ES2201077T3 - Metodo y espectrometro de masas para la desorcion e ionizacion de analitos. - Google Patents
Metodo y espectrometro de masas para la desorcion e ionizacion de analitos.Info
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE EN GENERAL A METODOS Y APARATOS PARA LA DESORCION E IONIZACION DE SUSTANCIAS DE ANALISIS CON EL FIN DE PODER REALIZAR A CONTINUACION UN ANALISIS CIENTIFICO SEGUN TALES METODOS, POR EJEMPLO, UNA ESPECTROMETRIA DE MASA O BIODETECTORES. DE MANERA MAS ESPECIFICA, ESTA INVENCION SE REFIERE AL CAMPO DE LA ESPECTROMETRIA DE MASA, ESPECIALMENTE AL TIPO DE ESPECTROMETRIA DE MASA POR TIEMPO DE VUELO DE DESORCION/IONIZACION LASERICA ASISTIDA POR UNA MATRIZ UTILIZADA PARA ANALIZAR MACROMOLECULAS, TALES COMO PROTEINAS O BIOMOLECULAS. DE MANERA MAS ESPECIFICA, ESTA INVENCION SE REFIERE A LA GEOMETRIA DE SONDAS PARA MUESTRAS, A LA COMPOSICION DE SONDAS PARA MUESTRAS Y A QUIMICAS DESDE LAS SUPERFICIES DE LAS SONDAS PARA MUESTRAS QUE PERMITEN LA CAPTURA Y DESORCION SELECTIVA DE SUSTANCIAS DE ANALISIS, INCLUIDAS LA MACROMOLECULAS INTACTAS, DIRECTAMENTE DESDE LA SUPERFICIE DE LA SONDA A LA FASE DE GAS (VAPOR) SIN LA UTILIZACION DE UNA MATRIZ QUIMICA AÑADIDA.
Description
Método y espectrómetro de masas para la desorción
e ionización de analitos.
Esta invención se refiere generalmente a métodos
y aparatos para desorción e ionización de analitos con el fin de un
análisis científico subsiguiente mediante tales métodos, por
ejemplo, como espectrometría de masas (MS) o biosensores.
Generalmente, el análisis mediante espectrometría de masas implica
la vaporización e ionización de una pequeña muestra de material,
usando una fuente de alta energía, tal como un láser, incluyendo un
haz de láser. El material se vaporiza de la superficie de la punta
de una sonda a la fase gaseosa o de vapor por el haz de láser, y, en
el procedimiento, algunas de las moléculas individuales se ionizan
por la ganancia de un protón. Las moléculas ionizadas cargadas
positivamente se aceleran entonces a través de un corto campo de
alto voltaje, y se deja que vuelen (que sean arrastradas) a una
cámara de alto vacío, en cuyo extremo más alejado chocan con una
superficie detectora sensible. Puesto que el tiempo de vuelo es una
función de la masa de la molécula ionizada, se puede usar el tiempo
transcurrido entre la ionización y el impacto para determinar la
masa de la molécula que, a su vez, se puede usar para identificar
la presencia o ausencia de moléculas conocidas de masa
específica.
Todos los procedimientos conocidos de la técnica
anterior, que presentan proteínas u otras biomoléculas grandes en
una punta de una sonda para la espectrometría de masas de tiempo de
vuelo con desorción/ionización por láser (TOF), se basan en la
preparación de una mezcla sólida cristalina de la proteína u otra
molécula de analito en un gran exceso molar de material matriz
ácido depositado sobre la superficie desnuda de una punta de sonda
metálica. (La punta de la sonda para muestra es típicamente
metálica, bien de acero inoxidable, de material chapado con níquel,
o platino). Se pensó que era necesario embeber el analito en tal
matriz a fin de evitar la destrucción de las moléculas del analito
por el haz de láser. El haz de láser golpea a la mezcla sólida sobre
la punta de la sonda y su energía se usa para vaporizar una pequeña
porción del material de la matriz junto con algunas de las
moléculas del analito embebidas. Sin la matriz, las moléculas del
analito son fácilmente fragmentadas por la energía del láser, de
forma que es muy difícil o imposible determinar la masa y la
identidad de la macromolécula original.
Este procedimiento de la técnica anterior tiene
varias limitaciones que han evitado su adaptación al análisis
molecular automatizado de proteínas o de otras moléculas
macrobiológicas. En primer lugar, en una mezcla muy bruta es
necesario fraccionarla parcialmente (o de otro modo purificar la
muestra tanto como sea posible) para eliminar la presencia de
materiales extraños excesivos en la mezcla cristalina o sólida de
matriz/analito. La presencia de grandes cantidades de componentes
puede disminuir la señal iónica (bien desorción, ionización y/o
detección) del analito seleccionado. Tal purificación consume
tiempo, es cara, típicamente da como resultado una recuperación
pobre (o pérdida completa) del analito, y sería muy difícil de
realizar en un analizador automatizado.
En segundo lugar, aunque la cantidad de material
del analito necesaria para el análisis mediante el método de la
técnica anterior no es grande (típicamente en un intervalo de
picomoles), en algunas circunstancias tales como en ensayos en
pacientes pediátricos, los fluidos del analito están disponibles
sólo en volúmenes extremadamente pequeños (microlitros) y se pueden
necesitar para realizar varios análisis diferentes. Por lo tanto,
incluso la pequeña cantidad (es decir, volumen) necesaria para la
preparación de la mezcla cristalina de analito/matriz para un único
análisis puede ser significativa. También, sólo se consume
realmente en la desorción o en el análisis espectrométrico de masas
una fracción minúscula (unos pocos miles o menos) de analito usado
para preparar la mezcla sólida de analito/matriz para uso en la
punta de la sonda. Cualquier mejora en el procedimiento de la
técnica anterior que haga posible 1) usar mucho menos analito, 2)
colocar el analito o múltiples analitos en la punta de la sonda o
en su superficie en una localización predeterminada, 3) realizar
análisis repetidos de la misma alícuota del analito (por ejemplo,
antes y después de una o más reacciones químicas y/o enzimáticas), y
4) realizar el ensayo de una manera más cuantitativa, sería
altamente ventajoso en muchas áreas clínicas.
En tercer lugar, la proteína del analito, u otra
macromolécula, usada para preparar la disolución sólida de
analito/matriz para uso en la punta de la sonda no es adecuada para
cualquier ensayo o procedimiento químico subsiguiente debido a que
está unida (es decir, embebida) en el material de la matriz.
También, todo el material de la matriz usado hasta la fecha es
fuertemente ácido, de forma que afectaría adversamente a muchas
reacciones químicas que se pudieran intentar en la mezcla a fin de
modificar las moléculas del analito para examen subsiguiente.
Cualquier mejora en el procedimiento que haga posible realizar
modificaciones o reacciones químicas subsiguientes en las moléculas
del analito, sin retirarlas de la matriz o de la punta de la sonda
o sin formar una "matriz" todo en conjunto, sería de un
beneficio enorme para los investigadores y profesionales
clínicos.
Las primeras medidas con éxito de la masa
molecular de péptidos intactos y pequeñas proteínas (de sólo
hasta alrededor de 15 kDa), por cualquier forma de espectrometría de
masas, se obtuvieron bombardeando superficies con partículas de
alta energía (espectrometría de masas con desorción por plasma y por
bombardeo con átomos rápidos); este adelanto importante se produjo
en 1981 y 1982. Las mejoras llegaron en 1985 y 1986, y sin embargo
el rendimiento (intensidades de la señal), sensibilidad, precisión
y exactitud de la masa permanecieron relativamente bajos. No se
observaron proteínas de masa molecular más elevada (alrededor de 20
a 25 kDa), excepto en ocasiones raras; con estos métodos nunca se
observaron proteínas que tuvieran pesos moleculares medios
(aproximadamente 70 kDa). De este modo, continuó siendo irrealizable
la evaluación de la mayoría de las proteínas mediante
espectrometría de masas.
En 1988, Hillenkamp y sus colaboradores usaron
espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser
de ultravioleta, y descubrieron que, cuando las proteínas de masa
molecular relativamente elevada se depositaban en la punta de la
sonda en presencia de un exceso molar muy grande de una matriz
química ácida, que absorbe la luz UV (ácido nicotínico), se podían
desorber en estado intacto. Esta nueva técnica se denomina
espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización
por láser asistida por una matriz (MALDI). Obsérvese que la
espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser
(sin la matriz química) ya existía desde algún tiempo; sin embargo,
no tenía éxito o muy poco determinando los pesos moleculares de
grandes biopolímeros intactos tales como proteínas y ácidos
nucleicos, debido a que se fragmentaban (destruían) con la
desorción. De este modo, antes de la introducción de una matriz
química, la espectrometría de masas con desorción por láser era
esencialmente inútil para la detección de cambios específicos en la
masa de macromoléculas intactas. Obsérvese que la formación
aleatoria de cristales de la matriz y la inclusión aleatoria de
moléculas de analito en la disolución sólida es técnica
anterior.
Existe un número de problemas y limitaciones con
los métodos de la técnica anterior. Por ejemplo, previamente, se ha
encontrado que es difícil lavar contaminantes presentes en el
analito o en la matriz. Otros problemas incluyen la formación de
aductos iónicos de analito-sal, una solubilidad
menos que óptima del analito en la matriz, una localización y
concentración desconocidas de moléculas de analito en la matriz
sólida, la supresión o "envenenamiento" de la señal (ion
molecular) debido a la presencia simultánea de múltiples
componentes, y la desorción/ionización selectiva del analito. Los
investigadores anteriores, incluyendo Karas y Hillenkamp han dado a
conocer una variedad de técnicas para la detección de analitos
usando espectroscopía de masas, pero estas técnicas padecían de
limitaciones inherentes en la sensibilidad y selectividad de las
técnicas, que incluyen específicamente limitaciones en la detección
de analitos en muestras no diferenciadas, de bajo volumen.
(Hillenkamp, Bordeaux Mass Spectrometry Conference Report,
p. 354-62 (1988); Karas y Hillenkamp, Bordeaux
Mass Spectrometry Conference Report, p. 416-17
(1988); Karas y Hillenkamp, Analytical Chemistry, 60:2299
(1988); Karas, et al., Biomed. Environ. Mass Spectrum (en
prensa)). El uso de haces de láser en espectrómetros de masa de
tiempo de vuelo se muestra, por ejemplo, en las patentes de EE.UU.
nº 4.694.167; 4.686.366, 4.295.046 y 5.045.694.
La volatilización con éxito de biopolímeros de
elevado peso molecular, sin fragmentación, ha permitido que se
analice mediante espectrometría de masas una amplia variedad de
macromoléculas biológicas. De forma más importante quizás, ha
ilustrado el potencial de usar la espectrometría de masas de forma
más creativa para resolver problemas encontrados rutinariamente en
la investigación biológica. La atención más reciente se ha centrado
en la utilidad de la espectrometría de masas (MS) de tiempo de vuelo
(TOF) con desorción/ionización por láser asistida por matriz
(MALDI), principalmente debido a que es rápida (minutos), sensible
(se requieren muestras de < picomoles), y permite que se
analicen mezclas complejas.
Aunque la MS de MALDI-TOF
continúa siendo útil para la determinación/verificación estática de
masas para analitos individuales, en el caso de biopolímeros a
menudo son las diferencias en la masa las que proporcionan la
información más importante sobre las estructuras desconocidas. De
este modo, para uso rutinario en biología estructural, una
limitación desafortunada de la técnica de MS
MALDI-TOF se refiere a la preparación y
presentación (deposición) de la muestra sobre una superficie de la
sonda inerte, específicamente, el requisito de que los analitos sean
embebidos (es decir, co-solidificados) en la
superficie de la sonda en una matriz recientemente preparada de
ácido orgánico cristalino. La distribución aleatoria del analito en
una disposición heterogénea de matriz cristalina en la superficie
de la sonda requiere la deposición de mucho más analito o muestra
que la necesaria para el proceso de desorción por láser, incluso
para la recogida de espectros de masas más que adecuados (por
ejemplo, múltiples conjuntos de 100 disparos cada uno). La porción
que queda del analito habitualmente no se recupera para análisis
adicionales o caracterizaciones subsiguientes. Incluso aunque se
requieren típicamente 1 a 10 pmoles (algunas veces menos) del
analito para la deposición en la superficie de la sonda, se ha
estimado que se consumen durante la desorción por láser menos de
unos pocos atomoles. De este modo, sólo 1 parte en 10^{5} ó
10^{6} del analito aplicado puede ser necesaria; el resto se
pierde.
Otra pérdida importante de datos potenciales
asociada con el embebimiento del analito en una matriz sólida es la
reducción o la eliminación completa de la capacidad para realizar
modificaciones químicas y/o enzimáticas subsiguientes al analito
embebido (por ejemplo, proteína o ADN) que permanece en la
superficie de la sonda. Sólo otra alícuota de analito, o la
capacidad para recuperar el analito embebido libre de la matriz
(difícil, con una pobre recuperación), permite realizar lo que se
denomina ahora como espectrometría de masas diferencial para
derivar datos estructurales.
Además, ha habido una aplicación limitada de MS
en los campos biológicos, probablemente debido al hecho de que
muchos biólogos y clínicos están intimidados por la MS y/o son
escépticos con respecto a su utilidad. Además, la MS se percibe
como inaccesible o demasiado costosa, particularmente debido a que
la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS es un sustituto
adecuado, en algunos casos en los que se podría aplicar MALDI (por
ejemplo, separación de fluidos biológicos brutos). Además, la MALDI
ha sido poco explicada en revistas biológicas y clínicas.
Un objeto de la invención es proporcionar métodos
mejorados, composiciones de materiales y aparatos para la
adsorción, desorción e ionización acopladas de múltiples analitos o
de analitos seleccionados a la fase gaseosa (vapor).
Otro objeto es proporcionar un método y aparato
para la detección de analitos dirigida a la afinidad, que incluye
la desorción e ionización de analitos en los que el analito no está
disperso en una disolución de matriz o en una estructura cristalina
sino está presente dentro, sobre o por encima de una superficie
unida de material "matriz" que absorbe energía, a través de
sucesos de reconocimiento molecular, en una posición en la que es
accesible y receptivo a una variedad amplia de reacciones de
modificación o reconocimiento químicas, físicas y biológicas.
Otro objeto es proporcionar tal método y aparato
en el que el material del analito está unido químicamente o
adherido físicamente a un sustrato que forma una superficie de
presentación de la muestra en la punta de una sonda.
Un objeto adicional es proporcionar un medio para
la modificación de superficies de presentación de la muestra, cuya
modificación se realiza con moléculas que absorben energía, para
permitir la desorción con éxito de moléculas del analito sin
adición de moléculas de matriz exógena como en la técnica
anterior.
Un objeto adicional es proporcionar la densidad
apropiada de moléculas que absorben energía enlazadas (covalente o
no covalentemente) en una variedad de geometrías, de forma que se
usan monocapas y múltiples capas de moléculas unidas que absorben
energía para facilitar la desorción de moléculas del analito de
masas variables.
Un objeto adicional es proporcionar múltiples
combinaciones de superficies modificadas con moléculas que absorben
energía, dispositivos de captura de analitos dirigidos a la
afinidad, fototubos, etc.
Un objeto adicional es proporcionar tal método y
aparato en el que el sustrato que forma la punta de la sonda u otra
superficie de presentación de la muestra, se derivatiza con uno o
más reactivos de afinidad (una variedad de densidades y grados de
amplificación) para el enlace selectivo con analitos predeterminados
o clases de analitos.
Un objeto adicional es proporcionar tal sistema
en el que el reactivo de afinidad se enlaza químicamente o se
adhiere biológicamente al analito diana o a la clase de
analitos.
Aún un objeto adicional es proporcionar un método
y aparato para la desorción e ionización de analitos en el que la
porción sin usar de los analitos contenida en la superficie de
presentación de la muestra permanece químicamente accesible, de
forma que se puede realizar una serie de tratamientos químicos,
enzimáticos o físicos del analito, seguido de los análisis
secuenciales del analito modificado.
Un objeto adicional es proporcionar un método y
aparato para las modificaciones químicas o enzimáticas combinadas
de analitos diana con el fin de elucidar la estructura primaria,
secundaria, terciaria o cuaternaria del analito y sus
componentes.
Otro objeto es proporcionar un método y aparato
para la desorción e ionización de materiales del analito, en el que
se utilizan cationes distintos de protones (H^{+}) para la
ionización de macromoléculas de analitos.
En consecuencia, la presente invención
proporciona una sonda que es insertable de forma retirable en un
espectrómetro de masas, teniendo la sonda una superficie de
presentación de la muestra para exponer un analito a una fuente de
energía que emite energía capaz de desorber/ionizar el analito de
la sonda para la detección del analito, en la que la mencionada
superficie se derivatiza con un reactivo de afinidad que es capaz
de unirse al analito y que se selecciona de iones metálicos, ácidos
nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, proteínas y sus
combinaciones, y en la que se proporciona sobre la superficie
mencionada un material matriz que ayuda a la desorción/ionización,
en asociación con el reactivo de afinidad.
La superficie de presentación de la muestra se
puede seleccionar de metal revestido con un polímero sintético,
vidrio, producto cerámico, polímeros sintéticos y biopolímeros. De
este modo, la superficie de presentación de la muestra puede ser un
metal que tiene un revestimiento de dextrano o agarosa reticulados,
nailon, polietileno o poliestireno.
El reactivo de afinidad puede ser un anticuerpo,
una lectina, un ión de Cu(II) o un ión Fe(III). El
analito puede comprender biomoléculas, y dicho reactivo de afinidad
se puede adaptar para aislar selectivamente dichas biomoléculas a
partir de una muestra biológica no diferenciada.
Se pueden proporcionar, sobre la superficie de
presentación de la muestra, reactivos de afinidad dispuestos en una
disposición predeterminada para la adsorción selectiva de analitos
diferentes. Se proporciona sobre la superficie de presentación de la
muestra un material matriz que ayuda a la desorción/ionización, en
asociación con el reactivo de afinidad. El material matriz puede
tener un pH por encima de 6,0. El material matriz puede ser ácido
nicotínico o ácido sinapínico. Se puede proporcionar una sonda de la
invención con el analito unido al reactivo de afinidad.
La invención también proporciona un espectrómetro
de masas para detectar un analito, que comprende:
- (a) una sonda de la invención que tiene el analito unido al reactivo de afinidad;
- (b) una fuente de energía para dirigir energía a la superficie de presentación de la muestra de la sonda, para desorber/ionizar el analito; y
- (c) medios para detectar el analito desorbido.
