CN117247993A - 检测mRNA加帽效率的前处理方法、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供检测mRNA加帽效率的前处理方法、试剂盒及应用，涉及生物技术领域。该检测mRNA加帽效率的前处理方法中使用的探针包含多个核糖核苷酸和一个脱氧核糖核苷酸，探针与mRNA杂交后的双链中仅有一个杂合子序列，RNaseH II酶可以特异识别该杂合子序列，并从该位置切割mRNA序列，该方法处理后的mRNA有且仅有一个酶切位点，得到的前处理样品大小一致。本申请所使用的方法可以避免在多个位置发生酶切反应和杂合子序列部分为GTP带来的误差干扰。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及检测mRNA加帽效率的前处理方法、试剂盒及应用。
背景技术
信使核糖核酸(mRNA)是中心法则中信息的载体，来自DNA的信息，通过mRNA，传递到细胞质，直接指导蛋白质合成，参与到各项生命活动中。在疫苗领域mRNA起着举足轻重的地位，同时越来越多基于mRNA的基因治疗产品，肿瘤治疗或预防性疫苗产品，以及细胞治疗的CAR-T/CAR-NK/CAR-巨噬细胞等领域，都逐渐有了mRNA应用的身影。
目前用于各项应用或研究的mRNA，都是采用体外合成的方式生产，在T7 RNA聚合酶等酶的作用下，单个的核糖核苷酸以DNA序列为模板生产出RNA序列。大多数mRNA最终的目标宿主是真核生物，真核生物mRNA表达需要具有完整的帽子结构，因此体外转录的mRNA也需要具有帽子结构。在目前的工艺中，帽子结构可以通过两种方式产生，其一是在体外转录后通过牛痘病毒加帽酶，以GTP为底物，以SAM为甲基供体，产生cap0帽子结构，随后再通过2-氧甲基转移酶，同样以SAM为甲基供体，进一步生成与80％真核生物mRNA相似的cap1帽子结构；另一种生成帽子结构的方式是在体外转录的体系中加入三核苷酸的帽类似物，即在转录的过程中直接生成具有cap1结构的mRNA。
综上，无论采用什么方式，mRNA的加帽率都是直接的评判指标。一方面mRNA加帽率是工艺过程监控，产品质量控制的重要手段；另一方面mRNA加帽率与后续mRNA的表达息息相关。国内外发布的政策法规，也把mRNA加帽率这一指标列为mRNA类药物/疫苗申报的必检项目。
加帽mRNA样品和未加帽mRNA样品的差别只在于一个核苷酸的分子量，相对于核酸序列全长而言，这点差别微乎其微，因此，想在动辄数以十万计的分子量中找出数以百计的差异，几乎无可能。目前通常方式都需要将mRNA序列开头的前20个左右的碱基酶切纯化出来，而变成在数以千计的分子量数量级中寻找到以百为单位的差异。
现有技术使用RNaseH I酶切处理，通过一个带有链霉亲和素的RNA和DNA杂合片段作为引物。RNaseH I的特性是识别4个位点以上的DNA-RNA杂合子，切割当中的RNA条带。因此，该探针巧妙的利用了这一原理，前面16个左右的RNA是与目标序列互补的RNA序列，形成局部双链RNA片段，RNaseH I无法识别发挥切割作用，后面6个左右的核苷酸为脱氧核糖核苷酸序列，与目标序列在此区域形成互补的杂合子，引导RNaseH I在该部位进行识别和切割，随后通过3’端的亲和素，使用亲和素磁珠，捕捉切割后的片段。
RNaseH I酶的特性是识别的杂合子序列必须在4个以上，这就导致了所设计的杂合子片段必须大于4个，考虑序列匹配度，酶切效率等因素，常用6个杂合子。此外RNaseH I切割杂合子中的RNA并没有序列特异性，这也导致酶切过程往往会产生多个酶切位点，酶切得到的小片段大小不固定，从而影响加帽率的测定；如果在这一区域内有GTP的存在，也会对加帽率的测定产生干扰，因为帽子结构m7G刚好是一个甲基化的GTP，其分子量非常接近。
发明内容
本申请的目的在于提供检测mRNA加帽效率的前处理方法、试剂盒及应用，以解决上述问题。
