CN104109708B - 一种直接测定生物样品中未经分离的小核酸的方法及检测试剂盒 - Google Patents
一种直接测定生物样品中未经分离的小核酸的方法及检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种直接测定生物样品中未经分离的小核酸的方法，包括如下步骤：（1）取生物样品；（2）加Ploy A到小核酸的3’端：3）逆转录反应：加入带一第一引物的寡聚dT及逆转录酶，生成带寡聚T+和设计的第一引物尾的单链cDNA；（4）PCR放大定量小核酸：加入和小核酸序列完全互补或部分互补的第二引物，以及和第一引物完全互补或部分互补的第三引物，之后进行PCR检测定量小核酸的量。本发明无需分离生物样品中的小核酸，而是直接利用生物样品测定其小核酸（如siRNA、miRNA、反义核酸、aptamer)含量。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及定量分析生物样品中的小核酸的方法和试剂盒。
背景技术
小核酸广泛应用于生物医学研究和药物开发，但目前亟需解决问题是：siRNA的组织定量检测是小核酸体内分布及代谢动力学研究的瓶颈，而小核酸组织的分布和代谢的部位是直接或间接地确定其小核酸及传输系统的效果及毒性的证据，所以亟需建立一种简便而准确的siRNA定量检测方法。但生物样品中小核酸量的测定尚无较好的测定方法，尤其是体内样品的定量分析。而体内小核酸的定量是开发药物的极其重要的手段。生物样品中小核酸的定量分析方法最为成熟、应用最多的是非放射性同位素标记定量分析方法包括毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)和高效液相色谱法(High performance liquidchromatography,HPLC)。CE方法对于小核酸的检测具有高分辨率、可分辨相差一个核苷酸的小核酸,其在血浆基质中对小核酸的最低定量限约在70μg/L(约12nmol/L)水平。HPLC方法的分辨率和灵敏度与CE方法相比略低。目前小核酸类药物通常在较低剂量下(≤1mg/kg)给药即能发挥药效,这对定量分析方法学的灵敏度提出越来越高的要求。而上述方法的灵敏度难以达到对小核酸在血浆和组织中药代动力学终末消除相的定量能力(浓度通常低于10nmol/L)。此外,上述两种主流分析方法还有一个共同的缺陷,即样品前处理过程相当复杂,绝对回收率低,分析周期长、成本高,应用受限。核酸分子杂交的酶联桥接(Enzyme-linked bridging assay,ELBA)法其检测灵敏度也仅比上述方法稍高一些，仍不能满足对生物样品中小核酸定量的精确要求.茎环法RT-qPCR技术已经普遍应用，但是据我们及其他实验室的验证，实验数据的一致性差、误差大、很难达到符合RNAi药物申报的要求。
发明内容
为克服背景技术的以上问题，本发明提供了一种直接测定生物样品中未经分离的小核酸的方法及试剂盒
本发明的试剂盒包括：
1.Triton－X100溶液；
2.组织裂解液；
3.Poly A聚合酶反应液；
4.Poly A聚合酶；
5.Poly T+第一引物；
6.逆转录酶反应液；
7.逆转录酶；
8.PCR反应液；
9.PCR聚合酶；
10.3’端通用PCR引物，其和第一引物完全互补或部分互补；
11.去DNase和RNase水；
本发明的一种直接测定生物样品中未经分离的小核酸的方法，包括如下步骤：
（1）分离生物样品；
（2）加Ploy A到小核酸的3’端：
如生物样品为体液样品，用含Triton-X100水稀释，然后在稀释液中加入聚合酶A以及dATP,使生物样品中的小核酸生成polyA尾；
如生物样品为组织样品，则先用组织裂解液将组织匀浆，之后用含Triton-X100
水稀释组织匀浆液，然后在稀释液中加入聚合酶A以及dATP,使生物样品中的小核酸生成polyA尾；
（3）逆转录反应：加入带一第一引物的寡聚dT及逆转录酶，生成带寡聚T+和设计的第一引物尾的单链DNA；
（4）PCR放大定量小核酸：在PCR反应液中，加入逆转录反应合成的单链cDNA,加入和小核酸序列完全互补或部分互补的第二引物（小核酸特异引物），以及和第一引物完全互补或部分互补的第三引物（3’端引物），之后进行PCR检测定量小核酸的量。