- Tal espectrómetro de masas puede comprender además:
- un tubo de espectrómetro;
- medios de vacío para aplicar vacío al interior de dicho tubo;
- medios de potencial eléctrico dentro del tubo para aplicar un potencial acelerador a las moléculas del analito desorbidas; y
- una muestra de analito unida mediante el reactivo de afinidad sobre dicha superficie de presentación de la muestra de la sonda, con lo que al menos una porción de dichas moléculas del analito no consumidas en dicho análisis de espectrometría de masas permanece accesible para procedimientos químicos, biológicos o físicos analíticos subsiguientes;
en el que dicha fuente de energía comprende un
medio de haz de láser para producir un haz de láser dirigido a
dicha muestra de analito para dar suficiente energía para desorber
e ionizar una porción de dichas moléculas de analito de la
mencionada muestra de analito;
y
en el que dicho medio de detección comprende
medios asociados con dicho espectrómetro para detectar el impacto
de moléculas del analito ionizadas, aceleradas, sobre
ellos.
La invención proporciona además un método para
detectar un analito, que comprende:
- (a) proporcionar un espectrómetro de masas de la invención;
- (b) desorber al menos una porción del analito de la superficie de presentación de la muestra, de la sonda del espectrómetro de masas exponiendo al analito a energía procedente de la fuente de energía; y
- (c) detectar el analito desorbido con los medios de detección.
El método puede comprender además, tras la etapa
(c) de detección, la etapa de realización de un procedimiento
químico o biológico en la porción de dicho analito no desorbida,
para alterar la composición de dicha porción de dicho analito no
desorbida; y repetir las etapas (b) y (c) con respecto a dicho
analito alterado.
El método de detección de la invención puede
comprender, de este modo:
- (i) proporcionar una sonda que se puede insertar de forma retirable en un espectrómetro de masas, teniendo la sonda una superficie de presentación de la muestra, para exponer un analito a una fuente de energía que emite energía capaz de desorber/ionizar al analito de la sonda para la detección del analito;
- (ii) derivatizar dicha superficie de presentación de la muestra, con un reactivo de afinidad que es capaz de unirse al analito y que se selecciona de iones metálicos, ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, proteínas y sus combinaciones;
- (iii) exponer dicha superficie derivatizada, de presentación de la muestra, a una fuente de dicho analito para unir dicho analito a ella;
- (iv) depositar sobre dicha superficie de presentación de la muestra un material matriz, que ayuda a la desorción/ionización, en asociación con el reactivo de afinidad;
- (v) colocar la superficie derivatizada de presentación de la muestra con dichas moléculas del analito unidas a ella en un extremo de un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo y aplicar vacío y un campo eléctrico para formar un potencial acelerador dentro del espectrómetro;
- (vi) golpear al menos una porción de las moléculas del analito unidas a dicha superficie derivatizada de presentación de la muestra, dentro del espectrómetro, con uno o más pulsos de láser a fin de desorber iones de dichas moléculas de analito de dicha sonda;
- (vii) detectar la masa de los iones mediante su tiempo de vuelo en dicho espectrómetro de masas; y
- (viii) presentar en una pantalla tal masa detectada.
\newpage
La presente invención proporciona
adicionalmente:
- un método para preparar una sonda de la
invención, método el cual comprende:
- (i) proporcionar una sonda que se puede insertar de forma retirable en un espectrómetro de masas, teniendo la sonda una superficie de presentación de la muestra para exponer un analito a una fuente de energía que emite energía capaz de desorber/ionizar el analito de la sonda para la detección del analito;
- (ii) derivatizar dicha superficie de presentación de la muestra, con un reactivo de afinidad que es capaz de unirse al analito y que se selecciona de iones metálicos, ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, proteínas y sus combinaciones; y
- (iii) depositar sobre dicha superficie de presentación de la muestra un material matriz que ayuda a la desorción/ionización, en asociación con el reactivo de afinidad;
- un método para capturar un analito en una sonda
para un espectrómetro de masas, método el cual comprende:
- - proporcionar una sonda que se puede insertar de forma retirable en un espectrómetro de masas, teniendo la sonda una superficie de presentación de la muestra para exponer un analito a una fuente de energía que emite energía capaz de desorber/ionizar el analito de la sonda para la detección del analito, en la que dicha superficie se derivatiza con un reactivo de afinidad que es capaz de unirse al analito y que se selecciona de iones metálicos, ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, proteínas y sus combinaciones,
- - exponer dicha superficie de presentación de la muestra de la sonda a una muestra que contiene dicho analito; y
- - depositar sobre dicha superficie de presentación de la muestra un material matriz que ayuda a la desorción/ionización, en asociación con el reactivo de afinidad;
- uso de una sonda de la invención en
espectrometría de masas; y
- uso de una sonda de la invención en un
espectrómetro de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización
por láser.
Serán manifiestos otros objetos, características
y ventajas, y la invención se entenderá más fácilmente a partir de
la lectura de la siguiente memoria descriptiva y mediante
referencia a los dibujos que se acompañan y que forman parte de la
misma, en la que los ejemplos de las realizaciones actualmente
preferidas de la invención se dan con fines de descripción.
Los objetos y ventajas anteriores y otros objetos
y ventajas de la invención serán manifiestos a partir de la
siguiente memoria descriptiva y a partir de los dibujos que se
acompañan.
La Figura 1A (perfil superior) muestra el
espectro de masas de los tres péptidos (dominios de unión a metal
de glicoproteína rica en histidina humana (GHHPH)_{2}G
(1206 Da), (GHHPH)_{5}G (2904 Da), y dominio de
dimerización de receptor de estrógenos humano
(D473-L525) (6168,4 Da)) desorbidos en presencia de
moléculas neutralizadas que absorben energía (ácido sinapínico, pH
6,2). La Figura 1B (perfil inferior) muestra la unión secuencial
in situ a cobre metálico de los péptidos en presencia de
moléculas neutras que absorben energía.
La Figura 2A (perfil superior) muestra el
espectro de masas del fosfopéptido de caseína humana (5P, 2488 Da)
desorbido en presencia de moléculas neutralizadas que absorben
energía (ácido sinapínico, pH 6,5). La Figura 2B (segunda desde el
perfil superior) muestra la digestión secuencial in situ con
fosfatasa alcalina durante 5 minutos para eliminar grupos fosfato
del fosfopéptido. La Figura 2C (tercera desde el perfil superior)
muestra el espectro de masas del fosfopéptido tras una digestión
adicional en fosfatasa en presencia de moléculas ácidas que
absorben energía (ácido 2,5-dihidroxibenzoico, pH
2) como se describe en la técnica anterior.
La Figura 3 muestra unos espectros de masas, en
material compuesto, del péptido (GHHPH)_{5}G (2904 Da)
antes (perfil inferior) y después (perfil superior) de la digestión
in situ por carboxipeptidasa P en presencia de moléculas
neutralizadas que absorben energía (ácido sinapínico, pH 6,2).
La Figura 4 muestra unos espectros de masas de
desorción por láser asistida por matriz de tipo material compuesto,
de mezclas peptídicas desorbidas de sondas de vidrio sólido, de
acero inoxidable revestido con polipropileno, de acero inoxidable
revestido con poliestireno, y de nailon sólido.
\newpage
La Figura 5, perfil A, muestra el espectro de
masas del factor activador del esperma (933 Da) y de neurotensina
(1655 Da) (y sus múltiples aductos de sodio) en la disolución
peptídica no adsorbida por la superficie de
IDA-Cu(II). La Figura 5, perfil B, muestra
el espectro de masas de angiotensina I (1296,5 Da) más los picos del
aducto de sodio que se adsorbieron selectivamente sobre la
superficie de IDA-Cu(II). La Figura 5,
perfil C, y la Figura 6, perfil C, muestran el espectro de masas de
la misma angiotensina I adsorbida sobre
IDA-Cu(II) tras lavado con agua. La Figura 6,
perfil D, muestra la unión secuencial in situ a cobre (1 y 2
Cu) mediante angiotensina I adsorbida por afinidad. La Figura 6,
perfil E, muestra la digestión secuencial in situ con
tripsina de la angiotensina I adsorbida por afinidad.
La Figura 7 muestra el espectro de masas de
mioglobina (4 a 8 fmoles) adsorbida por afinidad sobre la
superficie de IDA-Cu(II).
La Figura 8 (perfil superior) muestra el espectro
de masas del péptido de caseína sintética (1934 Da) con múltiples
formas fosforiladas, adsorbido por afinidad, de una mezcla bruta
sobre la superficie de TED-Fe(III). Tras la
digestión secuencial in situ con fosfatasa alcalina, sólo
quedó la forma original no fosforilada (perfil inferior).
La Figura 9, perfil A, muestra el espectro de
masas de proteínas totales en una fórmula para lactantes. La Figura
9, perfil B, muestra el espectro de fosfopéptidos en la fórmula
para lactantes adsorbidos por afinidad sobre la superficie de TED-
Fe(III). La Figura 9, perfil C, muestra el espectro de masas
de proteínas totales en un aspirado gástrico de niño prematuro
obtenido tras alimentar la fórmula para lactantes. La Figura 9,
perfil D, muestra el espectro de masas de fosfopéptidos en el
aspirado gástrico adsorbidos por afinidad sobre superficie de
TED-Fe(III).
La Figura 10A muestra los espectros de masas, en
material compuesto, de glicoproteína enriquecida con histidina tanto
humana como bovina adsorbida sobre superficie de
IDA-Cu(II) antes y después de la digestión
con N-glicanasa. Los desplazamientos másicos
representan la eliminación de carbohidratos de las glicoproteínas
respectivas. La Figura 10B muestra los espectros de masas, en
material compuesto, de péptidos digeridos con tripsina procedentes
de las proteínas desglicosiladas de las dos especies (perfil
superior para la proteína humana, segundo desde el perfil inferior
para la proteína bovina), y la unión in situ a Cu(II)
de los péptidos digeridos con tripsina de las dos especies (segundo
desde el perfil superior para la proteína humana, perfil inferior
para la proteína bovina; los números 1, 2 indican el número de unión
a cobre). La Figura 10C muestra que uno de tales péptidos que se
unen a Cu(II) (perfil inferior) tiene al menos 4 residuos de
His que se modifican específicamente mediante pirocarbonato de
dietilo para formar 4 aductos
N-carbetoxi-histidílicos
(1-4, perfil superior). La Figura 10D muestra la
secuencia parcial de C-terminal del principal
péptido que se une a Cu en la glicoproteína enriquecida con
histidina bovina.
La Figura 11 (perfil inferior) muestra el
espectro de masas de inmunoglobulina
anti-lactoferrina humana de conejo sola (control)
adsorbida por afinidad sobre una superficie paramagnética de IgG
anti-conejo de oveja. El perfil superior muestra el
espectro de masas de un complejo de lactoferrina humana e
inmunoglobulina anti-lactoferrina humana de conejo
adsorbido por afinidad en una superficie paramagnética de IgG
anti-conejo de oveja.
La Figura 12 muestra el espectro de masas de
lactoferrina humana adsorbida por afinidad procedente de orina de
niño prematuro en una superficie de nailon con inmunoglobulina
anti-lactoferrina humana. La Figura 13 muestra el
espectro de masas equivalente de la orina completa de niño
prematuro que contiene 1 nmol/ml de lactoferrina.
La Figura 14 (perfil inferior) muestra el
espectro de masas de glicoproteína enriquecida con histidina bovina
pura. El perfil superior muestra el espectro de masas de
glicoproteína enriquecida con histidina bovina y fragmentos
adsorbidos por afinidad procedentes de calostro bovino sobre una
superficie de inmunoglobulina anti- glicoproteína rica en histidina
bovina.
La Figura 15 muestra el espectro de masas, en
material compuesto, de los péptidos de la hormona estimulante de
los folículos reconocida por los diferentes anticuerpos antihormona
estimulante de folículos.
La Figura 16 muestra el espectro de masas de
lactoferrina humana adsorbida por afinidad sobre un lecho único de
agarosa con ADN de una sola hebra depositada sobre una sonda de 0,5
mm de diámetro.
La Figura 17 muestra el espectro de masas de
lactoferrina humana adsorbida por afinidad procedente de la orina
de niño prematuro sobre una superficie de ADN de una sola
hebra.
La Figura 18A muestra los espectros de masas, en
material compuesto, de las proteínas totales en un aspirado
duodenal humano (perfil inferior) y la tripsina adsorbida por
afinidad procedente del aspirado sobre una superficie inhibidora de
tripsina de haba de soja (perfil superior).
La Figura 18B muestra el espectro de masas de la
tripsina adsorbida por afinidad procedente de 1 \mul de aspirado
sobre una superficie de nailon inhibidora de tripsina de haba de
soja.
La Figura 19A muestra el espectro de masas de
insulina biotinilada adsorbida por afinidad procedente de la orina
humana en una superficie de estreptavidina. La Figura 19B muestra
el espectro de masas de insulina biotinilada adsorbida por afinidad
procedente de plasma humano sobre una superficie de
estreptavidina.
La Figura 20 (perfil superior) muestra el
espectro de masas de albúmina humana en suero humano. La Figura 20
(perfil inferior) muestra el espectro de masas de albúmina sérica
adsorbida por afinidad procedente de suero humano sobre una
superficie de azul de Cibacron.
La Figura 21 muestra la estructura molecular de
la cinamamida unida a la superficie; R representa la superficie más
el agente reticulante.
La Figura 22 (perfil superior) muestra el
espectro de masas de mezclas peptídicas desorbidas de cinamamida
unida a la superficie. La Figura 20B (perfil inferior) muestra el
espectro de masas de las mismas mezclas peptídicas con cinamamida
libre.
La Figura 23 muestra la estructura molecular de
bromuro de cinamilo unido a la superficie; R representa la
superficie más el agente reticulante.
La Figura 24 (perfil superior) muestra el
espectro de masas de mezclas peptídicas desorbidas de bromuro de
cinamilo unido a la superficie. La Figura 22B (perfil inferior)
muestra el espectro de masas de las mismas mezclas peptídicas con
bromuro de cinamilo libre.
La Figura 25 muestra la estructura molecular de
MAP-ácido dihidroxibenzoico unido a la superficie; R representa la
superficie más el agente reticulante.
La Figura 26 (perfil superior) muestra el
espectro de masas de mezclas peptídicas desorbidas de MAP solo
unido a superficie. La Figura 26 (perfil inferior) muestra el
espectro de masas de las mismas mezclas peptídicas desorbidas de
MAP-ácido dihidroxibenzoico unidos a la superficie.
La Figura 27A muestra el espectro de masas
(región de m/z 1200-50.000) de mioglobina desorbida
de ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinámico
unido a superficie. La Figura 27B muestra el mismo espectro de
masas en la región de masas baja (0-1200 m/z).
La Figura 28 muestra la estructura molecular de
moléculas que absorben energía unidas a una superficie de
poliacrilamida, o de nailon, o acrílica, vía activación con
glutaraldehído.
La Figura 29 muestra la estructura molecular de
moléculas que absorben energía unidas a superficie de
poliacrilamida, o de nailon, o acrílica, vía activación con
divinilsulfona.
La Figura 30 muestra la estructura molecular de
moléculas que absorben energía unidas a superficie de
poliacrilamida, o de nailon, o acrílica, vía activación con
diciclohexilcarbodiimida.
La Figura 31 muestra la estructura molecular de
moléculas que absorben energía unidas a superficie de
poliacrilamida o de nailon o acrílica, con múltiples péptidos
antigénicos, vía activación con diciclohexilcarbodiimida.
La Figura 32 muestra la estructura molecular de
ácido tiosalicílico unido a una superficie de iminodiacetato
(IDA)-Cu(II).
La Figura 33 muestra el espectro de masas del
dominio de dimerización de receptor de estrógenos humano desorbido
de la superficie de ácid
tiosalicílico-IDA-Cu(II).
La Figura 34 muestra la estructura molecular de
ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinámico
unido a una superficie de DEAE.
La Figura 35A muestra el espectro de masas del
dominio de dimerización del receptor de estrógenos humano desorbido
de la superficie de ácido sinapínico-DEAE. La Figura
35B muestra el espectro de masas de mioglobina desorbida de una
superficie de ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinámico-DEAE.
La Figura 36 muestra la estructura molecular de
ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinámico
unido a una superficie de poliestireno.
La Figura 37 muestra el análisis de la secuencia
de C-terminal del dominio de unión a metal de
glicoproteína rica en histidina, inmovilizada a la superficie vía
enlace fotolítico.
Será manifiesto para el experto en la técnica que
se pueden realizar diversas sustituciones y modificaciones a la
invención descrita en este documento sin separarse del alcance de
la invención.
El desarrollo de nuevas composiciones para
elementos de sonda de MS con superficies que permitan que el
elemento de sonda participe activamente en la captura y
acoplamiento de analitos específicos ha definido varias nuevas
oportunidades en el área que ahora se describe como espectrometría
de masas de afinidad (AMS). Resumiendo, se han diseñado varios
tipos de nuevos elementos de sonda para MS con superficies
mejoradas para la captura por afinidad (SEAC). Tales elementos de
sonda con SEAC también se dan a conocer en una publicación por los
inventores (Hutchens y Yip, Rapid Commun. Mass Spectrom.
7:576-580 (1993)), que se publicó tras la presente,
fecha de prioridad de EE.UU. de 28 de Mayo de 1993. Los elementos
de sonda con SEAC se han usado de forma exitosa para recobrar y
trabar diferentes clases de biopolímeros, particularmente
proteínas, explotando lo que se conoce sobre estructuras de
superficies proteínicas y reconocimiento molecular
bioespecífico.