为实现以上目的，本申请采用以下技术方案：
本申请首先提供一种检测mRNA加帽效率的前处理方法，包括：
探针设计：针对待检测mRNA的序列设计探针，所述探针序列包括不位于3’末端的一个脱氧核糖核苷酸，所述探针序列还包括除所述一个脱氧核糖核苷酸以外，与所述待检测mRNA从5’末端开始碱基互补配对的15-30个核糖核苷酸；
探针和mRNA结合：将所述探针与所述待检测mRNA结合，得到复合物；
酶切：使用RNaseH II酶切割所述复合物，并对切割产物进行纯化回收，得到所述待检测mRNA的5’端小片段。
优选地，所述一个脱氧核糖核苷酸位于所述探针的5’末端。
优选地，所述探针的3’末端标记有生物素。
优选地，所述纯化回收采用磁珠法进行，所述磁珠偶联有链霉亲和素。
优选地，所述待检测mRNA与所述磁珠的用量比为(150-200pmol)：(320μg-400μg)。
优选地，所述探针和mRNA结合的孵育条件为：95℃，5-10min；65℃，2-4min；55℃，2-4min；40℃，2-4min；22℃，2-4min。
优选地，所述酶切的条件为：37℃酶切1.5h-3h。
优选地，所述探针、所述待检测mRNA和所述RNaseH II酶的用量比为：(1-1.5pmol):(2-3pmol):(4-6mU)。
优选地，所述核糖核苷酸为2号位甲氨基修饰的核糖核苷酸。
本申请还提供一种检测mRNA加帽效率的前处理试剂盒，用于上述的检测mRNA加帽效率的前处理方法，包括：
RNaseH II酶；
探针，所述探针序列包括不位于3’末端的一个脱氧核糖核苷酸，所述探针序列还包括除所述一个脱氧核糖核苷酸以外，与所述待检测mRNA从5’末端开始碱基互补配对的15-30个核糖核苷酸。
优选地，所述试剂盒还包括：偶联有链霉亲和素的磁珠。
本申请还提供一种检测mRNA加帽效率的方法，包括上述的检测mRNA加帽效率的前处理方法。
优选地，对所述待检测mRNA的5’端小片段采用LC-MS定量mRNA加帽效率。
优选地，对所述待检测mRNA的5’端小片段采用毛细管电泳定量mRNA加帽效率。
本申请还提供一种生产mRNA的方法，包括上述的检测mRNA加帽效率的方法。
优选地，所述生产mRNA的方法包括基于所述检测mRNA加帽效率的方法的定量结果而调节生产条件的步骤。
本申请还提供上述的生产mRNA的方法生产得到的mRNA。
与现有技术相比，本申请的有益效果包括：
本申请的检测mRNA加帽效率的前处理方法中使用的探针仅有一个脱氧核糖核苷酸，探针与mRNA结合的复合物中仅有一个杂合子序列，RNaseH II酶可以特异识别该杂合子序列，并从该位置切割mRNA序列，该方法处理的mRNA仅有一个酶切位点，不会产生多个酶切位点，从而得到的前处理样品大小统一，可以避免杂合子序列部分为GTP带来的误差干扰。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对本申请范围的限定。
图1为本申请方案的检测mRNA加帽效率的前处理方法的流程示意图；
图2为实施例1的探针设计序列图；
图3为RNaseH I和RNaseH II酶切样品回收小片段的跑胶图；
图4为实施例1的RNaseH II酶切未加帽样品的解卷积图；
图5为实施例1的RNaseH II酶切加帽样品的解卷积图；
图6为实施例2的探针设计序列图；
图7为实施例3的探针设计序列图；
图8为实施例4的探针设计序列图；
图9为实施例1至实施例4的RNaseH II酶切样品回收小片段的跑胶图；
图10为对比例1的RNaseH I酶切未加帽样品的解卷积图；
图11为对比例1的RNaseH I酶切加帽样品的解卷积图。
具体实施方式
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。
