通过各种电离途径，包含光-电离、质子化、去质子化和簇衰变使样品中的分析物解吸和电离。对于MALDI，样品与能量吸收基质混合，这促进分析物分子的解吸。MALDI-TOF是指基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法(MS)。MALDI-TOF可用于至多约15,000道尔顿的化合物。

“表面增强激光解吸电离”或“SELDI”是指将非挥发性样品暴露于激光照射的另一种方法，所述方法通过各种电离途径，包含光电离、质子化、去质子化和簇衰变使样品中的分析物解吸和电离。对于SELDI，样品通常与优选地保留一种或多种所关注分析物的表面结合。如在MALDI中一样，此过程也可以采用能量吸收材料来促进电离。

在一些实施例中，质谱法包括电喷雾电离(ESI)。在一些实施例中，所述ESI包括纳流ESI。纳流ESI是指可以在纳升/分钟范围内的流速(与常规HPLC的高微升/分钟到低毫升/分钟范围相反)。其可以用于灵敏检测微量样品浓度。

“电喷雾电离”或“ESI”是指溶液沿较短长度的毛细管传递到向其施加高正电位或负电位的端部的方法。到达管的端部的溶液被蒸发(雾化)成呈溶剂蒸汽形式的非常小的溶液液滴的喷射流或喷雾。这种液滴雾流过蒸发室，所述蒸发室被轻微加热以防止冷凝并使溶剂蒸发。随着液滴变得更小，电表面电荷密度增加，直到相似电荷之间的自然排斥使离子以及中性分子被释放的时间为止。

“大气压化学电离”或“APCI”是指类似于ESI的质谱法方法；然而，APCI通过在等离子体内在大气压下发生的离子-分子反应产生离子。等离子体通过喷雾毛细管与对电极之间的放电来维持。然后通常通过使用一组差动泵浦截取锥级将离子提取到质量分析器中。可以使用干燥和预加热的N2气体的逆流来改进溶剂的去除。相比于ESI，APCI中的气相电离可以更有效地分析极性较小的物种。

如本文所用，术语“大气压光电离”或“APPI”是指质谱法的用于分子M的光电离的机制是用于形成分子M+的光子吸收和电子发射的形式。因为光子能量通常仅高于电离势，所以分子离子不易于受解离的影响。

如本文所用，术语“电感耦合等离子体”或“ICP”是指样品在足够高的温度下与经部分电离的气体相互作用以使大多数元素原子化和电离的方法。

如本文所用，“离子迁移光谱法”，有时也被称为“离子迁移分离”或“IMS”，是指基于气相离子与碰撞气体的相互作用和气相离子的质量来分离气相离子的分析化学方法。在第一步骤中，使用离子迁移谱仪在毫秒时间尺度上通过缓冲气体根据离子的迁移率分离离子。然后在第二步骤中将分离的离子引入到质量分析器中，在所述步骤中可以在微秒时间尺度上确定离子的质荷比。

如本文所用，术语“场解吸”是指将非挥发性测试样品置于电离表面上并使用强电场来产生分析物离子的方法。

如本文所用，术语“解吸”是指从表面去除分析物和/或分析物进入到气相中。

在寡核苷酸组合物或其组分已被电离之后，可以分析由此产生的带电荷的离子以确定m/z。适于确定m/z的分析器包含四极杆分析器、离子阱分析器、飞行时间分析器、傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)分析器和Orbitrap光谱仪。离子可以使用几种检测模式之一进行检测。例如，可以使用选择性离子监测模式(SIM)检测仅所选离子，或者可替代地，可以使用扫描模式，例如，多反应监测(MRM)或所选反应监测(SRM)来检测多个离子。

在一些实施例中，使用四极杆分析器(仪器)确定m/z。在“四极杆”或“四极杆离子阱”仪器中，振荡射频场中的离子经历与施加在电极之间的DC电位、RF信号的振幅和m/z成正比的力。电压和振幅可以被选择为使得仅具有特定m/z的离子行进四极杆的长度，而所有其它离子都偏转。因此，四极杆仪器既可以充当“质量过滤器”，又可以充当注射到仪器中的离子的“质量检测器”。在飞行时间(ToF)中，离子在使用接地电极和排斥电极的均匀静电场中被加速。动能保持恒定，并且离子沿无场ToF管向下行进。因为动能是恒定的(KE＝1/2MV^2)，与较大的m/z相比，具有较小m/z的那些将具有更大的速度。“四极杆飞行时间”或“QTof”质谱法是指质谱法的使用将用作碰撞池的四极杆与飞行时间分析器配对的质谱仪的类型。这允许同时对所有离子进行高分辨率、高质量准确度分析。在示例性QTof系统中，样品由在线液相色谱法系统递送并电离。粒子束然后行进穿过离子导向器并进入四极杆，之后传递到ToF分析器。