在一较佳实施例中，步骤（2）中，含Triton-X100水稀释体液的倍数范围为3倍-50倍。。
在一较佳实施例中，步骤（2）中，组织中加入的组织裂解液体积比范围为2倍-50倍，含Triton-X100水稀释组织匀浆液的倍数范围为2倍-500倍，更佳可以为5倍-15倍。。
在一较佳实施例中，poly-A的长度范围为5个碱基-100个碱基，更佳可以为20个碱基-50个碱基。
在一较佳实施例中，第一引物的长度范围为5个碱基-100个碱基，更佳可以为15个碱基-27个碱基。
在一较佳实施例中，第二引物的长度范围为5个碱基-100个碱基，更佳可以为15个碱基-27个碱基。
在一较佳实施例中，第三引物的长度范围为5个碱基-100个碱基，更佳可以为15个碱基-27个碱基。
在一较佳实施例中，步骤（2）反应体系为：
在一较佳实施例中，步骤（2）反应体系为：
1-10ul稀释后的血浆或组织匀浆，然后按下列顺序分别加入：
0.4-20ul5X反应液
0.2-20ul25mM MnCl2
0.8-10ul ATP
0.04-5ul Poly A聚合酶
0.3-7ul水
37℃度温育15分钟。
在一较佳实施例中，步骤（3）反应体系为：
0.6-6.25ul缓冲液
1.8-18.75ul含寡聚dT的引物
65℃孵育5分钟，然后分别加入
6-62.5ul2X反应液
1-12.5ul反转录酶
50℃孵育5分钟，85℃孵育5分钟。
在一较佳实施例中，步骤（4）反应体系为：
2-15ul稀释的cDNA
1-25ul2X反应液
0.2-1ul50X SYBR green
1-10ul PCR引物（6uM）
1-10ul水
95℃15分钟，40个循环:95℃15秒，55℃30秒，72℃30秒。
本发明提供了一种快速高灵敏及高效的检测方法及其试剂盒，本发明方法无需分离生物样品中的小核酸，而是直接利用生物样品测定其小核酸（如siRNA、miRNA、反义核酸、aptamer)含量。本发明首先用聚合酶在小核酸的3’末端加上一段寡聚核酸，从而使小核酸变得更长而能作为一个有效的PCR模板。延长的小核酸可以用一个特异的与5’端小核酸本身互补的寡聚核酸作为引物，并用另一与3’延长段的寡聚核酸互补的另一核酸作为另一引物来经PCR扩增而达到定量测定小核酸量的目的。该方法不但灵敏度高。数据的一致性高，其数据可以用于GLP实验室和RNAi药物的定量及申报要求。
使用本发明的小核酸定量试剂盒，用户只需要根据自己的小核酸序列设计特异的PCR引物即可。其优点是无需从样品中分离、纯化，就能够快速、准确定量分析生物样品中的小核酸。该方法灵敏度高(可精确定量血浆中小核酸的量至10pg/ml,组织中小核酸的量至10pg/g)，线性范围宽，重复性好，可用于小核酸的生物医学研究和药物开发。
附图说明
图1为本发明的原理图；
图2为siRNA标准曲线(用实施例1-5的方法)。A:含10%小鼠血浆的Triton X-100的水中有不同浓度的siRNA。B:含1%小鼠肝组织匀浆的Triton X-100的水有不同浓度的siRNA。用A和B的样品经定量RT-PCR方法分析并建立siRNA标准曲线。
图3为用定量RT-PCR测定肝组织或血浆中siRNA的量(用实施例1-5的方法)。CD-1小鼠经尾静脉注射抗乙肝siRNA配方制剂(1mg/kg)，一组小鼠在给药4小时后取血并分离血浆，另一组动物在给药24小时后取肝脏，其血浆用0.25%Triton X-100的水稀释后用定量RT-PCR方法测定血浆中抗乙肝siRNA的量；肝脏组织在组织裂解液中匀浆并用0.25%Triton X-100的水稀释后用定量RT-PCR方法测定血浆中抗乙肝siRNA。
具体实施方式
定义
本发明中所用技术术语的定义应理解为包括这些术语和在本领域中的技术人员已知的那些技术名词。并不限于本发明的范围。并不需要重复每一次的申明。
本文中使用的术语“一”，“一个”和类似的术语在描述本发明，并在权利要求中，将被解释为包括单数和复数。术语“包括”；“具有”；和“含有”将被解释为开放式术语。它们的意思是，例如“包括，但不限于”。
应用的或设定值的范围是指在此范围内的每个单独的值，应等同于任何单独值的描述。这里所采用的具体值，将被理解为示例性，而不是限于本发明的范围。
如本文所用的术语小核酸是指单链或双链小于500碱基或碱基对的脱氧核糖核酸或核糖核酸包括但不限于siRNA,antisense,miRNA,aptamer.