如本文使用的，术语“核苷”或“核碱基”指与糖类例如D-核糖(RNA中)或2’-脱氧-D-核糖(DNA中)通过糖类的异头碳(糖类的1’-碳原子)与核碱基之间的N-糖苷键连接的腺嘌呤(“A”)、鸟嘌呤(“G”)、胞嘧啶(“C”)、尿嘧啶(“U”)、胸腺嘧啶(“T”)及其类似物。
如本文使用的术语“核苷酸”表示磷酸化形式的核苷(核苷的磷酸酯)，作为单体单元或者多核苷酸多聚物内。
术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”或“寡核苷酸”在本文可互换使用。他们指核苷酸单体或其类似物的聚合物，例如脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)及其组合。多核苷酸可以完全由脱氧核糖核苷酸、完全由核糖核苷酸或其嵌合混合物构成。
术语“3’”指来自相同寡核苷酸的另一区域或位置的多核苷酸或寡核苷酸3’末端(即，下游)中的区域或位置。术语“5’”指来自相同多核苷酸或寡核苷酸的另一区域或位置的多核苷酸或寡核苷酸5’末端(即，上游)中的区域或位置。本文涉及核酸分子使用的术语“3’末端”或“3’端”指包含与末端戊糖的3’碳连接的游离羟基的核酸末端。本文涉及核酸分子使用的术语“5’末端”和“5’端”指包含与末端戊糖的5’碳连接的游离羟基或磷酸基团的核酸分子末端。
本申请所述的检测mRNA加帽效率的前处理方法及检测mRNA加帽效率的方法一般适用于定量任何类型的mRNA帽。mRNA帽子结构通常有三种类型(m7G5'ppp5'Np，m7G5'ppp5'NmpNp，m7G5'ppp5'NmpNmpNp)，分别称为O型、I型和II型。O型指末端核苷酸的核糖未甲基化，I型指末端一个核苷酸的核糖甲基化，II型指末端两个核苷酸的核糖均甲基化。
本申请首先提供一种检测mRNA加帽效率的前处理方法，用于对待检测mRNA进行前处理，得到检测mRNA加帽效率的检测样品，请参阅图1，该前处理方法包括：
S100：探针设计：针对待检测mRNA的序列设计探针，所述探针序列包括不位于3’末端的一个脱氧核糖核苷酸，所述探针序列还包括除所述一个脱氧核糖核苷酸以外，与所述待检测mRNA从5’末端开始碱基互补配对的15-30个核糖核苷酸。
S200：探针和mRNA结合：将所述探针与所述待检测mRNA结合，得到复合物。
S300：酶切：使用RNaseH II酶切割所述复合物，并对切割产物进行纯化回收，得到所述待检测mRNA的5’端小片段。
本申请的检测mRNA加帽效率的前处理方法中使用的探针仅有一个脱氧核糖核苷酸，探针与mRNA结合的复合物中仅有一个杂合子序列，RNaseH II酶可以特异识别该杂合子序列，并从该位置切割mRNA序列，该方法处理的mRNA仅有一个酶切位点，不会产生多个酶切位点，切割位点的特异性强，寡核苷酸目标物响应度明显提高，从而得到的前处理样品大小统一，可以避免杂合子序列部分为GTP带来的误差干扰。
步骤S100中，待检测mRNA不特别限定，可以是体外合成的mRNA。本领域技术人员可以理解，mRNA还包括体外转录的mRNA、分离的真核mRNA和病毒RNA。
针对待检测mRNA的序列不同，需要设计不同的探针序列。其中，探针中设计为仅有一个脱氧核糖核苷酸，并且该脱氧核糖核苷酸不位于探针的3’末端，也即该脱氧核糖核苷酸可以位于探针的5’末端，也可以位于探针的3’末端和5’末端之间的位置。除了该脱氧核糖核苷酸以外，该探针的其余序列均为与待检测mRNA从5’末端开始碱基互补配对的核糖核苷酸，长度大约为15-30个核糖核苷酸，例如可以为(15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)个核糖核苷酸。
示例性的，本申请的探针寡核苷酸序列可以为具有下式的结构：5’-X-Yn-3’，其中，X为DNA腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G、胞嘧啶C碱基中的任意一种；Y选自RNA腺瞟呤A、鸟瞟呤G、胞嘧啶C和尿嘧啶U碱基中的至少一种或其组合，n表示RNA碱基数目，其中n为15-30之间的整数。
