-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Diese Erfindung betrifft allgemein
Verfahren und Gerätschaft
für die
Desorption und Ionisation von Analyten zum Zweck der späteren wissenschaftlichen
Analyse durch die Verfahren, wie beispielsweise Massenspektrometrie
(MS) oder Biosensoren. Im Allgemeinen umfasst die Analyse durch
Massenspektrometrie die Verdampfung und Ionisation einer kleinen
Materialprobe mithilfe einer Hochenergiequelle wie z. B. einem Laser,
einschließlich
einem Laserstrahl. Das Material wird von der Oberfläche einer Sondenspitze
mit dem Laserstrahl in die Gas- oder die Dampfphase verdampft und
im Verlauf werden manche der einzelnen Moleküle durch Gewinnung eines Protons
ionisiert. Die positiv geladenen, ionisierten Moleküle werden
dann durch ein kurzes Hochenergiefeld beschleunigt und fliegen (driften)
in eine Hochvakuumkammer, an deren entferntem Ende sie auf eine
empfindliche Detektorfläche
auftreffen. Da die Flugzeit eine Funktion der Masse des ionisierten Moleküls ist,
kann die verstrichene Zeit zwischen Ionisation und Auftreffen verwendet
werden, um die Masse des Moleküls
zu bestimmen, die dann wiederum verwendet werden kann, um das Vorhandensein oder
Nichtvorhandensein von bekannten Molekülen einer spezifischen Masse
zu identifizieren.
-
Alle bekannten Verfahren aus dem
Stand der Technik, die Proteine oder andere große Biomoleküle auf einer Sondenspitze für die Laserdesorption/-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie
(Time-of-Flight Mass Spectrometn, TOF) präsentieren, beruhen auf der
Herstellung einer kristallinen, festen Mischung des Proteins oder
einem anderen Analytmolekül
in einem großen
molaren Überschuss
eines sauren Matrixmaterials, das auf der bloßen Oberfläche einer metallischen Sondenspitze
angebracht ist. (Die Probensondenspitze ist typischerweise metallisch
und besteht entweder aus rostfreiem Edelstahl, aus vernickeltem
Material oder aus Platin). Es wurde angenommen, dass das Einbetten
des Analyten in eine solche Matrix erforderlich ist, um die Zerstörung des
Analytmoleküls
durch den Laserstrahl zu verhindern. Der Laserstrahl trifft auf
die fest Mischung auf der Sondenspitze auf und seine Energie wird
verwendet, um einen kleinen Anteil des Matrixmaterials zusammen
mit etwas von dem eingebetteten Analytmolekül zu verdampfen. Ohne die Matrix
werden die Analytmoleküle
leicht von der Laserenergie fragmentiert, so dass die Masse und
Identität
des ursprünglichen
Makromoleküls
sehr schwierig oder gar nicht mehr zu bestimmen ist.
-
Dieses Verfahren aus dem Stand der
Technik hat mehrere Einschränkungen,
die seine Adaption an die automatisierte Proteinanalyse oder Analyse
anderer makrobiologischer Moleküle
verhindert hat. Erstens muss eine sehr ungereinigte Probe partiell fraktioniert
werden (oder die Probe so weit wie möglich anderweitig gereinigt
werden), um das Vorhandensein von zu viel externem Material in der
kristallinen oder festen Matrix-Analyt-Mischung zu eliminieren.
Das Vorhandensein großer
Mengen an Bestandteilen kann das Ionensignal (entweder Desorption, Ionisation
und/oder Nachweis) des gewünschten Analyten
unterdrücken.
Eine solche Aufreinigung ist zeitraubend, teuer, resultiert typischerwise
in geringen Erträgen
(oder vollständigem
Verlust) des Analyten und wäre
in einem automatischen Analysegerät sehr schwierig durchzuführen.
-
Während
die Menge an Analytmaterial, das für die Analyse mit dem Verfahren
aus dem Stand der Technik benötigt
wird, nicht groß ist
(typischerweise im Picomol-Bereich liegt), sind zweitens unter manchen
Umständen,
beispielsweise bei Tests mit pädiatrischen
Patienten, Analytflüssigkeiten
nur in extrem kleinen Volumina (Mikroliter) verfügbar und werden gegebenenfalls
für die
Durchführung
mehrerer unterschiedlicher Analysen benötigt. Daher kann selbst die
kleine Menge (d. h. Volumen), die für die Herstellung der kristallinen
Analyt/Matrix-Mischung für
eine einzige Analyse benötigt
wird, signifikant sein. Außerdem
wird nur ein winziger Anteil (einige Tausendstel oder weniger) an
Analyt, der für
die Herstellung der festen Analyt/Matrix-Mischung für die Verwendung
auf der Sondenspitze verwendet wird, bei der Desorption oder Massenspektrometrieanalyse
tatsächlich
verbraucht. Alle Verbesserungen des Verfahrens aus dem Stand der
Technik, die es ermöglichen,
1) viel weniger Analyt zu verwenden, 2) den Analyten oder mehrere
Analyten auf der Sondenspitze oder -fläche an einer vorbestimmten
Stelle zu lokalisieren, 3) wiederholte Analysen desselben Analytaliquots
durchzuführen
(z. B. vor und nach einer chemischen Reaktion oder mehreren chemischen
Reaktionen und/oder einer enzymatischen Reaktion oder mehreren enzymatischen
Reaktionen) und 4) den Test in einer quantitativeren Weise durchzuführen, wären in vielen
medizinischen Bereichen höchst
vorteilhaft.
-
Drittens ist das Analytprotein bzw.
das andere Makromolekül,
das zum Herstellen der festen Lösung
von Analyt/Matrix für
die Verwendung auf der Sondenspitze verwendet wird, nicht für etwaige
spätere
chemische Tests oder Verfahren geeignet, da es in das Matrixmaterial
eingebunden (d. h. eingebettet) ist. Außerdem ist das gesamte, bis
dato verwendete Matrixmaterial stark sauer, so dass es viele chemische
Reaktionen, welche mit der Mischung versucht würden, um die Analytmoleküle für eine spätere Untersuchung
zu modifizieren, gegenteilig beeinflussen würde. Alle Verbesserungen des
Verfahrens, welche es ermöglichen
würden,
spätere
chemische Modifikationen oder Reaktionen mit den Analytmolekülen durchzuführen, ohne
sie aus der Matrix oder von der Sondenspitze zu entfernen, oder
sie vollkommen ohne "Matrix" zu verwenden, wären für Wissenschaftler
und Kliniker von enormem Vorteil.
-
Die ersten, erfolgreichen Messungen
der molekularen Masse intakter Peptide und kleiner Proteine (nur
bis zu etwa 15 kDa) durch eine Form von Massenspektrometrie erfolgten
durch Bombardierung von Flächen
mit Hochenergiepartikeln (Plasmadesorption und Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie);
dieser Durchbruch erfolgte 1981 und 1982. Verbesserungen kamen 1985
und 1986, dennoch blieben Ertrag (Signalintensitäten), Sensitivität, Präzision und
Massegenauigkeit relativ gering. Proteine mit höherer molekularer Masse (etwa
20 bis 25 kDa) wurden abgesehen von seltenen Gelegenheiten nicht
beobachtet; nicht ein einziges Mal wurden Proteine beobachtet, die
durchschnittliche Molekulargewichte (etwa 70 kDa) darstellten. Die
Evaluierung der meisten Proteine durch Massenspektrometrie blieb
daher undurchführbar.
-
1988 verwendeten Hillenkamp und seine Mitarbeiter
UV-Laser-Desorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
und entdeckten, dass Proteine mit relativ hoher molekularer Masse
im intakten Zustand desorbiert werden konnten, wenn sie unter Vorhandensein
eines sehr hohen molaren Überschusses
einer sauren, UV-absorbierenden chemischen Matrix (Nikotinsäure) auf
der Sondenspitze abgeschieden wurden. Diese neue Technik wird Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-lonisations(MALDI-)-Flugzeit-Massenspektrometrie
genannt. Dabei gab es die Laser-Desorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie (ohne
die chemische Matrix) bereits seit einiger Zeit, obgleich sie für die Bestimmung
der Molekulargewichte großer
intakter Biopolymere wie z. B. Proteine und Nukleinsäuren wenig
oder gar nicht erfolgreich war, da diese Moleküle bei der Desorption fragmentiert
(zerstört)
wurden. Vor der Einführung
einer chemischen Matrix war die Laser-Desorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
daher für
den Nachweis spezifischer Veränderungen
der Masse intakter Makromoleküle
im Wesentlichen nutzlos. Es wird darauf hingewiesen, dass die zufällige Bildung
von Matrixkristallen und der zufällige
Einschluss von Analytmolekülen
in der festen Lösung
Stand der Technik sind.
-
Mit den Verfahren aus dem Stand der
Technik ist eine Anzahl von Problemen und Einschränkungen
verbunden. So wurde beispielsweise herausgefunden, dass es schwierig
ist, Verunreinigungen, die in Analyt oder Matrix vorhanden sind,
fortzuwaschen. Andere Probleme umfassen die Bildung von Analyt-Salzionen-Addukten,
suboptimale Löslichkeit
von Analyt in Matrix, unbekannte Lokalisation und Konzentration
von Analytmolekülen
in der festen Matrix, "Vergiftung" durch Signal-(molekulare
Ionen-)Unterdrückung
durch gleichzeitiges Vorhandensein von mehreren Bestandteilen und
selektive Analytdesorption/-ionisation. Frühere Investigatoren, einschließlich Karas
und Hillenkamp haben von einer Vielzahl von Techniken für den Analytnachweis
mithilfe von Massenspektrometrie berichtet, aber diese Techniken
leiden an inhärenten
Einschränkungen
der Sensitivität
und Selektivität
bei dem Nachweis von Analyten in undifferenzierten Proben mit geringem
Volumen (Hillenkamp, Bordeaux Mass Spectrometn Conference Report,
S. 354–62
(1988); Karas und Hillenkamp, Bordeaux Mass Spectrometn Conference
Report, S. 416–17
(1988); Karas und Hillenkamp, Analytical Chemistn, 60: 2299 (1988);
Karas et al., Biomed. Environ. Mass. Spectrum (in Druck).) Die Verwendung
von Laserstrahlen in Flugzeit-Massenspektrometern ist beispielsweise
in US-Patent Nr. 4,694,167; 4,686,366; 4,295,046 und 5,045,694 gezeigt.
-
Die erfolgreiche Volatilisierung
von Biopolymeren mit hohem Molekulargewicht ohne Fragmentierung
ermöglichte
die massenspektrometrische Analyse einer großen Vielzahl von biologischen
Makromolekülen.
Was vielleicht noch wichtiger ist, es wurde dadurch veranschaulicht,
dass es möglich
ist, Massenspektrometrie kreativer anzuwenden, um die routinemäßig auftretenden
Probleme in der biologischen Forschung zu lösen. Die jüngste Aufmerksamkeit richtete
sich auf die Anwendung der Matrix-unterstützten Laser-Desorptions-Ionisations(MALDI-)-Flugzeit
(Time of Flight, TOF)-Massenspektrometrie (MS), überwiegend, weil sie schnell
(Minuten) und empfindlich (es sind < pmol an Probe erforderlich) ist und
es ermöglicht,
komplexe Mischungen zu analysieren.
-
Obgleich die MALDI-TOF-MS auch weiterhin für die statische
Bestimmung/Verifizierung der Masse einzelner Analyten dienlich ist,
sind es vor allem im Falle von Biopolymeren häufig Unterschiede in der Masse,
die die wichtigsten Informationen über unbekannte Strukturen geben.
Die routinemäßige Nutzung
der MALDI-TOF-MS-Technik in der Strukturbiologie ist daher leider
durch Grenzen in Bezug auf die Probenvorbereitung und -präsentation
(Deposition) auf einer inerten Sondenelementfläche eingeschränkt, insbesondere
durch die Maßgabe,
dass Analyte auf der Sondenoberfläche in einer frisch hergestellten
Matrix kristalliner organischer Säure eingebettet (d. h. co-solidifiziert)
werden. Die zufällige
Analytverteilung in einem heterogenen Display einer Kristallmatrix
auf der Sondenelementoberfläche
erfordert die Ablagerung von weit mehr Analyt oder Probe, als für den Laser-Desorptionsvorgang,
ja selbst für
die Erhebung mehr als adäquater
Massenspektren (z. B. mehrere Serien von jeweils 100 Schüssen) erforderlich
ist. Der verbleibende Analytanteil wird in der Regel nicht für weitere
Analysen oder nachfolgende Charakterisierungen wiedergewonnen. Obgleich
typischerweise nur 1 bis 10 pmol (manchmal weniger) Analyt für die Ablagerung
auf der Sondenoberfläche
benötigt
werden, wurde geschätzt,
dass bei der Laserdesorption weniger als einige wenige Attomole
verbraucht werden. Nur 1 Teil in 105 oder
106 des aufgetragenen Analyten ist daher erforderlich;
der Rest geht verloren.
-
Ein weiterer wichtiger Verlust potenzieller Daten
in Verbindung mit der Einbettung von Analyt in eine feste Matrix
ist die Verringerung oder vollständige
Eliminierung der Möglichkeit
für die
darauf folgende Durchführung
chemischer und/oder enzymatischer Modifikationen des eingebetteten
Analyten (z. B. Protein oder DNA), der auf der Sondenoberfläche verbleibt.
Nur ein anderes Aliquot des Analyten oder die Möglichkeit, den eingebetteten
Analyten matrixfrei wiederzugewinnen (schwierig, geringe Ausbeute) erlaubt,
dass das, was wir heute als differenzielle Massenspektrometrie bezeichnen,
durchgeführt wird,
um strukturelle Daten zu gewinnen.
-
Außerdem war die Anwendung von
MS in biologischen Gebieten eingeschränkt, wahrscheinlich durch die
Tatsache, dass viele Biologen und Kliniker von der MS abgeschreckt
werden und/oder in Bezug auf ihre Nützlichkeit skeptisch sind.
Die MS gilt außerdem
als unzugänglich
oder zu teuer, besonders da die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese in manchen
Fällen,
in denen MALDI angewandt werden würde, ein adäquater Ersatz ist (z. B. bei
der Trennung von unverarbeiteten biologischen Flüssigkeiten). Zudem wurde MALDI
in biologischen und klinischen Fachzeitschriften bisher selten erwähnt.
-
ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Es ist eine Aufgabe der Erfindung,
verbesserte Verfahren, Materialzusammensetzungen und Gerätschaft
für die
gekoppelte Adsorption, Desorption und Ionisation mehrerer oder ausgewählter Analyte
in die Gas-(Dampf-)Phase
bereit zu stellen.
-
Eine andere Aufgabe ist es, ein Verfahren und
Gerät für den affinitätsgerichteten
Nachweis von Analyten bereit zu stellen, einschließlich Desorption und
Ionisation von Analyten, in dem der Analyt nicht in einer Matrixlösung oder
in einer kristallinen Struktur verteilt ist, sondern in einer Position,
in der er für eine
breite Vielzahl von chemischen, physikalischen und biologischen
Modifikations- oder Erkennungsreaktionen zugänglich und verfügbar ist,
durch molekulare Erkennungsereignisse in, auf oder über einer
angebrachten Oberfläche
einer energieabsorbierenden Matrix präsentiert ist.
-
Eine andere Aufgabe ist es, ein solches
Verfahren und Gerät
bereit zu stellen, in dem das Analytmaterial chemisch gebunden oder
physikalisch an ein Substrat angeheftet ist, das eine sondenspitzenprobenpräsentierende
Oberfläche
bildet.
-
Eine weitere Aufgabe ist es, Mittel
für die
Modifikation von probenpräsentierenden
Oberflächen mit
energieabsorbierenden Molekülen
bereit zu stellen, um die erfolgreiche Desorption von Analytmolekülen ohne
die Zugabe von exogenen Matrixmolekülen, wie im Stand der Technik,
zu ermöglichen.
-
Eine weitere Aufgabe ist es, die
geeignete Dichte von energieabsorbierenden Molekülen bereit zu stellen, die
(kovalent oder nicht kovalent) in einer Vielzahl von Geometrien
so gebunden sind, dass Einzelschichten und mehrere Schichten von
angehefteten energieabsorbierenden Molekülen verwendet werden, um die
Desorption von Analytmolekülen mit
unterschiedlichen Massen zu ermöglichen.
-
Eine weitere Aufgabe ist es, mehrere
Kombinationen von Oberflächen
mit energieabsorbierenden Molekülen,
affinitätsgerichteten
Analyt-Capture-Vorrichtungen,
Fotoröhren,
etc. bereit zu stellen.
-
Eine zusätzliche Aufgabe ist es, ein
Verfahren und Gerätschaft
bereit zu stellen, in dem das Substrat, das die Sondenspitze formt,
oder eine andere probenpräsentierende
Oberfläche
mit einem Affinitätsreagens
oder mehreren Affinitätsreagenzien (unterschiedliche
Dichten und Amplifikationsgrade) für die selektive Bindung mit
vorbestimmten Analyten oder Klassen von Analyten derivatisiert wird.
-
Es ist eine weitere Aufgabe, ein
solches System bereit zu stellen, in dem das Affinitätsreagens chemisch
an den Zielanalyten oder die Klasse von Analyten gebunden oder biologisch
angeheftet ist.
-
Eine weitere Aufgabe ist es, ein
Verfahren und Gerätschaft
für die
Desorption und Ionisation von Analyten bereit zu stellen, in dem
ungenutzte Anteile von den Analyten, die auf der präsentierenden
Oberfläche
enthalten sind, chemisch zugänglich
bleiben, so dass eine Reihe von chemischen, enzymatischen oder physikalischen
Behandlungen des Analyten durchgeführt werden kann, gefolgt von
sequenziellen Analysen des modifizierten Analyten.
-
Eine weitere Aufgabe ist es, ein
Verfahren und Gerätschaft
für die
kombinierten chemischen oder enzymatischen Modifikationen von Zielanalyten für den Zweck
des Aufklärens
der Primär-,
Sekundär-,
Tertiär-
oder Quartärstruktur
des Analyten und seiner Bestandteile bereit zu stellen.
-
Eine weitere Aufgabe ist es, ein
Verfahren und Gerätschaft
für die
Desorption und Ionisation von Analytmaterialien bereit zu stellen,
in denen Kationen, bei denen es sich nicht um Protonen (H+) handelt, für die Ionisation von Analytmakromolekülen verwendet
werden.
-
Entsprechend stellt die vorliegende
Erfindung eine Sonde bereit, die entnehmbar in ein Massenspektrometer
eingebracht werden kann, wobei die Sonde eine probenpräsentierende
Oberfläche
für das
Präsentieren
eines Analyten gegenüber
einer Energiequelle, die eine für
das Desorbieren/Ionisieren des Analyten von der Sonde für den Analytnachweis
geeignete Energie abgibt, aufweist, wobei die Oberfläche mit
einem Affinitätsreagens
derivatisiert ist, welches den Analyten binden kann und aus Metallionen,
Nukleinsäuren,
Peptiden, Kohlenhydraten, Proteinen und Kombinationen davon ausgewählt ist und
wobei ein desorptions-/ionisationsunterstützendes
Matrixmaterial auf der Oberfläche
in Assoziation mit dem Affinitätsreagens
vorgesehen ist.
-
Die probenpräsentierende Oberfläche kann ausgewählt sein
aus Metall, das mit einem synthetischen Polymer, Glas, Keramik,
synthetischen Polymeren und Biopolymeren beschichtet ist. Die probenpräsentierende
Oberfläche
kann daher Metall mit einer Beschichtung von quervernetztem Dextran
oder Agarose, Nylon, Polyethylen oder Polystyrol sein.
-
Das Affinitätsreagens kann ein Antikörper, ein
Lektin, ein Cu(II)-Ion oder ein Fe(III)-Ion sein. Der Analyt kann
Biomoleküle
umfassen und das Affinitätsreagens
kann angepasst sein, um die Biomoleküle selektiv aus einer undifferenzierten
biologischen Probe zu isolieren.
-
Auf der probenpräsentierenden Oberfläche können Affinitätsreagenzien,
die in einer vorbestimmten Anordnung angeordnet sind, für die selektive
Adsorption von unterschiedlichen Analyten vorgesehen sein. Auf der
probenpräsentierenden
Oberfläche kann
in Verbindung mit dem Affinitätsreagens
ein desorptions-/ionisationsunterstützendes Matrixmaterial vorgesehen
sein. Das Matrixmaterial kann einen pH-Wert über 6,0 haben. Das Matrixmaterial
kann Nikotin- oder Sinapinsäure
sein. Eine erfindungsgemäße Sonde
kann vorgesehen sein, bei der der Analyt an das Affinitätsreagens
gebunden ist.
-
Die Erfindung sieht ferner ein Massenspektrometer
zum Nachweis eines Analyten vor, umfassend:
- (a)
eine erfindungsgemäße Sonde,
bei der der Analyt an das Affinitätsreagens gebunden ist;
- (b) eine Energiequelle für
das Lenken von Energie auf die probenpräsentierende Oberfläche der Sonde
für das
Desorbieren/Ionisieren des Analyts und
- (c) Mittel für
das Nachweisen des desorbierten Analyts.
-
Ein solches Massenspektrometer kann
des Weiteren umfassen:
- – eine Spektrometerröhre;
- – ein
Vakuummittel für
das Anlegen eines Vakuums im Inneren der Röhre;
- – ein
elektrisches Potenzialmittel in der Röhre für das Anlegen eines beschleunigten
Potenzials an desorbierte Analytmoleküle; und
- – eine
durch das Affinitätsreagens
gebundene Analytprobe auf der probenpräsentierenden Oberfläche der
Sonde, wodurch zumindest ein Teil der in der Massenspektrometrieanalyse
nicht aufgebrauchten Analytmoleküle
für spätere chemische,
biologische oder physikalische Analyseverfahren verfügbar bleibt;
die
Energiequelle Laserstrahlenmittel für das Erzeugen eines auf die
Analytprobe gerichteten Laserstrahls für das Zukommenlassen ausreichender
Energie zum Desorbieren und Ionisieren eines Teils der Analytmoleküle von der
Analytprobe umfasst; und
wobei das Nachweismittel zu dem Spektrometer
gehörige
Mittel für
das Nachweisen der Auswirkung der beschleunigten ionisierten Analytmoleküle hierauf umfasst.