El progreso en la biología estructura continúa
estando limitado por la incapacidad para obtener una información de
la secuencia de biopolímeros a una velocidad aceptable o a un nivel
aceptable de sensibilidad. Utilizando los métodos y aparatos de la
presente invención, se ha demostrado que la AMS proporciona una
oportunidad para aliviar esta limitación. Debido a que los
dispositivos de captura por afinidad inmovilizados en la superficie
del elemento de sonda para MS (es decir, SEAC) determinan la
localización y la afinidad (especificidad) del analito por la
superficie de la sonda, el proceso analítico subsiguiente con AMS
es mucho más eficiente por varias razones. En primer lugar, la
localización del analito sobre la superficie del elemento de sonda
está predeterminada. De este modo, la desorción subsiguiente no
depende ya más de una búsqueda aleatoria del campo de la matriz de
la superficie de la sonda con el haz de láser incidente. En segundo
lugar, se aumenta la sensibilidad de la detección del analito (y el
intervalo dinámico) debido a que se eliminan los efectos de
supresión de la ionización molecular a menudo observados con
mezclas de complejos. En tercer lugar, el analito trabado, que no se
consume realmente por el proceso de desorción inicial inducido por
láser, permanece disponible para análisis subsiguientes. Si se usó
una matriz exógena para promover la desorción del analito, se
elimina, en la mayoría de los casos, sin pérdida del analito
trabado. El analito que queda se puede modificar entonces química
y/o enzimáticamente directamente in situ (es decir, mientras
que aún está sobre el elemento de sonda). Cuando se analiza
nuevamente por MS para determinar diferencias en la masa, se
revelan detalles estructurales específicos. El procedimiento
completo de análisis/modificación se puede repetir muchas veces
para obtener una información estructural mientras se consumen sólo
cantidades muy pequeñas de analito (algunas veces sólo unos pocos
femtomoles o menos). Las demostraciones de los análisis de
estructura de proteínas basados en AMS han incluido hasta la fecha
tanto análisis de secuencias N- y C-terminales como
la verificación de varios tipos de modificaciones
post-traduccionales específicas de la secuencia que
incluyen fosforilación y desfosforilación, glicosilación,
reactividad con residuos de cisteína, modificaciones químicas
específicas del sitio (por ejemplo, residuos de histidina), y unión
a ligandos.
Más allá de las determinaciones de las secuencias
de biopolímeros y de la solución de estructuras de biopolímeros
individuales, está la capacidad para comprender los determinantes
estructurales de las disposiciones supramoleculares funcionales. La
oportunidad para investigar los determinantes estructurales de
estructuras de orden superior (por ejemplo, cuaternarias) también
se presenta mediante AMS. Se ha demostrado usando la presente
invención que los sucesos de reconocimiento molecular no covalentes,
algunos no observados fácilmente por procedimientos bioanalíticos
más tradicionales (que a menudo requieren la perturbación del
equilibrio y condiciones de disociación de la estructura), se
investigan directamente por la evaluación de asociaciones
moleculares (es decir, reconocimiento) con analitos macromoleculares
que han sido trabados, directa o indirectamente, a la superficie
del elemento de sonda.
Como se usa en este documento, "analito" se
refiere a cualquier átomo y/o molécula, incluyendo sus complejos e
iones de fragmentos. En el caso de macromoléculas biológicas,
incluyen pero no se limitan a proteínas, péptidos, ADN, ARN,
hidratos de carbono, esteroides, y lípidos. Obsérvese que las
biomoléculas más importantes bajo investigación, por su implicación
en la estructura o regulación de procesos vitales, son bastante
grandes (típicamente varios miles de veces más grandes que
H_{2}O).
Como se usa en este documento, la expresión
"iones moleculares" se refiere a moléculas en el estado
cargado o ionizado, típicamente por adición o pérdida de uno o más
protones (H^{+}).
Como se usa en este documento, la expresión
"fragmentación molecular" o "iones fragmentos" se refiere
a productos de ruptura de moléculas de analito provocados, por
ejemplo, durante la desorción inducida por láser (especialmente en
ausencia de matriz añadida).
Como se usa en este documento, la expresión
"fase sólida" se refiere a la condiciónde estar en estado
sólido, por ejemplo sobre la superficie del elemento de sonda.
Como se usa en este documento, "gas" o
"fase de vapor" se refiere a moléculas en el estado gaseoso
(es decir, a vacío para espectrometría de masas).
Como se usa en este documento, la expresión
"desorción/ionización de analito" se refiere a la transición
de analitos desde la fase sólida a la fase gaseosa como iones.
Obsérvese que la desorción/ionización con éxito de grandes iones
moleculares intactos mediante desorción por láser es relativamente
reciente (aproximadamente 1988)- el gran adelanto fue el
descubrimiento casual de una matriz apropiada (ácido
nicotínico).
Como se usa en este documento, la expresión
"iones moleculares en fase gaseosa" se refiere a aquellos
iones que entran en la fase gaseosa. Obsérvese que los iones de
gran masa molecular, tales como proteínas (masa típica = 60.000 a
70.000 veces la masa de un único protón), no son típicamente
volátiles (es decir, normalmente no entran en la fase gaseosa o de
vapor). Sin embargo, en el procedimiento de la presente invención,
los iones de gran masa molecular, tales como proteínas, sí entran a
la fase gaseosa o de vapor.
Como se usa en este documento en el caso de
MALDI, el término "matriz" se refiere a uno cualquiera de
varios productos químicos pequeños, ácidos, que absorben la luz
(por ejemplo, ácido nicotínico o ácido sinapínico), que se mezcla en
disolución con el analito de tal manera que, al secar sobre el
elemento de sonda, las moléculas del analito embebidas en la matriz
cristalina se desorben con éxito (mediante irradiación por láser) y
se ionizan desde la fase sólida (cristales) a la fase gaseosa o de
vapor y se aceleran como iones moleculares intactos. Para que el
proceso MALDI tenga éxito, el analito se mezcla con una disolución
recientemente preparada de la matriz química (por ejemplo 10.000:1
de matriz:analito), y se coloca sobre la superficie inerte del
elemento de sonda para secarse al aire justo antes del análisis
espectrométrico de masas. El gran exceso molar de la matriz,
presente a concentraciones cerca de la saturación, facilita la
formación del cristal y el atrapamiento del analito.
Como se usa en este documento, "moléculas que
absorben energía (EAM)" se refiere a uno cualquiera de varios
productos químicos pequeños, que absorben luz, que, cuando están
presentes sobre la superficie de un elemento de sonda (como en el
caso de SEND), facilitan la desorción limpia de moléculas desde la
fase sólida (es decir, superficie) a la fase gaseosa o de vapor
para la aceleración subsiguiente como iones moleculares intactos.
Se prefiere el término EAM, especialmente con referencia a SEND.
Obsérvese que la desorción del analito mediante el procedimiento
SEND se define como un procedimiento dependiente de la superficie
(es decir, el analito puro se coloca sobre una superficie compuesta
de EAM unidas). Por contra, actualmente se piensa que MALDI facilita
la desorción del analito mediante un procedimiento de tipo erupción
volcánica que "lanza" a toda la superficie a la fase gaseosa.
Además, obsérvese que algunas EAM, cuando se usan como productos
químicos libres para embeber moléculas del analito, como se
describe para el proceso MALDI, no funcionarán (es decir, no
promueven la desorción molecular, y así no son moléculas de matriz
adecuadas).
Como se usa en este documento, "elemento de
sonda" o "dispositivo de presentación de la muestra" se
refiere a un elemento que tiene las siguientes propiedades: es
inerte (por ejemplo, típicamente acero inoxidable) y activo
(elementos de sonda con superficies potenciadas para
contener dispositivos de captura molecular).
Como se usa en este documento, "MALDI" se
refiere a desorción/ionización por láser asistida por matriz.
Como se usa en este documento, "TOF"
significa tiempo de vuelo.
Como se usa en este documento, "MS" se
refiere a espectrometría de masas.
Como se usa en este documento, "MS
MALDI-TOF" se refiere a espectrometría de masas
de tiempo de vuelo con desorción/ionización por láser asistida por
matriz.
Como se usa en este documento, "ESI" es una
abreviatura de ionización por electropulverización.
Como se usa en este documento, "enlaces
químicos" se usa simplemente como un intento para distinguir una
manipulación racional, deliberada y cognoscible de clases conocidas
de interacciones químicas desde los tipos pobremente definidos de
adherencia general observados cuando una sustancia química (por
ejemplo, matriz) se coloca sobre otra sustancia (por ejemplo, una
superficie inerte del elemento de sonda). Los tipos de enlaces
químicos definidos incluyen enlaces electrostáticos o iónicos (+/-)
(por ejemplo, entre grupos positiva y negativamente cargados en una
superficie proteínica), enlaces covalentes (enlaces muy fuertes o
"permanentes" que resultan de una verdadera compartición de
electrones), enlaces covalentes coordinados (por ejemplo, entre
grupos dadores de electrones en proteínas e iones metálicos de
transición tales como cobre o hierro), e interacciones hidrófobas
(tales como entre dos grupos no cargados).
Como se usa en este documento, "grupos dadores
de electrones" se refiere al caso de la bioquímica en el que los
átomos en las biomoléculas (por ejemplo, N, S, O) "dan" o
comparten electrones con grupos pobres en electrones (por ejemplo,
iones de Cu y otros iones de metales de transición).
Existe una categoría general de elementos de
sonda (es decir, medios de presentación de las muestras) con
superficie potenciada para la desorción/ionización por láser
(SELDI), dentro de la cual hay tres (3) subcategorías separadas.
Superficies potenciadas para la desorción limpia (SEND) en las que
las superficies del elemento de sonda (es decir, los medios
que presentan las muestras) se diseñan para contener moléculas que
absorben energía (EAM) en lugar de "una matriz" para facilitar
la desorción/ionización de analitos añadidos directamente
(limpiamente) a la superficie. Obsérvese que esta categoría 1
(SEND) se usa sola o en combinación con superficies potenciadas para
la captura por afinidad (SEAC) (categoría 2), que es según la
presente invención, en la que las superficies del elemento de sonda
(es decir, los medios de presentación de las muestras) se diseñan
para que contengan dispositivos de captura por afinidad químicamente
definidos y/o biológicamente definidos para facilitar la unión o
adsorción específica o no específica (el denominado acoplamiento o
trabamiento) de analitos a la superficie de la sonda, mediante una
variedad de mecanismos (principalmente no covalentes). Obsérvese
que la categoría 2 (SEAC), que es según la presente invención, se
usa con una matriz añadida. De este modo, la combinación de SEND y
SEAC representa actualmente una categoría distinta.
\newpage
La categoría 3 implica superficies potenciadas
para la anexión y liberación fotolábil (SEPAR) en la que la
superficie del elemento de sonda (es decir, los medios que
presentan las muestras) se diseñan/modifican para que contengan uno
o más tipos de moléculas reticulantes químicamente definidas para
que sirvan como dispositivos de acoplamientos covalentes.
Estas moléculas de anexión fotolábil (PAM) son de carácter
bivalente o multivalente, esto es, se hace reaccionar primero un
lado para que se una permanentemente las PAM a la superficie del
elemento de sonda de los medios que presentan las muestras, y
entonces el otro lado o lados reactivos de las PAM está listo para
hacerlo o hacerlos reaccionar con el analito cuando el analito
entra en contacto con la superficie de sonda derivatizada con PAM.
Tales superficies (es decir, medios que presentan las muestras)
permiten procesos de unión o adsorción (es decir, acoplamiento o
trabamiento) muy fuerte (es decir, covalente, estable) del analito
que son covalentes pero reversibles con la radiación (es decir,
fotolábiles). Tales superficies representan plataformas para la
desorción dependiente del láser de analitos que han de ser química
y/o enzimáticamente modificados in situ (es decir,
directamente sobre la punta de la sonda) con el fin de la
elucidación estructural. Sólo se desorben aquellos analitos sobre la
superficie de la sonda que están realmente irradiados (pequeño
porcentaje del total). El resto de los analitos trabados permanecen
unidos covalentemente y se modifican sin pérdida debido a cierto no
acoplamiento inadvertido de la superficie. Obsérvese que la
categoría SEPAR (categoría 3) se caracteriza por procedimientos de
unión a analito que son reversibles con la exposición a la luz. Sin
embargo, la inversión dependiente de la luz del enlace o enlaces de
unión a la superficie del analito no permite necesariamente la
desorción del analito en la fase gaseosa per se. En otras palabras,
las moléculas responsables de la unión fotolábil de los analitos a
la superficie de la sonda no son necesariamente las mismas que las
moléculas que absorben energía (EAM) descritas para SEND. Pero aquí
hay una importante excepción. La presente descripción muestra
algunos productos químicos de EAM/PAM híbridos que tienen una
funcionalidad dual con respecto a SEND y SEPAR. Esto es, algunas
moléculas de EAM usadas actualmente para SEND se pueden modificar
para que actúen como mediadores tanto en los procesos SEND como
SEPAR. De forma similar, se proporcionan algunos compuestos
químicos de afinidad por captura/PAM híbridos que tienen
funcionalidad dual con respecto a SEAC y SEPAR. La presente
descripción usa algunos dispositivos de captura por afinidad,
particularmente aquellos que están definidos biológicamente, que
están modificados para actuar como mediadores tanto de los procesos
de SEAC como SEPAR.
La descripción presenta un medio de presentación
de las muestras (es decir, superficie del elemento de sonda) con
moléculas asociadas a la superficie (o unidas a la superficie) para
promover la anexión (trabamiento o anclaje) y desunión subsiguiente
de moléculas de analito trabado de una manera dependiente de la luz,
en el que la mencionada o mencionadas moléculas de la superficie se
seleccionan del grupo que constan de moléculas fotoactivas
(fotolábiles) que participan en la unión (acoplamiento,
trabamiento, o reticulación) de moléculas del analito al medio que
presenta la muestra (mediante mecanismos de unión covalente o de
otro modo. Además, también se presenta un medio de presentación de
las muestras (compuesto de uno o más materiales del elemento de
sonda adecuados descritos en las reivindicaciones previas), en el
que el analito o analitos están unidos a la superficie de dicho
medio de presentación de las muestras mediante uno o más enlaces
fotolábiles de forma que el pulso o pulsos incidentes de luz (por
ejemplo, procedente de uno o más láseres) se usa para romper el o
los enlaces fotolábiles trabando al analito o analitos a la
superficie del elemento de sonda de una manera que es consistente
con la desorción subsiguiente del analito de la superficie de la
fase estacionaria (sólida) de la sonda en la fase gaseosa (de
vapor).
La especificidad o especificidades químicas que
determinan el tipo y número de dichos puntos de unión de la
molécula fotolábil entre los medios que presentan las muestras de
SEPAR (es decir, superficie del elemento de sonda) y el analito (por
ejemplo, proteína) pueden implicar uno cualquiera o más de un
número de residuos diferentes o estructuras químicas en el analito
(por ejemplo, residuos de His, Lys, Arg, Tyr, Phe y Cys, en el caso
de proteínas y péptidos). En otras palabras, en el caso de proteínas
y péptidos, el medio de presentación de las muestras de SEPAR puede
incluir superficies de sonda modificadas con varios tipos
diferentes de moléculas de unión fotolábiles para asegurar al
analito o analitos con una pluralidad de diferentes tipos de puntos
de unión.
La longitud de onda de la luz o intensidad de la
luz (o ángulo incidente) requeridos para romper la unión o uniones
fotolábiles entre el analito y la superficie del elemento de sonda
pueden ser iguales o diferentes a la longitud de la luz o
intensidad de la luz (o ángulo incidente) requeridos para promover
la desorción del analito desde la fase estacionaria a la fase de
gas o de vapor.
La unión fotolábil del analito o analitos a la
superficie del elemento de sonda (es decir, medio de presentación
de las muestras), particularmente biopolímeros tales como péptidos,
proteínas, ácido ribonucleico (ARN), ácidos desoxirribonucleicos
(ADN), e hidratos de carbono (CHO), puede implicar múltiples puntos
de unión entre la superficie de la sonda y la macromolécula del
analito. Una vez que el biopolímero se une vía múltiples puntos de
unión, los diferentes puntos en la cadena principal del biopolímero
se pueden cortar o fragmentar deliberadamente mediante medios
químicos y/o enzimáticos de forma que muchos de los fragmentos
resultantes son ahora analitos separados y distintos, cada uno aún
unido (trabado) a la superficie de la sonda por uno o más enlaces
fotolábiles, para ser desorbidos en la fase gaseosa en paralelo para
análisis másicos simultáneos con un analizador de masas de tiempo
de vuelo. Este procedimiento permite que se realicen
determinaciones de secuencias de biopolímeros (proteína, péptidos,
ARN, ADN, hidrato de carbono).
Como se usa en este documento, "afinidad" se
refiere a la atracción física y/o química entre dos moléculas.
Típicamente se usa por naturaleza para fines de estructura o
regulación de bioactividad (es decir, transferencia de información).
Habitualmente la afinidad de una biomolécula por otra es bastante
específica. Se usa en el presente caso para describir el principio
por el que los analitos moleculares de interés son capturados. En
el caso de SEAC, los productos químicos o biomoléculas con una
afinidad característica por el analito o analitos de interés se
traban (unen) a la superficie del elemento de sonda para
"buscar" activamente y unirse selectivamente al analito
deseado.
Como se usa en este documento, "reconocimiento
molecular" se refiere al suceso de interacción entre dos
moléculas con una afinidad natural entre sí.
Como se usa en este documento, "captura
molecular" se refiere al uso de biomoléculas trabadas para atraer
y unirse (capturar) otras biomoléculas para las que existe una
relación de afinidad específica.
Como se usa en este documento, "adsorción
pasiva" se refiere al hecho de colocar simplemente el analito
(por ejemplo, con una matriz).
Como se usa en este documento, "acoplamiento
activo" se refiere a la captura deliberada de moléculas de
analito sobre la superficie de un elemento de sonda activo como en
el caso de SEAC.
Como se usa en este documento, "fase
estacionaria" significa lo mismo que fase sólida. En el presente
contexto, es tanto la propia superficie del elemento de sonda como
uno de los dispositivos SEND o SEAC en partículas "externo"
usado en conjunción con una superficie del elemento de sonda
inerte.
Como se usa en este documento, "área específica
activa" se refiere a aquella área de la superficie que se piensa
o se sabe que participa en la reacción o suceso deseados (por
ejemplo, unión de EAM o captura por afinidad). El área específica
activa puede ser significativamente menor que el área específica
total (debido a los efectos físicos tales como impedimento
estérico, parte del área total puede no estar disponible o ser
útil).
Como se usa en este documento, "ligando" se
refiere a una molécula relativamente pequeña (cebo) que se une a
una gran biomolécula (pez). En el caso presente, los ligandos se
unen (químicamente unidos) a través de un brazo enlazante (línea de
pesca) a la superficie del elemento de sonda. Este procedimiento
permite que el suceso de captura biomolecular esté localizado en la
superficie (fase estacionaria o sólida).
Como se usa en este documento, "reactivo de
afinidad" se refiere a un dispositivo de captura de analito, es
decir, la clase de moléculas (tanto obtenida por el hombre, no
natural, natural y biológica) y/o compuestos que tienen la capacidad
de ser retenidos en la superficie de presentación de las muestras
(mediante enlace covalente, adsorción química, etc.) a la vez que
retienen la capacidad de reconocimiento y enlace a un analito.
Como se usa en este documento, "desorción"
se refiere a la partida del analito de la superficie y/o la entrada
del analito en una fase gaseosa.