示例性的，本申请的探针寡核苷酸序列还可以为具有下式的结构：5’-Yn1-X-Yn2-3’，其中，X为DNA腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G、胞嘧啶C碱基中的任意一种；Y选自RNA腺瞟呤A、鸟瞟呤G、胞嘧啶C和尿嘧啶U碱基中的至少一种或其组合，n1和n2表示RNA碱基数目，其中n1+n2为15-30之间的整数。
在一优选实施方案中，探针的一个脱氧核糖核苷酸位于探针的5’末端。
优选地，所述探针中的核糖核苷酸为2号位甲氨基修饰的核糖核苷酸，可以使得探针更稳定。
步骤S200中，使待检测mRNA与步骤S100设计的探针寡核苷酸结合，得到复合物。mRNA与寡核苷酸探针的结合通过退火或杂交程序实现，术语“退火”、“杂交”指由Watson-Crick碱基互补配对的核苷酸序列之间形成复合物(双链体或杂交体)。本文所用术语“互补”指在特定条件下与其互补序列形成稳定双链体的核酸分子。如果所有核酸碱基匹配，则两个核酸分子之间的互补性称为“完全”或“全部”，否则称为“部分”。
在一优选实施方案中，所述探针和mRNA结合的孵育条件为：95℃，5-10min；65℃，2-4min；55℃，2-4min；40℃，2-4min；22℃，2-4min。更优选地，所述探针和mRNA结合的孵育条件为：95℃，5min；65℃，2min；55℃，2min；40℃，2min；22℃，2min。
步骤S300中，RNaseH II酶发现于大肠杆菌中，是一种核糖核酸酶H，与NaseH I酶一样可以有效降解RNA和DNA杂交链中的RNA链，并且RNaseH II酶可以酶切RNA和DNA杂交链中的多杂合子，也可以酶切RNA和DNA杂交链中的单杂合子。本申请方案中，将探针设计为仅有一个脱氧核糖核苷酸，使得RNaseH II酶降解待检测mRNA和探针结合复合物中的单杂合子，从而得到特异的单一酶切位点。
本申请方案中，RNaseH II酶降解RNA和DNA杂交链中的RNA链的酶切条件为：37℃酶切1.5h-3h；优选为37℃酶切2h。酶切步骤中，除了添加RNaseH II酶外，还包括其他试剂，其他试剂包括但不限于：10×RNase H II buffer和RNA酶抑制剂，RNase H II buffer和RNA酶抑制剂可通过市售获得。
优选地，所述探针、所述待检测mRNA和所述RNaseH II酶的用量比为：(1-1.5pmol):(2-3pmol):(4-6mU)。
步骤S300中，对切割产物进行纯化回收，术语“纯化回收”是指用于减少待测体系内其他物质对后续反应的影响的处理步骤，优选通过磁珠法进行纯化和回收，磁珠偶联有链霉亲和素，从而探针的3’末端标记有生物素。
首先将磁珠混匀后，按照待检测mRNA每150-200pmol取320μg-400μg磁珠的用量放至磁力架，磁性分离去上清；取200μL Wash buffer(0.3M-0.8M NaCl、10-50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.5-5mM EDTA)加入有磁珠的EP管中，磁性分离去上清，重复该操作两次；将酶切后的样品和磁珠混匀，混匀仪室温混匀30min；混匀后，置于磁力架磁性分离去上清，加入200μL Wash buffer，清洗磁珠4次；然后加入100μL预冷Low salt buffer(0.05-0.3MNaCl、10-50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.5-5mM EDTA)混匀，磁性分离并将上清保留；取25μL 80℃加热的Elution buffer(5-25mM Tris-HCl(pH7.5)、0.5-5mM EDTA)和磁珠混匀，80℃加热4min，磁力架磁性分离并保留上清至标记好的管中，重复2次；最后将两次上清混合再次置于磁力架吸附，确保去除少量残留磁珠。