-
Die Erfindung sieht des Weiteren
ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten vor, umfassend:
- (a) Vorsehen eines Massenspektrometers der
Erfindung;
- (b) Desorbierten zumindest eines Teils des Analyten von der
probenpräsentierenden
Oberfläche der
Sonde des Massenspektrometers, indem der Analyt der Energie der
Energiequelle ausgesetzt wird, und
- (c) Nachweisen des desorbierten Analyts mit dem Nachweismittel.
-
Das Verfahren kann nach dem Nachweisschritt
(c) des Weiteren den Schritt des Ausführens eines chemischen oder
biologischen Verfahrens an dem nicht desorbierten Teil des Analyten
umfassen, um die Zusammensetzung des nicht desorbierten Teils des
Analyten zu verändern;
und wobei Schritte (b) und (c) bezüglich des veränderten
Analyten wiederholt werden.
-
Das Nachweisverfahren der Erfindung
kann deshalb umfassen:
- (i) Vorsehen einer Sonde,
die in ein Massenspektrometer entnehmbar eingebracht werden kann, wobei
die Sonde eine probenpräsentierende Oberfläche für das Präsentieren
eines Analyts gegenüber
einer Energiequelle, die eine für
das Desorbierten/Ionisieren des Analyts von der Sonde für den Analytnachweis
geeignete Energie abgibt, aufweist;
- (ii) Derivatisieren der probenpräsentierenden Oberfläche mit
einem Affinitätsreagens,
welches den Analyten binden kann und aus Metallionen Nukleinsäuren, Peptiden,
Kohlenhydraten, Proteinen und Kombinationen derselben ausgewählt ist;
- (iii) Aussetzen der derivatisierten, probenpräsentierenden
Oberfläche
gegenüber
einer Quelle des Analyts, um den Analyten daran zu binden;
- (iv) Abscheiden eines desorptions-/ionisationsunterstützenden
Matrixmaterials an der probenpräsentierenden
Oberfläche
in Assoziation mit dem Affinitätsreagens;
- (v) Geben der derivatisierten, probetragenden Oberfläche mit
den daran gebundenen Analytmolekülen
in ein Ende eines Flugzeit-Massenspektrometers
und Anlegen eines Vakuums und eines elektrischen Felds, um ein beschleunigtes
Potenzial in dem Spektrometer zu bilden;
- (vi) Beschießen
mindestens eines Teils der an der derivatisierten, probenpräsentierenden
Oberfläche
in dem Spektrometer gebundenen Analytmoleküle mit einem oder mehreren
Laserimpulsen, um Ionen der Analytmoleküle von der Sonde zu desorbieren;
- (vii) Nachweisen der Masse der Ionen durch ihre Flugzeit in
dem Massenspektrometer; und
- (viii) Anzeigen der nachgewiesenen Masse.
-
Die vorliegende Erfindung sieht ferner
vor:
- – ein
Verfahren für
das Herstellen einer Sonde der Erfindung, wobei das Verfahren umfasst:
- (i) Vorsehen einer Sonde, die in ein Massenspektrometer entnehmbar
eingebracht werden kann, wobei die Sonde eine probenpräsentierende Oberfläche für das Präsentieren
eines Analyts gegenüber
einer Energiequelle, die eine für
das Desorbieren/Ionisieren des Analyts von der Sonde für den Analytnachweis
geeignete Energie abgibt, aufweist;
- (ii) Derivatisieren der probenpräsentierenden Oberfläche mit
einem Affinitätsreagens,
welches den Analyten binden kann und aus Metallionen Nukleinsäuren, Peptiden,
Kohlenhydraten, Proteinen und Kombinationen derselben ausgewählt ist;
- (iii) Abscheiden eines desorptions-/ionisationsunterstützenden
Matrixmaterials an der probenpräsentierenden
Oberfläche
in Assoziation mit dem Affinitätsreagens;
- – ein
Verfahren zum Einfangen eines Analyten auf einer Sonde für ein Massenspektrometer,
wobei das Verfahren umfasst:
- – Vorsehen
einer Sonde, die in ein Massenspektrometer entnehmbar eingebracht
werden kann, wobei die Sonde eine probenpräsentierende Oberfläche für das Präsentieren
eines Analyts gegenüber
einer Energiequelle, die eine für
das Desorbieren/Ionisieren des Analyts von der Sonde für den Analytnachweis
geeignete Energie abgibt, aufweist, wobei die Oberfläche mit
einem Affinitätsreagens
derivatisiert wird, welches den Analyten binden kann und welches
aus Metallionen, Nukleinsäuren,
Peptiden, Kohlenhydraten, Proteinen und Kombinationen derselben
ausgewählt
ist;
- – Aussetzen
der probenpräsentierenden
Oberfläche
der Sonde gegenüber
der den Analyten enthaltenden Probe; und
- – Abscheiden
eines desorptions-/ionisationsunterstützenden Matrixmaterials an
der probenpräsentierenden
Oberfläche
in Assoziation mit dem Affinitätsreagens;
- – Verwendung
einer Sonde der Erfindung in der Massenspektrometrie; und
- – Verwendung
einer Probe der Erfindung in einem Laserdesorptions/lonisations-Flugzeit-Massenspektrometer.
-
Andere und weitere Aufgaben, Merkmale und
Vorzüge
werden offenkundig und die Erfindung besser verständlich durch
ein Lesen der folgenden Spezifikationen und durch Bezugnahme auf
die beigefügten
Zeichnungen, die einen Teil davon bilden, worin die Beispiele der
derzeit bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung zum Zweck der Offenbarung gegeben sind.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
Die zuvor erwähnten und weitere Aufgaben und
Vorzüge
der Erfindung werden aus den folgenden Spezifikationen und aus den
beigefügten
Zeichnungen offenkundig.
-
1A (oberes
Profil) zeigt das Massenspektrum der drei Peptide (Metallbindungs-Domänen des
menschlichen, histidinreichen Glykoproteins (GHHPH)2G
(1206 Da), GHHPH)5G (2904 Da) und Dimerisierungsdomäne des menschlichen Östrogenrezeptors
(D473-L525) (6168,4 Da), desorbiert in Anwesenheit von neutralisierenden,
energieabsorbierenden Molekülen
(Sinapinsäure,
pH 6,2). 1B (unteres
Profil) zeigt die sequenzielle Metall-(Cu)-Bindung in situ der Peptide in
Anwesenheit von neutralisierenden, energieabsorbierenden Molekülen.
-
2A (oberes
Profil) zeigt das Massenspektrum des menschlichen Caseinphosphopeptids (5P,
2488 Da), desorbiert in Anwesenheit von neutralisierenden, energieabsorbierenden
Molekülen
(Sinapinsäure,
pH 6,5). 2B (zweites
Profil von oben) zeigt den sequenziellen 5-Minuten-Verdau in situ
mit alkalischer Phosphatase zum Entfernen von Phosphatgruppen von
dem Phosphopeptid. 2C (drittes
Profil von oben) zeigt das Massenspektrum des Phosphopeptids nach
weiterem Phosphataseverdau in situ in Anwesenheit von sauren, energieabsorbierenden
Molekülen
(2,5-Dihydroxybenzoesäure,
pH 2), wie im Stand der Technik beschrieben.
-
3 zeigt
ein Verbundmassenspektrum des (GHHPH)5G-Peptids
(2904 Da) vor (unteres Profil) und nach (oberes Profil) dem Verdau
in situ durch Carboxypeptidase P in Anwesenheit von neutralisierenden,
energieabsorbierenden Molekülen
(Sinapinsäure,
pH 6,2).
-
4 zeigt
ein matrixunterstütztes
Laserdesorptions-Verbundmassenspektrum
von Peptidmischungen, desorbiert von festem Glas, polypropylenbeschichtetem,
rostfreiem Edelstahl, polystyrolbeschichtetem, rostfreiem Edelstahl
und festen Nylonsondenelementen.
-
SEAC
-
5,
Profil A, zeigt das Massenspektrum von Spermienaktivierungsfaktor
(933 Da) und Neurotensin (1655 Da) (und ihrer zahlreichen Na-Addukte) in
der Peptidlösung,
nicht an der IDA-Cu(II)-Oberfläche
adsorbiert. 5, Profil
B, zeigt das Massenspektrum von Angiotensin 1 (1296,5 Da) plus Na-Addukt-Spitzen, die selektiv
an der IDA-Cu(II)-Oberfläche
adsorbiert wurden. 5,
Profil C, und 6, Profil
C, zeigen das Massenspektrum desselben Angiotensin 1, adsorbiert
an IDA-Cu(II) nach dem Waschen mit Wasser. 6, Profil D, zeigt die sequenzielle Kupferbindung
(1 und 2 Cu) in situ von aftinitätsadsorbiertem
Angiotensin 1. 6, Profil
E, zeigt den sequenziellen Trypsinverdau in situ des affinitätsadsorbierten
Angiotensin 1.
-
7 zeigt
das Massenspektrum von Myoglobin (4 bis 8 fmol), affinitätsadsorbiert
an die IDA-Cu(II)-Oberfläche.
-
8 (oberes
Profil) zeigt das Massenspektrum von synthetischem Caseinpeptid
(1934 Da) mit mehreren phosphonlierten Formen, affinitätsadsorbiert
aus einer ungereinigten Mischung an eine TED-Fe(III)-Oberfläche. Nach
sequenziellem Verdau in situ mit alkalischer Phosphatase bleibt
nur die ursprüngliche,
nicht phosphorylierte Form erhalten (unteres Profil).
-
9,
Profil A, zeigt das Massenspektrum von Gesamtproteinen in Kindernahrung. 9, Profil B, zeigt das Massenspektrum
von Phosphopeptiden in Kindernahrung, affinitätsadsorbiert an eine TED-Fe(III)-Oberfläche. 9, Profil C, zeigt das Massenspektrum
von Gesamtprotein in Magenaspirat eines frühgeborenen Kindes nach Füttern der
Kindernahrung. 9, Profil
D, zeigt das Massenspektrum von Phosphopeptiden in dem Magenaspirat,
affinitätsadsorbiert
an eine TED-Fe(III)-Oberfläche.
-
10 zeigt
die Verbundmassenspektren von menschlichem und bovinem histidinreichem
Glykoprotein, adsorbiert an eine IDA-Cu(II)-Oberfläche vor
und nach Verdau mit N-Glykanase. Die Massenverschiebung stellt das
Entfernen von Kohlenhydrat von den jeweiligen Glykoproteinen dar. 10B zeigt das Verbundmassenspektrum
von mit Trypsin verdauten Peptiden der deglykosylierten Proteine
der beiden Arten (oberes Profil für menschliches Protein, zweites
Profil von unten für
bovines Protein) und die In-situ-Cu(II)-Bindung der mit Trypsin verdauten Peptide
der beiden Arten (zweites Profil von oben für menschliches Protein, unteres
Profil für
bovines Protein; die Zahlen 1, 2 zeigen die Anzahl des gebundenen
Kupfers an). 10C zeigt,
dass ein solches Cu(II)-bindendes Peptid (unteres Profil) mindestens 4
His-Reste besitzt, die durch Diethylpyrocarbonat spezifisch modifiziert
sind, um 4 N-Carbethoxyhistidyl-Addukte
zu bilden (1–4,
oberes Profil). 10D zeigt
die partielle C-terminale Sequenz des größten Cu-bindenden Peptids in
dem bovinen histidinreichen Glykoprotein.
-
11 (unteres
Profil) zeigt das Massenspektrum von Kaninchen-Anti-Human-Laktoferrin-Immunglobulin
alleine (Kontrolle), affinitätsadsorbiert
an eine paramagnetische Schaf-Anti-Kaninchen-IgG-Oberfläche. Das
obere Profil zeigt das Massenspektrum von menschlichem Laktoferrin
und Kaninchen-Anti-Human-Laktoferrin-Immunglobulinkomplex,
affinitätsadsorbiert
an eine paramagnetische Schaf-Anti-Kaninchen-IgG-Oberfläche.
-
12 zeigt
das Massenspektrum von menschlichem Laktoferrin, affinitätsadsorbiert
aus Harn von Frühgeborenen
an eine Anti-Human-Laktoferrin-Immunglobulin-Nylonoberfläche. 13 zeigt das äquivalente
Massenspektrum von gesamtem Harn von Frühgeborenen mit 1 nmol/ml Laktoferrin.
-
14 (unteres
Profil) zeigt das Massenspektrum von reinem bovinen, histidinreichen
Glykoprotein. Das obere Profil zeigt das Massenspektrum von bovinem,
histidinreichem Glykoprotein und Fragmente, affinitätsadsorbiert
aus bovinem Kolostrum an einer Anti-Bovines-Histidinreiches-Glykoprotein-Immunglobulin-Oberfläche.
-
15 zeigt
dies Verbundmassenspektren von Peptiden von follikelstimulierendem
Hormon, erkannt von den unterschiedlichen Antikörpern gegen das follikelstimulierende
Hormon.
-
16 zeigt
das Massenspektrum von menschlichem Laktoferrin, affinitätsadsorbiert
an einem einzigen Kügelchen
von Einzelstrang-DNA-Agarose,
abgeschieden an einem Sondenelement mit einem Durchmesser von 0,5
mm.
-
17 zeigt
das Massenspektrum von menschlichem Laktoferrin, affinitätsadsorbiert
aus dem Harn von Frühgeborenen
an einer Einzelstrang-DNA-Oberfläche.
-
18A zeigt
das Verbundmassenspektrum der Gesamtproteine in menschlichem Duodenalaspirat
(unteres Profil) und das Trypsin, aftinitätsadsorbiert aus dem Aspirat
an eine Sojabohnentnpsininhibitoroberfläche (oberes Profil). 18B zeigt das Massenspektrum
von Trypsin, aftinitätsadsorbiert aus
1 μl Aspirat
an eine Sojabohnentrypsininhibitornylonoberfläche.
-
19A zeigt
das Massenspektrum von biotinyliertem Insulin, affinitätsadsorbiert
aus menschlichem Harn an einer Streptavidinoberfläche. 19B zeigt das Massenspektrum
von biotinyliertem Insulin, affinitätsadsorbiert aus menschlichem
Plasma an einer Streptavidinoberfläche.
-
20 (oberes
Profil) zeigt das Massenspektrum von menschlichem Albumin in menschlichem
Serum. 20 (unteres Profil)
zeigt das Massenspektrum von Serumalbumin, aftinitätsadsorbiert aus
menschlichem Serum an einer Cibacron-Blau-Oberfläche.
-
SEND
-
21 zeigt
die Molekularstruktur von oberflächengebundenem
Cinnamamid; R repräsentiert die
Oberfläche
plus Quervernetzer.
-
22 (oberes
Profil) zeigt das Massenspektrum von Peptidmischungen, desorbiert
aus oberflächengebundenem
Cinnamamid. 20B (unteres
Profil) zeigt das Massenspektrum derselben Peptidmischungen mit
freiem Cinnamamid.
-
23 zeigt
die Molekularstruktur von oberflächengebundenem
Cinnamylbromid; R repräsentiert
die Oberfläche
plus Quervernetzer.
-
24 (oberes
Profil) zeigt das Massenspektrum von Peptidmischungen, desorbiert
aus oberflächengebundenem
Cinnamylbromid. 22B (unteres Profil)
zeigt das Massenspektrum derselben Peptidmischungen mit freiem Cinnamylbromid.
-
25 zeigt
die Molekularstruktur von oberflächengebundener
MAP-Dihydroxybenzoesäure; R repräsentiert
die Oberfläche
plus Quervernetzer.
-
26 (oberes
Profil) zeigt das Massenspektrum von Peptidmischungen, desorbiert
aus oberflächengebundenem
MAP alleine. 26 (unteres
Profil) zeigt das Massenspektrum derselben Peptidmischungen, desorbiert
aus oberflächengebundener
MAP-Dihydroxybenzoesäure.
-
27A zeigt
das Massenspektrum (1.200 – 50.000
m/z-Region) von Myoglobin, desorbiert von oberflächengebundener α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure. 27B zeigt dasselbe Massenspektrum
in einem niedrigen Massebereich (0–1.200 m/z).
-
28 zeigt
die Molekularstruktur von energieabsorbierenden Molekülen, die über Glutaraldehydaktivierung
an Polyacrylamid oder Nylon oder acrylische Oberfläche gebunden
sind.
-
29 zeigt
die Molekularstruktur von energieabsorbierenden Molekülen, die über Divinylsulfonaktivierung
an Polyacrylamid oder Nylon oder acrylische Oberfläche gebunden
sind.
-
30 zeigt
die Molekularstruktur von energieabsorbierenden Molekülen, die über Dicyclohexylcarbodiimidaktivierung
an Polyacrylamid oder Nylon oder acrylische Oberfläche gebunden
sind.
-
31 zeigt
die Molekularstruktur von energieabsorbierenden Molekülen, die
mit mehreren antigenen Peptiden über
Dicyclohexylcarbodiimidaktivierung an Polyacrylamid oder Nylon oder
acrylische Oberfläche
gebunden sind.
-
32 zeigt
die Molekularstruktur von Thiosalicylsäure, gebunden an Iminodiacetat (IDA)-Cu(II)-Oberfläche.
-
33 zeigt
das Massenspektrum der Dimerisierungsdomäne des menschlichen Östrogenrezeptors,
desorbiert von Thiosalicylsäure-ID-Cu(II)-Oberfläche.
-
34 zeigt
die Molekularstruktur von α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure, gebunden
an DEAE-Oberfläche.
-
35A zeigt
das Massenspektrum der Dimerisierungsdomäne des menschlichen Östrogenrezeptors,
desorbiert von Sinapinsäure-DEAE-Oberfläche. 35B zeigt das Massenspektrum
von Myoglobin, desorbiert von α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure-DEAE-Oberfläche.
-
36 zeigt
die Molekularstruktur von ⧠-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure gebunden
an Polystryroloberfläche.
-
SEPAR
-
37 zeigt
die Analyse der C-terminalen Sequenz von über photolytische Bindung oberflächenimmobilisierter
histidinreicher Glykoprotein-Metallbindungsdomäne.
-
AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Einem Fachmann ist klar, dass unterschiedliche
Substitutionen und Modifikationen der hierin offenbarten Erfindung
gemacht werden können,
ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.
-
Die Entwicklung neuer MS-Sondenelementzusammensetzungen
mit Oberflächen,
die erlauben, dass das Sondenelement aktiv an dem Capture (Fangen)
und Andocken spezieller Analyte teilnimmt, hat mehrere neue Möglichkeiten
auf dem Gebiet, das heute als Affinitätsmassenspektrometrie (AMS)
bezeichnet wird, definiert. Kurz erläutert, wurden mehrere Typen
neuer MS-Sondenelemente gemäß dem "Surfaces enhanced
for Affinity Capture"(SEAC)-Prinzip
(Prinzip der zum Affinitäts-Capturing
verstärkten
Oberflächen)
konzipiert. Solche SEAC-Sondenelemente werden auch in einer Veröffentlichung
der Erfinder (Hutchens and Yip, Rapid Commun. Mass. Spectrom. 7:
576–580
(1993)) berichtet, welche nach dem vorliegenden US-Prioritätsdatum
vom 28. Mai 1993 veröffentlicht
wurde. SEAC-Sondenelemente
wurden erfolgreich verwendet, um unterschiedliche Klassen von Biopolymeren, besonders
Proteinen, zu erhalten und festzumachen, indem ausgewertet wurde,
was über
Proteinoberflächenstrukturen
und biospezifische molekulare Erkennung bekannt ist.
-
Der Fortschritt in der strukturellen
Biologie ist weiterhin durch die Unvermögen eingeschränkt, Sequenzinformation über Biopolymere
in einer akzeptablen Geschwindigkeit oder einem akzeptablen Maß an Sensitivität zu erhalten.
Durch Nutzung der Verfahren und Gerätschaft der vorliegenden Erfindung wurde
gezeigt, dass AMS eine Möglichkeit
für die Aufhebung
dieser Einschränkung
bietet. Da die immobilisierten Affinitäts-Capture-Vorrichtungen auf der
MS-Sondenelementoberfläche
(d. h. SEAC) den Ort und die Affinität (Spezifität) des Analyten für die Sondenoberfläche festlegen,
ist der nachfolgende analytische AMS-Prozess aus mehreren Gründen viel
effizienter. Zunächst
einmal ist die Stelle, an der sich der Analyt auf der Sondenelementoberfläche befindet,
vorbestimmt. Deshalb ist die nachfolgende Desorption nicht länger von
einer zufälligen
Suche auf dem Sondenoberflächenmatrixfeld
mit dem einfallenden Laserstrahl abhängig. Zweitens ist die Sensitivität des Analytnachweises
(und der dynamische Bereich) erhöht,
da die häufig
bei komplexen Mischungen beobachteten Effekte der Suppression der molekularen
Ionisation ausgeschaltet sind. Drittens bleibt der festgemachte
Analyt, der nicht von dem anfänglichen
laserinduzierten Desorptionsprozess verbraucht wird, für nachfolgende
Analysen verfügbar. Bei
Verwendung einer exogenen Matrix zur Förderung der Analytdesorption
kann diese in den meisten Fällen
ohne Verlust des festgemachten Analyten entfernt werden. Der verbleibende
Analyt kann dann direkt in situ (d. h. solange er sich noch auf
dem Sondenelement befindet) chemisch und/oder enzymatisch modifiziert
werden. Durch nochmalige MS-Analyse zur Bestimmung von Massenunterschieden
werden spezielle Struktureinzelheiten aufgeklärt. Der gesamte Vorgang der
Analyse/Modifikation kann viele Male wiederholt werden, um strukturelle
Informationen zu erhalten, während
nur sehr kleine Mengen an Analyt (manchmal nur einige Femtomole
oder weniger) verbraucht werden. Die Demonstrationen der Proteinstrukturanalyse
auf der Basis von AMS umfassten bisher die Analyse sowohl der N-
als auch der C-terminalen Sequenz und die Verifizierung mehrerer
Arten von sequenzspezifischen, posttranslationalen Modifikationen,
einschließlich
Phosphorylierung und Dephosphorylierung, Glykosylierung, Reaktivität von Cysteinresten,
ortsspezifische chemische Modifikationen (z. B. Histidinreste) und
Ligandenbindung.
-
Über
die Bestimmungen von Biopolymersequenzen und der Aufklärung individueller
Biopolymerstrukturen hinaus geht die Möglichkeit, die strukturellen
Determinanten funktionaler supramolekularer Anordnungen zu verstehen.