Como se usa en este documento, "ionización"
se refiere al proceso de crear o retener en un analito una carga
eléctrica igual a más o menos una o más unidades electrónicas.
Como se usa en este documento, "aducto" se
refiere a la aparición de una masa adicional asociada con el
analito y provocada habitualmente por la reacción de exceso de
matriz (o productos de ruptura de la matriz) directamente con el
analito.
Como se usa en este documento, "adsorción"
significa la unión química (covalente y/o no covalente) de las
moléculas que absorben energía, el reactivo de afinidad (es decir,
el dispositivo de captura del analito), y/o el analito a la sonda
(superficie presentadora).
Una realización de la presente invención es un
aparato para medir la masa de una molécula de analito de una
muestra de analito por medio de espectrometría de masas,
comprendiendo dicho aparato: un tubo de espectrómetro; un medio de
vacío para aplicar vacío al interior de dicho tubo; un medio de
potencial eléctrico dentro del tubo para aplicar un potencial
eléctrico acelerador para desorber moléculas del analito de dicha
muestra de analito; un medio de presentación de las muestras que se
puede insertar de forma retirable en dicho tubo de espectrómetro,
para exponer dicha muestra de analito en asociación con una
molécula asociada a la superficie para promover la desorción e
ionización de dichas moléculas de analito, en el que dicha molécula
de superficie es un dispositivo de captura por afinidad (reactivo
de afinidad) y se proporciona una material matriz que ayuda a la
desorción/ionización en asociación con el reactivo de afinidad sobre
la citada superficie; una muestra de analito depositada sobre dicho
medio de presentación de las muestras en asociación con dichas
moléculas asociadas a la superficie; con lo que al menos una
porción de dichas moléculas de analito no consumidas en dicho
análisis de espectrometría de masas permanecerá accesible para
procedimientos subsiguientes químicos, biológicos o físicos
analíticos; un medio de haz de láser para producir un haz de láser
dirigido a dicha muestra de analito para dar suficiente energía
para desorber e ionizar una porción de dichas moléculas de analito
desde dicha muestra de analito; y un medio detector asociado con
dicho tubo de espectrómetro para detectar el impacto de moléculas de
analito ionizadas aceleradas sobre él.
Otra realización de la presente invención es un
método en espectrometría de masas para medir la masa de una
molécula de analito, comprendiendo dicho método las etapas de:
derivatizar una superficie de presentación de las muestras en una
cara de la punta de la sonda con un dispositivo de captura por
afinidad que tiene un medio para unirse con una molécula de
analito; exponer dicha cara de la punta de la sonda derivatizada a
una fuente de dicha molécula de analito para unir dicha molécula de
analito a aquélla; colocar la punta de sonda derivatizada con
dichas moléculas de analito unidas a ella en un extremo de un
espectrómetro de masas de tiempo de vuelo y aplicar vacío y un campo
eléctrico para formar un potencial acelerador en el espectrómetro;
golpear al menos una porción de las moléculas de analito unidas a
dicha cara de la punta de la sonda derivatizada en el espectrómetro
con uno o más pulsos de láser a fin de desorber iones de dichas
moléculas de analito desde dicha punta; detectar la masa de los
iones mediante su tiempo de vuelo en dicho espectrómetro de masas;
y mostrar tal masa detectada. En este método, se aplica un material
matriz que ayuda a la desorción/ionización a dicha cara de la punta
de la sonda en asociación con dicho dispositivo de captura por
afinidad. En una realización más preferida, el método según la
invención comprende además retirar dicha punta de la sonda de dicho
espectrómetro de masas; realizar un procedimiento químico o
biológico sobre dicha porción de dichas moléculas de analito no
desorbidas para alterar la composición de dicha porción de dichas
moléculas de analito no desorbidas; reinsertar dicha punta de la
sonda con dichas moléculas de analito alteradas sobre ella; y
realizar posteriores análisis de espectrometría de masas para
determinar el peso molecular de dichas moléculas de analito
alteradas.
En una realización adicional, dicho dispositivo
de captura por afinidad está enlazado químicamente a dicha cara de
dicha punta de la sonda, está adherido físicamente a dicha cara de
dicha punta de la sonda, está adaptado para unirse químicamente a
dichas moléculas de analito, o está adaptado para adherirse
biológicamente a dichas moléculas de analito. En una realización
posterior, dichas moléculas de analito son biomoléculas y dicho
reactivo de afinidad está adaptado para aislar selectivamente dichas
biomoléculas a partir de una muestra biológica no diferenciada.
En una realización preferida, dichos materiales
matriz están en el intervalo de pH débilmente ácido a fuertemente
básico. En una realización más preferida, dichos materiales matriz
tienen un pH por encima de 6,0. Además, una realización adicional
presenta la cara de dicha punta de sonda formada por un material
eléctricamente aislante.
En otra realización posterior del aparato de la
presente invención para facilitar la desorción e ionización de
moléculas de analito, dicho aparato comprende: una superficie de
presentación de las muestras; y una superficie asociada a la
molécula, en el que dicha superficie asociada a la molécula es un
dispositivo de captura por afinidad (reactivo de afinidad), estando
asociada dicha superficie asociada a la molécula con dicha
superficie de presentación de las muestras y que tiene un medio para
unirse con dichas moléculas del analito. En dicha superficie se
proporciona un material matriz que ayuda a la desorción/ionización
en asociación con el agente de afinidad.
En una realización preferida, dicha superficie de
presentación de las muestras comprende la superficie de una punta
de sonda para uso en un analizador de espectrometría de masas de
tiempo de vuelo. Además, la realización preferida presenta un
dispositivo de captura por afinidad que está enlazado químicamente a
dicha superficie de presentación de las muestras, está adherido
físicamente a dicha superficie de presentación de las muestras,
está enlazado químicamente a dichas moléculas de analito o está
adaptado para adherirse biológicamente a dichas moléculas de
analito. Además, la realización preferida presenta moléculas de
analito que son biomoléculas, y dicho dispositivo de captura por
afinidad está adaptado para aislar selectivamente dichas
biomoléculas a partir de una muestra biológica no diferenciada.
Como se ha mencionado anteriormente, el aparato
tiene un material matriz depositado sobre dicha superficie que
presentan las muestras en asociación con dicho dispositivo de
captura por afinidad (reactivo de afinidad). En una realización más
preferida, el material matriz está en el intervalo de pH débilmente
ácido a fuertemente básico. En una realización más preferida, el
material matriz tiene un pH por encima de 6,0. Adicionalmente, una
realización preferida incluye una superficie de presentación de las
muestras formada por un material eléctricamente aislante.
En una realización adicional de la presente
invención, se presenta un método para capturar moléculas de analito
en una superficie de presentación de las muestras, y
desorber/ionizar dichas moléculas del analito capturadas procedentes
de dicha superficie de presentación de las muestras para el
análisis subsiguiente, comprendiendo dicho método: derivatizar
dicha superficie de presentación de las muestras con un dispositivo
de captura por afinidad que tiene un medio para unirse con dichas
moléculas de analito; exponer dicha superficie de presentación de
las muestras derivatizada a una muestra que contiene dichas
moléculas de analito; capturar dichas moléculas de analito en dicha
superficie de presentación de las muestras derivatizada por medio
de dicho dispositivo de captura por afinidad; y exponer dichas
moléculas de analito, mientras están unidas a dicha superficie de
presentación de las muestras derivatizada por medio de dicho
dispositivo de captura por afinidad, a una fuente de energía o de
luz para desorber al menos una porción de dichas moléculas de
analito de dicha superficie. Este método también comprende la etapa
de depositar un material matriz que ayuda a la desorción/ionización
a dicha superficie de presentación de la muestra en asociación con
dicho dispositivo de captura por afinidad (reactivo de
afinidad).
Una realización adicional de la presente
invención es un método para preparar una superficie que presenta
moléculas de analito para análisis, comprendiendo dicho método:
proporcionar un sustrato sobre dicha superficie para soportar dicho
analito; derivatizar dicho sustrato con un dispositivo de captura
por afinidad que tiene un medio para unirse selectivamente con
dicho analito; depositar un material matriz que ayuda a la
desorción/ionización en dicha superficie de presentación de las
muestras en asociación con dicho dispositivo de captura por
afinidad (reactivo de afinidad); y un medio para detectar dichas
moléculas de analito enlazadas con dicho dispositivo de captura por
afinidad. En una realización preferida, se proporciona la etapa
adicional de aplicar un material de detección a dicha superficie.
En una realización más preferida, tal material de detección
comprende una especie fluorescente, una especie enzimática, una
especie radioactiva, o una especie que emite luz.
En una realización adicional preferida, la fuente
de energía comprende un láser. En otra realización preferida, se
usa un dispositivo de captura por afinidad, y dicha fuente de
energía comprende una fuente de iones. Además, una realización
preferida puede incluir una porción de dichas moléculas de analito
que permanecen unidas a dicha superficie de presentación de las
muestras tras la exposición a dicha fuente de energía. En una
realización más preferida, se incluyen las etapas adicionales de
convertir al menos una porción de las moléculas de analito que
quedan unidas en dicha superficie de presentación de las muestras
derivatizada en moléculas de analito modificadas mediante reacción
química, biológica o física, en las que dichas moléculas de analito
permanecen unidas a dicha superficie de presentación de las
muestras derivatizada por medio de dicho dispositivo de captura por
afinidad; y exponer dichas moléculas de analito modificadas a una
fuente de energía para desorber al menos una porción de dichas
moléculas de analito modificadas de dicha superficie.
En un ejemplo no realizado de la presente
invención, se proporciona una sonda de muestra para promover la
desorción de analitos intactos en la fase gaseosa, que comprende:
una superficie de presentación de las muestras; y una molécula que
absorbe energía asociada con dicha superficie de presentación de
las muestras, en el que dicha sonda de muestra promueve la
desorción de una molécula de analito intacta colocada en, encima o
entre las moléculas que absorben energía cuando dicha sonda de
muestra es golpeada mediante una fuente de energía. En un ejemplo
adicional, la molécula que absorbe energía se selecciona del grupo
que consta de cinamamida, bromuro de cinamilo, ácido
2,5-dihidroxibenzoico y ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinámico.
También en un ejemplo, se puede utilizar una superficie de
presentación de las muestras seleccionada del grupo que consta de
vidrio, materiales cerámicos, materiales magnéticos revestidos con
teflón (marca registrada), polímeros orgánicos y biopolímeros
naturales.
En otra realización de la presente invención, se
proporciona una sonda de muestra para promover la desorción de
analitos intactos en la fase gaseosa, que comprende: una superficie
de presentación de las muestras; y un dispositivo de captura por
afinidad asociado con dicha superficie de presentación de las
muestras; en el que, cuando dicha sonda de muestra es golpeada por
una fuente de energía, dicha sonda de muestra promueve la
transición de una molécula de analito intacto a la fase gaseosa. Se
proporciona sobre dicha superficie un material matriz que ayuda a la
desorción/ionización en asociación con el dispositivo de captura
por afinidad (reactivo de afinidad). El dispositivo de captura por
afinidad se selecciona de iones metálicos, proteínas, péptidos,
ácidos nucleicos, hidratos de carbono, y sus combinaciones. El
dispositivo de captura por afinidad puede ser un anticuerpo,
lectina, unión Cu(II) o unión Fe(III). Puede ser de
este modo una inmunoglobulina. En otra realización preferida, la
superficie de presentación de las muestras se selecciona del grupo
que consta de vidrio, materiales cerámicos, materiales magnéticos
revestidos con teflón (marca registrada), polímeros orgánicos y
biopolímeros naturales.
En otra realización, la sonda de muestra de la
invención comprende una superficie de presentación de las muestras
y al menos dos dispositivos de captura por afinidad diferentes
asociados con dicha superficie de presentación de las muestras; en
el que, cuando dicha sonda de muestra es golpeada por una fuente de
energía, dicha sonda de muestra promueve la transición de una
molécula de analito a la fase gaseosa a diferentes velocidades
dependiendo del dispositivo de captura por afinidad asociado con
dichas moléculas de analito.
En una realización preferida, el analito se
desorbe selectivamente de la mezcla tras el golpe mediante la
fuente de energía. En otra realización preferida, los dispositivos
de captura por afinidad están dispuestos en disposiciones
predeterminadas. En una realización más preferida, las
disposiciones absorben selectivamente una pluralidad de diferentes
analitos.
En una realización más preferida, se usa un
aparato de la presente invención para cuantificar un analito; en el
que la posición y cantidad de los dispositivos de captura por
afinidad determinan la cantidad de analito adsorbido. En otra
realización preferida, la unión puede ser selectiva o no
selectiva.
En una realización adicional, una sonda de
muestra para promover la desorción del analito intacto a la fase
gaseosa comprende: una superficie de presentación de muestras; y
una molécula asociada a la superficie, en el que dicha molécula
asociada a la superficie puede funcionar tanto como una molécula
que absorbe energía como un dispositivo de captura por
afinidad.
Otra realización muestra un método para la
determinación de la secuencia de biopolímeros que comprende las
etapas de: unir un analito biopolimérico a la punta de una sonda
que contiene una superficie de presentación de las muestras que
tiene una molécula asociada a la superficie, en el que la molécula
asociada a la superficie es un dispositivo de captura por afinidad;
desorber el analito biopolimérico en el análisis de espectrometría
de masas, en el que al menos una porción de dicho biopolímero no
está desorbido de la punta de la sonda; analizar los resultados de
la desorción; modificar el analito biopolimérico aún unido a la
punta de la sonda; y repetir las etapas de desorción, análisis y
modificación hasta que se secuencia el biopolímero. En una
realización preferida, el biopolímero se selecciona del grupo que
consta de proteína, ARN, ADN e hidratos de carbono.
Los siguientes ejemplos incluyen ejemplos que
describen realizaciones específicas ilustrativas de la presente
invención, y que no pretenden limitar el alcance de la invención,
que se define por las reivindicaciones anejas. También se dan otros
ejemplos no realizados de la invención.
Los Ejemplos utilizan un espectrómetro de masas
de tiempo de vuelo con una fuente de alta energía, tal como un haz
de láser, para vaporizar el analito desde la superficie de una
punta de sonda. En el procedimiento, algunas de las moléculas se
ionizan. Las moléculas positivamente cargadas se aceleran entonces
a través de un campo corto de alto voltaje y entran en un tubo de
vuelo libre de campos. Un detector sensible colocado en el extremo
del tubo de vuelo da una señal a medida que el ion molecular lo
golpea. El experto en la técnica reconoce que también se pueden
usar otros modos de detección e ionización.
El material matriz de la técnica anterior usado
en una espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción con
láser ayudada en matriz es fuertemente ácido. Uno de los
descubrimientos actuales es que los analitos se desorben cuando se
mezclan con moléculas que absorben energía neutralizadas disueltas
en disolventes completamente acuosos. Mediante la neutralización
adecuada a pH 6,0 o superior, el material matriz se hace
enormemente pasivo a las posteriores reacciones químicas o
enzimáticas llevadas a cabo sobre las moléculas de analito
presentes en las superficies de la punta de la sonda. Puesto que
sólo se usa una pequeña fracción de las moléculas de analito en cada
medida del espectrómetro de masas por desorción, las muestras en
las puntas de la sonda están disponibles para las modificaciones
secuenciales in situ químicas o enzimáticas. Tras la
modificación, las muestras se analizan mediante espectrometría de
masas. El análisis en las mismas puntas de la sonda proporciona una
determinación más exacta de la molécula y sus características,
incluyendo su estructura.
La espectrometría de masas se realiza en un
espectrómetro de masas de tiempo de vuelo Vestec modificado modelo
VT2000 o un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo MAS modelo
SELDI Research Linear que usa una salida de frecuencia triple
procedente de un láser pulsado de
neodimio-itrio-aluminio
(Nd-YAG) (355 nm, 5 ns de pulso). Los iones
desorbidos por la radiación de láser pulsado son acelerados hasta
una energía de 30 keV y se deja que sean arrastrados a lo largo de
una región de arrastre libre de campos de 2 metros (mantenida a
10^{-6} torr). Las señales de los iones detectadas usando un
multiplicador electrónico dinódico discreto de 20 etapas son
amplificadas por un factor de 10 usando un preamplificador rápido
antes de ser registrados usando un registro transitorio de 200 MS/s
(LeCroy TR8828D, resolución en el eje y de 8 bits) o un
digitalizador Tektronix capaz de promediar la señal rápida. La
radiancia del láser se ajusta a tiempo real, mientras se monitoriza
el procedimiento en un osciloscopio (Tektronix), a fin de logra
runa señal iónica óptima. La reducción de datos (cálculos de
centroide del pico y conversiones de tiempo a masa/carga) se
realizan con un programa de ordenador para PC. También se puede
usar un espectrómetro de masas VG TOFSpec que usa un láser de
nitrógeno que genera un láser pulsado a 335 nm o un espectrómetro
de masas Linear LDI 1700 que usa un láser de nitrógeno que genera
un láser pulsado a 335 nm.
1. Se suspende ácido sinapínico (Aldrich Chemical
Co., Inc. Milwaukee, WI) en agua a 20 mg/ml (pH 3,88), y se
neutraliza con trietilamina (Pierce, Rockford, IL) hasta pH
6,2-6,5. Se mezcla una mezcla acuosa (1 l) de
péptidos sintéticos, que contienen dominios de unión a metal de
glicoproteína enriquecida con histidina humana (GHHPH)_{2}G
(1206 Da), (GHHPH)_{5}G (2904 Da), y el dominio de
dimerización de receptor de estrógenos humano
(D473-L525) (6168,4 Da), con 2 \mul de ácido
sinapínico (20 mg/ml de agua, pH 6,2) en una punta de sonda, y se
analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con
desorción por láser. Tras adquirir cinco espectros (100 disparos de
láser de media por espectro), se recupera la sonda, se añaden 2
\mul de Cu(SO_{4}) 20 mM, y la mezcla se vuelve a
analizar mediante espectrometría de masas. La Figura 1A (perfil
superior) muestra el espectro de masas de los tres péptidos
desorbidos en presencia de moléculas neutralizadas que absorben
energía. La Figura 1B (perfil inferior) muestra la unión in
situ a metal de los péptidos en presencia de moléculas neutras
que absorben energía. El péptido (GHHPH)_{2}G se puede
unir a al menos 4 iones Cu(II), el péptido
(GHHPH)_{5}G se puede unir a al menos 5 Cu(II), y
el dominio de dimerización se puede unir a al menos 1 Cu(II)
en las condiciones experimentales actuales. Se obtiene un resultado
similar con ácido \alpha-
ciano-4-hidroxicinámico (20 mg/ml de
agua) neutralizado hasta pH 6,5.