本申请还提供一种检测mRNA加帽效率的前处理试剂盒，用于上述的检测mRNA加帽效率的前处理方法，包括：
RNaseH II酶；
探针，所述探针序列包括不位于3’末端的一个脱氧核糖核苷酸，所述探针序列还包括除所述一个脱氧核糖核苷酸以外，与所述待检测mRNA从5’末端开始碱基互补配对的15-30个核糖核苷酸。
术语“试剂盒”指用于递送材料的任何递送系统。此类递送系统可以包括允许储存、运输或递送各种诊断或治疗试剂和/或支持材料(例如，缓冲剂，用于进行测定的书写说明书，等)从一个地方至另一个地方的系统。
除了上述组分之外，本发明的试剂盒还可包括与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。
本发明的试剂盒的组分(例如，寡核苷酸和酶)可设置于容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器的手段。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，例如寡核苷酸的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
优选地，所述试剂盒还包括：偶联有链霉亲和素的磁珠，以及可选的磁珠缓冲液、清洗液、洗脱液等所必需的试剂等。
本申请还提供一种检测mRNA加帽效率的方法，包括上述的检测mRNA加帽效率的前处理方法，由该前处理方法得到待检测样品，即待检测mRNA的5’端小片段。
在一实施例中，对所述待检测mRNA的5’端小片段采用LC-MS定量mRNA加帽效率。
液质联用(LC-MS)又叫液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统，两者结合可以减少实验误差，提高准确度。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来。
为了确保完全电离并保持质谱的检测灵敏度，LC-MS的流速应小于HPLC的流速。因此，LC-MS的色谱柱要小得多，以适应较小的溶剂流速和样品体积。注射泵因其精确度高并可以提供非常低的流速，常用于LC-MS。此外，还可以使用注射泵将样品注入系统，因为其可以提供的样品剂量非常精确。
在另一实施例中，对所述待检测mRNA的5’端小片段采用毛细管电泳定量mRNA加帽效率。
毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE)技术是一种基于电荷和分子量大小差异分离分析生物分子(核酸、蛋白质、多肽、糖等)的方法。它利用电场将带电生物分子在带电毛细管中移动，分离不同大小、电荷和形状的分子。mRNA是由核苷酸组成的单链生物大分子，带负电荷的性质。由于核酸mRNA具有负电荷，因此在电场作用下，基于mRNA的大小、形态和电荷密度的不同可在毛细管中移动并差异分离。
本申请还提供一种生产mRNA的方法，包括上述的检测mRNA加帽效率的方法。
优选地，所述生产mRNA的方法包括基于所述检测mRNA加帽效率的方法的定量结果而调节生产条件的步骤。
本申请还提供上述的生产mRNA的方法生产得到的mRNA。
下面将结合具体实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
1.1探针设计：在体外转录合成mRNA目标序列，分别得到加帽和没有加帽的mRNA样品，并根据mRNA序列设计探针，探针序列包括位于5’末端的一个脱氧核糖核苷酸，还包括与待检测mRNA从5’末端开始碱基互补配对的19个核糖核苷酸，目标序列和探针的碱基互补配对如图2所示，实施例1的探针序列为：5'-dGrCrUrArGrCrCrArGrCrUrUrGrGrGrUrCrUrCrCrC-3'，d：脱氧核糖核苷酸，r：2号位甲氮基修饰的核糖核苷酸；根据设计的探针序列合成得到探针。