在一些实施例中，MS技术可以采用“串联质谱法”或“MS/MS”。在此技术中，由所关注分子产生的前体离子(也被称为母离子)可以在MS仪器中过滤，并且前体离子随后被碎片化以得到一个或多个碎片离子(也被称为子离子或产物离子)，所述一个或多个碎片离子然后在第二MS程序中进行分析。通过仔细选择前体离子，仅通过某些分析物产生的离子才能进入碎片化室，在所述碎片化室中，与惰性气体的原子碰撞产生碎片离子。由于前体离子和碎片离子两者都是在给定一组电离/碎片化条件下以可再现的方式产生的，因此MS/MS技术可以提供极其强大的分析工具。例如，过滤/碎片化的组合可以用于消除干扰物质，并且可以特别用于复杂样品。

在一些实施例中，使用高能碰撞诱导解离(HCD)方法实现碎片化，其中前体离子被加速到高速进入充气碰撞池。HCD在US 8,148,677中描述，所述文献的内容通过引用并入本文。

一般来说，当碰撞能量从较低的值增加时，将观察到阈值或开始碰撞能量，在所述阈值或开始碰撞能量下，观察到的碎片离子的数量从零点的初始值快速增加。进一步观察到碎片离子的产率随着碰撞能量的增加而增加，达到某个最大值。碰撞能量的超过了对应于最大值的值的进一步增加与碎片产率的减少相对应，所述碎片产率在某种能量下降低回到基本上零产率。“归一化碰撞能量”(NCE)是碰撞能量相比于与给定m/z比的最优碰撞能量相比的表达。NCE在US 8,278,620中描述，所述文献的内容通过引用并入本文。

如本文所用，“最大HCD”是指最大数量的碎片所产生的HCD能量。HCD能量可以计算为最大HCD(NCE)的百分比，例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％HCD等。

在一些实施例中，串联质谱法可以涉及使用HCD进行碎片化。在一些实施例中，HCD使用特定NCE，例如在0％与75％之间实现。在一些实施例中，所述NCE介于10％与50％之间，例如介于10％与25％之间，或介于15％和20％之间。在一些实施例中，NCE为20％。

在一些实施例中，所述HPLC-MS/MS系统可以由数据依赖性采集(DDA)控制。在串联质谱法中，数据依赖性采集(DIA)是一种确定分子结构的方法，在所述方法中，所选m/z范围内的所有离子在第二级中被碎片化并分析。串联质谱是通过在给定时间(被称为宽带DIA)将进入质谱仪的所有离子碎片化，或通过将m/z的范围依序分离和碎片化获得的。可替代地，在数据依赖性采集(DDA)中，通过串联质谱法选择和分析固定数量的前体离子。DDA可以在组分从色谱系统中洗脱时实时选择用于MS/MS采集的离子。嵌入式算法可以快速查询MS调查光谱，并且可以基于阈值强度、电荷状态、预定义的确切质量包含/排除列表或其组合来选择用于MS/MS分析的共洗脱前体离子。可以根据前体电荷状态和m/z优化每个光谱的碰撞能量。

质谱仪通常为用户提供离子扫描或质谱；即，在给定范围(例如，400到1600m/z)内具有特定m/z的每个离子的相对丰度。质谱可以通过本领域已知的多种方法与样品中的分析物，例如寡核苷酸组合物的组分，的量相关。例如，如果仔细控制采样和分析参数，则可以将给定离子的相对丰度，有时被称为相对强度，与将所述相对丰度转换为原始分子的绝对量的表格进行比较。可替代地，分子标准品可以与样品一起运行，并且基于由这些标准品产生的离子信号构建标准品曲线。产生和使用此类标准品曲线的方法是本领域众所周知的，并且普通技术人员能够选择适当的内部标准品。用于将离子的量与原始分子的量相关的许多其它方法对于本领域的普通技术人员来说将是众所周知的。

当离子与检测器碰撞时，离子会产生电子脉冲，所述电子被转换为数字信号。所获取的数据被中继到计算机，所述计算机绘制每单位时间的离子计数。测量与特定离子相对应的峰下面积或此类峰的振幅，并且所述面积或振幅与寡核苷酸组合物中的所关注组分或标志物的量相关。在某些实施例中，测量碎片离子和/或前体离子的曲线下面积或峰的振幅，以确定给定m/z的情况下分析物的量。如以上所描述的，相对丰度，有时被称为相对强度，或给定离子的应答可以使用基于内部分子标准品的一个或多个离子的峰的校准标准品曲线转化成原始分析物的绝对量。然后可以将通过LC-MS检测到的寡核苷酸组合物组分的绝对量转化为原始样品中存在的组分的绝对量。

用于确定样品，如所关注寡核苷酸，中分析物的相对丰度的方法包含但不限于完整质量分析。完整质量分析是在先前未对分析物进行消化或碎片化的情况下，通过质谱法(MS)评估分析物的总分子量。如通过液相色谱法确定的每个峰的强度提供了对对应分析物的相对丰度的指示。进行完整质量分析的方法将是本领域已知的，并且包含ProteinMetrics公司(Protein Metrics)的Intact Mass^TM软件。

在一些实施例中，可以将m/z(质量除以电荷)谱解卷积为中性质量(即没有任何电荷的物种的质量)谱。解卷积方法通过以下将m/z谱转换为中性质谱：推导m/z谱中离子的电荷，并且然后将m/z值乘以适当的值z(电荷)，并减去电荷载体(通常是质子)的质量来确定中性质量。电荷由m/z谱中峰之间的关系推导。m/z谱的解卷积在US 10,319,573中描述，所述文献的内容通过引用并入本文。