2. Se mezcla 1 alícuota de un \mul de
fosfopéptido de \beta-caseína humana
(R1-K18 + 5P) (2488 Da) con 1 \mul de ácido
sinapínico (20 mg/ml de agua) neutralizado hasta pH 6,5, y se
analizó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con
desorción con láser. Tras adquirir cinco espectros (100 disparos de
láser de media por espectro), se retiró la sonda, el fosfopéptido
restante mezclado con el ácido sinapínico neutralizado se digirió
directamente en la punta de la sonda mediante 0,5 \mul de
fosfatasa alcalina (Sigma), y se incubó a 23ºC durante 5 minutos.
Después de adquirir 5 espectros (100 disparos de láser de media por
espectro), se retiró la sonda, se llevó a cabo una digestión
adicional sobre los fosfopéptidos restantes añadiendo otra alícuota
de 0,5 l de fosfatasa alcalina, y se incubó a 23ºC durante 5
minutos. La muestra se volvió a analizar mediante espectrometría de
masas por desorción con láser. La Figura 2A (perfil superior)
muestra el espectro de masa del fosfopéptido desorbido en presencia
de moléculas neutralizadas que absorben energía. La Figura 2B
(segundo desde el perfil superior) muestra la digestión in
situ durante 5 minutos con fosfatasa alcalina para eliminar
grupos fosfato del fosfopéptido. Los picos 0P, 1P y 3P representan
los productos tras la eliminación de 5, 4 y 2 grupos fosfato,
respectivamente, del fosfopéptido. La Figura 2C (tercera desde el
perfil superior) muestra que una digestión adicional in situ
con fosfatasa alcalina puede dar como resultado casi la eliminación
completa de todos los grupos fosfato del fosfopéptido. Por contra,
la Figura 2D (perfil inferior) muestra que, en el experimento de
control, en el que se lleva a cabo la digestión in situ con
fosfatasa alcalina (0,5 \mul) en presencia de moléculas que
absorben energía sin neutralización anterior (por ejemplo ácido
sinapínico a pH 3,88, o ácido dihidroxibenzoico a pH 2,07), ocurrió
una digestión muy limitada en 10 minutos a 23ºC.
3. Se mezcló una alícuota de 1 \mul de péptido
(GHHPH)_{5}G (2904 Da) con 2 \mul de ácido sinapínico
(20 mg/ml de agua) neutralizado a pH 6,2, y se analizó mediante
espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser.
Tras adquirir cinco espectros (100 disparos de láser de media por
espectro), los péptidos restantes mezclados con ácido sinapínico
neutralizado se digirieron directamente en la punta de la sonda
mediante 1 \mul de carboxipeptidasa P (Boehringer Mannheim Corp,
Indianapolis, IN), y se incubó a 23ºC durante 30 minutos. La mezcla
se analizó mediante espectrometría de masas. La Figura 3 muestra
espectros de masas de material compuesto del péptido antes (perfil
inferior) y después (perfil superior) de la digestión in situ
por carboxipeptidasa P en presencia de moléculas neutralizadas que
absorben energía. La disminución en la masa representa la
eliminación de un residuo Gly del C-terminal del
péptido.
Este ejemplo ilustra que las moléculas
neutralizadas que absorben energía en disoluciones acuosas son más
biocompatibles conservando la estructura y función de los analitos
incluso cuando se añaden en un gran exceso molar. Su presencia no da
como resultado interferencia a las reacciones in situ
secuenciales químicas o enzimáticas sobre el analito que queda.
Se ha encontrado que los elementos de sonda
(puntas de sonda o superficies que presentan las muestras) usados
en el procedimiento de la invención no necesitan ser metales o
estar revestidos con metales, según se describe en los
procedimientos de la técnica anterior. Las superficies que
presentan las muestras están compuestas de una variedad de
materiales, que incluyen materiales porosos o no porosos,
proporcionando los materiales porosos áreas de tipo esponja,
poliméricas, de gran superficie específica para la adsorción
optimizada y presentación del analito.
Se funde polipropileno o poliestireno o
polietileno o policarbonato en una llama abierta, y se depositan
como una capa delgada sobre un elemento de sonda de acero
inoxidable de 2 mm de diámetro para cubrirlo completamente. Se corta
una varilla de vidrio sólido o filamentos de nailon sólidos (de
hasta 1,5 mm de diámetro) o una varilla de poliacrilamida en
segmentos de 1 cm, y se insertan en el soporte de la sonda de acero
inoxidable. Se insertan barras de agitación magnéticas (1,5 x 8 mm,
revestidas con teflón) en el soporte de la punta de la sonda de
acero inoxidable. Se mezcla una alícuota de 1 \mul de mezcla
peptídica que contiene (GHHPH)_{5}G y dominio de
dimerización de receptor de estrógenos humano, con 2 \mul de
ácido dihidroxibenzoico (disuelto en 30% de metanol, 0,1% de ácido
trifluoroacético) en cada uno de tales elementos de sonda, y se
analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con
desorción por láser. La Figura 4 muestra que los analitos se
pudieron desorber de varios ejemplos de superficies aislantes,
biocompatibles.
Estas superficies se pueden derivatizar (a
densidades variables) para unirse mediante enlaces químicos
(covalente o no covalente) a reactivos de adsorción por afinidad
(dispositivos de captura por afinidad), moléculas que absorben
energía (unión a moléculas "matriz") o moléculas de unión
fotolábiles. La geometría de la superficie de presentación de las
muestras se varía (es decir, tamaño, textura, flexibilidad, grosor,
etc.) para adecuar a las necesidades (por ejemplo, inserción en un
organismo vivo a través de espacios de tamaños predeterminados) del
experimento (ensayo).
Este ejemplo describe el uso de reactivos de
afinidad en fase sólida ya existentes y nuevos diseñados para (1)
la captura (adsorción) de uno o más analitos, (2) la preparación de
estos analitos capturados (por ejemplo, lavado con agua u otras
disoluciones tamponadas o no tamponadas para eliminar contaminantes
tales como sales, y ciclos múltiples de lavado, tales como con
disolvente orgánico polar, disolvente que disuelve detergentes,
ácido diluido, base diluida o urea), y (3) de forma más importante,
la transferencia directa de estos analitos capturados y preparados
a la superficie de la sonda para desorción subsiguiente del analito
(para detección, cuantificación y/o análisis de masas). Los
dispositivos de captura por afinidad están inmovilizados en una
variedad de materiales, que incluyen materiales eléctricamente
aislantes (porosos y no porosos), materiales flexibles o no
rígidos, materiales ópticamente transparentes (por ejemplo, vidrio,
que incluye vidrio de densidades variables, grosores, colores y con
índices de refracción variables), así como materiales menos
reactivos, más biocompatibles (por ejemplo, biopolímeros tales como
agarosa, dextrano, celulosa, almidones, péptidos, y fragmentos de
proteínas y de ácidos nucleicos). La punta preferida de la sonda, o
superficie de la muestra, para adsorción/presentación selectiva de
muestra para análisis de masas es (1) acero inoxidable (u otro
metal) con un revestimiento polimérico sintético (por ejemplo,
dextrano o agarosa reticulados, nailon, polietileno, poliestireno)
adecuado para la unión covalente de biomoléculas específicas u
otros reactivos de afinidad no biológicos, (2) vidrio o material
cerámico y/o (3) plásticos (polímeros sintéticos). Las estructuras
químicas implicadas en la inmovilización selectiva de reactivos de
afinidad a estas superficies de sonda englobarán la variedad
conocida de medios de inmovilización covalente o no covalente
dependientes de oxígeno, dependientes de carbono, dependientes de
azufre, y/o dependientes de nitrógeno.
1. Se queda un ion Cu(II) mediante el
grupo iminodiacetato (IDA) unido covalentemente a perlas de agarosa
porosas (Sepharose quelante de flujo rápido, Pharmacia Biotech
Inc., Piscataway, NJ, densidad del ligando 22-30
\mumoles/ml de gel) o bien a perlas de gel de sílice sólidas
(quelante TSK-SW, ToyoSoda, Japón, densidad del
ligando 15-20 \mumoles/ml de gel). Se mezcla una
mezcla de péptidos sintéticos que contienen neurotensina (1655 Da),
péptido activante del esperma (933 Da) y angiotensina I (1296,5 Da)
con un volumen empaquetado de 50 \mul de TSK-SW
IDA-Cu(II) a pH 7,0 (20 mM de fosfato de
sodio, cloruro de sodio 0,5 M) a 23ºC durante 10 minutos. El gel se
separa de la disolución peptídica restante por centrifugación, y
entonces se lava con 200 \mul de tampón de fosfato de sodio con
cloruro de sodio, pH 7,0, tres veces para eliminar los péptidos
unidos no específicamente. Finalmente, el gel se suspende en 50
\mul de agua. Se mezclan alícuotas de 2 \mul de suspensión de
gel y disolución peptídica no adsorbida con 1 \mul de ácido
sinapínico (disuelto en metanol) en una punta de sonda de acero
inoxidable, y se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo
de vuelo por desorción con láser. Tras adquirir cinco espectros
(media de 100 disparos de láser por espectro) en diversos puntos de
la punta de la sonda, se eliminó el ácido sinapínico mediante
metanol. Se añadió una alícuota de 2 \mul de CuSO_{4} 20 mM,
entonces se mezcló con 1 \mul de ácido sinapínico, y se volvió a
analizar mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo por
desorción con láser. Tras adquirir otros cinco espectros (media de
100 disparos de láser por espectro) en diversos puntos de la punta
de la sonda, el ácido sinapínico se eliminó mediante metanol. El
péptido restante adsorbido en perlas de gel de
IDA-Cu(II) se digirió entonces con 1 \mul
de tripsina (Sigma) en bicarbonato de sodio 0,1 M, pH 8,0, a 23ºC
durante 10 minutos en una cámara de humedad. Las perlas de gel se
lavaron entonces con agua para eliminar la enzima y la sal antes de
que se añadiera 1 \mul de ácido sinapínico, y la mezcla se
analizó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo por
desorción con láser. La Figura 5A muestra las señales moleculares (y
los múltiples aductos de Na) del factor activante del esperma (933
Da) y de neurotensina (1655 Da) en la disolución peptídica restante
no absorbida por IDA-Cu(II). No hay ningún
pico significativo que corresponde a la angiotensina I (1296,5 Da).
El espectro de masas en la Figura 5B muestra los picos de
angiotensina I más el aducto de Na que son adsorbidos
selectivamente sobre el gel de IDA-Cu(II).
Cuando el gel de IDA-Cu(II) se lavó
posteriormente con 500 \mul de agua, dos veces, el espectro de
masas resultante muestra sólo el ion progenitor de angiotensina I y
ningún pico de aductos (Figuras 5 y 6, perfiles C). La Figura 6D
muestra la unión in situ a cobre (1 y 2 Cu) por el péptido de
angiotensina. La Figura 6E muestra la digestión in situ con
tripsina del péptido de angiotensina en la posición única Arg2 en
la secuencia.
Este ejemplo ilustra que: a) la desorción con
láser se lleva a cabo con éxito sobre el analito adsorbido por
afinidad sobre el ion metálico inmovilizado a la superficie; b) una
vez unido, la superficie se lava con diversos disolventes para
eliminar todos los compuestos contaminantes en la muestra para dar
un espectro de masas muy limpio del analito; c) el dispositivo de
captura por afinidad selecciona sólo el analito de estructura
definida (en este caso, se adsorbe selectivamente la angiotensina I
de la mezcla peptídica mediante IDA-Cu(II)
debido a que este péptido tiene un N-terminal libre
y dos residuos aminoácidos de histidina en la secuencia,
propiedades ambas que se requieren para la unión fuerte a
Cu(II); mientras que tanto el factor activante del esperma
como la neurotensina tienen el N-terminal bloqueado
y ningún residuo aminoácido de histidina en su secuencia); d) los
análisis de estructura y de función mediante las modificaciones
secuenciales in situ químicas o enzimáticas se llevan a cabo
sobre el analito adsorbido con una pérdida mínima en cada etapa de
reacción y lavado; y e) se usa un elemento de sonda con un sustrato
(por ejemplo, angiotensina I) unido a superficie para monitorizar la
actividad enzimática específica (por ejemplo, tripsina) in
situ (por ejemplo, dentro del tubo gastrointestinal del cuerpo
humano).
2. Se mezcló una disolución de mioglobina de
corazón de caballo (325 pmoles, 16.952 Da) con 50 \mul de
TSK-SW IDA-Cu(II) a pH 7,0
(fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M) a 23ºC durante 10
minutos. El gel se separó de la disolución mediante centrifugación,
y entonces se lavó con 50 \mul de tampón, dos veces, y 500 \mul
de agua, dos veces. Entonces se estimó espectrofotométricamente la
cantidad de mioglobina restante en todas estas disoluciones, y
entonces se puede calcular la cantidad adsorbida sobre el gel. El
gel se suspende en 50 \mul de agua, y entonces se diluye en series
en agua. Se mezcla una alícuota de 0,5 \mul de la suspensión del
gel diluida con 1 \mul de ácido sinapínico (disuelto en 30% de
metanol, 0,1% de ácido trifluoroacético), y se analizó mediante
espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción con láser.
La Figura 7 muestra que se obtiene una señal detectable
(señal/ruido = 6, tras hacer la media de 50 disparos de láser) de
mioglobina con una cantidad calculada de 4 a 8 fmoles depositados
sobre la punta de la sonda.
Este ejemplo ilustra que los analitos adsorbidos
por afinidad sobre una superficie son mucho más fáciles de
transferir y están libres de cualquier pérdida por adsorción no
específica en la superficie del recipiente y de los dispositivos de
transferencia. El analito adsorbido se secuestra en áreas
predeterminadas (que incluso son menores que el tamaño del punto
del láser) de la superficie de presentación de las muestras en
cantidades bajas (ato a femtomoles) a una densidad definida de
superficie o concentración local requerida para la detección
eficiente mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo por
desorción/ionización con láser.
3. Se sintetizan péptidos de
\beta-caseína humana (E2-K18) en
un sintetizador de péptidos Applied Biosystem Modelo 430A usando el
protocolo NMP-HOBt. Los residuos de Ser a
fosforilar se acoplan a la cadena de péptido sin grupo protector de
la cadena lateral. La Ser no protegida se fosfinila primero usando
N,N-diisopropilfosforamidito de
di-t-butilo. El éster de fosfito se
oxida entonces con peróxido de t-butilo, se lava y
se rompe de la resina. Se eliminan todos los grupos productores de
la cadena lateral con ácido trifluoroacético al 95%. Los
fosfopéptidos brutos se extraen con étermetil-t-
butílico, y se secan. Esta preparación bruta de fosfopéptidos
sintéticos se disuelve en 50 mM de MES, cloruro de sodio 0,15 M, pH
6,5, y se mezcla con 50 \mul de
tris(carboximetil)-etilendiamina
(TED)-Fe(III) sobre Sepharose porosa
(sintetizada como se describe por Yip, T.-T. y Hutchens, T.W.,
Protein Expression and Purification 2:
355-362 (1991), densidad del ligando 65
\mumoles/ml) a 23ºC durante 15 minutos. El gel se lava con 500
\mul del mismo tampón tres veces, y entonces con 500 \mul de
agua una sola vez. Se mezcla una alícuota de 1 \mul de gel con 1
\mul de ácido sinapínico (disuelto en 30% de metanol, 0,1% de
ácido trifluoroacético) en la punta de la sonda, y se analiza
mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción
con láser. Tras adquirir cinco espectros (media de 100 disparos de
láser por espectro) en diversos puntos de la punta de la sonda, se
elimina el ácido sinapínico mediante metanol, y los fosfopéptidos
restantes adsorbidos sobre TED-Fe(III) se
digieren directamente en la punta de la sonda mediante 1 \mul de
fosfatasa alcalina (suspensión de fosfato de amonio, Sigma) en 50 mM
de HEPES, pH 7,0, a 23ºC durante 10 minutos en una cámara de
humedad. El gel se lava con agua para eliminar la enzima y la sal.
Se añade ácido sinapínico, y la muestra se vuelve a analizar
mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción
con láser. La Figura 8 (perfil superior) muestra la distribución
del péptido caseínico (1934 Da) con múltiples formas fosforiladas.
Tras la digestión in situ con fosfatasa alcalina, sólo queda
la forma original no fosforilada (perfil inferior).
Este ejemplo ilustra la aplicación de SEAC como
una monitorización rápida de la síntesis de fosfopéptidos en una
mezcla bruta sin limpieza previa. La identidad del fosfopéptido se
confirma fácilmente mediante digestión in situ con fosfatasa
alcalina.
4. Se mezclan alícuotas de 100 \mul de fórmula
para niños prematuros (SIMILAC, Meade Johnson) y contenido gástrico
de aspirado de infante prematuro 90 minutos tras la administración
de la fórmula con 50 \mul de Sepharose con
TED-Fe(III) en 0,1 M de MES, 0,15 M de
cloruro de sodio, pH 6,5, a 23ºC durante 15 minutos. El gel se lavó
con 500 \mul del mismo tampón, tres veces, y entonces con 500
\mul de agua, una vez. Se mezclaron alícuotas de 1 \mul de
suspensiones de gel o fórmula para niño prematuro o aspirado
gástrico con 2 \mul de ácido sinapínico (disuelto en acetonitrilo
al 50%, ácido trifluoroacético al 0,1%) en la punta de la sonda, y
se analizó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo por
desorción con láser. La Figura 9 muestra que el espectro de masas
de todo el aspirado gástrico (segundo a partir del perfil superior)
es bastante similar al de la fórmula completa de infante (perfil
inferior) en la región de 1.000- 15.000 Da. Sin embargo, los
espectros de masas de los analitos adsorbidos selectivamente
mediante TED-Fe(III) procedentes de las dos
muestras son bastante diferentes; hay más fosfopéptidos de bajo
peso molecular (es decir, unión mediante
TED-Fe(III)) presente en el aspirado
gástrico (perfil superior) que en la fórmula (segundo desde el
perfil inferior) debido a la digestión proteolítica gástrica de las
fosfoproteínas presentes en la fórmula.
Este ejemplo ilustra que SEAC es particularmente
útil analizando analitos específicos en muestras biológicas. Los
fosfopéptidos son más difíciles de detectar en presencia de otros
componentes contaminantes en una muestra compleja debido a que se
ionizan menos en el modo de ion positivo. Sin embargo, cuando los
fosfopéptidos se adsorben selectivamente y se eliminan todos los
otros componentes en la muestra, no ocurre tal depresión de la
señal.