如本文所用的术语小干扰核酸（siRNA）是指具有彼此互补链的核酸双链。当进入RISC复合物后，诱导RNA酶降RNA的RNAi（RNA interference）机制。此外，siRNA通过启动子的RNAa机制，调节目标基因的增高表达。一般来说，siRNA的每一条核苷酸链主要是核糖核酸（核糖核苷酸），但也可以是RNA的类似物，RNA和RNA的类似物，经修饰的核苷酸，RNA和DNA，RNA的类似物和DNA，非核苷酸，或一个链完全是DNA，另一个链是RNA,只要是能通过RNAi机制诱导同源RNA降解,均可作为iNA的构造。
在遗传学上，微分子RNA（microiRNA,miRNA）是单链RNA，长度约21-23个核苷酸，调节基因的表达。miRNA是从DNA转录的，但没有翻译成蛋白质（非编码RNA），它们是由被称为初级转录的PRi-miRNA的短茎环结构而生成pre-miRNA，最后从pre-miRNA生成miRNA。成熟miRNA分子部分互补于一个或多个的信使RNA分子，它们的主要功能是降低基因的表达。
siRNA分子修饰的核苷酸可以在任何链。例如，经修饰的核苷酸，可以有一个Northern的构象（例如，Northern pseudorotation周期，见Sanger，核酸结构的原理，Springer-Verlag ed.,1984）。核苷酸具有Northern配置的实例包括锁核酸（Lock nucleicacid,LNA）的核苷酸（如2'-O，4'-C-亚甲基-（D-呋喃核糖基）核苷酸），(2'-O,4'-C-methylene-(D-ribofuranosyl)nucleotides)，2'-甲氧基乙氧基（MOE）核苷酸（2'-methoxyethoxy(MOE)nucleotides,），2'-甲基-硫代-乙基，2'-脱氧-2'-氟核苷酸（2'-methyl-thio-ethyl,2'-deoxy-2'-fluoro nucleotides），2'-脱氧-2'-氯核苷酸（2'-deoxy-2'-chloro nucleotides），2'-叠氮基的核苷酸（2'-azido nucleotides），2'-O-甲基核苷酸（2'-O-methyl nucleotides）。同时保持诱导RNAi的能力和可以抵抗核酸酶降解的化学修饰的核苷酸。
在一些实施例中，siRNA分子包括正义和反义序列或区段，其特征在于正义和反义区的核苷酸或非核苷酸以共价键连接，或通过非共价、离子性相互作用、氢键、范德华相互作用，疏水相互作用和/或堆积（stacking）相互作用。
siRNAs可以由两个单独的寡核苷酸组装成一个双链，其中一条链是正义链和另一个是反义链，其中，所述的反义和正义链自身互补（即每一条链所含的碱基的核苷酸序列与另一条链的序列相补，如其中的反义链和有义链形成了一个双相或双链结构）。反义链的碱基序列可与一个靶核酸分子或其部分的核苷酸序列互补，有义链的核苷酸序列可于靶核酸序列或其一部分相同。siRNA可以从单一的寡聚核苷酸而来，其中双向siRNA的自身互补的正义和反义区域可由核酸的碱基或非核酸的基团连接。
“反义核酸”，是指非酶的核酸分子，结合到靶RNA的RNA、DNA或PNA（蛋白质核酸，见Egholm et al.,1993Nature365,566）的分子，并改变了靶RNA的活性（见论述：Stein and Cheng,1993Science261,1004and Woolf et al.,U.S.Pat.No.5,849,902)。通常情况下，反义序列是一单一的连续与靶序列完全互补的序列。然而，在某些实施例中，反义分子可以结合到底物，使得靶核酸分子形成了一个环和/或结合的反义分子本身形成一个环。因此，反义分子可以与两个（或甚至更多）非连续的底物（RNA）的区段序列互补、反义分子非连续区段序列的部分，可以互补于靶序列的两个区段。此外，反义DNA可以用于靶基因RNA，通过DNA-RNA的相互作用，激活RNA酶H，降解靶RNA。反义寡核苷酸可以包括一个或多个RNA酶H的激活区，能够激活RNA酶H，裂解靶RNA。反义DNA可以化学合成，或者，也可以通过使用的单链DNA的表达载体或等表达。“反义RNA”具有互补靶基因RNA序列，通过结合到靶基因RNA可以诱导RNA干扰。反义RNA具有结合靶基因RNA的互补序列，通过结合到靶基因的RNA诱导RNA干扰。正义核糖核酸“具有互补反义RNA的序列，与其互补的反义RNA退火形成siRNA。这些反义和正义RNA可以化学合成。