合适的LC-MS仪器和系统将是本领域的技术人员已知的。

药物组合物

本公开提供了包括已使用本文所述的方法表征的所关注寡核苷酸的组合物。在一些实施例中，所述组合物是药物组合物。

在包括所关注寡核苷酸的药物组合物的一些实施例中，所述组合物适于进一步施用于受试者以治疗疾病或病症。在一些实施例中，所述受试者是人。在药物组合物的一些实施例中，所述所关注寡核苷酸包括如本文所述的至少一个修饰。

因此，本公开提供了包括所关注寡核苷酸的药物组合物，其中组合物中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的寡核苷酸为所述所关注寡核苷酸。在一些实施例中，药物组合物中至少95％的寡核苷酸为所述所关注寡核苷酸。在一些实施例中，药物组合物中至少98％的寡核苷酸为所述所关注寡核苷酸。在一些实施例中，药物组合物中至少99％的寡核苷酸为所述所关注寡核苷酸。在一些实施例中，药物组合物中至少99.5％的寡核苷酸为所述所关注寡核苷酸。在一些实施例中，药物组合物中至少99.9％的寡核苷酸为所述所关注寡核苷酸。组合物中寡核苷酸的类型的百分比可以被描述为质量百分比。可替代地或另外，组合物中寡核苷酸的类型的百分比可以通过分子的数量确定。

“药学上可接受的”是指并非是生物学上或其它方面不期望的材料，例如，可以施用于受试者而不会引起任何不期望的生物学作用，如毒性的材料。

本公开的药物组合物可以任选地包括另外的医学药剂、药物药剂、载体、佐剂、分散剂等。

包括所关注寡核苷酸的组合物可以根据已知技术调配以供以药物载体的形式施用。参见例如《雷明顿：药学科学与实践(Remington,The Science And Practice ofPharmacy)》(第9版1995)。在根据本公开的药物组合物的制造中，所关注寡核苷酸(包含其生理上可接受的盐)通常与尤其可接受的载体掺和。载体可以为固体或液体或两者，并且可以用所关注寡核苷酸调配为可以含有0.01重量％或0.5重量％到95重量％或99重量％的所关注寡核苷酸的单位剂量调配物，例如片剂。一种或多种所关注寡核苷酸可以掺入到本发明的调配物中，所述调配物可以通过任何众所周知的药学技术制备。

本公开的药物组合物的非限制性实例包含适于口腔、直肠、颊(例如，舌下)、阴道、肠胃外(例如，皮下、肌肉内，包含骨骼肌、心肌、膈肌和平滑肌、皮内、静脉内、腹膜内)、局部(即皮肤和粘膜表面两者，包含气道表面)、鼻内、经皮、关节内、颅内、鞘内和吸入施用，通过门静脉内递送施用于肝脏，以及直接器官注射(例如，注射到肝脏、肢体、大脑或脊髓中以递送到中枢神经系统、注射到胰腺或肿瘤或肿瘤周围的组织中)。最合适的途径在任何给定情况下将取决于所治疗的病状的性质和严重程度以及所使用的特定药物组合物的性质。在一些实施例中，可能期望局部递送组合物以避免与全身施用相关的任何副作用。例如，局部施用可以通过直接注射在期望治疗部位处、通过静脉内引入在期望治疗部位附近的部位处(例如，引入到向治疗部位馈送的血管)来实现。在一些实施例中，组合物可以局部递送到缺血组织。在某些实施例中，组合物可以是缓释调配物，例如，呈缓释贮库的形式。

对于注射，载体将通常是液体，如无菌无热原水、无热原磷酸盐缓冲盐水溶液、抑菌水或Cremophor EL[R](新泽西州帕西波尼巴斯夫公司(BASF,Parsippany,N.J.))。对于其它施用方法，载体可以是固体或液体。

对于口服施用，药物组合物可以以固体剂型，如胶囊剂、片剂和粉末，或液体剂型，如酏剂、糖浆剂和悬浮剂来施用。药物组合物可以与非活性成分和粉状载体，如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或者纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石、碳酸镁等一起包封在明胶胶囊中。用于口服施用的液体剂型可以含有着色剂和调味剂以增加患者接受度。

适于颊(舌下)施用的药物组合物包含：在调味基料中包括所述化合物的糖锭剂，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶；以及在惰性基料，如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶中包括所述化合物的软锭剂。

药物组合物可以被调配为用于鼻腔施用或另外通过任何合适的方式施用于受试者的肺部，例如，通过受试者吸入的包括化合物的可吸入颗粒的气溶胶悬浮液施用。可吸入颗粒可以是液体或固体。术语“气溶胶”包含能够吸入到支气管或鼻腔通道中的任何气载悬浮相。