5. Se mezclan alícuotas de 200 \mul de
glicoproteína enriquecida con histidina humana y bovina con 50
\mul de Sepharose (Pharmacia) IDA-Cu(II) a
pH 7,0 (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M) a 23ºC
durante 10 minutos. El gel se lava con 500 \mul de tampón, dos
veces, y 500 \mul de agua, una vez. Se mezclan alícuotas de 1
\mul de gel con 2 \mul de ácido sinapínico (disuelto en metanol
al 30%, ácido trifluoroacético al 0,1%), y se analizaron mediante
espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción con láser.
Tras adquirir cinco espectros (media de 100 disparos de láser por
espectro) en diversos puntos de la punta de la sonda, se eliminó el
ácido sinapínico mediante lavado con metanol. Las glicoproteínas
restantes adsorbidas sobre el gel de
IDA-Cu(II) se digirió entonces con
N-glicanasa en fosfato de sodio 20 mM, cloruro de
sodio 0,5 M, urea 3 M, pH 7,0 a 37ºC toda la noche en una cámara de
humedad. Tras lavar con agua para eliminar la enzima y la sal, se
añadieron 2 \mul de ácido sinapínico y la muestra se analizó
mediante espectrometría de masas. Tras adquirir cinco espectros
(media de 100 disparos de láser por espectro) en diversos puntos de
la punta de la sonda, se eliminó el c sinapínico mediante metanol.
Se añadieron alícuotas de 2 \mul de tripsina en bicarbonato de
sodio 0,1 M, y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos en una cámara
de humedad. Tras un lavado con agua para eliminar la enzima y la
sal, se añadió ácido sinapínico, y la muestra se analizó mediante
espectrometría de masas. Tras adquirir cinco espectros (media de
100 disparos de láser por espectro) sobre diversos puntos de la
punta de la sonda, se eliminó el ácido sinapínico mediante metanol.
Se añadieron alícuotas de 2 \mul de CuSO_{4} 20 mM. Esto fue
seguido de la adición de 2 \mul de ácido sinapínico, y entonces
de los análisis por espectrometría de masas. Tras adquirir cinco
espectros (media de 100 disparos de láser por espectro) en diversos
puntos de la punta de la sonda, se eliminó el ácido sinapínico
mediante metanol. Se añadieron alícuotas de 2 \mul de
pirocarbonato de dietilo (Sigma) en HEPES 5 mM, pH 6,5, y se
incubaron a 23ºC durante 30 minutos. Tras un lavado con agua para
eliminar los productos químicos y las sales del tampón, se
añadieron 2 \mul de ácido sinapínico, y la muestra se analizó
mediante espectrometría de masas. Para obtener una secuencia
parcial de los péptidos unidos a metal, en lugar de modificar los
residuos de histidina con pirocarbonato de dietilo, añadir 1 \mul
de carboxipeptidasa Y (Boehringer Mannheim) a la digestión tríptica
adsorbida sobre la superficie, e incubar a temperatura ambiente en
una cámara de humedad durante 5 minutos. Lavar la enzima y la sal
con agua, añadir 1 \mul de ácido sinapínico y analizar mediante
espectrometría de masas. La Figura 10A muestra los espectros de
masas de materiales compuestos de glicoproteína enriquecida con
histidina tanto humana como bovina adsorbida sobre Sepharose con
IDA-Cu(II) antes y después de la digestión
con N-glicanasa. Los desplazamientos másicos
representan la eliminación del hidrato de carbono de las
glicoproteínas respectivas. La Figura 10B muestra los espectros de
masas de materiales compuestos de péptidos digeridos con tripsina
procedentes de proteínas desglicosiladas de las dos especies
(perfil superior para la proteína humana, segundo desde el perfil
inferior para la proteína bovina) y la unión in situ a
Cu(II) de los péptidos digeridos con tripsina de las dos
especies (segundo desde el perfil superior para la proteína humana,
perfil inferior para la proteína bovina; los números 1, 2 indican el
número de unión de cobre). La Figura 10C muestra que uno de tales
péptidos que se une a Cu(II) (perfil inferior) tiene al
menos 4 residuos His que se modifican específicamente por
pirocarbonato de dietilo para formar 4 aductos
N-carbetoxi-histidílicos
(1-4, perfil superior). La Figura 10D muestra la
secuencia C-terminal parcial del principal péptido
que se une a Cu en la glicoproteína rica en histidina bovina. Este
ejemplo ilustra el uso efectivo de SEAC para investigar la
estructura y función de dominios de unión a metal de proteínas
procedentes de diferentes especies.
1. Se genera de forma habitual un anticuerpo
policlonal antilactoferrina humana de conejo frente a lactoferrina
humana purificada de Bethyl Laboratories (Montgomery, TX). El
anticuerpo es purificado por afinidad mediante adsorción tiofílica y
se inmoviliza en columnas de lactoferrina. Se obtiene IgG
anti-conejo de oveja unida covalentemente a perlas
magnéticas de Dynal AS, Oslo, Noruega (perlas de poliestireno
supermagnético de 2,8 \mum uniformes, densidad de ligando 10
\mug de IgG de oveja por mg de perla). Se incuba lactoferrina
humana (1 nmoles, marcado isotópicamente con ^{69}Fe, 81.100 Da)
con anticuerpo antilactoferrina humana de conejo en 20 mM de fosfato
de sodio, 0,15 M de cloruro sódico, pH 7,0 a 37ºC durante 30
minutos. Subsiguientemente, se añaden 40 \mul de IgG
anti-conejo de oveja sobre dinaperlas
(6-7 x 10^{3} perlas/ml), y se incuba a 37ºC
durante 30 minutos. Las perlas se lavan con 500 \mul de tampón de
fosfato de sodio tres veces, y 500 \mul de agua, dos veces. La
cantidad final de lactoferrina humana unida al complejo se estima
que es 4 pmoles. Aproximadamente la décima parte de las perlas se
transfieren a una punta de sonda magnética revestida con teflón,
mezclada con 2 \mul de ácido sinapínico (disuelto en 30% de
metanol, 0,1% de ácido trifluoroacético), y se analiza mediante
espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser.
La Figura 11 muestra la presencia de lactoferrina (81,143 Da) en el
complejo de antígeno/anticuerpo primario/anticuerpo secundario
(perfil superior), mientras que el control de anticuerpo
primario/anticuerpo secundario (perfil inferior) muestra sólo la
señal del anticuerpo de conejo (149.000 Da para la únicamente
cargada, y 74.500 Da para la doblemente cargada).
Este ejemplo ilustra que a) la desorción por
láser se lleva a cabo de forma exitosa sobre analito adsorbido por
afinidad en un anticuerpo inmovilizado sobre la superficie (si la
señal de analito se identifica de forma no ambigua en una mezcla de
complejo de anticuerpo primario/analito, en este método para
identificar el analito se usa cualquier dispositivo de captura, por
ejemplo, anticuerpo secundario inmovilizado a la superficie,
proteína A, proteína G, estreptavidina, de los anticuerpos
primarios); b) el principio del descubrimiento de la proteína vía
sucesos de reconocimiento molecular específicos en los que se
detecta uno de los analitos a través de su asociación con la diana
principal de captura; y c) el uso de una superficie magnética como
dispositivo de captura eficiente.
2. Se une covalentemente lactoferrina antihumana
de conejo purificada por afinidad a la punta de un elemento de
sonda de nailon activado (2 mm de diámetro) vía glutaraldehído. Esta
se sumerge en 1 ml de orina de niño prematuro, pH 7,0, que contiene
350 fmoles de lactoferrina humana, y se agita a
4-8ºC durante 15 h. La punta de la sonda de nailon
se retiró y se lavó con 1 ml de 20 mM de fosfato de sodio, 0,5 M de
cloruro de sodio, 3 M de urea, pH 7,0, tres veces, y 1 ml de agua,
dos veces. Se añadió una alícuota de 2 \mul de ácido sinapínico
(disuelto en 30% de metanol, 0,1% de ácido trifluoroacético), y la
muestra se analizó por espectrometría de masas de tiempo de vuelo
con desorción por láser. La Figura 12 muestra el ion molecular de
lactoferrina humana (señal/ruido = 2,5, media de 25 disparos de
láser) en el espectro de masas. La Figura 13 muestra el espectro de
masas equivalente de orina completa de niño prematuro que contiene 1
nmol/ml de lactoferrina; la supresión de la señal provocada por la
presencia de otros componentes en la muestra de orina es tan
importante que incluso la adición de un exceso de varios miles de
veces sobre 350 fmoles/ml de lactoferrina, según se describe para la
Figura 12, no se puede detectar.
Este ejemplo ilustra el uso de un dispositivo
SEAC sobre una superficie plana (una configuración bidimensional)
de un elemento de sonda flexible. Este dispositivo SEAC se puede
usar para aislar materiales analito dianas de muestras biológicas no
diferenciadas, tales como sangre, lágrimas, orina, saliva, fluidos
gastrointestinales, fluido de la médula espinal, fluido amniótico,
médula ósea, bacterias, virus, células en cultivo, tejido de
biopsia, tejido vegetal o fluidos vegetales, tejidos o fluidos de
insectos, etc. La etapa de adsorción por afinidad específica limpió
el analito de contaminación de otros componentes en una mezcla
compleja, y de este modo supera el efecto de depresión de la señal
especialmente cuando el analito está presente en una concentración
muy baja (femtomoles/ml).
3. Se logra una mejora adicional de la
sensibilidad de la detección mediante la técnica SEAC mediante
amplificación de un marcador isotópico unido al analito. Una forma
de hacer esto es mediante la combinación de catálisis enzimática y
el sistema de estreptavidina/biotina. Tras capturar cantidades
pequeñas de lactoferrina en un elemento de sonda de nailon según se
describe en el Ejemplo 3.II.2, se usa anticuerpo antilactoferrina
biotinilado o ADN de una sola hebra biotinilada para unirse
específicamente a la lactoferrina. Entonces se añade estreptavidina
para unirse específicamente al marcador biotinilado. Finalmente se
añade fosfatasa alcalina biotinilada para unirse específicamente a
la estreptavidina. Puesto que varias de tal fosfatasa alcalina
biotinilada se puede unir a una estreptavidina, existe un nivel
principal de amplificación. El nivel secundario de amplificación
proviene de la catálisis enzimática, en la que la enzima puede
lograr un número de velocidad de recambio de 10^{2} a 10^{3}
min^{-1}. El ensayo de la actividad enzimática de la fosfatasa
alcalina se puede lograr fácilmente usando un sustrato fosforilado
de bajo peso molecular tal como ATP, NADPH o un fosfopéptido. La
eficiencia para detectar el desplazamiento de masa de un analito de
bajo peso molecular es mucho mayor que la de una glicoproteína de
80 kDa.
4. La última mejora de detección actualmente se
logra mediante la amplificación basada en el principio de reacción
de cadena de polimerasa. Tras capturar cantidades pequeñas de
lactoferrina en un elemento de sonda de nailon según se describe en
el Ejemplo 3.II.2, se usa anticuerpo antilactoferrina biotinilado o
ADN de una sola hebra biotinilada para unirse específicamente a la
lactoferrina. Entonces se añade estreptavidina para unirse
específicamente al marcador isotópico biotinilado. Finalmente se
añade una pieza de ADN lineal biotinilado para unirse a la
estreptavidina. Este marcador isotópico de ADN unido se amplifica
en un procedimiento de reacción en cadena de polimerasa de 30
ciclos. Cada ciclo consta de una etapa de desnaturalización de 1
minuto a 94ºC, una reacción de hibridación de 1 minuto a 58ºC y una
reacción de extensión del cebador durante 1 minuto a 72ºC. Este
técnica proporciona factores de amplificación en el intervalo de
10^{5}. El ADN amplificado se detecta directamente mediante
espectrometría de masas por desorción con láser usando ácido
3-OH picolínico como la matriz.
5. Se genera de forma habitual anticuerpo
antiglicoproteína rica en histidina bovina de conejo policlonal
frente a glicoproteína rica en histidina bovina purificada por
Bethyl Laboratories (Montgomery, TX). El anticuerpo se purifica por
afinidad mediante adsorción tiofílica, y se inmoviliza en columnas
de glicoproteína ricas en histidina bovina. El anticuerpo
purificado se inmoviliza en Affigel 10 (BioRad Laboratories,
Hercules, CA, densidad de ligando 15 \mumoles/mg de gel) según la
instrucción del fabricante. Se diluye una alícuota de 200 \mul de
calostro bovino con 200 \mul de 20 mM de fosfato de sodio, pH
7,0, y se mezcla con 50 \mul de anticuerpo inmovilizado a 23ºC
durante 30 minutos. El gel se lava con 500 \mul de 20 mM de
fosfato de sodio, 0,5 M de cloruro de sodio, 3 M de urea, pH 7,0,
tres veces, y 500 \mul de agua, dos veces. Se mezcló una alícuota
de 1 \mul del gel lavado con 2 \mul de ácido sinapínico
(disuelto en 30% de metanol, 0,1% de ácido trifluoroacético) sobre
la punta de una sonda, y se analizó mediante espectrometría de
masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. La Figura 17
muestra los espectros de masas de material compuesto de
glicoproteína rica en histidina bovina purificada (perfil inferior)
y proteínas adsorbidas por afinidad procedentes de calostro bovino
(perfil superior). El resultado indica la presencia de glicoproteína
rica en histidina intacta, y sus principales fragmentos
proteolíticos en el calostro bovino.
Este ejemplo ilustra el uso efectivo de SEAC como
una técnica rápida y simple para detectar y caracterizar nuevas
proteínas en una pequeña cantidad de fluido biológico. Este
resultado apoya los hallazgos iniciales obtenidos por la técnica
tremendamente intensa de inmunotransferencia de electroforesis en
gel de poliacrilamida.
6. Se logró el mapa del epítopo del anticuerpo
con la técnica SEAC. Se inmovilizan tres fuentes diferentes de
hormona estimulante de folículos antihumana (un policlonal
específico frente a beta FSH de Chemicon International, Temecula,
CA, un monoclonal específico frente a epítope beta 3 de Serotec,
Indianapolis, IN, un monoclonal de Biodesign, Kennebunk, ME) sobre
AffiGel 10 según la instrucción del fabricante. Estos anticuerpos
inmovilizados se ensayan todos para unirse específicamente a la
hormona estimulante del folículo incubando con dos preparaciones
diferentes de hormona estimulante del folículo (una preparación
semipura de Chemicon, y una preparación bruta de Accurate Chemical
and Scientific Corp.), y entonces se analizó mediante espectrometría
de masas en presencia de ácido sinapínico. Entonces, la preparación
semipura de FSH humana (Chemicon) se digiere con tripsina, y se
hacen reaccionar alícuotas separadas (7 \mul) con los anticuerpos
inmovilizados (10 \mul de una suspensión en gel 1:1) en disolución
salina tamponada con fosfato a 4ºC durante 2 h. Tras lavar con
disolución salina tamponada con fosfato y con agua, las proteínas
adsorbidas se analizaron mediante espectrometría de masas con
desorción por láser en presencia de ácido sinapínico. La Figura 15
muestra los espectros de masas de material compuesto de los
péptidos de la hormona estimulante de folículos reconocidas por los
diferentes anticuerpos. Los dos anticuerpos monoclonales reconocen
claramente diferentes epítopes, mientras que el anticuerpo
policlonal reconoce múltiples epítopes comunes a los reconocidos
por ambos anticuerpos monoclonales.
1. Se obtienen ADN de una sola hebra inmovilizada
sobre perlas de agarosa al 4%, de GIBCO BRL (Gaithersburg, MD,
densidad de ligando 0,5-1,0 mg de ADN/ml de gel).
Se mezcla una alícuota de lactoferrina humana ^{125}I (equivalente
a 49 nmoles) con 100 \mul de ADN de una sola hebra inmovilizado
en 20 mM de HEPES, pH 7,0 a temperatura ambiente durante 10 min. El
gel se lava con 500 \mul de tampón HEPES, cinco veces, y entonces
se suspende en un volumen igual de agua. La cantidad de lactoferrina
unida por perla se estima que es de 62 fmoles determinando la
radioactividad y contando el número de perlas por unidad de
volumen. Se depositan diversos números de perlas (de 1 a 12) en
puntas de sonda de 0,5 mm de diámetro, se mezclan con 0,2 \mul de
ácido sinapínico (disuelto en 30% de metanol, 0,1% de ácido
trifluoroacético), y se analiza mediante espectrometría de masas de
tiempo de vuelo con desorción por láser. La Figura 16 muestra el
espectro de masas de lactoferrina adsorbida por afinidad sobre una
única perla de agarosa con ADN de una sola hebra. Este es un
espectro representativo de un total de cinco (media de 100 disparos
de láser por espectro) obtenidos de la perla única.
Este ejemplo ilustra que la desorción por láser
se lleva a cabo con éxito sobre el analito adsorbido por afinidad
sobre biopolímero inmovilizado a la superficie, tal como ácido
nucleico. La especificidad de interacción entre lactoferrina humana
y ADN ha sido documentada y explotada eficazmente en la captura de
cantidades minúsculas de lactoferrina procedente de orina de niño
prematuro. En este caso, la combinación de la eficiencia de
transferencia del dispositivo de captura por afinidad de
lactoferrina con la sensibilidad de la espectrometría de masas por
desorción con láser aumenta enormemente la sensibilidad de la
detección.
2. Se mezcla una alícuota de 1 ml de orina niño
prematuro que contiene 30 pmoles de lactoferrina humana ^{59}Fe
con 20 \mul de agarosa con ADN de una sola hebra en 0,1 M de
HEPES pH 7,4 a 23ºC durante 15 min. El gel se lavó con 500 \mul de
tampón HEPES, dos veces, y 500 \mul de agua, dos veces. El gel se
suspendió en un volumen igual de agua, y se mezcló 1 l de la
suspensión (que contiene no más de 350 fmoles de lactoferrina
adsorbida, según se determinó por radioactividad), con 1 \mul de
ácido sinapínico (disuelto en 30% de metanol, 0,1% de ácido
trifluoroacético) en una punta de sonda, y se analizó mediante
espectrometría de masa de tiempo de vuelo con desorción por láser.
La Figura 17 muestra el espectro de masas de lactoferrina extraída
de orina mediante ADN inmovilizado a la superficie como el
dispositivo de captura por afinidad.
Este ejemplo ilustra la eficiencia y sensibilidad
de la detección de cantidades minúsculas de analito de elevado peso
molecular en fluido biológico con el dispositivo de captura de tipo
ADN.