“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，它们的聚合物可是单链或双链形式。该术语包括含由已知的核苷酸类似物或修饰骨架残基或联接子的核酸，可以化学合成，天然存在，非天然存在，具有相似的作为基准的核酸结合特性，以及类似方式被代谢。这种类似物的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，甲基膦酸，手性甲基膦酸盐，2'-O-甲基核糖核苷酸，肽核酸（肽核酸，PNAs）。
所谓“RNA”是指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”是指核苷酸的βD-核糖呋喃糖部分的2'位是一个羟基基团。这一术语包括双链RNA，单链RNA，分离的RNA（例如部分纯化的RNA），基本上纯的RNA，合成RNA，重组产生的RNA，以及从天然存在的RNA通过添加，缺失，取代不同和/或改变一个或多个核苷酸改变的RNA。这样的改变可包括添加非核苷酸材料到siRNA的末端或内部。例如，一个或多个核苷酸。发明中的RNA分子中的核苷酸还可以包括非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可称为天然存在的RNA的类似物。如本文所用，术语“核糖核酸”和“RNA”指含有至少一个核糖核苷酸残基的分子。核糖核苷酸是含有β-D-核呋喃糖基部分的2'位的羟基核苷酸。这些术语包括双链RNA，单链RNA，分离的RNA（例如部分纯化的RNA），基本上纯的RNA，合成RNA，重组产生的RNA，以及不同于天然存在的RNA通过添加，缺失RNA修饰和改变，替代，修改和/或改变一个或多个核苷酸。RNA的改变可包括添加非核苷酸到siRNA的末端或内部。例如RNA分子中的核苷酸包括一个或多个非标准核苷酸，例如，非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可称为类似物。
本文所用的“核苷酸”在本领域中所承认的，包括天然的碱（标准）基，并在本领域中公知的经修饰的碱基。这类碱基一般位于核苷酸糖1'的位置。核苷酸一般包括碱，糖和磷酸基团。核苷酸可以在糖，磷酸盐和/或碱基部分修饰（也可简称为可互换的核苷酸类似物，经修饰的核苷酸，非天然核苷酸，其他未修饰或修饰的非标准核苷酸。参见,Usmanand McSwiggen,supra;Eckstein,et al.,International PCT Publication No.WO92/07065;Usman,et al,International PCT Publication No.WO93/15187;Uhlman&Peyman,supra，所有在此引入本文作为参考）。核酸研究作为总结可参考Limbach,et al,Nucleic Acids Res.22:2183,1994。一些非限制性实施例可以被引入到核酸分子的修饰基团包括，次黄嘌呤核苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、pseudouracil、2,4,6-三甲氧基苯、3－甲基尿嘧啶、dihydrouridine、萘基、氨基苯基、5-alkylcytidines（例如，5-甲基胞苷）、5-alkyluridines（例如，ribothymidine）、5-halouridine（例如，5-溴尿苷）或6-azapyrimidines或6-alkylpyrimidines（例如6-甲基尿苷）、丙炔和其它基团（Burgin,et al.,Biochemistry35:14090,1996;Uhlman&Peyman,supra)。在这方面的所谓“经修饰的碱基”是指在1'的位置腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶核苷酸碱基以外的或等同物。