适于肠胃外施用的本公开的药物组合物包括所述化合物的无菌水性和非水性注射溶液，其制剂优选地与预期受体的血液等渗。这些制剂可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使得组合物与预定接受者的血液等渗的溶质。水性和非水性无菌悬浮液可以包含悬浮剂和增稠剂。所述组合物可以呈现在单位/剂量或多剂量容器，例如密封安瓿和小瓶，中，并且可以在仅需要在即将使用之前添加无菌液体载体，例如盐水或注射用水，的冷冻干燥(冻干)条件下储存。

可以由包括所关注寡核苷酸的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。例如，可以在密封容器中以单位剂型提供包括所关注寡核苷酸的可注射稳定无菌组合物。所关注寡核苷酸可以作为盐以能够与合适的药学上可接受的载体重组以形成适于将其注射到受试者体内的液体组合物的冻干剂形式提供。

治疗方法

本公开提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括施用有效量的包括使用本文所述的方法表征的所关注寡核苷酸的组合物。

设想了可以通过施用治疗性寡核苷酸，如本文所述的反义寡核苷酸、dsRNA、siRNA、核酸适配体、微RNA或mRNA来治疗的任何疾病或病症在本公开的范围内。在一些实施例中，治疗性寡核苷酸包括如本文所述的至少一个修饰。

可以使用治疗性核苷酸来治疗的疾病或病症包含可以通过调节或减少靶基因来治疗的疾病或病症。这些疾病或病症包含遗传性疾病和癌症。可以使用治疗性寡核苷酸治疗的示例性疾病和病症包含但不限于视网膜炎、黄斑变性、纯合子家族性高胆固醇血症、杜氏肌营养不良、高剂量化疗和自体骨髓移植后发生的严重肝静脉闭塞性病(sVOD)和脊髓性肌肉萎缩症(SMA)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病(Parkinson's disease)和共济失调毛细血管扩张症。再举一个例子，认为可用治疗性寡核苷酸治疗的另外的疾病包含癌症(例如，包含肺癌、结直肠癌、胰腺癌、恶性胶质瘤和恶性黑色素瘤)、糖尿病和具有炎症成分的炎症性疾病，如哮喘、关节炎和结肠袋炎。

本公开提供了预防受试者的疾病或病症或降低受试者的疾病或病症的严重程度的方法，所述方法包括施用有效量的包括使用本文所述的方法表征的所关注寡核苷酸的组合物。例如，可以向受试者施用使用本文所述方法表征的寡核苷酸疫苗，以降低传染性疾病或癌症的严重程度或预防传染性疾病或癌症。

如本文所用，“治疗有效”量是为受试者提供一些改善或益处的量。可替代地说明的，“治疗有效”量是将提供受试者的至少一种临床症状的某种减轻、缓和或减少的量(例如，在癌症的情况下，减少肿瘤负担，防止进一步肿瘤生长，防止转移，或延长生存时间)。本领域的技术人员将理解，在向受试者提供一些益处的情况下，治疗效果不需要是完全的或可治愈的。

术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment of)”旨在降低或至少部分改善或改变受试者的病状的严重程度，并且实现至少一种临床症状的减轻、缓和或减少。

试剂盒和制品

本公开提供了用于使用本文所述的方法表征寡核苷酸和包括所述寡核苷酸的组合物的试剂盒和制品。

在一些实施例中，所述试剂盒包括缓冲液、试剂、对照样品和使用方法的说明书。

在一些实施例中，所述试剂盒包括包含用于治疗疾病或病症的所关注寡核苷酸的剂型和使用说明书。

以下实例无意将权利要求的范围限制于本发明，而是旨在例示某些实施例。本领域的技术人员想到的例示的方法的任何变化都旨在落入本发明的范围内。如本领域的技术人员将理解的，对于所要求保护的发明的每个方面，存在几个实施例和要素，并且在此预期了不同要素的所有组合，因此本文例示的特定组合不应被解释为对所要求保护的发明的范围的限制。如果特定要素被移除或添加到可用于组合中的要素组中，则该要素组应被解释为并入了此类改变。

实例

实例1：经修饰的和未经修饰的寡核苷酸的HILIC-UV检测

测定了疏水相互作用液相色谱法和紫外检测(HILIC-UV)解析小的未经修饰的和经修饰的寡核苷酸的能力。

图1示出了代表性未经修饰的和经修饰的寡核苷酸的HILIC-UV分析，所述寡核苷酸的序列和修饰在以下表3中描述。表3中的定制寡核苷酸是从IDTDNA订购的。

使用Phenomenex Luna 3μm HILIC

LC柱，150x 2mm进行了HILIC-UV。以0.25毫升/分钟的流速进行色谱法。流动相溶剂A(MPA)为含15mM乙酸铵的70％乙腈(ACN)。流动相溶剂B(MPB)为含15mM乙酸铵的30％ACN。图1示出了HILIC-UV可以解析代表性经修饰的和未经修饰的寡核苷酸。

表3：实例中使用的定制寡核苷酸

(*)表示硫代磷酸酯键(PS)

图2A和2B示出了使用来自表3的代表性未经修饰的和经修饰的寡核苷酸对两种HILIC缓冲液系统之间的分析性能的比较。在图2A中，MPA和MPB分别用含15mM乙酸铵的70％和30％ACN进行。在图2B中，MPA和MPB分别用含15mM甲酸铵的70％和30％ACN进行。选择15mM乙酸铵作为缓冲液。