AMS präsentiert
ferner die Möglichkeit
zur Untersuchung der strukturellen Determinanten von Strukturen
höherer
Ordnung (z. B. der Quartärstruktur).
Durch Anwendung der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass nichtkovalente
molekulare Erkennungsereignisse, von denen manche nicht sofort durch
die traditionelleren bioanalytischen Verfahren beobachtet werden
(und häufig
eine Störung
der Gleichgewichtsbedingungen und strukturdissoziierende Bedingungen
erfordern), mit makromolekularen Analyten, die direkt oder indirekt
auf der Sondenelementoberfläche
festgemacht sind, direkt durch Evaluierung der molekularen Assoziationen
(d. h. Erkennung) untersucht werden können.
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Analyt" auf jedes Atom und/oder
Molekül;
einschließlich
ihrer Komplexe und Fragmentionen. Im Falle biologischer Makromoleküle einschließlich, jedoch
nicht beschränkt
auf: Protein, Peptide, DNA, RNA, Kohlenhydrate, Steroide und Lipide.
Es wird darauf hingewiesen, dass die meisten wichtigen Biomoleküle, die
hinsichtlich ihrer Beteiligung an der Struktur oder Regulierung
von lebenswichtigen Abläufen
untersucht werden, sehr groß sind
(typischerweise mehrere tausend Mal größer als H2O).
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich
der Begriff "molekulare
Ionen" auf Moleküle im geladenen
oder ionisierten Zustand, typischerweise durch die Addition oder
den Verlust eines Protons bzw. mehrerer Protonen (H+).
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich
der Begriff "molekulare
Fragmentierung" bzw. "Fragmention" auf Abbauprodukte
von Analytmolekülen,
beispielsweise verursacht bei der laserinduzierten Desorption (besonders
in Abwesenheit von zugegebener Matrix).
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich
der Begriff "feste
Phase" auf den Zustand
des Fest-Seins, beispielsweise auf der Sondenelementoberfläche.
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich
der Begriff "Gasphase" bzw. "Dampfphase" auf Moleküle im gasförmigen Zustand
(d. h. in vacuo für
die Massenspektrometrie).
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich
der Begriff "Analytdesorption/Ionisation" auf den Übergang
von Analyten aus der festen Phase in die Gasphase als Ionen. Es
wird darauf hingewiesen, dass die erfolgreiche Desorption/Ionisation
großer,
intakter molekularer Ionen durch Laserdesorption relativ neu ist
(etwa 1988) – der
große
Durchbruch war die zufällige Entdeckung
einer geeigneten Matrix (Nikotinsäure).
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich
der Begriff "molekulare
Gasphaseionen" auf
die Ionen, die in die Gasphase übertreten.
Es wird darauf hingewiesen, dass große molekulare Ionen, wie z.
B. Proteine (typische Masse = 60.000- bis 70.000-mal größer als die
Masse eines einzelnen Protons) typischerweise nicht flüchtig sind
(d. h., sie treten normalerweise nicht in die Gas- bzw. Dampfphase über). In
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung geschieht es jedoch trotzdem,
dass große
molekulare Ionen, wie z. B. Proteine, in die Gas- bzw., Dampfphase übertreten.
-
Wie hierin im Falle von MALDI verwendet, bezieht
sich der Begriff "Matrix" auf ein Beliebiges aus
mehreren kleinen, sauren, lichtabsorbierenden Chemikalien (z. B.
Nikotin- oder Sinapinsäure),
die in Lösung
mit dem Analyten so gemischt werden, dass die kristallinen, in die
Matrix eingebetteten Analytmoleküle
nach dem Trocknen des Sondenelements erfolgreich desorbiert werden
(durch Laserbestrahlung) und aus der festen Phase (Kristalle) in
die gasförmige Phase
bzw. Dampfphase ionisiert und als intakte molekulare Ionen beschleunigt
werden. Damit das MALDI-Verfahren erfolgreich ist, wird der Analyt
mit einer frisch hergestellten Lösung
der chemischen Matrix gemischt (z. B. Matrix zu Analyt in einem
Verhältnis von
10.000 : 1) und auf die inerte Sondenelementoberfläche gegeben,
um unmittelbar vor der Massenspektrometrieanalyse an der Luft zu
trocknen. Der vielfache molare Überschuss
der Matrix, die in Konzentrationen in der Nähe des Sättigungsbereichs vorhanden
ist, erleichtert die Kristallbildung und das Einschließen des
Analyten.
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich "energieabsorbierende
Moleküle
(EAM)" auf ein Beliebiges aus
mehreren kleinen, lichtabsorbierenden Chemikalien, die, wenn sie
auf der Oberfläche
eines Sondenelements präsentiert
sind (wie im Falle von SEND), die reine Desorption von Molekülen aus
der festen Phase (d. h. Oberfläche)
in die gasförmige
Phase bzw. Dampfphase zur nachfolgenden Beschleunigung als intakte
molekulare Ionen ermöglichen.
Der Begriff EAM ist bevorzugt, besonders bei Bezugnahme auf SEND.
Es wird darauf hingewiesen, dass die Analytdesorption durch das
SEND-Verfahren als Surface-Dependent-Process (oberflächenabhängiger Prozess) definiert ist
(d. h. der unvermischte Analyt wird auf eine Oberfläche gegeben,
die aus gebundenen EAM besteht). Im Gegensatz dazu herrscht derzeit
die Meinung, dass MALDI die Analytdesorption durch einen Prozess
von der Art eines Vulkanausbruchs ermöglicht, bei dem die gesamte
Oberfläche in
die Gasphase "geworfen" wird. Es wird des
Weiteren darauf hingewiesen, dass manche EAM, wenn sie als freie
Chemikalien zum Einbetten von Analytmolekülen wie für den MALDI-Prozess beschrieben verwendet werden,
nicht funktionieren (d. h. sie fördern
die molekulare Desorption nicht und sind daher keine geeigneten
Matrixmoleküle).
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Sondenelement" oder "probenpräsentierende
Vorrichtung" auf
ein Element mit den folgenden Eigenschaften: es ist inert (beispielsweise
typischerweise rostfreier Edelstahl) und aktiv (Sondenelemente mit
verstärkten
Oberflächen
(surfaces enhanced), um molekulare Capture-Vorrichtungen zu enthalten).
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich "MALDI" auf matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation.
-
Wie hierin verwendet, steht "TOF" für Time-of-Flight
(Flugzeit).
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich "MS" auf Massenspektrometrie.
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich "MALDI-TOF MS" auf matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisations-Flugzeitspektrometrie.
-
Wie hierin verwendet, ist "ESI" eine Abkürzung für Elektrosprayionisation.
-
Wie hierin verwendet, wird "chemische Bindungen" einfach als ein
Versuch zur Unterscheidung einer rationalen, bewussten und kundigen
Manipulation bekannter Klassen von chemischen Wechselwirkungen der
schlecht definierten Art einer allgemeinen Haftung verwendet, die
beobachtet werden, wenn eine chemische Substanz (z. B. Matrix) auf
eine andere Substanz (z. B. eine inerte Sondenelementoberfläche) platziert
wird. Arten von definierten chemischen Bindungen umfassen elektrostatische
oder ionische (+/–)
Bindungen (z. B. zwischen einer positiv und einer negativ geladenen
Gruppe auf einer Proteinoberfläche),
kovalente Bindungen (sehr starke bzw. "permanente" Bindungen als Ergebnis einer echten gemeinsamen
Nutzung von Elektronen), koordinative kovalente Bindungen (z. B.
zwischen Elektronendonorgruppen in Proteinen und Übergangsmetallionen wie
z. B. Kupfer oder Eisen) und hydrophobe Wechselwirkungen (wie z.
B. zwischen ungeladenen Gruppen).
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Elektronendonorgruppen" auf den Fall einer
Biochemie, in dem Atome in Biomolekülen (z. B. N, S, 0) Elektronen an
elektronenarme Gruppen (z. B. Kupferionen und andere Übergangsmetallionen) "spenden" bzw. sie mit ihnen
teilen.
-
Es gibt eine allgemeine Kategorie
von Sondenelementen (d. h. probenpräsentierende Mittel) unter den
für die
Laserdesorption/Ionisation verstärkten
Oberflächen
(Surfaces enhanced for Laser Desorption/Ionization bzw. SELDI),
innerhalb derer es drei (3) gesonderte Unterkategorien gibt. Für die Reindesorption
verstärkte
Oberflächen
(Surfaces enhanced for Neat Desorption bzw. SEND), bei denen die
Sondenelementoberflächen
(d. h. probenpräsentierende
Mittel) konzipiert sind, um energieabsorbierende Moleküle (EAM)
anstand einer "Matrix" zu enthalten, um
Desorption/Ionisation von Analyten zu ermöglichen, die direkt (rein oder
unvermischt) zu der Oberfläche
gegeben werden. Es wird darauf hingewiesen, dass diese Kategorie
1 (SEND) alleine oder in Kombination mit den zum Affinitäts-Capture
verstärkten
Oberflächen
(Surfaces enhanced for Affinity Capture bzw. SEAC) (Kategorie 2),
welche gemäß der vorliegenden
Erfindung sind, verwendet wird, bei denen die Sondenelementoberflächen (d.
h. probenpräsentierende
Mittel) konzipiert sind, um chemisch definierte und/oder biologisch
definierte Vorrichtungen zum Affinity-Capture zu enthalten, um durch
unterschiedliche Mechanismen (meistens nicht kovalent) entweder
die spezifische oder die unspezifische Haftung oder Adsorption (so
genanntes Andocken oder Festmachen) von Analyten an die Sondenoberfläche zu ermöglichen.
Es wird darauf hingewiesen, dass Kategorie 2 (SEAC), welche gemäß der vorliegenden
Erfindung ist, mit zugegebener Matrix verwendet wird. Die Kombination
von SEND und SEAC stellt daher eigentlich eine Kategorie für sich alleine dar.
-
Kategorie 3 umfasst für photolabile
Anheftung verstärkte
Oberflächen
(Surfaces enhanced for Photolabile Attachment bzw. SEPAR), bei denen
die Sondenelementoberflächen
(d. h. probenpräsentierende
Mittel) konzipiert/modifiziert sind, um einen Typ bzw. mehrere Typen
von chemisch definierten, quer vernetzten Molekülen zu enthalten, um als kovalente Andockvorrichtungen
zu dienen. Diese photolabilen Anheftungsmoleküle (PAM) haben bivalente oder multivalente
Eigenschaften, d. h. es wird zunächst eine
Seite umgesetzt, um das PAM an die Sondenelementoberfläche des
probenpräsentierenden
Mittels permanent anzuheften, und dann ist die andere reaktive Seite
(sind die anderen reaktiven Seiten) des PAM bereit, um mit dem Analyten
umgesetzt zu werden, wenn der Analyt in Berührung mit der PAM-derivatisierten Sondenoberfläche kommt.
Solche Oberflächen
(d. h. probenpräsentierende
Mittel) erlauben eine sehr starke (d. h. stabile, kovalente) Analytanheftungs-
oder -adsorptionsprozesse (d. h. Andocken oder Festmachen), die
kovalent aber auf Bestrahlung hin reversibel (d. h. photolabil)
sind. Solche Oberflächen
stellen Plattformen für
die laserabhängige
Desorption von Analyten dar, die in situ für den Zweck der Strukturaufklärung chemisch
und/oder enzymatisch modifiziert werden sollen (d. h. direkt auf
der Sondenspitze). Nur die bestrahlten Analyten auf der Sondenoberfläche (kleiner
Prozentanteil der Gesamtmenge) werden desorbiert. Die übrigen festgemachten
Analyte bleiben kovalent gebunden und werden ohne Verlust aufgrund
einer unbeabsichtigten Abkopplung von der Oberfläche modifiziert. Es wird darauf
hingewiesen, dass die SEPAR-Kategorie (Kategorie 3) durch Analytanheftungsprozesse
gekennzeichnet ist, die auf Bestrahlung mit Licht hin reversibel
sind. Die lichtabhängige
Umkehrung der Analytoberflächenanheftungsbindung(en)
erlaubt jedoch nicht unbedingt per se die Analytdesorption in die
Gasphase. Mit anderen Worten sind die Moleküle, die für die photolabile Anheftung
der Analyten an die Sondenoberfläche
verantwortlich sind, nicht unbedingt dieselben wie die für SEND beschriebenen energieabsorbierenden
Moleküle
(EAM). Aber es gibt eine wichtige Ausnahme: Die vorliegende Offenbarung
zeigt EAM/PAM-Hybridchemikalien, die in Bezug auf SEND und SEPAR
zweifache Funktionalität haben.
Das heißt,
dass manche EAM-Moleküle,
die derzeit für
SEND verwendet werden, modifiziert werden können, um als Mediatoren für sowohl
den SEND- als auch den SEPAR-Prozess
zu wirken. Entsprechend sind einige Affinitäts-Capture/PAM-Hybridchemikalien
vorgesehen, die in Bezug auf SEAC und SEPAR zweifache Funktionalität haben.
Die vorliegende Offenbarung verwendet einige Affinitäts-Capture-Vorrichtungen,
besonders solche, die biologisch definiert sind, die modifiziert
sind, um als Mediatoren für
sowohl den SEAC- als auch den SEPAR-Prozess zu wirken.
-
Die Offenbarung präsentiert
ein probenpräsentierendes
Mittel (d. h. eine Sondenelementoberfläche) mit oberflächenassoziierten
(oder oberflächengebundenen)
Molekülen,
um das Anheften (Festmachen oder Verankern) und nachfolgende Ablösung von
festgemachten Analytmolekülen
in einer lichtabhängigen
Weise zu fördern,
wobei das Oberflächenmolekül (die Oberflächenmoleküle) von
der Gruppe bestehend aus photoaktiven (photolabilen) Molekülen ausgewählt ist,
die an der Bindung (Andocken, Festmachen oder Quervernetzung) der
Analytmoleküle
an das probenpräsentierende
Mittel (durch kovalente Anheftungsmechanismen oder auf andere Art)
teilnehmen. Des Weiteren wird ein probenpräsentierendes Mittel (bestehend
aus einem oder mehreren der geeigneten Sondenelementmaterialien,
beschrieben in den vorhergehenden Ansprüchen) präsentiert, in dem Analyt(en)
an die Oberfläche
des probenpräsentierenden
Mittels durch eine oder mehrere photolabile Bindungen gebunden ist
(sind), so dass ein einfallender Lichtimpuls (einfallende Lichtimpulse)
(z. B. von einem oder mehreren Lasern) verwendet wird (werden),
um die photolabile Bindung (die photolabilen Bindungen), die den
Analyten (die Analyte) an der Sondenelementoberfläche festmachen, auf
eine Art und Weise aufzubrechen, die mit der nachfolgenden Desorption
des Analyten aus der stationären
(festen) Phasenoberfläche
der Sonde in die Gas- (Dampf-)Phase vereinbar ist.
-
Die chemische Spezifität (chemischen
Spezifitäten),
die die Art und Anzahl der Anheftungspunkte der photolabilen Moleküle zwischen
dem SEPAR-probenpräsentierenden
Mittel (d. h. der Sondenelementoberflache) und dem Analyten (z.
B. Protein) festlegt (festlegen), kann (können) einen Beliebigen oder
mehrere Beliebige aus unterschiedlichen Resten oder chemischen Strukturen
in dem Analyten beinhalten (z. B. His-, Lys-, Arg-, Tyr-, Phe- und Cys-Reste
im Falle von Proteinen und Peptiden). Mit anderen Worten kann das
SEPAR- probenpräsentierende
Mittel im Falle von Proteinen und Peptiden Sondenoberflächen umfassen,
die mit mehreren unterschiedlichen Arten von photolabilen Anheftungsmolekülen modifiziert
sind, um den Analyten (die Analyte) mit einer Vielzahl von unterschiedlichen
Arten von Anheftungspunkten festzumachen.
-
Die Wellenlänge des Lichts oder die Lichtintensität (oder
der Einfallswinkel), die für
das Aufbrechen der photolabilen Anheftung(en) zwischen dem Analyten
und der Sondenelementoberfläche
erforderlich sind, kann der Wellenlänge des Lichts oder der Lichtintensität (oder
dem Einfallswinkel), die erforderlich sind, um die Desorption des
Analyten aus der stationären
Phase in die Gas- oder Dampfphase zu fördern, entsprechen oder sich
davon unterscheiden.
-
Die photolabile Anheftung des (der)
Analyten an die Sondenelementoberfläche (d. h. an das probenpräsentierende
Mittel), insbesondere Biopolymere wie z. B. Peptide, Proteine, Ribonukleinsäure (RNS),
Desoxyribonukleinsäure
(DNS) und Kohlenhydrate (CHO), kann viele Anheftungspunkte zwischen
der Sondenoberfläche
und dem Analytmakromolekül
umfassen. Ist das Biopolymer einmal über viele Anheftungspunkte
angeheftet, können
unterschiedliche Punkte des Gerüsts
des Biopolymers durch chemische und/oder enzymatische Mittel absichtlich
herausgeschnitten bzw. fragmentiert werden, so dass viele der resultierenden
Fragmente nun gesonderte und distinkte Analyten sind, von denen jeder
durch eine photolabile Bindung oder mehrere photolabile Bindungen
an die Sondenoberfläche
geheftet (festgemacht) ist, um parallel dazu für die gleichzeitige Massenanalyse
mit einem Flugzeit-Massenanalysegerät in die
Gasphase desorbiert zu werden. Dieser Vorgang erlaubt die Durchführung der
Bestimmung der Sequenz von Biomolekülen (Protein, Peptide, RNA,
DNA, Kohlenhydrate).
-
Wir hierin verwendet, bezieht sich "Affinität" auf physikalische
und/oder chemische Anziehung zwischen zwei Molekülen. Sie wird typischerweise
in Natur für
Strukturzwecke oder die Regulierung von Bioaktivität (d. h.
Informationsübertragung)
verwendet. In der Regel ist die Affinität eines Biomoleküls für ein anderes
Biomolekül
ziemlich spezifisch. Sie wird im vorliegenden Fall verwendet, um
ein Prinzip zu beschreiben, durch das molekulare Analyten von Interesse
gefangen werden (Capture). Im Falle von SEAC sind Chemikalien oder
Biomoleküle
mit einer kennzeichnenden Affinität für den (die) Analyten an die Oberfläche des
Sondenelements festgemacht (gebunden), um den gewünschten
Analyten aktiv "herauszusuchen" und selektiv zu
binden.
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich "molekulare Erkennung" auf das Wechselwirkungsereignis zwischen
zwei Molekülen
mit einer natürlichen
Affinität
für einander.
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich "molekulares Capture
bzw. Fangen" auf
die Verwendung der festgemachten Biomoleküle, um andere Biomoleküle, zu denen
eine spezifische Affinitätsbeziehung
besteht, anzuziehen und festzumachen (zu fangen bzw. ein Capturing
durchzuführen).
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich "passive Adsorption" auf den Vorgang
des einfachen Platzierens des Analyten (z. B. mit Matrix).
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich "aktives Andocken" auf das absichtliche
Fangen von Analytmolekülen
an der Oberfläche
eines aktiven Sondenelements wie im Falle von SEAC.
-
Wie hierin verwendet, bedeutet "stationäre Phase" dasselbe wie feste
Phase. In dem vorliegenden Zusammenhang entweder die Sondenelementoberfläche selbst
oder eine der "externen", besonderen SEND
oder SEAC-Vorrichtungen, verwendet in Verbindung mit einer inerten
Sondenelementoberfläche.
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich "aktiver Oberflächenbereich" auf den Bereich
der Oberfläche, von
dem angenommen oder bekannt ist, dass er an der gewünschten
Reaktion bzw. an dem gewünschten
Ereignis teilnimmt (z. B. EAM-Anheftung oder Affinitäts-Capture).
Der aktive Oberflächenbereich kann
wesentlich kleiner sein als der gesamte Oberflächenbereich (aufgrund physikalischer
Effekte wie sterischer Behinderung können manche Bereiche des Gesamtbereichs
nicht verfügbar
oder nützlich sein).
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Ligand" auf ein typischerweise
relativ kleines Molekül
(Köder),
das an ein großes
Biomolekül
bindet (Fisch). Im vorliegenden Fall sind Liganden über einen
Linkerarm (Angel) an die Sondenelementoberfläche angeheftet (chemisch gebunden).
Dieser Vorgang erlaubt die Lokalisierung des biomolekularen Capture-Ereignisses
auf der Oberfläche
(stationäre
oder feste Phase).
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Affinitätsreagens" auf eine Analyt-Capture-Vorrichtung, viz., die
Klasse von Molekülen
(beide von Menschen gemacht, unnatürlich, natürlich und biologisch) und/oder
Bestandteile, die die Fähigkeit
haben, auf der präsentierenden
Oberfläche
zurückgehalten
zu werden (durch kovalente Bindung, chemische Absorption, etc.),
während
gleichzeitig die Fähigkeit
der Erkennung und der Bindung an einen Analyten erhalten bleibt.
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Desorption" auf die Ablösung eines
Analyten von der Oberfläche
und/oder den Eintritt des Analyten in eine Gasphase.
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Ionisation" auf den Vorgang
des Erzeugens oder Zurückhaltens
einer elektrischen Ladung gleich plus oder minus einer Elektroneneinheit
oder mehrerer Elektroneneinheiten auf einem Analyten.
-
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Addukt" auf das Erscheinen
einer zusätzlichen
Masse, die mit dem Analyt assoziiert ist und die in der Regel durch die
direkte Reaktion von im Überschuss
vorhandener Matrix (oder Abbauprodukte der Matrix) mit dem Analyten
erzeugt wird.
-
Wie hierin verwendet, bedeutet "Adsorption" die chemische Bindung
(kovalent und/oder nicht kovalent) der energieabsorbierenden Moleküle, des
Affinitätsreagens
(d. h. der Analyt-Capture-Vorrichtung) und/oder des Analyten an
die Sonde (präsentierende Oberfläche).