碱基互补的核苷酸碱基是指彼形成氢键的碱基互补。腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）或RNA中的尿嘧啶（U），鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）。核酸的互补链段或链（加入通过氢键）彼此互补。“互补”是指核酸可以与另一核酸序列形成氢键，可以通过传统的Watson-Crick的或由其他非传统键结合。
siRNA可以通过化学合成或生物生产。化学合成的方法，可以在Nucleic AcidsResearch,624-627,1999and Nucleic Acids Research,3547-3553,1955分别找到。分子克隆技术可以用于生物生产。
如本文所用的术语小干扰RNA（siRNA）有时也被称为短干扰RNA或沉默RNA，是用来指双链RNA分子具有16-60个核苷酸的长度，可以发挥多种生物学作用。最值得注意的是，siRNA通过RNA干扰途径，能干扰一个特定的基因表达。
如本文所用，术语RNAa指的双链RNA激活基因表达的现象。这种现象被称为“小RNA介导的基因激活”或RNAa。双链RNA靶向性基因的启动子，诱导强有力的基因转录。最近，RNAa已经在几个其他哺乳动物，包括非人灵长类，小鼠，大鼠被证明。
本文所用术语“RNA干扰是指的依赖RNA的基因沉默的过程，是在细胞中由双链RNA诱导的沉默复合物，在那里它们与催化RISC的催化单位ARGONAUTE结合。当双链RNA或RNA-类似siRNA或siRNA是外生的（来自感染了病毒的RNA基因组或从转染的siRNA或siRNA），RNA或siRNA被直接导入到细胞质，由Dicer酶切割成短的片段。产生的dsRNA可以是内源性的（源于细胞）如前的microRNA从RNA编码基因的基因组中表达。基因的初级转录物首先被处理，以在细胞核中形成的特征的茎-环结构的pre-miRNA，然后将其导出到细胞质中，由Dicer切割。因此，有两个dsRNA的途径，外源性和内源性。RNA-诱导的沉默复合物（RISC）的活性成分，核酸内切酶被称为Argonaute蛋白。
实施例1:PCSK9siRNA及脂质体包裹
siRNA序列：
反义链：5’UCCGAAUAAACUCCAGGCCUA3’
正义链：5’UAGGCCUGGAGUUUAUUCGGA3’
按照供应商（上海百代（上海）生物科技有限公司）提供的体内siRNA脂质体传输系统的方法，将siRNA包裹，包裹后的双链siRNA悬浮液经过测定,包裹率大于85％以上。
实施例2:含小核酸血浆及组织的处理
体内实验动物的研究使用的所有程序是机构动物管理和使用委员会（IACUC）批准的，并按照当政府法规进行。CD1小鼠，通过尾静脉注射0.2毫升注射，1mg/公斤siRNA的配方。24小时后，取血，分离血浆，用含0.25%Triton X-100的水稀释血浆：2微升血浆加至18微升含0.25%Triton X-100的水稀释后直接用于定量RT-PCR或定量PCR测定血浆中小核酸的量（图1，2）。组织的处理:从注射小核酸的动物体内取100-500mg组织样品。组织样品如心、肝、脾、肺、肾等，用组织裂解液(Qiagen:RLN或Lifetech:AM8540G)按每毫升裂解液100毫克组织，用高速组织匀浆机将组织匀浆，然后取出2微升组织匀浆液加入198微升含0.25%Triton-x100水，均匀稀释后即可定量RT-PCR或定量PCR来测定其中的小核酸的量（图3）。
实施例3：加Ploy A到小核酸的3’端