图3A和3B示出了使用寡核苷酸，即未经修饰的CMV-F和硫代磷酸酯(PS)修饰的奥利默森对不同柱温度下的分析性能的比较。测定了23℃、30℃、40℃和50℃的柱温度。选择30℃作为柱温度。

实例2：经修饰的和未经修饰的寡核苷酸的IP-RPLC-UV检测

测定了离子配对反相液相色谱法和紫外检测(IP-RPLC-UV)解析小的未经修饰的和经修饰的寡核苷酸的能力。

图4示出了代表性未经修饰的和经修饰的寡核苷酸的IP-RPLC-UV分析，所述寡核苷酸的序列和修饰如以下表3所述。IP-RPLC-UV检测是使用Waters Acquity寡核苷酸BEH柱进行的。图4示出了IP-RPLC-UV可以解析代表性经修饰的和未经修饰的寡核苷酸。

IP-RPLC-UV还可以解析混合寡核苷酸样品，如图5和6所示。使用IP-RPLC-UV分析MassPrep OST标准品(序列在以下表4中提供)。

在图5中，混合MassPrep OST标准品在Waters Acquity寡核苷酸BEH柱上运行。流量和柱温度为0.25毫升/分钟(60℃)。MPA为含50mM六氟异丙醇(HFIP)和5mM N,N-二异丙基乙胺(DIEA)的水溶液。MPB为含50mM HFIP和5mM DIEA的乙腈。柱为ACQUITY UPLC寡核苷酸BEH C18柱，

1.7μm，2.1mm x 100mm。

在图6中，混合MassPrep OST标准品使用IP-RPLC-UV在Phenomenex Oligo-XT柱上运行。流量和柱温度为0.25毫升/分钟(60℃)。MPA为含50mM HFIP和5mM DIEA的水溶液。MPB为含50mM HFIP和5mM DIEA的乙腈。柱为

1.7μm Oligo-XT

LC柱，2.1mm x50mm。

表4：Waters MassPrep OST寡核苷酸标准品混合物

实例3：寡核苷酸的液相色谱法和串联质谱法表征

使用了液相色谱法(HILIC或IP-RPLC)和串联质谱法(MS/MS)以检测电离后未经修饰的寡核苷酸M13-R样品中具有不同电荷(z)的前体离子。

图7示出了具有pH为大约3.2的甲酸铵流动相的HILIC，以及之后的数据依赖性采集(DDA)MS/MS。如从图7中可以看到的，在这些条件下，z＝4-和z＝3-寡核苷酸前体离子占大多数。

图8示出了具有pH为大约5.8的乙酸铵流动相的HILIC，以及之后的DDA MS/MS。如从图8中可以看到的，在这些条件下，z＝4-和z＝3-寡核苷酸前体离子占大多数。

图9示出了具有DIEA流动相(pH值大于10)的IP-RPLC，以及之后的DDA MS/MS。如从图9中可以看到的，在这些条件下，M13-R的z＝9-、8-和7-前体离子占大多数。

实例4：未经修饰的寡核苷酸的完整质量分析

使用PMI完整软件(PMI Intact software)来计算未经修饰的寡核苷酸M13-R(图10A和10B)和未经修饰的寡核苷酸CMV-F(图11A和11B)的完整质量，以及完整M13-R和CMV-F寡核苷酸相对于寡核苷酸样品中的截短纯度的百分比。

此同一方法可以用于表征经修饰的寡核苷酸，如序列在表5中示出的商购寡核苷酸药物。

表5：使用具有已知序列和分子式的商购寡核苷酸药物对现有模板进行测试

图12A和12B示出了完整质量分析可以用于计算福米韦生的完整质量，并且示出了样品中完整福米韦生和福米韦生截短产物的百分比。编码和修饰的说明参见表2。

实例5：优化串联质谱法中更高能碰撞解离(HCD)碰撞能量

选择来自第一串联质谱仪(MS1)的特定m/z比的离子，并且然后通过更高能碰撞解离(HCD)将所述离子分裂成较小碎片离子。然后将这些碎片引入到第二质谱仪(MS2)中，所述质谱仪进而根据m/z对碎片进行分离和检测。

沿着磷酸酯骨架的寡核苷酸碎片产生了一组含有5'末端的离子(a-B、b和d)和另一组含有3'末端的离子(w和y)。DNA寡核苷酸产生a-B和w离子作为最丰富的碎片。RNA寡聚物有利于y和d-H2O离子的产生。(参见McLuckey等人,《美国质谱学会杂志(JASMS)》,1992,3:60-70和图13)。

优化了HILIC-MS/MS的HCD碰撞能量，如图14A和14B所示。对于大多数寡核苷酸序列，确定了15-20％的HCD NCE为最优碰撞能量。

寡核苷酸T7的[M-4H]^4-(M/z 1530.2549)和[M-8H]^8-离子前体的示例性碎片化分别在图15和18中示出。每个病例使用20％的HCD。在图18中，DNA中T的3'侧(C-O)通常不存在碎片化；T的5'侧(P-O)的碎片化产生强信号。