1.2探针与mRNA结合：取浓缩后的加帽mRNA 200pmol与复溶后探针150pmol于PCR管中混匀。
1.3探针与mRNA结合退火程序：使用基因扩增仪运行退火程序使mRNA与探针特异性结合，程序设定为：95℃，5min；65℃，2min；55℃，2min；40℃，2min；22℃，2min。
1.4RNase H II酶切：退火后样品加入RNase H II酶600mU、10×RNase H IIbuffer 6μl，补加Nuclease-Free water至终体积为60μl。混匀将液体离心至管底，37℃恒温水浴孵育2h。
2.磁珠清洗
2.1将磁珠漩涡混合均匀，取320μg-400μg磁珠加入新的EP管中。放置在磁分离器上，待溶液变澄清后，用移液器吸弃保护液。
2.2将EP管从磁分离器上取下，加入200μL Wash buffer溶液，用移液枪吹打清洗，放置在磁分离器上，收集磁珠，用移液器吸弃清洗液。重复洗涤2次。
3.mRNA与磁珠结合
3.1加入酶切后mRNA样品溶液与磁珠混匀，用移液枪轻柔吹打充分混匀。
3.2室温孵育30min，使磁珠与探针充分结合。
3.3孵育后样品置于磁分离器上，待液体澄清后，吸弃上清液。加入200μL Washbuffer溶液轻柔吹打清洗磁珠，置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清液。重复清洗4次。
4.样本洗脱
4.1加入100μL预冷Low salt buffer溶液，吹打混匀磁珠后磁性分离并将上清保留，取25μL 80℃加热的Elution buffer和磁珠混匀，80℃加热4min，磁力架磁性分离并保留上清至标记好的离心管中，重复2次，使mRNA从磁珠上洗脱下来。
4.2将离心管置于磁力架上吸附30s，待液体澄清后，将上清液收集至新的1.5ml离心管中。
4.3离心收集上清液：收集的样品于4℃冷冻离心机中20000rpm离心15min，将上清液转移至液相小瓶内插管中，待上机分析。
5.Urea-PAGE电泳
RNaseH I酶切和RNaseH II酶切回收的样品的21％ Urea-PAGE电泳如图3所示，图3中，1为：RNaseH I酶切探针；2为：RNaseH I酶切未加帽样品；3为：RNaseH I酶切加帽样品；4为：RNaseH II酶切探针；5为：RNaseH II酶切未加帽样品；6为：RNaseH II酶切加帽样品。根据图3可知，RNaseH I酶和RNaseH II酶均可以酶切待检测mRNA样品，得到纯度合适的相应的小片段，从而可以进行下一步上机LC-MS检测。
6.LC-MS分析
6.1色谱柱：Agilent Ad vanceBio Oligonucleotides HPH-C1 8，2.7μm，2.1mmx50mm。
6.2质谱条件：以含8mmol/L三乙胺，200mmol/L六氟异丙醇，1μM EDTA水溶液为流动相A，甲醇为流动相B，进行线性梯度洗脱；检测波长为260nm；柱温为60℃；流速为0.3mL/min；检测器为飞行时间质谱，鞘气温度为350℃，雾化气压力为35psi，鞘气流速为12L/min，喷嘴电压为1000V，毛细管电压为3500V，干燥气流速为8L/min，干燥气温度为325℃；空白样品(1％甲醇)、探针样品及加帽样品进样体积均为10～20μl。
6.3数据处理：使用BioConfirm 10.0软件对质谱数据进行解卷积分析目标物。
6.4实验结果
RNaseH II酶切未加帽样品的解卷积图如图4所示，RNaseH II酶切加帽样品的解卷积图如图5所示，根据图4和图5可知，RNaseH II酶切回收的小片段样品，上机检测只会有单一的识别序列，没有产生不同的端口，不容易匹配错，证明其酶切位点特异专一。