如要分析实施例2的样品中的小核酸是核糖核酸（如siRNA、miRNA)，则用Poly A聚合酶在小核酸的3’末端加上一段Poly A。方法如下:
1.25ul稀释后的血浆或组织匀浆，然后按下列顺序分别加入：
0.5ul5X反应液
0.25ul25mM MgCl2
0.1ul ATP
0.05ul Poly A聚合酶
0.35ul水
37℃温育15分钟。
其产物应为：5’TCCGAATAAACTCCAGGCCTAAAAAAAAAAAAAA……3’
实施例4：逆转录反应的原理及反应条件
将方案实施例3中已在3’末端加了Poly A的小核酸，加入如下与带一引物的寡聚dT
TTTTTTTTTTTTGAACCTAGCTGGCCAA，与带有Poly A的小核酸互补结合，如下：
5’UCCGAAUAAACUCCAGGCCUA AAAAAAAAAAAAA……3’
TTTTTTTTTTTTTTTTTGAACCTAGCTGGCCAA
在实施例3中已完成的反应中加入下列试剂：
0.625ul反应液
1.875ul含寡聚dT的引物
65度孵育5分钟。然后分别加入
6.25ul2X反应液
1.25ul反转录酶
50℃孵育5分钟，85度孵育5分钟,合成cDNA
实施例5：PCR放大定量小核酸
将方案实施例4中已合成的cDNA稀释加入5’和3’引物：5’TCCGAATAAACTCCAGGCCTA3’和5’AACCGGTCGATCCAA3,并按下列的每管的量，用API7500荧光定量PCR仪，定量PCR扩增来测定组织样品中小核酸的量。
6ul稀释的cDNA（方案实施例4）
10ul2X反应液
0.4ul50X SYBR green
1.5ul PCR引物（6uM）
2.1ul水
95℃15分钟，40个循环:95度15秒，55度30秒，72度30秒。小核酸的定量方法用标准曲线法定量血液及组织中量。
Claims (1)
1.一种直接测定生物样品中未经分离的小核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取生物样品：CD1小鼠通过尾静脉注射0.2ml的1mg/公斤的 siRNA，24小时后取血、分离血浆，2ul血浆加至18ul含0.25% Triton X-100的水稀释；
或从注射小核酸的动物体内取100-500mg组织样品；按每100mg组织加入1ml组织裂解液，高速匀浆后取2ul组织匀浆液加入198ul含0.25% Triton X-100的水稀释；
（2）加PolyA到小核酸的3’端,方法如下：
1.25ul稀释后的血浆或组织匀浆，然后按下列顺序分别加入：
0.5ul 5X反应液
0.25ul 25mM MgCl2
0.1ul ATP
0.05ul PolyA聚合酶
0.35ul 水
37℃温育15分钟；
（3）逆转录反应：在逆转录反应中加入如下带第一引物的寡聚dT
TTTTTTTTTTTTGAACCTAGCTGGCCAA与带有PolyA的小核酸互补结合；
反应体系为：
0.625ul步骤（2）的反应液
1.875ul含寡聚dT的引物
65℃孵育5分钟，然后分别加入
6.25ul 2X逆转录反应液
1.25ul反转录酶
50℃孵育5分钟，85℃孵育5分钟；
（4）PCR放大定量小核酸：将步骤（3）合成的cDNA稀释，加入和待测小核酸序列完全互补的引物，以及引物5’AACCGGTCGATCCAA 3’,用 API7500荧光定量 PCR 仪，定量 PCR 扩增来测定组织样品中小核酸的量；
反应体系为：
6ul稀释的cDNA
10ul 2X反应液
0.4ul 50XSYBRgreen
1.5ul PCR引物
2.1ul水
95℃ 15分钟，40个循环:95℃ 15秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒；小核酸用标准曲线法定量。
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