纳流电喷雾电离(ESI)使用流速较低的分流器。使用分流器来实现纳流电喷雾电离以分离样品。图16和17示出了纳流IP-RPLC-MS/MS可以进一步提高碎片化效率。

实例6：硫代磷酸酯(PS)修饰的寡核苷酸的碎片化

可以使用串联质谱法(参见实例5)以分析经修饰的寡核苷酸以及未经修饰的寡核苷酸。图19A、19B和19C示出了计算出的奥利默森碎片的质量。图20示出了用20％的HCD产生的碎片化的奥利默森[M-4H]^4-离子前体(M/z1419.8799)的示例性质谱。

序列表

<110> <110> 再生元制药公司（Regeneron Pharmaceuticals, Inc.）

HUANG, Ming

QIU, Haibo

XU, Xiaobin

LI, Ning

<120> 液相色谱法和质谱法用于表征寡核苷酸的用途

<130> REGE-020/001WO 181937-2305

<150> 62/968,368

<151> 2020-01-31

<160> 18

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> M13反向寡核苷酸

<400> 1

caggaaacag ctatgac 17

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> TRC-F寡核苷酸

<400> 2

caaggctgtt agagagataa ttgga 25

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> T7寡核苷酸

<400> 3

taatacgact cactataggg 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 未经修饰的奥利默森

<400> 4

tctcccagcg tgcgccat 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 具有修饰的奥利默森寡核苷酸

<220>

<221> 硫代磷酸酯

<222> (2)..(18)

<223> *表示硫代磷酸酯键

<400> 5

tctcccagcg tgcgccat 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SP6寡核苷酸

<400> 6

atttaggtga cactatag 18

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> T3寡核苷酸

<400> 7

gcaattaacc ctcactaaag g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CMV正向引物

<400> 8

cgcaaatggg cggtaggcgt g 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 福米韦生寡核苷酸

<220>

<221> 硫代磷酸酯

<222> (2)..(21)

<223> *表示硫代磷酸酯键

<400> 9

gcgtttgctc ttcttcttgc g 21

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> polyT核苷酸

<400> 10

tttttttttt ttttt 15

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> poly(T) 寡核苷酸

<400> 11

tttttttttt tttttttttt 20

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> poly(T) 寡核苷酸

<400> 12

tttttttttt tttttttttt ttttt 25

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> poly(T) 寡核苷酸

<400> 13

tttttttttt tttttttttt tttttttttt 30

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> poly(T) 寡核苷酸

<400> 14

tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttt 35

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 诺西那生寡核苷酸

<220>

<221> MOEr

<222> (1)..(18)

<223> 2'-O-甲氧基-乙基（MOEr）修饰

<220>

<221> 5me

<222> (2)..(2)

<223> 5-甲基修饰

<220>

<221> *

<222> (2)..(18)

<223> *表示硫代磷酸酯键

<220>

<221> 5me

<222> (4)..(4)

<223> 5-甲基修饰

<220>

<221> 5me

<222> (8)..(8)

<223> 5-甲基修饰

<220>

<221> 5me

<222> (15)..(15)

<223> 5-甲基修饰

<400> 15

tcactttcat aatgctgg 18

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 伊诺特森

<220>

<221> MOEr

<222> (1)..(5)

<223> 2'-O-甲氧基-乙基（MOEr）修饰

<220>

<221> *

<222> (2)..(20)

<223> *表示硫代磷酸酯键

<220>

<221> 5me

<222> (2)..(2)

<223> 5-甲基修饰

<220>

<221> 5me

<222> (10)..(10)

<223> 5-甲基修饰

<220>

<221> MOEr

<222> (16)..(20)

<223> 2'-O-甲氧基-乙基（MOEr）修饰

<220>

<221> 5me

<222> (18)..(20)

<223> 5-甲基修饰

<400> 16

tcttggttac atgaaatccc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 米泊美生

<220>

<221> MOEr

<222> (1)..(5)

<223> 2'-O-甲氧基-乙基（MOEr）修饰

<220>

<221> 5me

<222> (2)..(3)

<223> 5-甲基修饰

<220>

<221> *

<222> (2)..(20)

<223> *表示硫代磷酸酯键

<220>

<221> 5me

<222> (5)..(5)

<223> 5-甲基修饰

<220>

<221> 5me

<222> (9)..(9)

<223> 5-甲基修饰

<220>

<221> 5me

<222> (12)..(12)

<223> 5-甲基修饰

<220>

<221> 5me

<222> (15)..(15)

<223> 5-甲基修饰

<220>

<221> MOEr

<222> (16)..(20)

<223> 2'-O-甲氧基-乙基（MOEr）修饰

<220>

<221> 5me

<222> (17)..(17)

<223> 5-甲基修饰

<220>

<221> 5me

<222> (19)..(20)

<223> 5-甲基修饰

<400> 17

gcctcagtct gcttcgcacc 20

<210> 18

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> AZD4785

<220>

<221> cET

<222> (1)..(3)

<223> 约束乙基核苷类似物

<220>

<221> *

<222> (2)..(16)