对解卷积图谱中识别到的cap序列和uncap序列的Fractional Abundance占比计算，加帽率＝匹配上的cap的Fractional Abundance总占比/(匹配上的cap+uncap的Fractional Abundance总占比)×100，Fractional Abundance会在解卷积图中体现，根据占比进行计算。
样品中的uncapped和capped成分均可被准确分析出来，并依据其匹配上的序列以及可变序列有所对应，最后结果分析中，提取cap和uncap对应的Fractional Abundance进行样品中uncapped和capped成分的占比计算。
实施例2
采用与实施例1相同的mRNA目标序列设计实施例2的探针，目标序列和实施例2的探针的碱基互补配对如图6所示，实施例2的探针序列为：5'-rGrCrUrAdGrCrCrArGrCrUrUrGrGrGrUrCrUrCrCrC-3'；根据设计的探针序列合成得到实施例2的探针。
(1)探针与加帽mRNA孵育：
| 试剂 | 投入量 |
| 单酶切位点探针 | 150pmol |
| GG-fluc加帽 | 200pmol |
PCR仪孵育条件：95℃，5min；65℃，2min；55℃，2min；40℃，2min；22℃，2min。
(2)RNaseH II酶切：退火后样品加入RNase H II酶600mU、10×RNase H IIbuffer 6μl，补加Nuclease-Free water至终体积为60μl，37℃酶切2h。
实施例3
采用与实施例1相同的mRNA目标序列设计实施例3的探针，目标序列和实施例3的探针的碱基互补配对如图7所示，实施例3的探针序列为：5'-rGrCrUrArGrCrCrArGrCrUrUdGrGrGrUrCrUrCrCrC-3'；根据设计的探针序列合成得到实施例3的探针。其它孵育和酶切步骤与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例4
采用与实施例1相同的mRNA目标序列设计实施例4的探针，目标序列和实施例4的探针的碱基互补配对如图8所示，实施例4的探针序列为：5'-rGrCrUrArGrCrCrArGrCrUrUrGrGrGrUdCrUrCrCrC-3'；根据设计的探针序列合成得到实施例4的探针。其它孵育和酶切步骤与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例2至实施例4的探针以及RNaseH II酶切加帽mRNA样品的21％ Urea-PAGE电泳如图9所示，图9中，1为：实施例2的探针；2为：RNaseH II酶切实施例2的探针的加帽酶切样品；3为：实施例3的探针；4为：RNaseH II酶切实施例3的探针的加帽酶切样品；5为：实施例4的探针；6为：RNaseH II酶切实施例4的探针的加帽酶切样品。根据图9可知，RNaseH II酶可以酶切实施例2至实施例4的脱氧核糖核苷酸位于探针序列中间的探针和待检测mRNA样品的复合物，但是酶切条带没有实施例1清晰，酶切效果不如实施例1的探针。
对比例1
采用与实施例1相同的mRNA目标序列设计对比例1的探针，对比例1采用RNaseH I酶，对比例1的探针序列为：dAdAdCdGdCdTrArGrCrCrAr GrCrUrUrGrGrGrUrCrUrCrCrC。
结合条件：95℃，5min；65℃，2min；55℃，2min；40℃，2min；22℃，2min。
酶切条件：37℃酶切2h。RNaseH I酶切回收的样品的21％ Urea-PAG E电泳如图3所示。