-
Eine Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist eine Gerätschaft
zum Messen der Masse eines Analytmoleküls einer Analytprobe mittels
Massenspektrometrie, wobei die Gerätschaft umfasst: eine Spektrometerröhre; ein
Vakuummittel für
das Anlegen eines Vakuums im Inneren der Röhre; ein elektrisches Potenzialmittel
in der Röhre
für das
Anlegen eines beschleunigten Potenzials an desorbierte Analytmoleküle von der
Analytprobe; probenpräsentierendes
Mittel, das entnehmbar in der Spektrometerröhre angebracht ist, zum Präsentieren
der Analytprobe in Assoziation mit dem oberflächenassoziierten Molekül zum Fördern der
Desorption und Ionisation der Analytmoleküle, wobei das Oberflächenmolekül eine Affinitäts-Capture-Vorrichtung (Affinitätsreagens)
ist und eine desorptions-/ionisationsunterstützende Matrix
in Assoziation mit dem Affinitätsreagens
auf der Oberfläche
vorgesehen ist; eine Analytprobe, die auf dem probenpräsentierenden Mittel
in Assoziation mit den oberflächenassoziierten Molekülen vorgesehen
ist; wobei mindestens ein Teil der Analytmoleküle, die in der Massenspektrometrieanalyse
nicht verbraucht werden, für
nachfolgende chemische, biologische oder physikalische analytische
Verfahren zugänglich
bleiben; Laserstrahlenmittel für
das Erzeugen eines auf die Analytprobe gerichteten Laserstrahls
für das
Zukommenlassen ausreichender Energie zum Desorbieren und Ionisieren eines
Teils der Analytmoleküle
von der Analytprobe; und zur Spektrometerröhre gehörige Nachweismittel zum Nachweis
der Wirkung von beschleunigten ionisierten Analytmolekülen darauf.
-
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist ein Verfahren der Massenspektrometrie zum Messen der
Masse eines Analytmoleküls, wobei
das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Derivatisieren einer
probenpräsentierenden
Oberfläche
auf einer Seite einer Sondenspitze mit einer Affinitäts-Capture-Vorrichtung
mit Mitteln zum Verbinden mit einem Analytmolekül; Aussetzen der derivatisierten,
Sondenspitzenseite gegenüber
einer Quelle des Analytmoleküls,
um den Analyten daran zu binden; Geben der derivatisierten, Probenspitze
mit den daran gebundenen Analytmolekülen in ein Ende eines Flugzeit-Massenspektrometers
und Anlegen eines Vakuums und eines elektrischen Felds, um ein beschleunigtes
Potenzial in dem Spektrometer zu bilden; beschießen mindestens eines Teils
der an der derivatisierten Sondenspitzenseite in dem Spektrometer
gebundenen Analytmoleküle
mit einem oder mehreren Laserimpulsen, um Ionen der Analytmoleküle von der
Spitze zu desorbieren; Nachweisen der Masse der Ionen durch ihre
Flugzeit in dem Massenspektrometer und Anzeigen der nachgewiesenen Masse.
In diesem Verfahren wird ein desorptions-/ionisationsunterstützendes
Matrixmaterial auf die zu der Affinitäts-Capture-Vorrichtung gehörige Sondenspitzenseite
aufgetragen. In einer bevorzugteren Ausführungsform umfasst das entsprechende
Verfahren des Weiteren das Entfernen der Sondenspitze aus dem Massenspektrometer;
das Durchführen
eines chemischen oder biologischen Verfahrens mit dem Teil der nicht
desorbierten Analytmoleküle,
um die Zusammensetzung des Teils der nicht desorbierten Analytmoleküle zu verändern; Wiedereinführen der
Sondenspitze mit darauf befindlichen veränderten Analytmolekülen; und
Durchführen
einer darauf folgenden Massenspektrometrieanalyse zum Nachweisen
des Molekulargewichts der veränderten
Analytmoleküle.
-
In einer weitere Ausführungsform
ist die Affinitäts-Capture-Vorrichtung
chemisch an die Seite der Sondenspitze gebunden, physikalisch an
die Seite der Sondenspitze angeheftet, adaptiert, um an die Analytmoleküle zu binden,
oder adaptiert, um biologisch an die Analytmoleküle zu haften. In einer weiteren
Ausführungsform
sind die Analytmoleküle
Biomoleküle
und das Affinitätsreagens
ist adaptiert, um die Biomoleküle
aus einer undifferenzierten biologischen Probe selektiv zu isolieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform
sind die Matrixmaterialien in einem schwach sauren oder stark basischen
pH-Bereich. In einer
bevorzugteren Ausführungsform
haben die Matrixmaterialien einen pH-Wert von über 6,0. Eine zusätzliche
Ausführungsform
präsentiert
darüber
hinaus die Seite der Sondenspitze gebildet aus einem elektrisch
isolierenden Material.
-
In einer weitere Ausführungsform
der Gerätschaft
der vorliegenden Erfindung zum Ermöglichen einer Desorption und
Ionisation von Analytmolekülen umfasst
die Gerätschaft:
eine probenpräsentierende Oberfläche und
ein zur Oberfläche
gehöriges
Molekül,
wobei das zur Oberfläche
gehörige
Molekül
zu der probenpräsentierenden
Oberfläche
gehörig
ist und Mittel zum Verbinden mit den Analytmolekülen besitzt. Ein desorptions-/ionisationsunterstützendes Matrixmaterial
ist auf der Oberfläche
in Assoziation mit dem Affinitätsreagens
vorgesehen.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst die probenpräsentierende
Oberfläche
die Oberfläche
einer Sondenspitze für
die Verwendung in einem Flugzeit-Massenspektrometrie-Analysegerät. Darüber hinaus
präsentiert
die bevorzugte Ausführungsform
eine Affinitäts-Capture-Vorrichtung,
die chemisch an die probenpräsentierende
Oberfläche gebunden
ist, physikalisch an die probenpräsentierende Oberfläche angeheftet
ist, chemisch an die Analytmoleküle
gebunden ist oder adaptiert ist, um biologisch an die Analytmoleküle anzuheften.
Des Weiteren präsentiert
die bevorzugte Ausführungsform
Analytmoleküle,
die Biomoleküle
sind, und die Affinitäts-Capture-Vorrichtung
ist adaptiert, um die Biomoleküle
aus einer undifferenzierten biologischen Probe selektiv zu isolieren.
-
Wie oben erwähnt, ist in der Gerätschaft
ein Matrixmaterial auf der probenpräsentierenden Oberfläche abgeschieden,
das zu der Affinitäts-Capture-Vorrichtung
(dem Affinitätsreagens)
gehörig
ist. In einer bevorzugteren Ausführungsform
ist das Matrixmaterial in einem schwach sauren oder stark basischen
pH-Bereich. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform hat das Matrixmaterial
einen pH-Wert von über
6,0. Zusätzlich
beinhaltet eine bevorzugte Ausführungsform
eine probenpräsentierende
Oberfläche,
die aus einem elektrisch isolierenden Material gebildet ist.
-
In einer zusätzlichen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Fangen von Analytmolekülen auf
einer probenpräsentierenden
Oberfläche
und zum Desorbieren /Ionisieren der gefangenen Analytmoleküle von der
probenpräsentierenden
Oberfläche
für die
darauf folgende Analyse präsentiert,
wobei das Verfahren umfasst: Derivatisieren der probenpräsentierenden
Oberfläche
mit einer Affinitäts-Capture-Vorrichtung,
die Mittel zum Binden der Analytmoleküle aufweist; Aussetzen der
derivatisierten probenpräsentierenden
Oberfläche
gegenüber
einer die Analytmoleküle
enthaltenden Probe; Fangen (Capturing) der Analytmoleküle auf der derivatisierten,
probenpräsentierenden
Oberfläche durch
Mittel der Affinitäts-Capture-Vorrichtung;
und Aussetzen der durch Mittel der Affinitäts-Capture-Vorrichtung an die derivatisierte, probenpräsentierende
Oberfläche
gebundenen Analytmoleküle
gegenüber
einer Energie- oder Lichtquelle, um mindestens einen Teil der Analytmoleküle von der
Oberfläche
zu desorbieren. Dieses Verfahren umfasst außerdem den Schritt des Abscheidens
eines desorptions-/ionisationsunterstützenden
Matrixmaterials an die zu der Affinitäts-Capture-Vorrichtung (dem Affinitätsreagens)
gehörige,
probenpräsentierende
Oberfläche.
-
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen einer Oberfläche zum
Präsentieren
von Analytmolekülen für die Analyse,
wobei das Verfahren umfasst: Vorsehen eines Substrates auf der Oberfläche zum
Tragen des Analyten; Derivatisieren des Substrats mit einer Affinitäts-Capture-Vorrichtung
mit Mitteln zum selektiven Binden des Analyten; Anbringen eines
desorptions-/ionisationsunterstützenden
Matrixmaterials an die zu der Affinitäts-Capture-Vorrichtung (dem
Affinitätsreagens)
gehörige,
probenpräsentierende
Oberfläche;
und ein Mittel zum Nachweisen der Analytmoleküle, die an die Affinitäts-Capture-Vorrichtung
gebunden sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein zusätzlicher
Schritt des Auftragens eines Nachweismaterials auf die Oberfläche vorgesehen. In
einer bevorzugteren Ausführungsform
umfasst das Nachweismaterial eine fluoreszierende Art, eine enzymatische
Art, eine radioaktive Art oder eine Licht emittierende Art.
-
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Energiequelle einen Laser. In einer anderen bevorzugten
Ausführungsform
wird eine Affinitäts-Capture-Vorrichtung
verwendet und die Energiequelle umfasst eine Ionenquelle. Des Weiteren kann
eine bevorzugte Ausführungsform
einen Teil der Analytmoleküle
umfassen, die nach dem Aussetzen gegenüber der Energiequelle an der
probenpräsentierenden
Oberfläche
gebunden bleiben. In einer bevorzugteren Ausführungsform sind die zusätzlichen
Schritte des Umwandelns mindestens eines Teils der Analytmoleküle, die
auf der derivatisierten, probenpräsentierenden Oberfläche durch
eine chemische, biologische oder physikalische Reaktion an modifizierte
Analytmoleküle
gebunden bleiben, wobei die Analytmoleküle mittels einer Affinitäts-Capture-Vorrichtung an der
derivatisierten, probenpräsentierenden
Oberfläche
gebunden bleiben, und des Aussetzens der modifizierten Analytmoleküle gegenüber eine
Energiequelle, um mindestens einen Teil der modifizierten Analytmoleküle von der
Oberfläche zu
desorbieren, enthalten.
-
In einem Beispiel, bei dem es sich
nicht um eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung handelt, ist eine Probensonde zum Fördern der
Desorption von intakten Analyten in die Gasphase vorgesehen, umfassend:
eine probenpräsentierende Oberfläche; und
ein zu der probenpräsentierenden Oberfläche gehöriges energieabsorbierendes
Molekül,
wobei die Probensonde die Desorption eines intakten Analytmoleküls fördert, das
sich auf, über
oder zwischen den energieabsorbierenden Molekülen befindet, wenn die Probensonde
von einer Energiequelle getroffen wird. In einem weiteren Beispiel
ist das energieabsorbierende Molekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus Cinnamamid, Cinnamylbromid, 2,5-Dihydroxybenzoesäure und α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure. In
einem Beispiel kann auch eine probenpräsentierende Oberfläche ausgewählt aus der
Gruppe bestehend aus Glas, Keramik, TeflonTM-beschichtetem
Magnetmaterial, organischen Polymeren und nativen Biopolymeren verwendet werden.
-
In einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist eine Probensonde zum Fördern der
Desorption intakter Analyte in die Gasphase vorgesehen, umfassend:
eine probenpräsentierende Oberfläche und
eine zu der probenpräsentierenden Oberfläche gehörige Affinitäts-Capture-Vorrichtung; wobei
die Probensonde den Übergang
eines intaktes Analytmoleküls
in die Gasphase fördert,
wenn die Probensonde von einer Energiequelle getroffen wird. Auf
der Oberfläche
ist in Assoziation mit der Affinitäts-Capture-Vorrichtung (Affinitätsreagens)
ein desorptions-/ionisationsunterstützendes Matrixmaterial vorgesehen.
Die Aftinitäts-Capture-Vorrichtung
ist ausgewählt
aus Metallionen, Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten und Kombinationen davon.
Die Affinitäts-Capture-Vorrichtung
kann ein Antikörper,
Lektin, ein Cu(II)- oder
eine Fe(III)-Ion sein. Es kann daher ein Immunglobulin sein. In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
ist die probenpräsentierende
Oberfläche
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Glas, Keramik, TeflonTM-beschichteten
magnetischen Materialien, organischen Polymeren und nativen Biopolymeren
ausgewählt.
-
In einer anderen Ausführungsform
umfasst die Probensonde der Erfindung eine probenpräsentierende
Oberfläche
und:
- – mindestens
zwei verschiedene, zu der probenpräsentierenden Oberfläche gehörige Affinitäts-Capture-Vorrichtungen;
wobei die Probensonde je nach der zu den Analytmolekülen gehörigen Affinitäts-Capture-Vorrichtung
den Übergang
eines Analytmoleküls
in die Gasphase mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten fördert, wenn
die Probensonde von einer Energiequelle getroffen wird.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform
wird der Analyt selektiv aus der Mischung desorbiert, nachdem er
von einer Energiequelle getroffen ist. In einer anderen bevorzugten
Ausführungsform
sind die Affinitätsvorrichtungen
in vorbestimmten Anordnungen angeordnet. In einer bevorzugteren
Ausführungsform
absorbieren die Anordnungen selektiv eine Vielzahl von unterschiedlichen
Analyten.
-
In einer bevorzugteren Ausführungsform wird
eine Gerätschaft
der vorliegenden Erfindung verwendet, um einen Analyten zu quantifizieren,
wobei die Position und Quantität
von Affinitäts-Capture-Vorrichtungen
die Quantität
des absorbierten Analyten bestimmt. In einer anderen bevorzugten
Ausführungsform
kann die Bindung selektiv oder nicht selektiv sein.
-
In einer zusätzlichen Ausführungsform
umfasst eine Probensonde zum Fördern
der Desorption von intaktem Analyt in die Gasphase: eine probenpräsentierende
Oberfläche;
und ein oberflächenassoziiertes
Molekül,
wobei das oberflächenassoziierte Molekül sowohl
als energieabsorbierendes Molekül als
auch als Affinitäts-Capture-Vorrichtung
fungieren kann.
-
Eine andere Ausführungsform zeigt ein Verfahren
zum Bestimmen der Sequenz eines Biopolymers, umfassend die Schritte
des: Bindens eines Biopolymeranalyten an eine Sondenspitze enthaltend eine
probenpräsentierende
Oberfläche
mit einem oberflächenassoziierten
Molekül,
wobei das oberflächenassoziierte
Molekül
eine Affinitäts-Capture-Vorrichtung
ist; Desorption des Biopolymeranalyten in der Massenspektrometrieanalyse,
wobei mindestens ein Teil des Biopolymers nicht von der Sondenspitze desorbiert
wird; Analysieren der Ergebnisse der Desorption; Modifizieren des
Biopolymers, das noch immer an die Sondenspitze gebunden ist; und
Wiederholen der Desorptions-, Analyse- und Modifikationsschritte,
bis das Biopolymer sequenziert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Biopolymer ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Protein, RNA, DNA und Kohlenhydrat.
-
Die folgenden Beispiele beinhalten
Beispiele, die spezifische Ausführungsformen
beschreiben, welche die vorliegende Erfindung veranschaulichen und
nicht dazu bestimmt sind, den Umfang der Erfindung, der durch die
angehängten
Ansprüche
definiert ist, einzuschränken.
Es werden auch andere Beispiele, die keine Ausführungsformen der Erfindung
sind, gegeben.
-
Die Beispiele nutzen ein Flugzeit-Massenspektrometer
mit einer Hochenergiequelle, wie beispielsweise einen Laserstrahl,
um den Analyten von der Oberfläche
einer Sondenspitze zu verdampfen. Bei dem Vorgang werden einige
der Moleküle
ionisiert. Die positiv geladenen Moleküle werden dann durch ein kurzes
Hochspannungsfeld beschleunigt und gelangen in eine feldfreie Flugröhre. Am
Ende der Flugröhre
befindet sich ein empfindlicher Detektor, der jedes Mal, wenn ein
molekulares Ion auf ihn auftrifft, ein Signal gibt. Ein Fachmann
erkennt, dass andere Arten des Nachweises und der Ionisation ebenfalls
verwendet werden können.
-
BEISPIEL 1
-
Energieabsorbierende Moleküle in wässriger,
neutralisierter Form
-
Das im Stand der Technik für die matrixunterstützte Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
verwendete Matrixmaterial ist stark sauer. Eine der vorliegenden
Entdeckungen ist, dass Analyte desorbiert werden, wenn sie mit neutralisierten, energieabsorbierenden
Molekülen
gemischt werden, die in vollkommen wässrigen Lösungsmitteln gelöst sind.
Durch geeignete Neutralisation bei pH 6,0 oder darüber wird
das Matrixmaterial weit gehend passiv gegenüber nachfolgende chemische
oder enzymatische Reaktionen gemacht, die mit den auf der Sondenspitzenoberfläche präsentierten
Analytmolekülen durchgeführt werden.
Da bei jeder Desorption/Massenspektrometermessung nur ein kleiner
Bruchteil der Analytmoleküle
verwendet wird, sind die Proben auf der Sondenspitze für nachfolgende
chemische oder enzymatische Modifikationen in situ verfügbar. Nach
der Modifikation werden die Proben durch Massenspektrometrie analysiert.
Eine Analyse auf derselben Sondenspitze liefert eine genauere Bestimmung
des Moleküls
und seiner Eigenschaften, einschließlich seiner Struktur.
-
Massenspektrometrie wird mit einem
modifizierten Vestec Modell VT2000 oder einem MAS Linearflugzeit-Forschungsmassenspektrometer
Modell SELDI durchgeführt,
das einen frequenzverdreifachten, von einem gütegeschalteten, Neodym-Yttrium-Aluminium-Granat
(Nd-YAG)-gepulsten Laser (355 nm, 5 ns-Puls) verwendet. Die durch die gepulste
Laserbestrahlung desorbierten Ionen werden bis auf eine Energie
von 30 keV beschleunigt und können
einen 2 Meter langen, feldfreien Driftbereich entlang driften (aufrechterhalten
bei 10–8 Torr).
Die von einem 20-stufigen Elektronenvervielfacher mit diskreten
Dynoden nachgewiesenen Ionensignale werden von einem schnellen Vorverstärker um
einen Faktor 10 amplifiziert, bevor sie mithilfe eines 200 MS/s
transienten Rekorders (LeCroy TR8828D, 8 Bit Y-Achsenauflösung) oder
einem zur schnellen Signalmittelwertbildung fähigen Tektronix-Digitalisierer aufgezeichnet
werden. Die Bestrahlung im letzteren Fall wird in Echtzeit angepasst,
während der
Vorgang auf einem Oszilloskop (Tektronix) überwacht wird, um ein optimales
Ionensignal zu erhalten. Die Datenverringerung (Spitzencentroidberechnungen
und Dauer bis zu der Masse-/Ladungsumkehrung)
werden mit PC-Software durchgeführt.
Ein VG TOFSpec Massenspektrometer, das einen Stickstofflaser nutzt,
welcher einen gepulsten Laser mit 335 nm erzeugt, oder ein lineares
LDI 1700 Massenspektrometer, das einen Stickstofflaser nutzt, welcher
einen gepulsten Laser mit 335 nm erzeugt, können auch verwendet werden.
-
I. Spezifische Analyse
-
- 1. Sinapinsäure
(Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) wird in einer Konzentration
von 20 mg/ml (pH 3,88) in Wasser suspendiert und mit Triethylamin
(Pierce, Rockford, IL) auf einen pH-Wert von 6,2 – 6,5 neutralisiert.
Eine wässrige Mischung
(1 μl) synthetischer
Peptide, enthaltend menschliche, histidinreiche Glykoproteinmetallbindungsdomänen (GHHPH)2G (1206 1 Da), (GHHPH)5G
(2904 Da) und die Dimerisierungsdomäne des menschlichen Östrogenrezeptors (D473-L525)
(6168,4 Da) werden mit 2 μl
Sinapinsäure
(20 mg/ml Wasser, pH 6,2) auf einer Sondenspitze gemischt und durch
Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Nach dem
Erhalten von sieben Spektren (durchschnittlich 100 Laserschüsse pro
Spektrum) wird die Sonde entfernt, es werden 2 μl 20 mM Cu(SO)4 zugegeben
und die Probe durch Massenspektrometrie erneut analysiert. 1A (oberes Profil) zeigt
das Massenspektrum der drei Peptide, die in Anwesenheit neutralisierter,
energieabsorbierender, Molekülen
desorbiert wurden. 1 B
(unteres Profil) zeigt die Metallbindung in situ der Peptide in
Anwesenheit neutraler, energieabsorbierender Moleküle. Unter
den vorliegenden experimentellen Bedingungen kann das (GHHPH)2G-Peptid mindestens 4 Cu(II) binden, das
(GHHPH)5G-Peptid mindestens 5 Cu(II) binden
und die Dimerisierungsdomäne
mindestens 1 Cu(II) binden. Ähnliche
Ergebnisse wurden mit ⧠-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure (20 mg/ml Wasser), neutralisiert
auf pH 6,5, erhalten.
- 2. Ein Aliquot von 1 μl
menschlichem β-Casein-Phosphopeptid
(R1 – K18
+ 5P) (2488 Da) wird mit 1 μl
Sinapinsäure
(20 mg/ml Wasser), neutralisiert auf pH 6,5, gemischt und durch
Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Nach dem
Erhalten von fünf
Spektren (durchschnittlich 100 Laserschüsse pro Spektrum) wird die
Sonde entfernt, das verbleibende, mit der neutralisierten Sinapinsäure vermischte Phosphopeptid
wird direkt auf der Sondenspitze mit 0,5 μl alkalischer Phosphatase (Sigma)
verdaut und bei 23°C
5 Min. inkubiert. Nach dem Erhalten von fünf Spektren (durchschnittlich
100 Laserschüsse
pro Spektrum) wird die Sonde entfernt, und es wird durch Zugabe
eines weiteren Aliquots von 0,5 μl
alkalischer Phosphatase ein weiterer Verdau der verbleibenden Phosphopeptide
durchgeführt
und 5 Minuten lang bei 23°C
inkubiert. Die Probe wird nochmals durch Laserdesorptions-Massenspektrometrie
analysiert. 2A (oberstes
Profil) zeigt das Massenspektrum des Phosphopeptids, das in Anwesenheit neutralisierter
energieabsorbierender Moleküle desorbiert
wurde. 2B (zweites Profil
von oben) zeigt den 5-minütigen
Verdau in situ mit alkalischer Phosphatase, um Phosphatgruppen von dem
Phosphopeptid zu entfernen. Die 0P-, 1P- und 3P-Spitzen stellen die Produkte nach dem Entfernen
von respektive fünf,
vier und zwei Phosphatgruppen von dem Phosphopeptid dar. 2C (drittes Profil von oben)
zeigt, dass weiterer in situ-Verdau mit alkalischer Phosphatase
zu einer fast vollständigen
Entfernung aller Phosphatgruppen von dem Phosphopeptid führen kann.