<223> *表示硫代磷酸酯键

<220>

<221> cET

<222> (14)..(16)

<223> 约束乙基核苷类似物

<400> 18

gctattagga gtcttt 16

Claims

1.一种表征包括所关注寡核苷酸的群体的样品的方法，所述方法包括：

a.提供包括具有相同序列的所关注寡核苷酸的群体的样品；

b.对所述样品进行液相色谱法和质谱法，由此产生与所述所关注寡核苷酸的群体相对应的至少一个质谱图；以及

c.确定所述样品中与所述所关注寡核苷酸的群体相对应的总寡核苷酸的百分比。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品进一步包括至少一种杂质，所述至少一种杂质包括至少一个另外的寡核苷酸的群体。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述另外的寡核苷酸的群体包括所述所关注寡核苷酸的碎片化产物或合成副产物。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其进一步包括产生与所述至少一个另外的寡核苷酸的群体相对应的质谱图，以及确定所述样品中与所述至少一个另外的寡核苷酸的群体相对应的总寡核苷酸的百分比。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述所关注寡核苷酸为脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或DNA-RNA杂交体。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述所关注寡核苷酸为单链的。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述所关注寡核苷酸为双链的。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述所关注寡核苷酸包括发夹结构或茎-环结构。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述所关注寡核苷酸的长度介于15个核苷酸与100个核苷酸之间。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述所关注寡核苷酸为治疗性寡核苷酸。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述治疗性寡核苷酸包括反义寡核苷酸(ASO)、dsRNA、siRNA、核酸适配体或微RNA。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述所关注寡核苷酸包括至少一个修饰。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一个修饰位于所述所关注寡核苷酸的5'端、3'端或两者处。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述至少一个修饰包括对所述所关注寡核苷酸的至少一个内部核碱基的修饰。

15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述至少一个修饰影响所述所关注寡核苷酸的结合亲和力、结合特异性、稳定性、药代动力学或毒性。

16.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述至少一个修饰包括锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯(PS)键、末端5'或3'磷酸酯(PO)、5'甲基(5-Me)修饰、2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)修饰、约束乙基(cET)核苷类似物、聚乙二醇(PEG)或其组合。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述液相色谱法包括亲水相互作用液相色谱法(HILIC)或离子配对反相液相色谱法(Ion-pairing Reversed-Phase LiquidChromatography，IP-RPLC)。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述HILIC包括流动相缓冲液，所述流动相缓冲液包括乙酸铵。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述流动相包括第一缓冲液和第二缓冲液，所述第一缓冲液包括含15mM乙酸铵的70％乙腈(ACN)，所述第二缓冲液包括含15mM乙酸铵的30％(ACN)。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述HILIC包括流动相缓冲液，所述流动相缓冲液包括甲酸铵。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述流动相包括第一缓冲液和第二缓冲液，所述第一缓冲液包括含15mM甲酸铵的70％乙腈(ACN)，所述第二缓冲液包括含15mM甲酸铵的30％(ACN)。

22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中HILIC分离包括介于23℃与50℃之间的柱温度。

23.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中HILIC分离包括30℃的柱温度。

24.根据权利要求17至23中任一项所述的方法，其中所述HILIC包括具有平均标称粒径为3μm，中值颗粒孔径为

的固相，内径为2mm，并且长度柱为150mm的柱。

25.根据权利要求17所述的方法，其中所述IP-RPLC包括流动相缓冲液，所述流动相缓冲液包括六氟异丙醇(HFIP)和5mM N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述流动相包括第一缓冲液和第二缓冲液，所述第一缓冲液包括50mM HFIP和5mM DIEA的水溶液，所述第二缓冲液包括含50mM HFIP和5mMDIEA的乙腈。

27.根据权利要求17、25或26中任一项所述的方法，其中所述IP-RPLC包括具有平均标称粒径1.7μm、中值颗粒孔径

柱长度100mm和内径2.1mm的柱。

28.根据权利要求17、25或26中任一项所述的方法，其中所述IP-RPLC包括1.7μmOligo-XT

50x 2.1mm柱。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述质谱法包括电喷雾电离(ESI)。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述ESI包括纳流ESI。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述液相色谱法进一步包括对所述样品的紫外(UV)检测。

32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述质谱法为串联质谱法(MS/MS)。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述MS/MS包括数据依赖性采集(DDA)。

34.根据权利要求32或33所述的方法，其中所述MS/MS包括对所述所关注寡核苷酸的群体、所述至少另外的寡核苷酸的群体或其组合的碎片化。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述碎片化包括更高能碰撞解离(HCD)。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述HCD包括15％至35％的归一化碰撞能量(NCE)。

37.根据权利要求35所述的方法，其中所述HCD包括20％的归一化碰撞能量(NCE)。

38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括确定所述所关注寡核苷酸的完整质量。

39.根据权利要求2至38中任一项所述的方法，其中步骤(c)进一步包括确定所述至少一个另外的寡核苷酸的群体的完整质量。

40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括使用质谱法确定所述所关注寡核苷酸的结构。

41.根据权利要求2至40中任一项所述的方法，其中步骤(c)进一步包括确定所述至少一个另外的寡核苷酸的群体的结构。

42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述结构包含核苷酸序列、修饰或其组合。

43.一种制备包括所关注寡核苷酸的组合物的方法，所述方法包括：

a.合成所述所关注寡核苷酸；以及

b.使用根据权利要求1至42中任一项所述的方法来表征所述所关注寡核苷酸。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述组合物中的总寡核苷酸的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％为所述所关注寡核苷酸。