RNaseH I酶切未加帽样品的解卷积图如图10所示，RNaseH I酶切加帽样品的解卷积图如图11所示，根据图10和图11可知，RNaseH I酶切回收的小片段样品，上机检测会出现多个酶切位点，产生了不同的端口，酶切位点不专一，会导致识别到的序列有错误。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本申请的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本申请的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
Claims (17)
1.一种检测mRNA加帽效率的前处理方法，其特征在于，包括：
探针设计：针对待检测mRNA的序列设计探针，所述探针序列包括不位于3’末端的一个脱氧核糖核苷酸，所述探针序列还包括除所述一个脱氧核糖核苷酸以外，与所述待检测mRNA从5’末端开始碱基互补配对的15-30个核糖核苷酸；
探针和mRNA结合：将所述探针与所述待检测mRNA结合，得到复合物；
酶切：使用RNaseH II酶切割所述复合物，并对切割产物进行纯化回收，得到所述待检测mRNA的5’端小片段。
2.根据权利要求1所述的检测mRNA加帽效率的前处理方法，其特征在于，所述一个脱氧核糖核苷酸位于所述探针的5’末端。
3.根据权利要求1所述的检测mRNA加帽效率的前处理方法，其特征在于，所述探针的3’末端标记有生物素。
4.根据权利要求3所述的检测mRNA加帽效率的前处理方法，其特征在于，所述纯化回收采用磁珠法进行，所述磁珠偶联有链霉亲和素。
5.根据权利要求4所述的检测mRNA加帽效率的前处理方法，其特征在于，所述待检测mRNA与所述磁珠的用量比为(150-200pmol)：(320μg-400μg)。
6.根据权利要求1所述的检测mRNA加帽效率的前处理方法，其特征在于，所述探针和mRNA结合的孵育条件为：95℃，5-10min；65℃，2-4min；55℃，2-4min；40℃，2-4min；22℃，2-4min。
7.根据权利要求1所述的检测mRNA加帽效率的前处理方法，其特征在于，所述酶切的条件为：37℃酶切1.5h-3h。
8.根据权利要求1所述的检测mRNA加帽效率的前处理方法，其特征在于，所述探针、所述待检测mRNA和所述RNaseH II酶的用量比为：(1-1.5pmol):(2-3pmol):(4-6mU)。
9.根据权利要求1至8任一项所述的检测mRNA加帽效率的前处理方法，其特征在于，所述核糖核苷酸为2号位甲氨基修饰的核糖核苷酸。
10.一种检测mRNA加帽效率的前处理试剂盒，用于权利要求1至9任一项所述的检测mRNA加帽效率的前处理方法，其特征在于，包括：
RNaseH II酶；
探针，所述探针序列包括不位于3’末端的一个脱氧核糖核苷酸，所述探针序列还包括除所述一个脱氧核糖核苷酸以外，与所述待检测mRNA从5’末端开始碱基互补配对的15-30个核糖核苷酸。
11.根据权利要求10所述的检测mRNA加帽效率的前处理试剂盒，其特征在于，还包括：偶联有链霉亲和素的磁珠。
12.一种检测mRNA加帽效率的方法，其特征在于，包括权利要求1至9任一项所述的检测mRNA加帽效率的前处理方法。
13.根据权利要求12所述的检测mRNA加帽效率的方法，其特征在于，对所述待检测mRNA的5’端小片段采用LC-MS定量mRNA加帽效率。
14.根据权利要求12所述的检测mRNA加帽效率的方法，其特征在于，对所述待检测mRNA的5’端小片段采用毛细管电泳定量mRNA加帽效率。
15.一种生产mRNA的方法，其特征在于，包括权利要求12至14任一项所述的检测mRNA加帽效率的方法。
16.根据权利要求15所述的生产mRNA的方法，其特征在于，包括基于所述检测mRNA加帽效率的方法的定量结果而调节生产条件的步骤。
17.根据权利要求15或16所述的生产mRNA的方法生产得到的mRNA。
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