Im Gegensatz dazu zeigt 2D (unteres Profil),
dass in dem Kontrollexperiment, in dem der in-situ-Verdau mit alkalischer
Phosphatase (0,5 μl)
in Anwesenheit von energieabsorbierenden Molekülen ohne vorherige Neutralisierung
(z. B. Sinapinsäure
bei einem pH-Wert von 3,88 oder Dihydroxybenzoesäure bei pH 2,07) durchgeführt wird,
im Verlauf von 10 Minuten bei 23°C
ein sehr eingeschränkter
Verdau stattfand.
- 3. Ein Aliquot von 1 μl
(GHHPH)5G-Peptid (2904 Da) wird mit 2 μl Sinapinsäure (20
mg/ml Wasser) auf pH 6,2 neutralisiert und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
analysiert. Nach dem Erhalten von fünf Spektren (durchschnittlich
100 Laserschüsse
pro Spektrum) wurden die verbleibenden, mit neutralisierter Sinapinsäure gemischten
Peptide direkt auf der Sondenspitze mit 1 μl Carboxypeptidase P (Boehringer Mannheim
Corp, Indianapolis, IN) verdaut und bei 23°C 30 Minuten lang inkubiert.
Die Probe wird durch Massenspektrometrie analysiert. 3 zeigt ein Verbundmassenspektrum
des Peptids vor (unteres Profil) und nach (oberes Profil) dem in
situ-Verdau mit Carboxypeptidase P in Anwesenheit von neutralisierten
energieabsorbierenden Molekülen.
Die Verringerung der Masse stellt das Entfernen eines Gly-Restes
vom C-Terminus des Peptids dar.
-
Diese Beispiele veranschaulichen,
dass neutralisierte energieabsorbierende Moleküle in wässrigen Lösungen bei dem Erhalten der
Struktur und der Funktion der Analyte biokompatibler sind, wenn
sie in großem
molarem Überschuss
zugegeben werden. Ihre Anwesenheit führt nicht zu einer Interferenz
mit sequenziellen chemischen oder enzymatischen Reaktionen in situ
auf dem verbleibenden Analyten.
-
BEISPIEL 2
-
Nichtmetallische Sondenelemente
(probenpräsentierende
Oberflächen)
-
Es wurde herausgefunden, dass die
im Verfahren der Erfindung verwendeten Sondenelemente (Sondenspitzen
oder probenpräsentierende
Oberflächen)
nicht aus Metall bestehen oder metallbeschichtet sein müssen, wie
in der Verfahren im Stand der Technik beschrieben ist. Die probenpräsentierenden Oberflächen bestehen
aus unterschiedlichen Materialien, einschließlich porösen oder nicht porösen Materialien,
wobei die porösen
Materialien schwammähnliche,
polymere Bereiche mit großer
Oberfläche für die optimierte
Adsorption und Präsentation
von Analyt vorsehen.
-
Polypropylen oder Polystyrol oder
Polyethylen oder Polycarbonat werden in einer offenen Flamme geschmolzen
und als dünne
Schicht auf einem Sondenelement aus rostfreiem Edelstahl und einem Durchmesser
und 2 mm abgeschieden, um es vollständig zu bedecken. Feste Glasstäbe oder
feste Nylonfilamente (mit einem Durchmesser von bis zu 1,5 mm) oder
Polyacrylamidstäbe
werden in Abschnitte von 1 cm geschnitten und in den Träger der
Sonde aus rostfreiem Edelstahl eingeführt. Es werden magnetische
Rühren
(1,5 × 8
mm), TeflonTM-beschichtet) in den Träger der
Sonde aus rostfreiem Stahl eingeführt. Ein Aliquot von 1 μl Peptidmischung
enthaltend (GHHPH)5G und Dimerisierungsdomäne des menschlichen Östrogenrezeptors
wird mit 2 μl
Dihydroxybenzoesäure
(gelöst
in 30% Methanol, 0,1 Trifluoressigsäure) auf jedem der Sondenelemente gemischt
und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. 4 zeigt, dass Analyte von
mehreren Beispielen von isolierenden biokompatiblen Oberflächen desorbiert
werden konnten.
-
Diese Oberflächen können derivatisiert werden (zu
unterschiedlichen Dichten), um Affinitätsadsorptionsreagenzien (Aftinitäts-Capture-Vorrichtungen),
energieabsorbierende Moleküle
(gebundene "Matrix"-Moleküle) oder
photolabile Anheftungsmoleküle über chemische
Bindungen (kovalent oder nichtkovalent) zu binden. Die Geometrie
der probenpräsentierenden
Oberfläche
ist unterschiedlich (d. h. Größe, Struktur,
Flexibilität,
Dicke, etc.), um dem Anspruch des Experimentes (des Tests) zu entsprechen (z.
B. Einführen
in einen lebenden Organismus durch Öffnungen von vorbestimmter
Größe).
-
BEISPIEL 3
-
Affinitätsgerichtete
Laserdesorption (oberflächenverstärktes Aftinitäts-Capture;
surface enhanced affinity capture, SEAC, – die Erfindung)
-
Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung von
bestehenden und neuen Festphasenaffinitätsreagenzien, die konzipiert
sind (1) zum Fangen (Capture, Adsorption) eines Analyten oder mehrerer
Analyte, (2) zum Herstellen dieser gefangenen Analyte (z. B. Waschen
mit Wasser oder anderen gepufferten oder nicht gepufferten Lösungen zum
Entfernen von Verunreinigungen, wie z. B. Salze, und mehrere Zyklen
des Waschens, beispielsweise mit einem polaren, organischen Lösungsmittel,
detergenzlösenden Lösungsmittel,
verdünnter
Säure,
verdünnter
Base oder Harnstoff) und (3), was am wichtigsten ist, dem direkten
Transfer dieser gefangenen und hergestellten Analyte auf die Sondenoberfläche für die nachfolgende
Analytdesorption (für
den Nachweis, die Quantifizierung und/oder Massenanalyse). Affinitäts-Capture-Vorrichtungen
sind auf unterschiedlichen Materialien immobilisiert, einschließlich elektrisch
isolierenden Materialien (porös
und nicht porös),
flexibel oder nicht steife Materialien, optisch transparente Materialien
(z. B. Glas, einschließlich Glas
mit unterschiedlicher Dichte, Dicke, Farbe und mit unterschiedlichem
Brechungsindex) sowie weniger reaktive, biokompatiblere Materialien
(z. B. Biopolymere wie beispielsweise Agarose, Dextran, Zellulose,
Stärken,
Peptide und Fragmente von Proteinen und von Nukleinsäuren). Die
bevorzugte Sondenspitze, oder Probenoberfläche, für die selektive Adsorption/Präsentation
der Probe für
die Massenanalyse sind (1) rostfreier Edelstahl (oder anderes Metall),
mit einem synthetischen Polymer(z. B. quervernetztes Dextran oder
Agarose, Nylon, Polyethylen, Polystyrol)-Beschichtung, die zur kovalenten
Anheftung von spezifischen Biomolekülen oder anderen nicht biologischen Affinitätsreagenzien
geeignet ist, (2) Glas oder Keramik, und/oder (3) Plastik (synthetisches
Polymer). Die an der selektiven Immobilisierung von Affinitätsreagenzien
an diese Sondenoberflächen
beteiligten, chemischen Strukturen umfassen die bekannten, unterschiedlichen
sauerstoffabhängigen,
kohlenstoffabhängigen,
schwefelabhängigen und/oder
stickstoffabhängigen
Mittel der kovalenten oder nicht kovalenten Immobilisation.
-
I. Oberflächenimmobilisierte
Metallionen als die Affinitäts-Capture-Vorrichtung
-
- 1. Cu(II)-Ion wird cheliert durch Iminodiacetat (IDA)-Gruppe,
kovalent angeheftet an entweder poröse Agarosekügelchen (Chelating Sepharose Fast
Flow, Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, Ligandendichte 22–30 μmol/ml Gel)
oder an feste Kieselgelkügelchen
(Chelating TSK-SW, ToyoSoda, Japan), Ligandendichte 15–20 μmol/Gel).
Eine Mischung synthetischer Peptide enthaltend Neurotensin (1655
Da), spermienaktivierendes Peptid (933 Da) und Angiotensin 1 (1296,5
Da) wird bei 23°C
für 10
Minuten mit 50 μl Packungsvolumen
von TSK-SW-IDA-Cu(II) bei pH 7,0 (20 mM Natriumphosphat, 0,5 M Natriumchlorid)
gemischt. Das Gel wird durch Zentrifugation von der übrigen Peptidlösung abgetrennt
und wird dann mit 200 μl
Natriumphosphat, Natriumchlorid-Puffer, pH 7,0, dreimal gewaschen,
um unspezifisch gebundene Peptide zu entfernen. Schließlich wird
das Gel in 50 μl
Wasser suspendiert. Aliquots von 2 μl Gelsuspension und nicht adsorbierte
Peptidlösung
werden mit 1 μl
Sinapinsäure
(gelöst
in Methanol) gemischt und auf eine Sondenspitze aus rostfreiem Edelstahl
aufgetragen und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
analysiert. Nach dem Erhalten von fünf Spektren (durchschnittlich
100 Laserschüsse
pro Spektrum) an verschiedenen Stellen auf der Sondenspitze wird
die Sinapinsäure
mit Methanol entfernt. Ein Aliquot von 2 μl 20 mM CuSO4 wird
zugegeben, dann mit 1 μl
Sinapinsäure
gemischt und nochmals durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
analysiert. Nach dem Erhalten von fünf weiteren Spektren (durchschnittlich
100 Laserschüsse
pro Spektrum) an verschiedenen Stellen auf der Sondenspitze wird
die Sinapinsäure
mit Methanol entfernt. Das verbleibende, an die IDA-Cu(II)-Kügelchen
adsorbierte Peptid wird dann mit 1 μl Trypsin (Sigma) in 0,1 M Natriumbicarbonat,
pH 8,0 bei 23°C
10 Minuten lang in einer feuchten Kammer verdaut. Die Gelkügelchen
werden dann mit Wasser gewaschen, um Enzym und Salz zu entfernen, bevor
1 μl Sinapinsäure zugegeben
und die Probe durch Laserdesorptions-Flugzeit- Massenspektrometrie analysiert wird. 5A zeigt die molekularen
Ionen (und die vielfachen Na-Addukte) von spermienaktivierendem
Faktor (933 Da) und Neurotensin (1655 Da) in der verbleibenden Peptidlösung, die
nicht von dem IDA-Cu(II) adsorbiert wurde. Es gab keine signifikante
Spitze, die Angiotensin 1 (1296,5 Da) entspricht. Das Massenspektrum
in 5B zeigt die Peaks
von Angiotensin 1 plus Na-Addukt, die selektiv auf dem IDA-Cu(II)-Gel
adsorbiert wurden. Wird das IDA-Cu(II)-Gel noch zweimal mit 500 μl Wasser gewaschen,
zeigt das resultierende Massenspektrum nur das ursprüngliche
Angiotensin I-Ion
und keine anderen Adduktspitzen (5 und 6, Profil C). 6D zeigt die Kupferbindung
(1 und 2 Cu) in situ durch das Angiotensinpeptid. 6E zeigt den Trypsinverdau in situ des
Angiotensinpeptids an der einzigen Arg2-Position in der Sequenz.
Dieses
Beispiel veranschaulicht, dass: a) Laserdesorption auf Analyt, der
auf oberflächenimmobilisiertem
Metallion affinitätsadsorbiert
ist, erfolgreich durchgeführt
wurde; b) die Oberfläche
nach der Bindung mit unterschiedlichen Lösungsmitteln gewaschen wird,
um alle verunreinigenden Verbindungen in der Probe zu entfernen
und ein sehr sauberes Massenspektrum des Analyten zu ergeben; c)
die Affinitäts-Capture-Vorrichtung
nur den Analyten mit definierter Struktur auswählt (in diesem Fall wird Angiotensin
1 durch IDA-Cu(II) selektiv aus der Peptidmischung adsorbiert, da
dieses Peptid eine freie N-terminale Aminosäure und zwei Histidinaminosäureresten
in der Sequenz hat und beide Eigenschaften für eine starke Cu(II)-Bindung
erforderlich sind); d) auf dem adsorbierten Analyten Struktur- und
Funktionsanalysen durch sequenzielle, chemische oder enzymatische
Modifikationen in situ mit minimalem Verlust in jeder Schritt der
Reaktion und in jedem Waschschritt durchgeführt wurden; und e) ein Sondenelement
mit oberflächengebundenem Substrat
(z. B. Angiotensin 1) verwendet wird, um spezifische Enzymaktivität (z. B.
Trypsin) in situ (z. B. im Magen-Darm-Trakt des menschlichen Körpers) zu überwachen.
- 2. Eine Lösung
von Pferdeherzmyoglobin (325 pmol, 16.952 Da) wird mit 50 μl TSK-SW-IDA-Cu(II)
bei pH 7,0 (20 mM Natriumphosphat, 0,5 M Natriumchlorid) bei 23°C für 10 Minuten
gemischt. Das Gel wird durch Zentrifugation von der Lösung getrennt
und dann zweimal mit 500 μl
Puffer und zweimal mit 500 μl
Wasser gewaschen. Die Menge an verbleibendem Myoglobin in all diesen
Lösungen
wird dann spektrophotometrisch geschätzt, dann kann die an dem Gel
adsorbierte Menge berechnet werden. Das Gel wird in 50 μl Wasser suspendiert
und dann seriell in Wasser verdünnt.
Ein Aliquot von 0,5 μl
der verdünnten
Gellösung
wird dann mit 1 μl
Sinapinsäure
(gelöst
in 30% Methanol, 0,1% Trifluoressigsäure) gemischt und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
analysiert. 7 zeigt,
dass mit einer berechneten Quantität von 4 bis 8 fmol abgeschieden
auf der Sondenspitze ein nachweisbares Signal (Signal/Rauschen =
6, nach durchschnittlich 50 Laserschüssen) von Myoglobin erhalten
wird.
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass affinitätsadsorbierte
Analyte auf einer Oberfläche
viel einfacher zu übertragen
sind und frei von jeglichem Verlust durch unspezifische Adsorption
an Oberflächen
des Behältnisses
und von Transfervorrichtungen sind. Der adsorbierte Analyt wird
auf vorbestimmten Bereichen (die noch kleiner sind als die Laserpunktgröße) auf
der probenpräsentierenden
Oberfläche
in geringen (atto- bis femtomol) Quantitäten bei einer definierten Oberflächendichte
oder lokalen Konzentration abgesondert, die für einen wirksamen Nachweis
durch Laserdesorptions-/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie
erforderlich sind.
- 3. Die menschlichen β-Casein-Peptide
(E2-K18) sind auf einem Peptidsynthesizer Modell 430A von Applied
Biosystems anhand des NMP-HOBt-Protokolls
synthetisiert. Die zu phosphorylierenden Ser-Reste sind an die Peptidkette ohne
Seitenketten-Schutzgruppen gekoppelt. Die ungeschützten Ser-Reste
werden zunächst
mit di-t-Butyl-N,N,-Diisopropylphosphoramidit phosphinyliert. Der
Phosphitester wird dann mit t-Butylperoxid oxidiert, gewaschen und
vom Harz abgespalten. Alle Seitenketten-Schutzgruppen werden mit
95%iger Trifluoressigsäure
entfernt. Die ungereinigten Phosphopeptide werden mit Methyl-t-Butyläther extrahiert
und getrocknet. Diese ungereinigte Präparation von synthetischen Phosphopeptiden
wird in 50 mM MES, 0,15 M Natriumchlorid, pH 6,5, gelöst und mit
50 μl Tris
(Carboxymethyl)-Ethylendiamin (TED)-Fe(III), immobilisiert an poröser Sepharose
(synthetisiert wie beschrieben von Yip, T. -T. und Hutchens, T.
W., Protein expression and Purification 2: 355–362 (1991), Ligandendichte
65 μmol/ml),
bei 23°C
15 Minuten lang gemischt. Das Gel wird dann mit 500 μl desselben
Puffers dreimal gewaschen und dann einmal mit 500 μl Wasser.
Ein Aliquot von 1 μl
Gel wird mit 1 μl
Sinapinsäure
(gelöst
in 30% Methanol, 0,1% Trifluoressigsäure) auf der Sondenspitze gemischt
und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
analysiert. Nach dem Erhalten von fünf Spektren (durchschnittlich
100 Laserschüsse
pro Spektrum) an verschiedenen Stellen auf der Sondenspitze wird die
Sinapinsäure
mit Methanol entfernt und die verbleibenden, an TED-Fe(III) adsorbierten
Phosphopeptide direkt auf der Sondenspitze mit 1 μl alkalischer
Phosphatase (Ammoniumsulfatsuspension, Sigma) in 50 mM HEPES pH
7,0 bei 23°C
10 Minuten lang in einer feuchten Kammer verdaut. Das Gel wird mit
Wasser gewaschen, um Enzym und Salz zu entfernen. Es wird Sinapinsäure zugegeben
und die Probe wird nochmals durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. 8 (oberes Profil) zeigt
die Verteilung von Caseinpeptid (1934 Da) mit mehreren phosphorylierten
Formen. Nach dem in situ-Verdau mit alkalischer Phosphatase bleiben
nur die ursprünglichen,
nicht phosphorylierten Formen übrig
(unteres Profil).
Die Beispiele veranschaulichen die Anwendung von
SEAC für
die Schnellüberwachung
der Phosphoproteinsynthese in einer ungereinigten Mischung ohne
vorherige Rufreinigung. Die Identität des Phosphopeptids wird sofort
durch in situ-Verdau mit alkalischer Phosphatase bestätigt.
- 4. Aliquots von 100 μl
von Kindernahrung für Frühgeborene
(SIMILAC, Meade Johnson) und der Mageninhalt von frühgeborenen
Kindern, der 90 Minuten nach Fütterung
der Kindernahrung aspiriert wurde, werden mit 50 μl TED-Fe(III)-Sepharose
in 0,1 M MES, 0,15 M Natriumchlorid, pH 6,5 bei 23°C 15 Minuten
lang gemischt. Das Gel wird mit 500 μl desselben Puffers dreimal
gewaschen und dann einmal mit 500 μl Wasser. Aliquots von 1 μl Gelsuspension
oder Kindernahrung für
Frühgeborene
oder Magenaspirat werden mit 2 μl
Sinapinsäure
(gelöst
in 50% Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure) auf der Sondenspitze gemischt
und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
analysiert. 9 zeigt,
dass das Massenspektrum von Gesamtmagenaspirat (zweites Profil von
oben) dem der Gesamtkindernahrung für Frühgeborene (unteres Profil)
in der 1.000 – 15.000
Da-Region sehr ähnlich
ist. Die Massenspektren von Analyten, die aus den beiden Proben
selektiv an TED-Fe(III) adsorbiert wurden, sind allerdings sehr
unterschiedlich, aufgrund des proteolytischen Verdaus von in der
Kindernahrung vorhandenen Phosphoproteinen im Magen gibt es mehr
Phosphopeptide mit niederem Molekulargewicht (d. h. gebunden an
TED-Fe(III)) in
dem Magenaspirat (oberes Profil) als in der Kindernahrung (zweites
Profil von unten).
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass SEAC
besonders nützlich
ist für
das Analysieren von spezifischen Analyten in biologischen Proben.
Phosphopeptide sind in Anwesenheit anderer verunreinigender Bestandteile
in einer komplexen Probe schwieriger nachzuweisert, da sie im positiven
Ionenmodus schwächer
ionisiert sind. Werden jedoch die Phosphopeptide selektiv adsorbiert
und alle anderen Bestandteile aus der Probe entfernt, so tritt keine
Signalunterdrückung
auf.
- 5. Aliquots von 200 μl
von menschlichem und bovinem histidinreichem Glykoprotein werden
mit 50 μl
IDA-Cu(II)-Sepharose (Pharmacia) bei pH 7,0 (20 mM Natriumphosphat,
0,5 M Natriumchlorid) bei 23°C
10 Minuten lang gemischt. Das Gel wird zweimal mit 500 μl Puffer
und einmal mit 500 μl Wasser
gewaschen. Aliquots von 1 μl
Gel werden mit 2 μl
Sinapinsäure
(gelöst
in 30% Methanol, 0,1% Trifluoressigsäure) gemischt und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert.
Nach dem Erhalten von fünf
Spektren (durchschnittlich 100 Laserschüsse pro Spektrum) an verschiedenen
Stellen auf der Sondenspitze wird die Sinapinsäure durch Waschen mit Methanol
entfernt. Die verbleibenden, an IDA-Cu(II)-Gel adsorbierte Glykoproteine
werden mit N-Glykanase
in 20 mM Natriumphosphat, 0,5 M Natriumchlorid, 3 M Harnstoff, pH
7,0 bei 37°C über Nacht
in einer feuchten Kammer verdaut. Nach dem Waschen mit Wasser, um
Enzym und Salz zu entfernen, werden 2 μl Sinapinsäure zugegeben und die Probe
wird durch Massenspektrometrie analysiert. Nach dem Erhalten von
fünf Spektren
(durchschnittlich 100 Laserschüsse
pro Spektrum) an verschiedenen Stellen auf der Sondenspitze wird
die Sinapinsäure
mit Methanol entfernt. Es werden Aliquots von 2 μl Trypsin in 0,1 M Natriumbicarbonat
zugegeben und bei 37°C
30 Minuten lang in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach dem Waschen
mit Wasser, um Enzym und Salz zu entfernen, wird Sinapinsäure zugegeben und
die Probe wird durch Massenspektrometrie analysiert. Nach dem Erhalten
von fünf
Spektren (durchschnittlich 100 Laserschüsse pro Spektrum) an verschiedenen
Stellen auf der Sondenspitze wird die Sinapinsäure mit Methanol entfernt.