45.根据权利要求43或44所述的方法，其中所述方法进一步包括添加药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

46.一种组合物，其包括通过根据权利要求43至45中任一项所述的方法制备的所关注寡核苷酸。

47.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用根据权利要求46所述的组合物。

48.根据权利要求46所述的组合物，其在治疗有需要的受试者的方法中使用。

49.根据权利要求46所述的组合物，其用于制造用于治疗有需要的受试者的药物。

50.一种表征样品的方法，所述方法包括：

a.提供样品，所述样品包括具有相同序列和/或修饰的所关注寡核苷酸的群体以及至少一种杂质，所述至少一种杂质包括另外的寡核苷酸的群体；

b.对所述样品进行液相色谱法和串联质谱法(MS/MS)，

其中所述液相色谱法包括：

i.亲水相互作用液相色谱法(HILIC)，所述HILIC包括流动相，其中第一缓冲液包括含15mM甲酸铵或乙酸铵的70％乙腈(ACN)，

并且第二缓冲液包括含15mM甲酸铵或乙酸铵的30％ACN，或

ii.离子配对反相液相色谱法(IP-RPLC)，所述IP-RPLC包括流动相，其中第一缓冲液包括50mM六氟异丙醇(HFIP)和5mM N,N-二异丙基乙胺(DIEA)的水溶液，并且第二缓冲液包括含50mM HFIP和5mM DIEA的乙腈；

其中所述MS/MS包括使用更高能碰撞解离(HCD)对所述样品中的所述所关注寡核苷酸的群体和所述另外的寡核苷酸的群体的碎片化，所述HCD包括15％至35％的归一化碰撞能量(NCE)，

由此产生与所述所关注寡核苷酸的群体和所述另外的寡核苷酸的群体相对应的至少一个质谱图；以及

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述另外的寡核苷酸的群体包括所述所关注寡核苷酸的碎片化产物或合成副产物。

52.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述所关注寡核苷酸为脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或DNA-RNA杂交体。

53.根据权利要求50至52中任一项所述的方法，其中所述所关注寡核苷酸为单链的、双链的或其组合。

54.根据权利要求50至53中任一项所述的方法，其中所述所关注寡核苷酸包括发夹结构或茎-环结构。

55.根据权利要求50至54中任一项所述的方法，其中所述所关注寡核苷酸的长度介于15个核苷酸与100个核苷酸之间。

56.根据权利要求50至55中任一项所述的方法，其中所述所关注寡核苷酸为治疗性寡核苷酸。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述治疗性寡核苷酸包括反义寡核苷酸(ASO)、dsRNA、siRNA、核酸适配体或微RNA。

58.根据权利要求50至57中任一项所述的方法，其中所述所关注寡核苷酸包括至少一个修饰。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述至少一个修饰位于所述所关注寡核苷酸的5'端、3'端或两者处。

60.根据权利要求58或59所述的方法，其中所述至少一个修饰包括对所述所关注寡核苷酸的至少一个内部核碱基的修饰。

61.根据权利要求58至60中任一项所述的方法，其中所述至少一个修饰影响所述所关注寡核苷酸的结合亲和力、结合特异性、稳定性、药代动力学或毒性。

62.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中所述至少一个修饰包括锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯(PS)键、末端5'或3'磷酸酯(PO)、5'甲基(5-Me)修饰、2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)修饰、约束乙基(cET)核苷类似物、聚乙二醇(PEG)或其组合。

63.根据权利要求50至62中任一项所述的方法，其中所述HILIC色谱法包括30℃的柱温度。

64.根据权利要求50至63中任一项所述的方法，其中所述HILIC色谱法包括具有平均标称粒径为3μm，中值颗粒孔径为

的固相，内径为2mm，并且长度柱为150mm的柱。

65.根据权利要求50至62中任一项所述的方法，其中所述IP-RPLC包括1.7μm Oligo-XT

50x 2.1mm柱。

66.根据权利要求50至65中任一项所述的方法，其中所述MS/MS包括电喷雾电离(ESI)。

67.根据权利要求66所述的方法，其中所述ESI包括纳流ESI。

68.根据权利要求50至67中任一项所述的方法，其中所述液相色谱法进一步包括对所述样品的紫外(UV)检测。

69.根据权利要求50至68所述的方法，其中所述MS/MS包括数据依赖性采集(DDA)。

70.根据权利要求50至69中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括确定所述所关注寡核苷酸的群体和所述另外的寡核苷酸的群体的完整质量和/或结构。

71.一种制备包括所关注寡核苷酸的组合物的方法，所述方法包括：

a.合成所述所关注寡核苷酸，由此产生包括所述所关注寡核苷酸的群体的样品；以及

b.使用根据权利要求50至70中任一项所述的方法来表征所述样品。