1. Se inmoviliza inhibidor de tripsina de haba
de soja (Sigma) sobre AffiGel 10 (BioRad) según las instrucciones
del fabricante. Se mezcla una alícuota de 100 \mul de aspirado
duodenal humano con 50 \mul de inhibidor de tripsina de haba de
soja inmovilizado a la superficie, a pH 7,0 (20 mM de fosfato de
sodio, 0,5 M de cloruro sódico) a 23ºC durante 15 min. El gel se
lava entonces con 500 \mul de tampón de fosfato, tres veces, y
500 \mul de agua, dos veces. Se mezclaron alícuotas de 1 \mul de
suspensión en gel del aspirado duodenal original con 2 \mul de
ácido sinapínico (disuelto en 50% de acetonitrilo, 0,1% de ácido
trifluoroacético), y se analizó mediante espectrometría de masas de
tiempo de vuelo con desorción por láser. La Figura 18A muestra el
espectro de masas del material compuesto del aspirado duodenal
total (perfil inferior) y las proteínas adsorbidas mediante
inhibidor de tripsina de haba de soja inmovilizado a la superficie
(perfil superior). El pico principal en la muestra capturada por
afinidad representa la tripsina. Se obtienen resultados similares
con sólo 1 \mul de fluido duodenal depositado en a) la punta de
un elemento de sonda de nailon acoplado a inhibidor de tripsina de
haba de soja vía glutaraldehído, y b) la punta de un elemento de
sonda acrílico revestido con poliacrilamida acoplado con inhibidor
de tripsina de haba de soja vía glutaraldehído o divinilsulfona
(Figura 18B).
Estos resultados indican a) la falta de
ambigüedad al detectar y caracterizar un analito específico en
fluidos biológicos, y b) la factibilidad de toma de muestras in
situ insertando un elemento de sonda flexible (por ejemplo
nailon) a través de un endoscopio directamente en el cuerpo humano
(por ejemplo intestino delgado) para fines de diagnóstico.
2. Se obtiene estreptavidina inmovilizada sobre
dinaperlas (perlas uniformes, de 2,8 \mum, superparamagnéticas,
de poliestireno) procedentes de Dynal, AS, Oslo, Noruega. Se
mezclan alícuotas de 150 \mul de plasma u orina humana que
contiene 18 pmoles de insulina biotinilada (Sigma) con 20 \mul de
una suspensión de estreptavidina inmovilizada en dinaperlas a pH
7,0 (20 mM de fosfato de sodio, 0,5 M de cloruro de sodio) a 23ºC
durante 10 minutos. Las perlas se lavan entonces con 500 \mul de
tampón que contiene 3 M de urea, tres veces, y 500 \mul de agua,
una vez. Se mezclan alícuotas de 0,5 \mul de la suspensión de las
perlas con 2 \mul de ácido sinapínico (disuelto en 30% de
metanol, 0,1% de ácido trifluoroacético), y se analizó mediante
espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser.
La Figura 19A muestra el espectro de masas de insulina biotinilada
adsorbida por afinidad procedente de orina. Los múltiples picos
representan la insulina derivatizada con uno a tres grupos biotina.
La Figura 19B muestra el espectro de masas de insulina biotinilada
adsorbida por afinidad procedente de plasma.
Este ejemplo ilustra que la desorción por láser
se lleva a cabo sobre analito adsorbido por afinidad vía la unión
biotina-estreptavidina. En vista de la fuerte unión
entre biotina y avidina (Ka = 10^{15} M^{-1}), este sistema
sirve como un dispositivo SEAC ideal para proteínas y ácidos
nucleicos en una superficie de sonda en la que se llevan a cabo
modificaciones in situ químicas y enzimáticas
secuenciales.
3. Se expresó el dominio (84 residuos) de unión a
ADN de receptor de estrógenos humano, en bacterias. El vector de
expresión del plásmido pT_{7}ERDBD (J. Schwabe, MRC Laboratory of
Molecular Biology, Cambridge, UK) se transforma en células
BL21(DE3)plyS de E. coli (Novagene). La expresión del
dominio de unión a ADN se induce mediante 1 mM de
isopropiltiogalactósido (GIBCO BRL), y la bacteria se cosechó tras
inducción durante 3 h. La bacteria inducida completa se analizó
directamente mediante espectrometría de masas de
desorción/ionización por láser asistida en matriz para verificar
que el dominio de unión a ADN es el péptido principal sintetizado.
El péptido se purifica mediante HPLC en fase inversa a partir del
lisado bacteriano, y se moviliza en AffiGel 10 (BioRad). Se
sintetiza una secuencia de ADN de 30-bp que contiene
el elemento de respuesta a estrógenos, mediante Genosys (Houston,
TX). Se estudia la interacción de formas unidas a apo, Zn y Cu
adsorbidas por afinidad a la superficie, de dominio de unión a ADN
con ácido nucleico de secuencia específica (elemento de respuesta a
estrógenos) sobre elementos de sonda de vidrio usando ácido
3-hidroxipicolínico como la matriz.
Este ejemplo ilustra el uso del dominio funcional
superficial proteínico como dispositivo de captura en SEAC. El
efecto de la unión a metal sobre la estructura y la función de
tales dominios superficiales de proteínas se puede investigar.
4. Se usan diferentes alícuotas de lectinas
inmovilizadas sobre superficies (por ejemplo Con
A-Sepharose, lectina de germen de
trigo-Sepharose, Pharmacia) para unir los
glicopéptidos en digestiones trípticas de glicoproteína enriquecida
con histidina humana y bovina. Tras lavar con tampones y agua para
eliminar los péptidos no unidos, se realiza la digestión enzimática
secuencial in situ con FUCasa I, MANasa I, HEXasa I, NANasa
III y PNGasa (Glyko, Inc, Novato, CA). Las muestras se analizan con
espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser
para estudiar la composición de hidratos de carbono de los
glicopéptidos en las dos proteínas. Este ejemplo ilustra el uso del
dispositivo de SEAC para trabar un glicopéptido, cuyo componente de
hidratos de carbono se puede secuenciar entonces in
situ.
Se obtiene de Sigma agarosa Cibacron Blue 3GA
(Tipo 3000, agarosa en perlas al 4%, densidad de ligando
2-5 \mumoles/ml de gel). Se mezcla una alícuota de
200 \mul de plasma humano con 50 \mul de Cibacron Blue
inmovilizado a superficie a pH 7,0 (20 mM de fosfato de sodio, 0,5
M de cloruro sódico) a 23ºC durante 10 min. El gel se lava entonces
con 500 \mul de tampón, tres veces, y 500 \mul de agua, dos
veces. Se mezcla una alícuota de 1 \mul de suspensión de gel con
2 \mul de ácido sinapínico (disuelto en 50% de acetonitrilo, 0,1%
de ácido trifluoroacético), y se analizó mediante espectrometría de
masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. La Figura 20
muestra la adsorción selectiva de albúmina de suero humano (ion
doblemente cargado [M+2H]^{2+}, 32.000 m/z, ion cargado
una sola vez [M+H]^{+}, 64.000 m/z, ion dímero
2[M+H]^{+}, 128.000 m/z) procedente de la muestra
de suero mediante Cibacron Blue inmovilizado sobre superficie
(perfil inferior). Otros colorantes inmovilizados ensayados incluyen
Reactivo Rojo 120-agarosa, Reactivo
Azul-agarosa, Reactivo
Verde-agarosa, Reactivo
Amarillo-agarosa (todos de Sigma), y cada uno
selecciona diferentes proteínas del plasma humano.
Este ejemplo describe el método para la desorción
e ionización de analitos en el que el analito no se dispersa en una
estructura cristalina de matriz sino que está presente dentro,
sobre o encima de una superficie unida de moléculas que absorben
energía en una posición que es accesible y receptiva a una amplia
variedad de reacciones de modificación o reconocimiento químico,
físico y biológico. La superficie se derivatiza con la densidad
apropiada de moléculas que absorben energía enlazadas (covalente o
no covalentemente) en una variedad de geometrías de forma que se
usan monocapas y múltiples capas de moléculas que absorben energía
unidas para facilitar la desorción de moléculas de analito de masas
variables.
Los Ejemplos mostrados a continuación Grupos
I-IV) demuestran que SEND y SEAC combinados en los
que las moléculas que absorben energía adsorbidas (enlazadas)
también actúan como reactivos de adsorción por afinidad, potencian
la captura de moléculas de analito. Sin embargo, la presente
invención no utiliza los reactivos de afinidad de los Grupos I, III
y IV. Sólo los ejemplos del Grupo II, por lo tanto, son según la
invención.
1. Se disuelve cinamamida (Aldrich) (no una
matriz a una longitud de onda de láser de 355 nm por la técnica
anterior) en isopropanol:carbonato de sodio 0,5 M (3:1), y se
mezcló con divinilsulfona (Fluka, Ronkonkoma, NY) activada Sepharose
(Pharmacia) a 23ºC durante 2 h. Las moléculas que absorben energía
en exceso se lavan con isopropanol. La estructura molecular
propuesta se presenta en la Figura 21. Se depositan en las puntas
de sondas alícuotas de 2 \mul de las moléculas unidas o libres,
se añade 1 \mul de dominio de dimerización de receptor de
estrógenos humano en 0,1% de ácido trifluoroacético sobre la parte
superior, y se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo
de vuelo con desorción por láser. Los resultados muestran que las
señales del ion péptido se detectan sólo en la superficie con
moléculas que absorben energía unidas (Figura 22, perfil superior),
y las moléculas libres no son efectivas (Figura 22, perfil
inferior).
2. Se disuelve bromuro de dinamilo (Aldrich) (no
una matriz a una longitud de onda de láser de 355 nm por la técnica
anterior) en isopropanol:carbonato de sodio 0,5 M (3:1), y se
mezcló con Sepharose activada con divinilsulfona (Fluka) a 23ºC
durante 15 h. Las moléculas que absorben energía en exceso se lavan
con isopropanol. La estructura molecular propuesta se presenta en la
Figura 23. Se depositan sobre las puntas de las sondas alícuotas de
2 \mul de las moléculas unidas o libres, se añade a la parte
superior 1 \mul de mezclas peptídicas en ácido trifluoroacético al
0,1%, y se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de
vuelo con desorción por láser. Los resultados muestran que las
señales del ion peptídico se detectan sólo en la superficie con
moléculas que absorben energía unidas (Figura 24, perfil superior)
y las moléculas libres no son efectivas (Figura 24, perfil
inferior).
3. Se activa el ácido dihidroxibenzoico mediante
diciclohexilcarbodiimida y se mezcla con resina ramificada
Fmoc-MAP 8 (Applied Biosystems, Forster City, CA) a
23ºC durante 15 h. El exceso de moléculas que absorben energía se
lava mediante metanol. En la Figura 25 se presenta la estructura
molecular propuesta. Se depositan sobre las puntas de la sonda
alícuotas de 1 \mul de la superficie ramificada MAP 8, con y sin
moléculas unidas que absorben energía, se añadió 1 \mul de mezclas
peptídicas en 0,1% de ácido trifluoroacético encima, y se analizó
mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción
por láser. El resultado muestra que las señales de ion peptídico se
detectan sólo sobre la superficie sin moléculas unidas que absorben
energía (Figura 26, perfil inferior), la superficie de control sin
ninguna de las moléculas que absorben energía no es efectiva
(Figura 26, perfil superior).
4. Se disolvió ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinámico
en metanol, y se mezcló con AffiGel 10 o AffiGel 15 (BioRad) a
diversos pH a 23ºC durante 2-24 horas. El exceso de
moléculas que absorben energía se lava mediante metanol. Se
depositan sobre las puntas de la sonda alícuotas de 2 \mul de las
moléculas unidas, se añade 1 \mul de mezclas peptídicas o
mioglobina, o tripsina o anhidrasa carbónica encima, y se analiza
mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción
por láser. El resultado muestra que la señal del ion de mioglobina
se detecta sobre la superficie sin moléculas unidas que absorban
energía (Figura 27A) con muy pocas señales de iones de masa baja
contaminantes (Figura 27B).
5. Se prepara una disolución de polietilamida al
40%, y se moldea en la forma deseada de una punta de sonda. Se deja
que el gel se seque al aire hasta que no se observa una reducción
apreciable del tamaño. La punta se sumerge en disolución de 9% de
glutaraldehído/tampón (v/v), y se incuba con agitación suave a 37ºC
durante 2 horas. Tras la incubación, se usó tampón para eliminar
por enjuague el exceso de glutaraldehído. La punta activada se
añade a una disolución de moléculas que absorben energía, tamponada
saturada, y se incuba a 37ºC (aprox.) durante 24 horas (aprox.) con
agitación suave. Se usan disolventes orgánicos para solubilizar las
moléculas que absorben energía en situaciones que lo requieran. La
punta se enjuaga con tampón, y se coloca en una disolución de 9% de
etanolamina/agua (v/v) para incubar a 25ºC con agitación suave
durante 30 minutos. Seguidamente, la punta se enjuaga con tampón, y
se añade a una disolución de 5 mg/ml de cianoborohidruro
sódico/tampón para incubar a 25ºC durante 30 minutos. Finalmente, la
punta se enjuaga bien con tampón, y se almacena hasta su uso. Se
lleva a cabo la misma reacción sobre puntas de nailon que se prepara
mediante hidrólisis con HCl 6 N bajo sonicación durante 2 minutos,
y entonces se enjuaga bien con agua y tampón. LA misma reacción
también se lleva a cabo sobre puntas acrílicas activadas
sumergiendo en NaOH al 20% durante 7 días con sonicación cada día
durante 30-60 min, y entonces se lavan. En la
Figura 28 se muestra la estructura molecular general propuesta de
la superficie.
6. Se prepara una disolución de poliacrilamida
al 40%, y se moldea en la forma deseada de una punta de sonda. El
gel se seca al aire hasta que no se observa una reducción
apreciable del tamaño. Se prepara un tampón de carbonato de sodio
0,5 M con un pH de 8,8, como tampón de enjuague. La punta se coloca
entonces en una disolución de divinilsulfona (Fluka) y tampón a una
relación de 10:1, respectivamente, y se incubó durante 24 horas. La
punta se enjuaga con tampón, y se coloca en una disolución tamponada
de moléculas que absorben energía, a un pH de 8, para incubar
durante 2 horas. La misma reacción se lleva a cabo sobre puntas de
nailon que se prepara mediante hidrólisis con HCl 6 N con
sonicación durante 2 minutos, y entonces se enjuaga bien con agua y
tampón. También la misma reacción se lleva a cabo sobre puntas
acrílicas activadas sumergiendo en NaOH al 2% durante 7 días con
sonicación cada día durante 30-60 min, y entonces
se lavan. En la Figura 29 se muestra la estructura molecular general
propuesta de la superficie.
7. Se prepara una disolución de poliacrilamida
al 40% y se moldea en la forma deseada de una punta de sonda. El
gel se seca al aire hasta que no se observa ninguna reducción
apreciable del tamaño. Se mezcla una disolución de moléculas que
absorben energía a 100 mg/ml en diclorometano/NMP (2:1,
respectivamente) y una disolución de diciclohexilcarbodiimida 1
M/NMP a una relación de 1:2 (EAM:DCC), respectivamente. La
disolución de EAM/DCC se incuba seguidamente a 25ºC durante 1 hora
mientras se agita. Tras la incubación, se observa un precipitado
blanco. El precipitado blanco se filtra en un filtro de vidrio
sinterizado. El caudal es el EAM activado con DCC. Seguidamente, la
punta se coloca en la disolución de EAM activada con DCC, y se
incuba a 25ºC durante 2 horas (aprox.). La punta se enjuaga
finalmente con una variedad de disolventes, tales como acetona,
diclorometano, metanol, NMP, y hexano. La misma reacción se lleva a
cabo sobre puntas de nailon que se prepara mediante hidrólisis con
HCl 6 N con sonicación durante 2 minutos, y entonces se enjuaga bien
con agua y tampón. La misma reacción también se lleva a cabo sobre
puntas acrílicas activadas sumergiendo en NaOH al 20% durante 7
días con sonicación cada día durante 30-60 min, y
entonces se lava. En la Figura 30 se muestra la estructura
molecular general propuesta de la superficie.
8. Se prepara una disolución de poliacrilamida
al 40% y se moldea en la forma deseada de una punta de sonda. El
gel se seca al aire hasta que no se observa ninguna reducción
apreciable del tamaño. Se mezclan una disolución de 100 mg/ml de
N-\alpha-
Fmoc-N-\varepsilon-Fmoc-L-lisina
en diclorometano/NMP (2:1, respectivamente) y una disolución de DCC
1 M/NMP, a una relación de 1:2 (lisina:DCC), respectivamente. La
disolución de lisina/DCC se incuba a 25ºC durante 1 hora con
agitación. Tras la incubación, se observa un precipitado blanco, y
se filtra con un filtro de vidrio sinterizado. El caudal es lisina
activado con DCC. La punta se coloca en la disolución de lisina
activada con DCC, y se incuba a 25ºC durante 2 horas (aprox.). La
punta se coloca seguidamente en 5 ml de piperidina, y se incuba a
25ºC durante 45 minutos con agitación suave. La lisina activada con
DCC se hace reaccionar repetidamente en ciclos consecutivos con la
punta hasta que se obtiene la ramificación de lisina deseada. Se
mezclan una disolución de EAM a 100 mg/ml en diclorometano/NMP (2:1
respectivamente) y una disolución de DCC 1 M/NMP, a una relación de
1:2 (EAM:DCC), respectivamente. La disolución de EAM/DCC se incuba a
25ºC durante 1 hora con agitación. Tras la incubación, se observa un
precipitado blanco, y se filtra con un filtro de vidrio
sinterizado. El caudal que pasa es la EAM activada con DCC. La EAM
contiene un grupo funcional ácido que reacciona con la DCC. La punta
se coloca en la disolución de EAM activada con DCC, y se incuba a
25ºC durante 2 horas (aprox.) con agitación suave. Finalmente, la
punta se enjuaga con diclorometano en exceso, NMP, y metanol, antes
del uso. La misma reacción se lleva a cabo sobre puntas de nailon
que se prepara mediante hidrólisis con HCl 6 N con sonicación
durante 2 minutos, y entonces se enjuaga bien con agua y tampón. La
misma reacción también se realiza sobre puntas acrílicas activadas
sumergiendo en NaOH al 20% durante 7 días con sonicación cada día
durante 30-60 min, y entonces se lavaron. En la
Figura 31 se muestra la estructura molecular general propuesta de
la superficie.