Es werden Aliquots von 2 μl
20 mM CuSO4 zugegeben. Dies ist gefolgt
von Zugabe von 2 μl Sinapinsäure und
daraufhin von Analysieren durch Massenspektrometrie. Nach dem Erhalten von
fünf Spektren
(durchschnittlich 100 Laserschüsse
pro Spektrum) an verschiedenen Stellen auf der Sondenspitze wird
die Sinapinsäure
mit Methanol entfernt. Es werden Aliquots von 2 μl Diethylpyrocarbonat (Sigma)
in 5 mM HEPES, pH 6,5, zugegeben und bei 23°C 30 Minuten lang inkubiert.
Nach dem Waschen mit Wasser, um Chemikalien und Puffersalze zu entfernen,
wird 2 μl Sinapinsäure zugegeben
und die Probe durch Massenspektrometrie analysiert. Um eine partielle
Sequenz der metallbindenden Peptide zu erhalten, anstatt die Histidinreste
mit Diethylpyrocarbonat zu modifizieren, wird 1 μl Carboxypeptidase Y (Boehringer
Mannheim) zu dem an der Oberfläche
adsorbierten, tryptischen Verdau gegeben und bei Raumtemperatur
in einer feuchten Kammer 5 Minuten lang inkubiert. Enzym und Salz werden
mit Wasser weggewaschen, 1 μl
Sinapinsäure
zugegeben und durch Massenspektrometrie analysiert. 10A zeigt die Verbundmassenspektren von
menschlichem und bovinem histidinreichem Glykoprotein adsorbiert
an IDA-Cu(II)-Sepharose vor und nach Verdau mit N-Glykanase. Die
Massenverschiebungen stellen die Entfernung von Kohlenhydrat von
den entsprechenden Glykoproteinen dar. 10B zeigt die Verbundmassenspektren von
trypsinverdauten Peptiden von den deglykosylierten Proteinen der
beiden Arten (oberes Profil für
menschliches Protein, zweites Profil von unten für bovines Protein) und die
Cu(II)-Bindung in situ der trypsinverdauten Peptide der beiden Arten
(zweites Profil von oben für
menschliches Protein, unterstes Profil für bovines Protein, die Zahlen
1, 2 zeigen die Zahl des gebundenen Kupfers an). 10C zeigt, dass ein solches Cu(II)-bindendes
Peptid (unteres Profil) mindestens 4 His-Reste hat, die durch Diethylpyrocarbonat
spezifisch modifiziert sind, um 4-N-Carbethoxyhistidyladdukte (1–4, oberes
Profil) zu bilden. 10D zeigt
die partielle C-terminale Sequenz des hauptsächlichen Cu-bindenden Peptids
in dem bovinen, histidinreichen Glykoprotein. Dieses Beispiel veranschaulicht
die effektive Nutzung von SEAC, um die Struktur und Funktion von
metallbindenden Domänen
von Proteinen unterschiedlicher Arten zu untersuchen.
-
II. Oberflächenimmobilisierter
Antikörper
als die Affinitäts-Capture-Vorrichtung
-
- 1. Polyklonaler Kaninchen-Anti-Human-Laktoferrin-Antikörper wird
passend gegen gereinigtes menschliches Laktoferrin von Bethyl Laboratories (Montgomen,
TX) erzeugt. Der Antikörper
wird durch thiophile Adsorption und immobilisierte Laktoferrinsäulen affinitätsgereinigt.
Schaf-Anti-Kaninchen-IgG, kovalent gebunden an Magnetkügelchen,
stammen von Dynal AS, Oslo, Norwegen (superparamagnetische Polystyrenkügelchen
mit einheitlich 2,8 um Durchmesser, Ligandendichte 10 μg Schaf-IgG
pro mg Kügelchen).
-
Menschliches Laktoferrin (1 nmol, 59Fe-markiert, 81.100 Da) wird mit Kaninchen-Anti-Human-Laktoferrinantikörper in
20 mM Natriumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,0 bei 37°C 30 Minuten
lang inkubiert. Danach werden 40 μl
Schaf-Anti-Kaninchen-IgG auf Dynabeads (6–7 × 108 Kügelchen/ml)
zugegeben und bei 37°C
30 Minuten lang inkubiert. Die Kügelchen
werden dreimal mit 500 μl Natriumphosphatpuffer
und zweimal mit 500 μl
Wasser gewaschen. Die abschließende
Menge an menschlichem Laktoferrin, das an den Komplex gebunden ist,
wird auf 4 pmol geschätzt.
Etwa ein Zehntel der Kügelchen
wird auf eine TeflonTM-beschichtete, magnetische
Sondenspitze übertragen,
mit 2 μl Sinapinsäure (gelöst in 30%
Methanol, 0,1% Trifluoressigsäure)
gemischt und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. 11 zeigt die Anwesenheit
von Laktoferrin (81.143 Da) in dem Komplex aus Antigen, primärem Antikörper und
sekundärem
Antikörper
(oberes Profil), wobei die Kontrolle aus primärem Antikörper und sekundärem Antikörper (unteres
Profil) nur das Kaninchenantikörpersignal
(149.000 Da für
einmal geladene und 74.500 Da für
doppelt geladene) zeigt.
-
Dieses Beispiel veranschaulicht,
a) dass Laserdesorption erfolgreich auf einem Analyt durchgeführt wurde,
der auf oberflächenimmobilisiertem
Antikörper
affinitätsadsorbiert
ist (wenn das Analytsignal in einer Mischung eines Komplexes aus
primärem Antikörper und
Analyt eindeutig identifiziert wird, wird in diesem Verfahren des
Identifizierens des Analyten jede Capture-Vorrichtung, z. B. oberflächenimmobilisierter
sekundärer
Antikörper,
Protein A, Protein G, Streptavidin, des primären Antikörpers verwendet; b) das Prinzip
der Proteinentdeckung über
spezifische molekulare Erkennungsereignisse, wo einer der Analyten
durch seine Assoziation mit dem primären Ziel des Capture nachgewiesen
wird; und c) die Verwendung von magnetischer Oberfläche als
effiziente Capture-Vorrichtung.
- 2. Affinitätsgereinigtes
Kaninchen-Anti-Human-Laktoferrin ist über Glutaraldehyd kovalent an
die Spitze eines aktivierten Nylonsondenelements (Durchmesser 2
mm) gebunden. Dieses wird in 1 ml Harn eines frühgeborenen Kindes, pH 7,0,
enthaltend 350 fmol menschliches Laktoferrin, untergetaucht und
für 15
Stunden bei 4–8°C gerührt. Das
Nylonsondenelement wird heraus genommen und dreimal mit 1 ml 20
mM Natriumphosphat, 0,5 M Natriumchlorid, 3 M Harnstoff, pH 7,0,
und zweimal in 1 ml Wasser gewaschen.
-
Ein Aliquot von 2 μl Sinapinsäure (gelöst in 30%
Methanol, 0,1 Trifluoressigsäure)
wird zugegeben und die Probe durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
analysiert. 12 zeigt das
molekulare Ion von menschlichem Laktoferrin (Signal/Rauschen = 2,5,
durchschnittlich 25 Laserschüsse)
im Massenspektrum. 13 zeigt
das äquivalente
Massenspektrum von komplettem Harn eines frühgeborenen Kindes enthaltend
1 nmol/ml Laktoferrin; die durch Anwesenheit anderer Bestandteile
in der Harnprobe verursachte Signalunterdrückung ist so stark, dass selbst
die Zugabe von einem mehrtausendfachen Überschuss über 350 fmol/ml Laktoferrin,
wie für 12 beschrieben, nicht nachgewiesen
werden kann.
-
Dieses Beispiel veranschaulicht die
Verwendung einer SEAC-Vorrichtung auf einer flachen Oberfläche (einer
zweidimensionalen Konfiguration) eines flexiblen Sondenelements.
Diese SEAC-Vorrichtung kann verwendet werden, um Zielanalytmaterialien aus
undifferenzierten biologischen Proben, wie beispielsweise Blut,
Tränen,
Harn, Speichel, gastrointestinalen Flüssigkeiten, Spinatflüssigkeit,
amniotische Flüssigkeit,
Knochenmark, Bakterien, Viren, Zellen in Kultur, Biopsiegewebe,
Pflanzengewebe oder -flüssigkeiten,
Insektengewebe oder -flüssigkeiten,
etc., zu isolieren. Der spezifische Affinitätsadsorptionsschritt reinigte
den Analyten von Verunreinigungen durch andere Bestandteile in einer
komplexen Probe und überwand
daher den Signalunterdrückungseffekt,
besonders dann, wenn der Analyt in sehr geringer Konzentration (femtomol/ml)
vorliegt.
- 3. Weitere Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit
durch die SEAC-Technik wird durch Amplifikation eines an den Analyten
gebundenen Mackers erreicht. Eine Art, dies zu erreichen, ist durch
Kombination von Enzymkatalyse und dem Streptavidin-Biotin-System.
Nach dem Fangen (Capturing) winziger Mengen Laktoferrin auf einem
Nylonsondenelement, wie in Beispiel 3.11.2. beschrieben, wird biotinylierten
Anti-Laktoferrin-Antikörper
oder biotinylierte, einzelsträngige DNA
verwendet, um spezifisch an das Laktoferrin zu binden. Dann wird
Streptavidin zugegeben, um spezifisch an den biotinylierten Marken
zu binden. Schließlich
wird biotinylierte alkalische Phosphatase zugegeben, um spezifisch
an das Streptavidin zu binden. Da mehrere solcher biotinylierten alkalischen
Phosphatase-Moleküle
an ein Streptavidin binden können,
gibt es eine primäre
Amplifikationsstufe. Die zweite Amplifikationsstufe wird durch die
Enzymkatalyse erreicht, in der das Enzym eine Umsatzzahl von 102–103 min–1 erreichen kann. Durch
Verwendung eines phosphonlierten Substrates mit niedrigem Molekulargewicht wie
z. B. ATP, NADPH oder ein Phosphopeptid kann ein Test der Enzymaktivität der alkalischen Phosphatase
leicht durchgeführt
werden. Die Effizienz des Nachweises der Massenverschiebung eines
Analyten mit niedrigem Molekulargewicht ist viel höher als
die eines Glykoproteins mit 80 kDa.
- 4. Die ultimative Verbesserung des Nachweises wird derzeit erreicht
durch die auf dem Polymerasekettenreaktionsprinzip beruhenden Amplifikationen.
Nach dem Fangen (Capturing) winziger Mengen Laktoferrin auf einem
Nylonsondenelement, wie in Beispiel 3.11.2. beschrieben, wird biotinylierter
Anti-Laktoferrin-Antikörper oder
biotinylierte, einzelsträngige
DNA verwendet, um spezifisch an das Laktoferrin zu binden. Dann
wird Streptavidin zugegeben, um spezifisch an den biotinylierten
Marken zu binden. Schließlich
wird ein Stück
biotinylierte, lineare DNA zugegeben, um an das Streptavidin zu
binden. Diese gebundene DNA wird in einem Polymerasekettenreaktionsvorgang
mit 30 Zyklen amplifiziert. Jeder Zyklus besteht aus einem 1-minütigen Denaturierungsschritt
bei 94°C,
einer 1-minütigen
Anheftungsreaktion bei 58°C
und einer 1-minütigen
Primerverlängerungsreaktion
bei 72°C.
Diese Technik bietet Amplifikationsfaktoren im Bereich des 106-Fachen. Die amplifizierte DNA wird direkt
durch Laserdesorptions-Massenspektrometrie nachgewiesen, wobei 3-OH-Picolinsäure als
die Matrix verwendet wird.
- 5. Polyklonaler, gegen bovines histidinreiches Glykoprotein
gerichteter Antikörper
wird passend gegen gereinigtes bovines bovines histidinreiches Glykoprotein
von Bethyl Laboratories (Montgomery, TX) erzeugt. Der Antikörper wird
durch thiophile Adsorption und Säulen
mit immobilisiertem bovinem histidinreichem Glykoprotein affinitätsgereinigt.
Der gereinigte Antikörper
wird auf AffiGel 10 gemäß den Anweisungen
des Herstellers immobilisiert (BioRad Laboratories, Hercules, CA,
Ligandendichte 15 μmol/ml
Gel). Ein Aliquot von 200 μl bovinem
Kolostrum wird mit 200 μl
20 nM Natriumphosphat, pH 7,0 verdünnt und mit 50 μl immobilisiertem
Antikörper
bei 23°C
30 Minuten lang gemischt. Das Gel wird dreimal mit 500 μl 20 mM Natriumphosphat,
0,5 M Natriumchlorid, 3 M Harnstoff, pH 7,0, und zweimal mit 500 μl Wasser gewaschen.
Ein Aliquot von 1 μl
des gewaschenen Gels wird mit 2 μl
Sinapinsäure
(gelöst
in 30% Methanol, 0,1% Trifluoressigsäure) auf der Sondenspitze gemischt
und durch Laserdesorptions-Massenspektrometrie analysiert. 14 zeigt das Verbundmassenspektrum
von gereinigtem bovinem histidinreichem Glykoprotein (unteres Profil)
und Proteine, die aus bovinem Kolostrum aftinitätsadsorbiert wurden (oberes
Profil). Das Ergebnis zeigt das Vorhandensein von intaktem, histidinreichem
Glykoprotein und seiner größten, proteolytischen
Fragmente in bovinem Kolostrum an.
Dieses Beispiel veranschaulicht
die effektive Verwendung von SEAC als eine schnelle und einfache
Technik zum Nachweisen und Charakterisieren neuer Proteine in einer
kleinen Menge biologischer Flüssigkeit.
Dieses Ergebnis unterstützt
die anfänglichen
Befunde, die mit der sehr arbeitsintensiven Technik des Immunblottens
der Polyacrylamidgelelektrophorese erhalten wurden.
- 6. Antikörperepitopmapping
wird mit der SEAC-Technik leicht erreicht. Drei unterschiedliche
Quellen von Anti-Human-follikelstimulierendes-Hormon (ein polyklonaler
Antikörper
spezifisch gegen beta-FSH von Chemicon International, Temecula,
CA, ein monoklonaler Antikörper spezifisch
gegen Beta-3-Epitop von Serotec, Indianapolis, IN, ein monoklonaler
Antikörper
von Biodesign, Kennebunk, ME) werden auf AftiGel 10 entsprechend
den Anweisungen des Herstellers immobilisiert. Diese immobilisierten
Antikörper werden
alle getestet, um das follikelstimulierende Hormon spezifisch zu
binden, indem sie mit zwei unterschiedlichen Präparationen von follikelstimulierendem
Hormon (eine halb reine Präparation von
Chemicon und eine ungereinigte Präparation von Accurate Chemical
and Scientific Corp.) inkubiert und dann in Anwesenheit von Sinapinsäure durch
Massenspektrometrie analysiert wurden. Dann wurde die halb reine
Präparation
von menschlichem FSH (Chemicon) mit Trypsin verdaut und gesonderte
Aliquots (7 μl)
werden mit den immobilisierten Antikörpern (10 μl einer 1 : 1 Gelsuspension)
in phosphatgepufferter Salzlösung
bei 4°C
2 Stunden lang umgesetzt. Nach Waschen mit phosphatgepufferter Salzlösung und Wasser
werden die adsorbierten Proteine in Anwesenheit von Sinapinsäure durch
Laserdesorptions-Massenspektrometrie analysiert. 15 zeigt die Verbundmassenspektren der
Peptide von follikelstimulierendem Hormon, die von den unterschiedlichen
Antikörpern
erkannt wurden. Die beiden monoklonalen Antikörper erkannten eindeutig unterschiedliche
Epitope, während
die polyklonalen Antikörper
viele Epitope erkannten, die bei denen, die von den beiden monoklonalen Antikörpern erkannt
werden, häufig
vorkommen.
-
III. Oberflächenimmobilisierte
Nukleinsäure
als die Aftinitäts-Capture-Vorrichtung
-
- 1. Einzelsträngige DNA immobilisiert auf
4% Agarosekügelchen
stammen von GIBCO BRL (Gaithersburg, MD, Ligandendichte 0,5 – 1,0 mg DNA/ml
Gel). Ein Aliquot von 125I-Humanlaktoferrin
(äquivalent
zu 49 nmol) wird mit 100 μl
irrmobilisierter einzelsträngiger
DNA in 20 mM HEPES, pH 7,0, bei Raumtemperatur 10 Minuten lang gemischt.
Das Gel wird fünfmal
mit 500 μl
HEPES-Puffer gewaschen und dann in einem gleichen Volumen Wasser
suspendiert. Die Menge an pro Kügelchen
gebundenem Laktoferrin wird auf 62 fmol geschätzt, indem die Radioaktivität bestimmt
und die Anzahl von Kügelchen
pro Einheitsvolumen gezählt
wird. Eine unterschiedliche Anzahl von Kügelchen (zwischen 1 und 12)
werden auf Sondenspitzen mit einem Durchmesser von 0,5 mm abgeschieden,
mit 0,2 μl
Sinapinsäure
(gelöst
in 30% Methanol, 0,1% Trifluoressigsäure) gemischt und durch Laserdesorptions-Massenspektrometrie
analysiert. 16 zeigt
das Massenspektrum von Laktoferrin, das auf einem einzelnen Kügelchen
einzelsträngiger DNA-Agarose
affinitätsadsorbiert
wurde. Dies ist ein repräsentierendes
Spektrum aus insgesamt fünf
(durchschnittlich 100 Laserschüsse
pro Spektrum), die von einem einzelnen Kügelchen erhalten wurden.
Dieses
Beispiel veranschaulicht, dass Laserdesorption erfolgreich auf einem
auf oberflächenimmobilisiertem
Biopolymer, wie z. B. Nukleinsäure, affinitätsadsorbiertem
Analyten durchgeführt
wurde. Die Spezifität
der Wechselwirkung zwischen Humanlaktoferrin und DNA wurde dokumentiert und
effektiv ausgenutzt, indem winzige Mengen von Laktoferrin aus Harn
von frühgeborenen
Kindern gefangen wurden. In diesem Fall erhöht die Kombination der Effizienz
des Übertragens
der Laktoferrin-Affinitäts-Capture-Vorrichtung mit der Empfindlichkeit
der Laserdesorptions-Massenspektrometrie die Nachweisempfindlichkeit
erheblich.
- 2. Ein Aliquot von 1 ml Harn von frühgeborenen Kindern enthaltend
30 pmol 59Fe-Humanlaktoferrin wird mit 20 μl einzelsträngiger DNA-Agarose
in 0,1 M HEPES, pH 7,4, bei 23°C
15 Minuten lang gemischt. Das Gel wird zweimal mit 500 μl HEPES-Puffer
und zweimal mit 500 μl
Wasser gewaschen. Das Gel wird in einem gleichen Volumen von Wasser
suspendiert und 1 μl
der Suspension (enthaltend nicht mehr als 350 fmol adsorbiertes Laktoferrin,
wie bestimmt durch Radioaktivität) wird
mit 1 μl
Sinapinsäure
(gelöst
in 30% Methanol, 0,1% Trifluoressigsäure) auf einer Sondenspitze
gemischt und durch Laserdesorptions-Massenspektrometrie analysiert. 17 zeigt das Massenspektrum
von Laktoferrin, das mit oberflächenimmobilisierter
DNA als der Affinitäts-Capture-Vorrichtung
aus Harn extrahiert wurde.
-
Dieses Beispiel veranschaulicht die
Wirksamkeit und Empfindlichkeit des Nachweisens winziger Mengen
von Analyt mit hohem Molekulargewicht in biologischer Flüssigkeit
mit der DNA-Capture-Vorrichtung.
-
IV. Oberflächenimmobilisierte,
unterschiedliche Biomoleküle
als die Affinitäts-Capture-Vorrichtung
-
- 1. Sojabohnentrypsininhibitor (Sigma) wird
auf AffiGel10 (BioRad) entsprechend den Anweisungen des Herstellers
immobilisiert. Ein Aliquot von 100 μl menschlichem Duodenalaspirat
wird mit 50 μl
oberflächenimmobilisiertem
Sojabohnentnpsininhibitor bei pH 7,0 (20 mM Natriumphosphat, 0,5 M
Natriumchlorid) bei 23°C
15 Minuten lang gemischt. Das Gel wird dann dreimal mit 500 μl Phosphatpuffer
und zweimal mit 500 μl
Wasser gewaschen. Aliquots von 1 μl
Gelsuspension oder ursprünglichem
Duodenalaspirat werden mit 2 μl Sinapinsäure (gelöst in 50%
Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure)
gemischt und durch Laserdesorptions-Massenspektrometrie analysiert. 18A zeigt das Verbundmassenspektrum
des gesamten Duodenalaspirats (unteres Profil) und der auf dem oberflächenimmobilisierten
Sojabohnentnpsininhibitor adsorbierten Proteine (oberes Profil).
Die Hauptspitze der durch Affinität gefangenen Probe repräsentiert
Trypsin. Ähnliche
Ergebnisse werden mit nur 1 μl
Duodenalflüssigkeit erhalten,
die a) auf der Spitze eines Nylonsondenelements, über Glutaraldehyd
an Sojabohnentnpsininhibitor gekoppelt, und b) auf der Spitze eines
acrylischen Sondenelements beschichtet mit Polyacrylamid über entweder
Glutaraldehyd oder Divinylsulfon gekoppelt an Sojabohnentnpsininhibitor,
abgeschieden wird (18B).
Diese
Ergebnisse zeigen a) die Eindeutigkeit beim Nachweisen und Charakterisieren
eines spezifischen Analyten in biologischen Flüssigkeiten und b) die einfache
Möglichkeit
der Probengewinnung in situ durch Einführen eines flexiblen (z. B.
aus Nylon bestehenden) Sondenelements durch ein Endoskop direkt
in den menschlichen Körper
(z. B. in den Dünndarm)
für diagnostische Zwecke.
- 2. An Dynabeads (superparamagnetische Polystyrenkügelchen
mit einheitlich 2,8 μm
Durchmesser) immobilisiertes Streptavidin stammt von Dynal, AS,
Oslo, Norwegen. Aliquots von 150 μl menschlichem
Plasma oder Harn enthaltend 18 pmol biotinyliertes Insulin (Sigma)
werden mit 20 μl
einer Suspension von Streptavidin-Dynabeads bei pH 7,0 (20 mM Natriumphosphat,
0,5 M Natriumchlorid) bei 23°C
10 Minuten lang gemischt. Die Kügelchen
werden dann dreimal mit 500 μl Puffer
enthaltend 3 M Harnstoff und einmal mit 500 μl Wasser gewaschen. Aliquots
von 0,5 μl
der Kügelchensuspension
werden mit 2 μl
Sinapinsäure
(gelöst
in 30% Methanol, 0,1% Trifluoressigsäure) gemischt und durch Laserdesorptions-Massenspektrometrie
analysiert. 19A zeigt
das Massenspektrum von aus Harn affinitätsadsorbiertem, biotinyliertem
Insulin. Die verschiedenen Spitzen repräsentieren Insulinderivate mit
einer bis drei Biotingruppen. 19B zeigt das
Massenspektrum von aus Plasma affinitätsadsorbiertem, biotinyliertem
Insulin.
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass Laserdesorption
auf einem über
die Biotin-Streptavidin-Bindung adsorbierten Analyten durchgeführt wurde.
Angesichts der festen Bindung zwischen Biotin und Avidin (Ka = 1015 M–1) dient dieses System
als eine ideale SEAC-Vorrichtung für Proteine und Nukleinsäuren auf
einer Sondenoberfläche, auf
der sequenzielle chemische und enzymatische Modifikationen in situ
durchgeführt
werden.
- 3. DNA-Bindungsdomäne
des menschlichen Östrogenrezeptors
(84 Reste) wird in Bakterien exprimiert. Der Plasmidexpressionsvektor
pT7ERDBD (J. Schwabe, MRC Laboraton of Molecular
Biology, Cambridge, England) wird in BL21(DE3)plyS-E.coli-Zellen
(Novagene) transformiert. Expression der DNA-Bindungsdomäne wird induziert durch 1 mM
Isopropylthiogalaktosid (GIBCO BRL) und die Bakterien werden nach 3-stündiger Induktion
geerntet. Ganze, induzierte Bakterien werden dann direkt durch matrixunterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie
analysiert, um zu verifizieren, dass die DNA-Bindungsdomäne das hauptsächliche
synthetisierte Peptid ist. Das Peptid wird durch Umkehrphasen-HPLC
aus dem Bakterienlysat gereinigt und auf AffiGel 10 (BioRad) immobilisiert.
Eine DNA-Sequenz mit 30 by enthaltend das Östrogen-Response-Element wird von
Genosys (Houston, TX) synthetisiert. Die Wechselwirkung von oberflächenaffinitätsadsorbierten
Apoformen, Zn- und Cu-gebundenen Formen der DNA-Bindungsdomäne mit sequenzspezifischer
Nukleinsäure
(Östrogen-Response-Element)
werden auf Glassondenelementen unter Verwendung von 3-Hydroxypicolinsäure als
die Matrix untersucht.
Dieses Beispiel veranschaulicht die
Verwendung von funktionellen Proteinoberflächendomänen als Capture-Vorrichtung
für SEAC.
Es kann der Effekt der Metallbindung auf Struktur und Funktion solcher
Proteinoberflächendomänen untersucht
werden.
- 4. Es werden unterschiedliche Aliquots von an Oberflächen (z.
B. Con-A-Sepharose,
Weizenkeimlektin-Sepharose, Pharmacia) immobilisierten Lektinen
verwendet, um die Glykopeptide in tryptischen Verdaus von menschlichem
und bovinem histidinreichem Glykoprotein zu binden. Nach dem Waschen
mit Puffern und Wasser, um ungebundene Peptide zu entfernen, wird
in situ ein sequenzieller Enzymverdau mit FUCase 1, MANase 1, HEXase
1, NANase III und PNGase (Glyko, Inc., Novato, CA) durchgeführt. Die
Proben werden mit Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
analysiert, um die Kohlenhydratzusammensetzung der Glykopeptide
in den beiden Proteinen zu untersuchen. Dieses Beispiel veranschaulicht
die Verwendung der SEAC-Vorrichtung,
um ein Glykopeptid festzumachen, dessen Kohlenhydratbestandteil
dann in situ sequenziert werden kann.
-
V. Oberflächenimmobilisierter
Farbstoff als die Affinitäts-Capture-Vorrichtung
(nicht Endung)
-
Cibacron-Blau-3GA-Agarose (Typ 3000,
4% Agarosekügelchen,
Ligandendichte 2–5 μmol/ml Gel) stammen
von Sigma. Ein Aliquot von 200 μl
menschlichem Plasma werden mit 50 μl oberflächenimmobilisiertem Cibacron-Blau bei pH 7,0 (20
mM Natriumphosphat, 0,5 M Natriumchlorid) bei 23°C 10 Minuten lang gemischt.
Das Gel wird dann dreimal mit 500 μl Puffer und zweimal mit 500 μl Wasser
gemischt. Ein Aliquot von 1 μl
Gelsuspension wird mit 2 μl
Sinapinsäure
(gelöst
in 50% Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure) gemischt und durch Laserdesorptions-Massenspektrometrie
analysiert. 20 zeigt
die selektive Adsorption von menschlichem Serumalbumin (doppelt
geladenes Ion [M + 2H]2+, 32.000 m/z, einfach
geladenes Ion [M + H]+, 64.000 m/z, Dimerion, 2[M
+ H]+, 128.000 m/z) aus der Serumprobe mit oberflächenimmobilisiertem
Cibacron Blau (unteres Profil). Andere getestete, immobilisierte
Farbstoffe umfassten Reactive Red 120-Agarose, Reactive Blue-Agarose, Reactive
Green-Agarose, Reactive Yellow-Agarose (alle von Sigma) und jeder
davon wählt
andere Proteine aus menschlichem Plasma aus.
-
BEISPIEL 4
-
Oberflächenverstärkte Reindesorption (Surface
Enhanced Neat Desorption. SEND) Dieses Beispiel beschreibt das Verfahren
für die
Desorption und Ionisation von Analyten, in dem der Analyt nicht
in einer kristallinen Matrixstruktur dispergiert ist, sondern innerhalb,
auf oder über
einer angebrachten Oberfläche
von energieabsorbierenden Molekülen
in einer Position präsentiert
ist, wo er verfügbar
und zugänglich
ist für
sehr unterschiedliche chemische, physikalische und biologische Modifikations-
oder Erkennungsreaktionen. Die Oberfläche ist mit der angemessenen
Dichte von energieabsorbierenden Molekülen derivatisiert, die (kovalent
oder nicht kovalent) in unterschiedlichen Geometrien gebunden sind,
so dass Einzelschichten und Mehrtachschichten von angebrachten energieabsorbierenden
Molekülen
verwendet werden, um die Desorption von Analytmolekülen unterschiedlicher
Masse zu ermöglichen.
-
Die unten gezeigten Beispiele (Gruppe
I–IV) zeigen
kombiniertes SEND und SEAC, bei denen die adsorbierten (gebundenen)
energieabsorbierenden Moleküle
auch als Affinitätsadsorptionsreagenzien wirken,
um das Fangen (Capture) von Analytmolekülen zu verstärken. Dennoch
verwendet die vorliegende Erfindung nicht die Affinitätsreagenzien
der Gruppe 1, III und IV. Nur die Beispiele der Gruppe II sind demnach
gemäß der Erfindung.
-
1. Energieabsorbierende,
durch kovalente Bindung an die Oberfläche gebundene Moleküle
-
- 1. Cinnamamid (Aldrich) (keine Matrix bei einer Laserwellenlänge von
355 nm nach dem Stand der Technik) wird in Isopropanol: 0,5 M Natriumcarbonat
(3 : 1) gelöst
und mit Sepharose, aktiviert mit Divinylsulfon (Fluka, Ronkonkoma,
NY), bei 23°C
2 Stunden lang gemischt. Die überschüssigen, energieabsorbierenden
Moleküle werden
mit Isopropanol fortgewaschen. Die vorgeschlagene Molekularstruktur
ist in 21 präsentiert.
Aliquots von 2 μl
der gebundenen oder freien Moleküle
werden auf den Sondenspitzen abgeschieden, es wird 1 μl Dimerisierungsdomäne des menschlichen Östrogenrezeptors
in 0,1% Trifluoressigsäure
darauf gegeben und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert.
Das Ergebnis zeigt, dass Peptidionensignale nur auf der Oberfläche mit
den gebundenen energieabsorbierenden Molekülen nachgewiesen werden (22, oberes Profil), die
freien Moleküle
sind nicht effektiv (22,
unteres Profil).
- 2. Cinnamylbromid (Aldrich) (keine Matrix bei einer Lasenivellenlänge von
355 nm nach dem Stand der Technik) wird in Isopropanol: 0,5 M Natriumcarbonat
(3 : 1) gelöst
und mit Sepharose, aktiviert mit Divinylsulfon (Fluka), bei 23°C 15 Stunden
lang gemischt. Die überschüssigen,
energieabsorbierenden Moleküle
werden mit Isopropanol fortgewaschen. Die vorgeschlagene Molekularstruktur
ist in 23 präsentiert.
Aliquots von 2 μl
der gebundenen oder freien Moleküle werden
auf den Sondenspitzen abgeschieden, es wird 1 μl von Peptidmischungen in 0,1%
Trifluoressigsäure
darauf gegeben und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
analysiert. Das Ergebnis zeigt, dass Peptidionensignale nur auf
der Oberfläche
mit den gebundenen energieabsorbierenden Molekülen nachgewiesen werden (24, oberes Profil), die
freien Moleküle
sind nicht effektiv (24,
unteres Profil).
- 3. Dihydroxybenzoesäure
wird mit Dicyclohexylcarbodiimid aktiviert und mit Fmoc-MAP 8-Verzweigtkettenharz
(Applied Biosystems, Forster City, CA) bei 23°C 15 Stunden lang gemischt.
Die überschüssigen energieabsorbierenden
Moleküle werden
mit Methanol fortgewaschen. Die vorgeschlagene Molekularstruktur
ist in 25 präsentiert.
Aliquots von 1 μl
der MAP 8-Verzweigtkettenoberfläche mit
und ohne gebundene energieabsorbierende Moleküle werden auf den Sondenspitzen
abgeschieden, es wird 1 μl
an Peptidmischungen in 0,1% Trifluoressigsäure darauf gegeben und durch
Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Das Ergebnis
zeigt, dass Peptidionensignale nur auf der Oberfläche mit
den gebundenen energieabsorbierenden Molekülen nachgewiesen werden (26, unteres Profil), die
Kontrolloberfläche
ohne jegliche energieabsorbierende Moleküle ist nicht effektiv (26, oberes Profil).
- 4. α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure wird
in Methanol gelöst
und mit AffiGel 10 oder AffiGel 15 (BioRad) bei unterschiedlichen
pH-Werten bei 23°C
2–24 Stunden
lang gemischt. Die überschüssigen energieabsorbierenden
Moleküle
werden mit Methanol fortgewaschen. Aliquots von 2 μl der gebundenen
Moleküle
werden auf den Sondenspitzen abgeschieden, es wird 1 μl von Peptidmischungen oder
Myoglobin oder Trypsin oder Carboanhydrase darauf gegeben und durch
Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Das Ergebnis
zeigt, dass das Myoglobinionensignal nur auf der Oberfläche mit
den gebundenen energieabsorbierenden Molekülen nachgewiesen wird ( 27A) und sehr wenige Signale
von kontaminierenden Ionen mit geringer Masse vorhanden sind (27B).
- 5. Es wird eine 40%ige Polyacrylamidlösung hergestellt und in die
gewünschte
Form einer Sondenspitze gegossen. Das Gel wird solange luftgetrocknet,
bis keine merkliche Verringerung der Größe mehr beobachtet wird. Die
Spitze wird in eine Lösung
aus 9% Glutaraldehyd/Puffer (Vol./Vol.) getaucht und bei 37°C 2 Stunden
lang unter vorsichtigem Schütteln
inkubiert. Nach der Inkubation wird der Puffer verwendet, um überschüssiges Glutaraldehyd
abzuwaschen. Die aktivierte Spitze wird zu einer gesättigten,
gepufferten Lösung
mit energieabsorbierenden Molekülen
gegeben und bei 37°C
(zirka) 24 Stunden lang (zirka) unter vorsichtigem Schütteln inkubiert.
Es werden organische Lösungsmittel
verwendet, um die energieabsorbierenden Moleküle in Situationen, in denen
es erforderlich ist, zu lösen.
Die Spitze wird mit Puffer gespült
und in eine Lösung aus
9% Ethanolamin/Wasser (Vol./Vol.) gegeben und bei 25°C 30 Minuten
lang unter vorsichtigem Schütteln
inkubiert. Dann wird die Spitze mit Puffer gespült und zu einer Lösung aus
5 mg/ml Natriumcyanoborhydrid/Puffer gegeben und bei 25°C 30 Minuten
lang inkubiert. Schließlich
wird die Spitze gründlich
mit Puffer gespült
und bis zur Verwendung aufbewahrt. Dieselbe Reaktion wird auf Nylonspitzen
ausgeführt,
welche durch Hydrolyse mit 6 N HCl unter zweiminütigem Ultraschall und dann
gründlichem
Spülen
mit Wasser und Puffer hergestellt sind. Dieselbe Reaktion wird auch
auf Acrylspitzen durchgeführt,
die durch siebentägiges
Tränken
in 20%igem NaOH täglich
unter Ultraschall über
30–60
Minuten aktiviert und daraufhin gewaschen wurden. Die vorgeschlagene
allgemeine Molekularstruktur der Oberfläche ist in 28 gezeigt.
- 6. Es wird eine 40%ige Polyacrylamidlösung hergestellt und in die
gewünschte
Form einer Sondenspitze gegossen. Das Gel wird solange luftgetrocknet,
bis keine merkliche Verringerung der Größe mehr beobachtet wird. Als
Spülpuffer
wird ein 0,5 M Natriumcarbonatpuffer mit einem pH-Wert von 8,8 hergestellt.
Dann wird die Spitze wird in eine Lösung aus Divinylsulfon (Fluka)
und Puffer im Verhältnis
von 10 : 1 getaucht und 24 Stunden lang inkubiert. Die Spitze wird
mit Puffer gespült
und in eine gepufferte Lösung
mit energieabsorbierenden Molekülen
bei einem pH-Wert von 8 gegeben, um 2 Stunden lang zu inkubieren. Dieselbe
Reaktion wird auf Nylonspitzen durchgeführt, welche durch Hydrolyse
mit 6 N HCl unter zweiminütigem
Ultraschall und dann gründlichem Spülen mit
Wasser und Puffer hergestellt sind. Dieselbe Reaktion wird auch
auf Acrylspitzen durchgeführt,
die durch siebentägiges
Tränken
in 20%igem NaOH täglich
unter Ultraschall über 30–60 Minuten
aktiviert und daraufhin gewaschen wurden. Die vorgeschlagene allgemeine
Molekularstruktur der Oberfläche
ist in 29 gezeigt.
- 7. Es wird eine 40%ige Polyacrylamidlösung hergestellt und in die
gewünschte
Form einer Sondenspitze gegossen. Das Gel wird solange luftgetrocknet,
bis keine merkliche Verringerung der Größe mehr beobachtet wird. Eine
Lösung
mit 100 mg/ml energieabsorbierenden Molekülen in Dichlormethan/NMP (im
Verhältnis
von 2 : 1) und eine 1 M Lösung
aus Dicyclohexylcarbodiimid/NMP werden im Verhältnis von 1 : 2 (EAM : DCC)
gemischt. Die EAM/DCC-Lösung
wird dann bei 25°C
1 Stunde lang unter Rühren
inkubiert. Nach der Inkubation wird ein weißer Niederschlag beobachtet.
Der weiße
Niederschlag wird in einen gesinterten Glasfilter gefiltert. Der
Durchfluss sind die DCC-aktivierten EAM. Dann wird die Spitze in die
Lösung
mit DCC-aktivierten EAM gegeben und bei 25°C 2 Stunden lang (zirka) inkubiert.
Die Spitze wird schließlich
mit unterschiedlichen Lösungsmitteln
wie z. B. Aceton, Dichlormethan, Methanol, NMP und Hexan gespült. Dieselbe
Reaktion wird auf Nylonspitzen durchgeführt, welche durch Hydrolyse
mit 6 N HCl unter zweiminütigem Ultraschall
und dann gründlichem
Spülen
mit Wasser und Puffer hergestellt sind. Dieselbe Reaktion wird auch
auf Acrylspitzen durchgeführt, die
durch siebentägiges
Tränken
in 20%igem NaOH täglich
unter Ultraschall über
30–60
Minuten aktiviert und daraufhin gewaschen wurden. Die vorgeschlagene
allgemeine Molekularstruktur der Oberfläche ist in 30 gezeigt.
- 8. Es wird eine 40%ige Polyacrylamidlösung hergestellt und auf einer
Sondenspitze in die gewünschte
Form gegossen. Das Gel wird solange luftgetrocknet, bis keine merkliche
Verringerung der Größe mehr
beobachtet wird. Eine Lösung
mit 100 mg/ml N-α-Fmoc-N-ε-Fmoc-L-Lysin
in Dichlormethan/NMP (im Verhältnis
von 2 : 1) und eine 1 M Lösung
aus DCC/NMP werden im Verhältnis
von 1 : 2 (Lysin : DCC) gemischt. Die Lysin/DCC-Lösung
wird dann bei 25°C
1 Stunde lang unter Rühren
inkubiert. Nach der Inkubation wird ein weißer Niederschlag beobachtet
und mit einem gesinterten Glasfilter gefiltert. Der Durchfluss ist
das DCC-aktivierte Lysin. Die Spitze wird in die Lösung mit
DCC-aktivierten Lysin gegeben und bei 25°C 2 Stunden lang (zirka) inkubiert.
Die Spitze wird dann in 5 ml Piperidin gelegt und bei 25°C 45 Minuten
lang unter vorsichtigem Rühren inkubiert.
Das DCC-aktivierte Lysin wird wiederholt in aufeinander folgenden
Zyklen mit der Spitze umgesetzt, bis die gewünschte Lysinverzweigung erreicht
ist. Eine Lösung
mit 100 mg/ml EAM in Dichlormethan/NMP (im Verhältnis von 2 : 1) und eine 1
M Lösung
aus DCC/NMP werden im Verhältnis
von 1 : 2 (EAM : DCC) gemischt. Die EAM/DCC-Lösung
wird bei 25°C
1 Stunde lang unter Rühren
inkubiert. Nach der Inkubation wird ein weißer Niederschlag beobachtet
und mit einem gesinterten Glasfilter gefiltert. Der Durchfluss sind
die DCC-aktivierten EAM. Die EAM enthalten eine funktionelle Säuregruppe,
die mit dem DCC reagiert. Die Spitze wird in die Lösung mit DCC-aktivierten
EAM gegeben und bei 25°C
2 Stunden lang (zirka) inkubiert. Die Spitze wird schließlich vor
dem Gebrauch mit einem Überschuss
an Dichlormethan, NMP und Methanol gespült. Dieselbe Reaktion wird
auf Nylonspitzen durchgeführt,
welche durch Hydrolyse mit 6 N HCl unter zweiminütigem Ultraschall und dann
gründlichem
Spülen
mit Wasser und Puffer hergestellt sind. Dieselbe Reaktion wird auch
auf Acrylspitzen durchgeführt,
die durch siebentägiges
Tränken
in 20%igem NaOH täglich
unter Ultraschall über
30–60
Minuten aktiviert und daraufhin gewaschen wurden. Die vorgeschlagene
allgemeine Molekularstruktur der Oberfläche ist in 31 gezeigt.
-
II. Energieabsorbierende,
durch koordinative, kovalente Bindung an die Oberfläche gebundene
Moleküle
-
- 1. Thiosalicylsäure (Aldrich) wird entweder
in Wasser oder in 50% Methanol in Wasser oder in Methanol gelöst. Diese
Lösungen
werden entweder als solche verwendet, oder der pH-Wert der Lösungen wird
mit 0,5 M Natriumbicarbonat oder Ammoniumhydroxid oder Triethylamin
auf 6,5 eingestellt. Cu(II)-Ionen werden entweder mit Iminodiacetat
(IDA) (Chelating Sepharose Fast Flow, Pharmacia) oder Tris(carboxymethyl)-Ethylendiamin
(TED) (synthetisiert wie beschrieben von Yip und Hutchens, 1991),
auf einer Geloberfläche
immobilisiert, cheliert. Die Lösungen
der energieabsorbierenden Moleküle
werden entweder mit Wasser oder mit 50% Methanol in Wasser oder mit
Methanol fortgewaschen. Die vorgeschlagene Molekularstruktur der
Oberfläche
ist in 32 gezeigt.
Aliquots von 1 μl
der gebundenen energieabsorbierenden Moleküle werden auf den Sondenspitzen
abgeschieden, es wird darauf 1 μl
von Peptidmischungen oder Dimerisierungsdomäne des Östrogenrezeptors oder Myoglobin
in 0,1% Trifluoressigsäure
gegeben und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
analysiert. 33 zeigt
ein repräsentatives
Massenspektrum der von dieser Oberfläche desorbierten Dimerisierungsdomäne des Östrogenrezeptors.
- 2. Auf Proben, die auf einer EAM-Oberfläche abgeschieden sind, können sofort
sequenzielle in situ-Reaktionen durchgeführt werden. Thiosalicylsäurekoordinat,
kovalent an IDA-Cu(II) auf einer Sondenoberfläche gebunden, wird wie in Abschnitt
2.1. beschrieben hergestellt. Ein Aliquot von 1 μl (GHHPH)5G-Peptid
wird auf der Oberfläche
abgeschieden und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Nach
dem Erhalten mehrerer Spektren (durchschnittlich 50 Laserschüsse pro
Spektrum) wird die Probe entfernt. Ein Aliquot von 2 μl Carboxypeptidase
Y (Boehringer Mannheim) wird direkt auf die Oberfläche gegeben
und bei 37°C
in einer feuchten Kammer 5 Minuten bis 1 Stunde lang inkubiert.
Der Enzymverdau in situ wird durch 1 μl 0,1 Trifluoressigsäure beendet
und die Probe nochmals durch Massenspektrometrie analysiert.
- 3. Eine weitere Veranschaulichung einer sequenziellen in situ-Reaktion
ist Trypsinverdau gefolgt von C-terminaler Sequenzierung. Thiosalicylsäurekoordinat,
kovalent an IDA-Cu(II) auf einer Sondenoberfläche gebunden, wird wie in Abschnitt 2.1.
beschrieben hergestellt. Ein Aliquot von 1 μl Östrogenrezeptordimerisierungsdomäne (6168,4 Da)
wird auf der Oberfläche
abgeschieden und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Nach
dem Erhalten mehrerer Spektren (durchschnittlich 20 Laserschüsse pro Spektrum)
wird die Probe entfernt. Ein Aliquot von 2 μl Trypsin (Sigma) in 0,1 M Natriumbicarbonat wird
auf die Oberfläche
gegeben und bei 37°C
15 Minuten lang inkubiert. Der Enzymverdau in situ wird durch 1 μl 0,1% Trifluoressigsäure beendet und
die Probe nochmals durch Massenspektrometrie analysiert. Nach dem
Erhalten mehrerer Spektren (durchschnittlich 20 Laserschüsse pro Spektrum)
wird die Probe entfernt. Ein Aliquot von 2 μl Carboxypeptidase Y (Boehringer
Mannheim) wird direkt auf die Oberfläche gegeben und bei 37°C in einer
feuchten Kammer 1 Stunde lang inkubiert. Der Enzymverdau in situ
wird durch 1 μl 0,1%
Trifluoressigsäure
beendet und die Probe nochmals durch Massenspektrometrie analysiert.
-
III. Energieabsorbierende,
durch ionische Bindung an die Oberfläche gebundene Moleküle
-
Sinapinsäure oder α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure werden
in Wasser suspendiert und der pH wird mit verdünntem Natriumhydroxid auf 6,6
eingestellt. Tentacle DEAE Fractogel (EM Separations, Gibbstown,
NJ) wird mit 20 mM HEPES, pH 6,0, gewaschen und sauggetrocknet.
Die Lösung
aus energieabsorbierenden Molekülen
wird bei 23°C
15 Stunden lang mit dem DEAE-Gel gemischt. Das Gel wird mit Wasser
gewaschen, bis alle überschüssigen energieansorbierenden
Moleküle
entfernt waren. Die vorgeschlagene Molekularstruktur der Oberfläche ist
gezeigt in 34. Ein
Aliquot von 0,5 μl
der gebundenen energieabsorbierenden Moleküle wird auf den Sondenspitzen
abgeschieden, es wird 1 μl Östrogenrezeptordimerisierungsdomäne oder
Myoglobin in 0,1% Trifluoressigsäure
darauf gegeben und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. 35A und B zeigen
die Massenspektren.
-
IV. Energieabsorbierende, über hydrophobe
BindungeniVan-der-Waals-Bindungen
an die Oberflächen gebundene
Moleküle
-
- 1. α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure wird
in 50% Methanol in Wasser und Dimethylsulfoxid gewaschen. Dies wird
mit aminomethyliertem Polystyrol bei 23°C 15 Stunden lang gewaschen.
Die überschüssigen energieabsorbierenden
Moleküle werden
mit 50% Methanol in Wasser fortgewaschen. Die vorgeschlagene Molekularstruktur
ist in 36 gezeigt.
Ein Aliquot von 1 μl
der gebundenen energieabsorbierenden Moleküle wird auf der Sondenspitze
abgeschieden, es wird 1 μl
Peptid darauf gegeben und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert.
-
BEISPIEL 5
-
Für die photolabile Anheftung
und Freisetzung verstärkte
Oberflächen
(Surfaces enhanced for photolabile attachment and release, SEPAR)
-
Die lineare Anordnung einzelner Bausteine (Monomere),
die die Struktur und Kennzeichen von Biopolymeren wie z. B. DNA,
RNA und Protein definieren, sind häufig unbekannt, aber (als Ganzes
oder in Teilen) mit einem Verfahren entschlüsselt oder sequenziert, das
differenzielle Massebestimmungen von partiell verdauten (d. h. chemisch
oder enzymatisch) Biopolymeranalyten durch Laserdesorptions/lonisations-Flugzeit-(time-of-flight,
TOF) Massenspektrometrie (MS) analysiert.
-
Bekannte Biopolymere werden zunächst durch
eine oder mehrere (viele), kovalente, photolytische (d. h. lichtempfindliche)
Bindungen an die SELDI-Sondenelementoberfläche gekoppelt.
Als Nächstes
wird eine unterschiedliche Anzahl an einzelnen Einheiten (Monomere)
in einer einzigen Reaktion durch enzymatische oder chemische Verfahren
an den Enden des Biopolymers abgespalten (d. h. entfernt). Die auf
der Sondenelementoberfläche
verbleibenden Analyte bestehen aus einer Vielzahl unterschiedlicher
(Populationen) massedefinierter Biopolymere mit einer unterschiedlichen
Anzahl fehlender Endmonomere. Ein kleiner aber ausreichender Anteil der
modifizierten Biopolymere ist von der Sondenelementoberfläche durch
Laserlicht abgekoppelt (Iosgelöst),
d. h. durch Spaltung der photolytischen Bindungen mit UV-Licht zwischen
260 nm und 365 nm. Die abgekoppelten Biopolymere werden durch Flugzeit-Massenspektrometrie
desorbiert/ionisiert.
-
I. Koppeln von Biopolymeren
an die SELDI-Oberfläche
-
Es sind drei Bestandteile beteiligt:
1) eine Oberfläche,
die aktiviert ist, um entweder mit Amin- oder Carboxylgruppen oder
beiden zu reagieren; 2) photolytische Verbindung, typischerweise
eine Azo-Verbindung der allgemeinen Formel R1-N=N-R2, z. B. 5-(4-Aminophenylazo)salicylsäure (Aldrich), Azodicarbonamid
(Aldrich), oder es werden andere Mechanismen, die solche photolytischen
Bindungen erzeugen, wie z. B. die aktiven, wasserstoffreaktiven chemischen
Reaktionen mit Diazoniumverbindungen, verwendet; und 3) Biopolymer,
z. B. Proteine, Nukleinsäuren,
Kohlenhydrate.
-
Eine photolytische Verbindung muss
zunächst
an die aktivierte Oberfläche
angeheftet werden, z. B. Azodicarbonamid an aminreaktive Oberflächen, Aminophenylsalicylsäure an entweder
amin- oder carboxylreaktive Oberflächen. Dann werden entweder
die photolytische Verbindung oder das Biopolymer durch eine von
vielen üblichen
chemischen Reaktionen aktiviert, z. B. aminreaktive chemische Reaktionen-Cyanogenbromid,
N-Hydroxysuccinimidester,
FMP-Aktivierung, EDC-vermittelt, Divinylsulfon; hydroxylreaktive
chemische Reaktionen – Epoxidaktivierung,
Divinylsulfon; sulfhydrylreaktive chemische Reaktionen – Iodacetylaktivierung,
Maleimid, Divinylsulfon, Epoxidaktivierung; carbonylreaktive chemische
Reaktionen – Hydrazid,
reduktive Aminierung; mit aktivem Wasserstoff reaktive chemische Reaktionen – Diazonium,
das gleichzeitig auch eine photolytische Azobindung erzeugt. Schließlich wird das
Biopolymer durch eine oder mehrere (viele) Bindungen an die photolytische
Verbindung geheftet. Die überschüssigen Chemikalien
werden mit wässrigen
und organischen Lösungsmitteln,
Lösungsmitteln
mit hoher Ionenstärke
und Lösungsmitteln
mit niedrigem pH-Wert
in zahlreichen Zyklen fortgewaschen.
-
II. Massenspektrometrieanalyse
zum Verifizieren der strukturellen Unversehrtheit
-
UV-Laser von 260 bis 365 nm spalten
die photolytische Bindung. Die abgekoppelten Biopolymere werden
durch MALDI TOF desorbiert/ionisiert (ein Fachmann weiß, dass
auch SEND, SEAC und SEPAR verwendet werden können.)
-
III. in situ-Sequenzierung
eines Biopolymers
-
Dies wird erreicht durch alle wohlbekannten, enzymatischen
oder chemischen sequenziellen Degradationsverfahren, z. B. N-terminale
Sequenzierung von Proteinen mit Aminopeptidase, C-terminale Sequenzierung
von Proteinen mit Carboxypeptidase, N-terminale Sequenzierung von
Proteinen im Edman-Abbau;
Sequenzierung von Nukleinsäuren
mit Exonuklease, Sequenzierung von Nukleinsäuren mit dem Sangerschen Verfahren;
Sequenzierung von Kohlenhydraten mit spezifischen Enzymen wie z.
B. Neuraminidase, Mannase, Fucase, Galaktosidase, Glukosidase, O-
oder N-Glykanase. Nach Waschen, um überschüssige Reagenzien und Reaktionsprodukte
zu entfernen, werden die Analyten, die über viele photolytische Bindungen
auf der Oberfläche festgebunden
bleiben, bestehend aus einer Population von massedefinierten Biopolymeren
mit einer unterschiedlichen Anzahl an fehlenden Endmonomeren, mit
MALDI TOF analysiert (ein Fachmann weiß, dass auch SEND, SEAC und
SEPAR verwendet werden können.)
-
Es folgt mehrfaches internes Sequenzieren mit
enzymatischen oder chemischen Verfahren, z. B. Spaltung von Proteinen
mit Endoprotease oder Cyanogenbromid gefolgt von sequenziellem Abbau
der N- und/oder Cterminalen Spaltung von Nukleinsäuren mit
Endonuklease gefolgt von sequenziellem Abbau mit Exonuklease oder
einem chemischen Verfahren; Spaltung von Polysaccharidketten mit
Endoglykosidase N oder Endoglykosidase F gefolgt von sequenzieller
Spaltung mit spezifischen Enzymen. Nach Waschen, um überschüssige Reagenzien
und Reaktionsprodukte zu entfernen, werden die Analyten, die auf
der Oberfläche
bleiben, bestehend aus zahlreichen Populationen von massedefinierten
Biopolymeren mit einer unterschiedlichen Anzahl an fehlenden Endmonomeren,
mit MALDI TOF analysiert (ein Fachmann weiß, dass auch SEND, SEAC und SEPAR
verwendet werden können).
-
IV. Spezifische Beispiele
der Sequenzierunq
-
Eine Demonstration dieses Prinzips
wird durch die eigentliche Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Peptids mit
26 Resten gegeben:
GHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHG
-
Dieses Peptid (GHHPH)5 definiert
die metallbindende Domäne
in der intakten Sequenz des 80-kDa-Proteins, das als histidinreiches
Glykoprotein (HGR) bekannt ist.
-
Glaskügelchen mit Arylamingruppen
an der Oberfläche
als Kopplungsliganden (Sigma) werden mit kaltem 0,3 M HCl gewaschen
und darin suspendiert. Zu den Kügelchen
wird eine wässrige
Lösung mit
50 mg/ml NaNO2 im Verhältnis von 1 : 5 (Vol./Vol.)(NaNO2 : HCl) gegeben und bei 4°C 15 Minuten
lang unter vorsichtigem Schütteln
inkubiert. Nach der Inkubation werden die Kügelchen mit kaltem 0,3 M HCl
und 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, gewaschen. Das zu sequenzfierende
Peptid wird zu den Kügelchen
in Natriumphosphatpuffer bei pH 8,0 gegeben und 24 Stunden lang
bei 4°C
unter vorsichtigem Schütteln
inkubiert. Die Kügelchen
mit gekoppelten Peptiden werden mit Natriumphosphatpuffer, Natriumphosphatpuffer
mit einer hohen Salzkonzentration (z. B. 1,0 M), verdünnter Säure und
organischem Lösungsmittel
(z. B. Methanol) gewaschen, bis im Überstand durch MALDI TOF-Massenspektrometrie
(ein Fachmann weiß,
dass auch SEND, SEAC und SEPAR verwendet werden können) oder
durch Absorption bei 220 nm kein Peptidsignal nachgewiesen wird.
Ein Aliquot von 1 μl
der Kügelchen
wird dann auf der Sondenspitze abgeschieden, es wird 1 μl Sinapinsäure (gelöst in 50
Methanol/0,1% Trifluoressigsäure)
mit den Kügelchen gemischt
und die Probe wurde durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
analysiert. Nach dem Erhalten mehrerer Spektren (durchschnittlich
50 Laserschüsse
pro Spektrum) werden die auf der Oberfläche verbleibenden Peptide mit
Methanol von Sinapinsäure
frei gewaschen und dann mit Carboxypeptidase Y (Boehringer Mannheim)
bei 23°C
in einer feuchten Kammer verdaut. Die verdauten Peptide werden dann
mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS),
pH 8,0, gewaschen. Ein Aliquot von 1 μl Sinapinsäure wird zu der Oberfläche gegeben
und nochmals durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
analysiert. Das Ergebnis der C-terminalen Sequenzanalyse der GHHPHG-Sequenz ist in 37 gezeigt. Es wird eine
frei werdende Sequenz des Peptids beobachtet. Die Sequenz wird durch
die Unterschiede in der Masse zwischen zwei Spitzen abgeleitet.
-
Das zweite Beispiel ist das simultane
Sequenzieren von mehreren Peptiden, die durch photolytische Bindungen
kovalent an eine Oberfläche
gebunden sind. Dimerisierungsdomäne
des menschlichen Östrogenrezeptors
(6168,4 Da) wird über
mehrere photolytische Bindungen an der Oberfläche festgemacht. Das Peptid
hat drei Methioninreste in seiner Sequenz, die spezifisch durch
Cyanogenbromid gespalten werden, um Peptide der Masse 2170,58 Da
(D1-M18), 3118,77
Da (A19-M45), 535,62 Da (S46-M50) und 397,62 Da (E51-L53) zu erzeugen. Alle
diese Peptide sind über
die photolytischen Bindungen an die Oberfläche gebunden. Jedes von ihnen
wird dann in situ mit Carboxypeptidase Y verdaut, um eine frei werdende
Sequenz zu erzeugen, die vollständig
von der anderen gelöst
ist.
-
Ein anderer Ansatz zum Bestimmen
der Proteinstruktur ist das gleichzeitige N-terminale Sequenzieren von vielen Peptiden,
die durch tryptischen Verdau eines Proteins erzeugt werden, welches über viele
photolytische Bindungen an eine Oberfläche gekoppelt ist. Insulin-B-Kette
ist über
viele photolytische Bindungen an der Oberfläche festgemacht. Das Peptid
hat zwei Lysin-/Arginin-Reste
in seiner Sequenz, die von Trypsin spezifisch gespalten werden, um
Peptide der Masse 2585,9 Da (F1-R22) und 859,0 Da (G23-K29) zu erzeugen,
von denen beide über
photolytische Bindungen an die Oberfläche gebunden sind. Jedes von
ihnen wird dann in situ entweder einem Aminopeptidaseverdau oder
vielen Zyklen eines Edman-Abbaus unterzogen, um eine frei werdende
Sequenz zu erzeugen, die vollständig
von der anderen gelöst
ist.
-
Koppeln und Sequenzieren von Nukleinsäuren wird
mit einem ähnlichen
Vorgang durchgeführt. Glaskügelchen
mit Arylamingruppen an der Oberfläche als Kopplungsliganden (Sigma)
werden mit kaltem 0,3 M HCl gewaschen und darin suspendiert. Zu den
Kügelchen
wird eine wässrige
Lösung
mit 50 mg/ml NaNO2 im Verhältnis von
1 : 5 (Vol./Vol.)(NaNO2 : HCl) gegeben und
bei 4°C
15 Minuten lang unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. Nach der Inkubation
werden die Kügelchen
mit kaltem 0,3 M HCl und 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, gewaschen.
Die zu sequenzfierende DNA (z. B. Östrogenrezeptor-responsives
Element, ein Oligonukleotid mit 30 Basenpaaren) wird zu den Kügelchen
in Natriumphosphatpufter bei pH 8,0 gegeben und 24 Stunden lang
bei 4°C
unter vorsichtigem Schütteln
inkubiert. Die Kügelchen
mit gekoppelter DNA werden mit Natriumphosphatpuffer, Natriumphosphatpuffer
mit hoher Salzkonzentration (z. B. 1,0 M), verdünnter Säure und organischem Lösungsmittel
(z. B. Methanol) gewaschen, bis im Überstand durch MALDI TOF-Massenspektrometrie
(ein Fachmann weiß,
dass auch SEND, SEAC und SEPAR verwendet werden können) oder
durch Absorption bei 260 nm kein DNA-Signal nachgewiesen wird. Ein Aliquot
von 1 μl
der Kügelchen
wird dann auf der Sondenspitze abgeschieden, es wird 1 μl 3-Hydroxypicolinsäure (gelöst in 50%
Methanol/0,1% Trifluoressigsäure)
mit den Kügelchen
gemischt und die Probe wird durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
analysiert. Nach dem Erhalten mehrerer Massespektren (durchschnittlich
50 Laserschüsse
pro Spektrum) wird die auf der Oberfläche verbleibende DNA mit Methanol
von 3-Hydroxypicolinsäure frei
gewaschen und dann mit Exonuklease (Boehringer Mannheim) bei 23°C in einer
feuchten Kammer verdaut. Die verdaute DNA wird dann mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS),
pH 8,0, gewaschen, um überschüssiges Reagens
und Reaktionsprodukte zu entfernen. Ein Aliquot von 1 μl 3-Hydroxypicolinsäure wird
zu der Oberfläche
gegeben und nochmals durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert.
Es wird eine frei werdende Sequenz der DNA erzeugt. Die Sequenz
wird durch die Unterschiede in der Masse zwischen zwei Spitzen abgeleitet.
-
Kohlenhydratketten werden mit Periodat
oxidiert und aktiviert, um spezifisch an eine photolytische Verbindung
auf einer Oberfläche
gekoppelt zu werden. Es wird eine Sequenzierung des festgemachten
Kohlenhydrats mit spezifischen Enzymen wie z. B. Neuraminidase,
Fukase, Galaktosidase, Glukosidase, O- oder N-Glykanase durchgeführt und durch
Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
analysiert. 5-(4-Aminophenylazo)salicylsäure (Aldrich) wird an eine
carboxylreaktive Oberfläche wie
z. B. Arylamin auf Glaskügelchen
mit kontrollierten Proben gekoppelt. Die Kohlenhydrathälften von menschlichem
und bovinem histidinreichem Glykoprotein werden durch eine geringe
Konzentration (0,2 M) von Natriummetaperiodat in Wasser bei 23°C 90 Minuten
lang oxidiert. Die überschüssigen Reagenzien
werden mit Wasser fortgewaschen. Die Proteine werden zu der auf
Glaskügelchen
mit kontrollierten Proben gekoppelten 5-(4-Aminophenylazo)salicylsäure in Phosphatpuffer,
pH 8,0, gegeben. Dann wird Natriumcyanoborhydrid (0,6 mg/100 μl) zugegeben und
in einem Abzug bei 23°C
18 Stunden lang gerührt.
Es wird ausführlich
mit Wasser, 1 M NaCl und dann wieder Wasser gewaschen, um überschüssige Reagenzien
und nicht umgesetzte Proteine zu entfernen. Ein Aliquot von 1 μl der Kügelchen
wird dann auf der Sondenspitze abgeschieden, 1 μl Sinapinsäure (gelöst in 50% Methanol/0,1% Trifluoressigsäure) mit den
Kügelchen
gemischt und die Probe durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
analysiert. Die verbleibenden, auf der Oberfläche gebundenen Proteine werden
mit Methanol von Sinapinsäure
frei gewaschen und mit 2 μl
Trypsin in Phosphatpuffer pH 8,0 bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Die
Oberfläche
mit gebundenen Glykopeptiden wird gründlich mit phosphatgepufferter
Salzlösung
und Wasser gewaschen, um überschüssige Reagenzien und
nicht umgesetzte Proteine zu entfernen. Ein Aliquot von 1 μl Sinapinsäure wird
mit den Kügelchen gemischt
und die Probe wird durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie
analysiert. Nach dem Erhalten mehrerer Massespektren (durchschnittlich
50 Laserschüsse
pro Spektrum) werden die auf der Sondenoberfläche verbleibenden Glykopeptide
mit Methanol von Sinapinsäure
frei gewaschen und nacheinander oder in Kombination mit N-Acetylneuraminidase
(NANase III, Glyko, 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, 37°C 1 Stunde), Mannosidase
(MANase 1, Glyko, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,0, 37°C 18 Stunden),
Fucosidase (FUCase, Glyko, 50 mM Natriumphosphat, pH 5,0, 37°C 18 Stunden),
N-Acetylglukosaminidase (HEXase 1, Glyko, 50 mM Natriumphosphat,
pH 5,0, 37°C
4 Stunden), O-Glykosidase
(Glyko, 50 mM Natriumphosphat, pH 5,0, 37°C 18 Stunden) oder N-Glykanase
(PNGase F, Glyko, 50 mM Natriumphosphat, pH 8,6, 37°C 18 Stunden)
verdaut. Die fragmentierten Glykopeptide auf der Oberfläche werden
schließlich
mit phosphatgepufferter Salzlösung
und Wasser gewaschen, um die Reagenzien und Reaktionsprodukte zu
entfernen. Ein Aliquot von 1 μl
Sinapinsäure wird
auf die Oberfläche
gegeben und nochmals durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert.
Es werden frei werdende Sequenzen der Glykopeptide beobachtet. Die
Sequenzen werden durch die Unterschiede in der Masse zwischen zwei Spitzen
abgeleitet.
-
Alle, in dieser Beschreibung enwähnten Patente
und Veröffentlichungen
sind für
den Stand der Fachleute Indikativ, welche die Erfindung betrifft.
-
Ein Fachmann wird sofort anerkennen,
dass die vorliegende Erfindung gut angepasst ist, um die Aufgaben
durchzuführen
und die erwähnten
sowie die damit verbundenen Ergebnisse und Vorteile zu erhalten.
Die hierin beschriebenen Oligonukleotide, Verbindungen, Verfahren,
Vorgehensweisen und Techniken spiegeln derzeit die bevorzugten Ausführungsformen
wieder, sollen beispielhaft sein und sollen nicht den Umfang einschränken. Fachleuten
werden Veränderungen
darin und andere Verwendungen offenkundig sein, die im Schutzumfang
wie in den beigefügten
Ansprüchen
definiert enthalten sind.