1. Se disuelve ácido tiosalicílico (Aldrich) en
agua o 50% de metanol en agua, o metanol. Estas disoluciones se
usaron como tales, o el pH de las disoluciones se ajusta hasta 6,5
con bicarbonato sódico 0,5 M o hidróxido amónico o trietilamina. El
ion Cu(II) se quela con iminodiacetato (IDA) (Sepharose
Quelante de Flujo Rápido, Pharmacia) o
tris(carboximetil)etilendiamina (TED) (sintetizada
como se describe por Yip y Hutchens, 1991) inmovilizados sobre la
superficie del gel. Las disoluciones de molécula que absorbe
energía se mezclan con el gel de IDA-Cu(II) o
TED-Cu(II) a 4º hasta 23ºC durante 5 minutos
hasta 15 horas. Las moléculas en exceso que absorben energía se
lavan con agua, o metanol al 50% en agua, o con metanol. En la
Figura 32 se muestra la estructura molecular propuesta de la
superficie. Se depositan alícuotas de 1 \mul de las moléculas
unidas que absorben energía sobre las puntas de la sonda, se añade
encima 1 \mul de mezclas peptídicas o de dominio de dimerización
del receptor de estrógenos o mioglobina en ácido trifluoroacético
al 0,1%, y se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de
vuelo con desorción por láser. La Figura 33 muestra un espectro de
masas representativo del dominio de dimerización del receptor de
estrógenos desorbido de esta superficie.
2. Se logran fácilmente reacciones secuenciales
in situ sobre muestras depositadas encima de una superficie
EAM. Se prepara ácido tiosalicílico unido covalentemente coordinado
a IDA-Cu(II) sobre una superficie de la
sonda, como se describe en la Sección 2.1. Se deposita una alícuota
de 1 \mul de péptido (GHHPH)_{5}G sobre la superficie, y
se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con
desorción por láser. Tras obtener varios espectros (cada uno una
media de 50 disparos de láser), se retira la muestra. Se añade
directamente sobre la superficie una alícuota de 2 \mul de
carboxipeptidasa Y (Boehringer Mannheim), y se incuba a 37ºC en una
cámara de humedad durante 5 minutos hasta 1 h. La digestión in
situ con enzima se termina mediante 1 \mul de ácido
trifluoroacético al 0,1%, y la muestra se vuelve a analizar mediante
espectrometría de masas.
3. Otra ilustración de la reacción secuencial
in situ es la digestión con tripsina seguido de
secuenciamiento C-terminal. Se prepara ácido
tiosalicílico unido covalentemente coordinado a
IDA-Cu(II) sobre una superficie de la sonda,
según se describe en la Sección 2.1. Se deposita sobre la
superficie una alícuota de 1 \mul de dominio de dimerización
(6168,4 Da) de receptor de estrógenos, y se analiza mediante
espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser.
Tras obtener varios espectros (cada uno una media de 20 disparos de
láser), se retira la muestra. Se añade sobre la superficie una
alícuota de 1 \mul de tripsina (Sigma) en bicarbonato de sodio 0,1
M, y se incuba a 37ºC durante 15 min. La digestión in situ
con enzima se termina mediante 1 \mul de ácido trifluoroacético
al 0,1%, y la muestra se vuelve a analizar mediante espectrometría
de masas. Tras obtener varios espectros (cada uno una media de 20
disparos de láser), se retira la muestra. Se añade directamente
sobre la superficie una alícuota de 2 \mul de carboxipeptidasa Y
(Boehringer Mannheim), y se incuba a 37ºC en una cámara de humedad
durante 1 h. La digestión in situ con enzima se termina
mediante 1 \mul de ácido trifluoroacético al 0,1%, y la muestra
se vuelve a analizar mediante espectrometría de masas.
Se suspende en agua ácido sinapínico o ácido
\alpha-ciano-4- hidroxicinámico, y
se ajusta el pH hasta 6,6 con hidróxido sódico diluido. Se lava el
tentáculo DEAE Fractogel (EM Separations, Gibbstown, NJ) con HEPES
20 mM, pH 6,0, y se secó por succión. La disolución de moléculas
que absorben energía se mezcla con el gel de DEAE a 23ºC durante 15
horas. El gel se lavó con agua hasta que se eliminó todo el exceso
de moléculas que absorben energía. En la Figura 34 se muestra la
estructura molecular propuesta de la superficie. Se deposita sobre
las puntas de la sonda una alícuota de 0,5 \mul de moléculas
unidas que absorben energía, se añade encima 1 \mul de dominio de
dimerización de receptor de estrógenos o mioglobina en ácido
trifluoroacético al 0,1%, y se analiza mediante espectrometría de
masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. Las Figuras 35A y
B muestran el espectro de masas.
1. Se disolvió ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinámico
en metanol al 50% en agua y dimetilsulfóxido. Se mezcló con
poliestireno aminometilado a 23ºC durante 15 horas. El exceso de
moléculas que absorben energía se lavó con metanol al 50% en agua.
En la Figura 36 se muestra la estructura molecular propuesta. Se
depositó sobre la punta de la sonda una alícuota de 1 \mul de las
moléculas unidas que absorben energía, se añadió encima 1 \mul de
péptido, y se analizó mediante espectrometría de masas de tiempo de
vuelo con desorción con láser.
A menudo la disposición lineal de los bloques
constructores individuales (monómeros) que definen la estructura y
características de biopolímeros tales como ADN, ARN, y proteínas,
es desconocida, pero se descodifican o secuencian (en todo o en
parte) con un método que implica determinaciones diferenciales de
masas de analitos biopoliméricos parcialmente digeridos (es decir,
químico o enzimático) mediante espectrometría de masas de tiempo de
vuelo (TOF) con desorción/ionización por láser.
Los biopolímeros dados se acoplan primero a la
superficie de la sonda SELDI mediante uno o más (múltiples) enlaces
fotolíticos (es decir, sensibles a la luz) covalentes. Después, se
rompe (es decir, se elimina) un número diverso de unidades
individuales (monómeros) en los extremos del biopolímero, en una
única reacción mediante métodos enzimáticos o químicos. Los
analitos que permanecen en la superficie de la sonda constan de una
variedad (población) de biopolímeros de masas definidas perdiendo
números diferentes de sus unidades monómeras en los extremos. Una
porción pequeña pero suficiente de los biopolímeros modificados está
sin acoplar (no trabada) desde la superficie del elemento de sonda
mediante luz láser, es decir, mediante ruptura de los enlaces
fotolíticos con luz UV entre 260 nm y 365 nm. Los biopolímeros
desacoplados se desorben/ionizan mediante espectrometría de masas de
tiempo de vuelo.
Están implicados tres componentes: 1) una
superficie que es activada para que reaccione con grupos amina o
carboxilo, o ambos; 2) un compuesto fotolítico, típicamente un
compuesto con un grupo azo de la fórmula general
R_{1}-N=N-R_{2}, por ejemplo,
ácido 5-(4-aminofenilazo)salicílico
(Aldrich), azodicarbonamida (Aldrich), u otros mecanismos que
generan tal enlace fotolítico, tal como las químicas reactivas de
hidrógeno activo con compuestos de diazonio; y 3) un biopolímero,
por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, hidratos de carbono.
Primeramente se debe unir un compuesto fotolítico
a la superficie activada, por ejemplo, un azodicarbonamida a
superficies reactivas con aminas, ácido aminofenilazosalicílico a
superficies reactivas con aminas o con carboxilos. Entonces se debe
activar el compuesto fotolítico o el biopolímero mediante una de las
muchas químicas convencionales, por ejemplo, química reactiva de
aminas-bromuro de cianógeno, ésteres de
N-hidroxisuccinimida, activación de FMP, mediada por
EDC, divinilsulfona; químicas reactivas con
hidroxilos-activación epoxídica, divinilsulfona;
químicas reactivas con sulfhidrilos-activación
yodoacetílica, maleimida, divinilsulfona, activación epoxídica;
químicas reactivas con carbonilos-hidrazida,
aminación reductora; químicas reactivas con hidrógenos
activos-diazonio, que también genera un enlace
azofotolítico al mismo tiempo. Finalmente, se debe unir el
biopolímero al compuesto fotolítico a través de uno o más
(múltiples) enlaces. Lavar el exceso de productos químicos con
disolventes acuosos y orgánicos, disolventes de fuerza iónica
elevada y bajo pH en múltiples ciclos.
El láser de UV de 260 a 360 nm romperá el enlace
fotolítico. Los biopolímeros no acoplados se desorben/ionizan
mediante MALDI TOF (el experto en la técnica sabe que también se
pueden usar SEND, SEAC y SEPAR).
Esto se logra por cualquiera de los métodos
enzimáticos o químicos de degradación secuencial bien conocidos,
por ejemplo, secuenciación N-terminal de proteínas
con aminopeptidasa, secuenciación C-terminal de
proteínas con carboxipeptidasa, secuenciación
N-terminal de proteínas con degradación de Edman;
secuenciación de ácidos nucleicos con exonucleasa, secuenciación de
ácidos nucleicos con el método de Sanger; secuenciación de hidratos
de carbono con enzimas específicas tales como neuraminidasa,
manasa, fucasa, galactosidasa, glucosidasa, O- o
N-glicanasa. Tras lavar para eliminar el exceso de
reactivo y productos de reacción, los analitos que permanecen
trabados sobre la superficie vía múltiples enlaces fotolíticos que
constan de una población de biopolímeros de masas definidas con
números diferentes de sus monómeros de los extremos perdidos, se
analizan mediante MALDI TOF MS (el experto en la técnica sabe que
también se puede usar SEND, SEAC y SEPAR).
Secuenciación interna múltiple con métodos
enzimáticos o químicos, por ejemplo, ruptura de proteínas con
endoproteasa o bromuro de cianógeno seguido de degradación
secuencial de N- y/o C-terminal; ruptura de ácidos
nucleicos con endonucleasas seguido de degradación secuencial con
exonucleasa o método químico; ruptura de cadenas de polisacáridos
con endoglicosidasa H o endoglicosidasa F seguido de ruptura
secuencial con enzimas específicas. Tras lavar para eliminar el
exceso de reactivos y productos de reacción, los analitos que
permanecen sobre la superficie que constan de múltiples poblaciones
de biopolímeros de masas definidas con pérdida de diferentes números
de sus monómeros en los extremos, se analizan mediante MALDI TOF
MS.
Se proporciona una demostración de este principio
mediante la determinación de la secuencia presente de aminoácidos
de un péptido de 26 residuos:
GHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHG
Este péptido (GHHPH)_{5}G define el
dominio de unión a metal con la secuencia intacta de la proteína de
80 kDa conocida como glicoproteína rica en histidina (HRG).
Se lavan perlas de vidrio con grupos arilamina en
la superficie como ligandos de acoplamiento (Sigma) con y
suspendidas en HCl 0,3 M frío. Se añade una disolución acuosa de 50
mg/ml de NaNO_{2} a las perlas, en una relación de 1:5 (v/v)
(NaNO_{2}:HCl) y se incuba a 4ºC durante 15 minutos con agitación
suave. Tras la incubación todas las perlas se lavan con HCl 0,3 M
frío y tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 8,0. El péptido a
secuenciar se añade a las perlas en tampón de fosfato de sodio a pH
8,0, y se incuba durante 24 horas a 4ºC con agitación suave. Las
perlas con péptidos acoplados se lavaron con tampón de fosfato de
sodio, tampón de fosfato de sodio con alta concentración de sal
(por ejemplo, 1,0 M), ácido diluido y disolvente orgánico (por
ejemplo, metanol) hasta que no se detectó señal peptídica en el
supernato mediante espectrometría de masas
MALDI-TOF (el experto en la técnica sabe que también
se puede usar SEND, SEAC, y SEPAR) o mediante absorbancia a 220 nm.
Entonces se deposita una alícuota de 1 \mul de las perlas sobre
la punta de la sonda, se mezcla 1 \mul de ácido sinapínico
(disuelto en 50% de metanol/0,1% de ácido trifluoroacético) con las
perlas, y la muestra se analiza mediante espectrometría de masas de
tiempo de vuelo con desorción por láser. Tras obtener varios
espectros (cada uno una media de 50 disparos de láser), los péptidos
que quedan sobre la superficie se lavaron para que estuvieran
libres de ácido sinapínico con metanol, y entonces se digirieron
con carboxipeptidasa Y (Boehringer Mannheim) a 23ºC en una cámara
de humedad. Los péptidos digeridos se lavan seguidamente con
disolución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 8,0. Se añade una
alícuota de 1 \mul de ácido sinapínico a la superficie, y se
analiza nuevamente mediante espectrometría de masas de tiempo de
vuelo con desorción por láser. El resultado del análisis de la
secuencia C-terminal de la secuencia GHHPHG se
muestra en la Figura 37. Se observa una secuencia naciente del
péptido. La secuencia se deduce mediante las diferencias en la masa
entre los picos.
El segundo ejemplo es la secuenciación simultánea
de múltiples péptidos unidos covalentemente mediante enlaces
fotolíticos a una superficie. Se trabó el dominio de dimerización
(6168,4 Da) del receptor de estrógenos humano a la superficie vía
múltiples enlaces fotolíticos. El péptido tiene tres residuos
metionínicos en su secuencia, y se rompen específicamente mediante
bromuro de cianógeno para generar péptidos de masas 2170,8 Da
(D1-M18), 3118,77 Da (A19-M45),
535,62 Da (S46-M50) y 397,62 Da
(E51-L53). Todos estos péptidos están unidos a la
superficie vía los enlaces fotolíticos. Cada uno de estos se
digieren subsiguientemente in situ con carboxipeptidasa Y
para generar una secuencia naciente que se resuelve completamente
de la otra.
Otro enfoque para la determinación estructural de
las proteínas es la secuenciación simultánea
N-terminal de múltiples péptidos generados por
digestión tríptica de una proteína acoplada a una superficie
mediante múltiples enlaces fotolíticos. Se trabó la cadena de
insulina B a la superficie vía múltiples enlaces fotolíticos. El
péptido tiene dos residuos de lisina/arginina en su secuencia que
se rompen específicamente mediante tripsina para generar péptidos
de masas 2585,9 Da (F1-R22) y 859,0 Da
(G23-K29), los cuales ambos están unidos a la
superficie vía los enlaces fotolíticos. Cada uno de estos se somete
subsiguientemente in situ a digestión con aminopeptidasa o a
múltiples ciclos de degradación de Edman para generar una secuencia
naciente que se resuelve completamente de la otra.
El acoplamiento y secuenciación de ácidos
nucleicos se realiza con un procedimiento similar. Se lavan perlas
de vidrio con grupos arilamínicos superficiales como ligandos de
acoplamiento (Sigma), con y suspendidos en HCl 0,3 M frío. Se añade
una disolución acuosa de 50 mg/ml de NaNO_{2} a las perlas, en una
relación de 1:5 (v/v) (NaNO_{2}:HCl), y se incuba a 4ºC durante
15 minutos con agitación suave. Tras la incubación, las perlas se
lavan con HCl 0,3 M frío y tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH
8,0. El ADN (por ejemplo elemento sensible al receptor de
estrógenos, un oligonucleótido de 30 pares de bases) a secuenciar se
añade a las perlas en tampón de fosfato de sodio a pH 8,0, y se
incuba durante 24 h a 4ºC con agitación suave. Las perlas con ADN
acoplado se lavan con tampón de fosfato de sodio, tampón de fosfato
de sodio con concentración elevada de sal (por ejemplo, 1,0 M),
ácido diluido y disolvente orgánico (por ejemplo, metanol) hasta
que no se detecta ninguna señal de ADN en el sobrenadante mediante
espectrometría de masas MALDI-TOF (el experto en la
técnica sabe que también se puede usar SEND, SEAC, y SEPAR) o
mediante absorbancia a 260 nm. Entonces se deposita sobre la punta
de la sonda una alícuota de 1 \mul de las perlas, se mezcla 1
\mul de ácido 3-hidroxipicolínico (disuelto en
metanol al 50%/ácido trifluoroacético al 0,1%) con las perlas, y la
muestra se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de
vuelo con desorción por láser. Tras obtener varios espectros de
masas (cada uno una media de 50 disparos de láser), el ADN que
queda unido sobre la superficie se lava libre de ácido
3-hidroxipicolínico con metanol, y se digiriere con
exonucleasa (Boehringer Mannheim) a 23ºC en una cámara de humedad.
El ADN digerido sobre la superficie se lava seguidamente con
disolución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 8,0 para eliminar
el exceso de reactivo y productos de reacción. Se añade a la
superficie una alícuota de 1 \mul de ácido
3-hidroxipicolínico, y se analiza nuevamente
mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción
por láser. Se genera una secuencia naciente del ADN. La secuencia
se deduce mediante las diferencias en la masa entre dos picos.
Se oxidan cadenas de hidratos de carbono mediante
peryodato, y se activan para que se acoplen específicamente a un
compuesto fotolítico sobre una superficie. Se lleva a cabo la
secuenciación del hidrato de carbono trabado, con enzimas
específicas, tales como neuraminidasa, manasa, fucasa,
galactosidasa, glucosidasa, O- o N-glicanasa, y se
determina mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con
desorción con láser. Se acopla ácido
5-(4-aminofenilazo)salicílico (Aldrich) a una
superficie reactiva con carboxilos, tal como arilamina sobre perlas
de vidrio de poros controlados. Los restos de hidratos de carbonos
de glicoproteína rica en histidina humana y bovina se oxidan
mediante concentración baja (0,2 M) de metaperyodato de sodio en
agua a 23ºC durante 90 minutos. Los reactivos en exceso se lavan con
agua. Se añaden las proteínas al ácido
5-(4-aminofenilazo)salicílico acoplado a las
perlas de vidrio de poros controlados en tampón de fosfato, pH 8,0.
Entonces se añade cianoborohidruro de sodio (0,6 mg/100 \mul), y
se agita en una campana de humos a 23ºC durante 18 h. Se lava
extensamente con agua, NaCl 1 M, y entonces con agua nuevamente para
eliminar el exceso de reactivos y de proteínas sin reaccionar.
Entonces se deposita sobre la punta de la sonda una alícuota de 1
\mul de las perlas, se mezcla con las perlas 1 \mul de ácido
sinapínico (disuelto en metanol al 50%/ácido trifluoroacético al
0,1%), y la muestra se analiza mediante espectrometría de masas de
tiempo de vuelo con desorción por láser. Las proteínas restantes
unidas sobre la superficie se lavan libres de ácido sinapínico con
metanol, y se incuban con 2 \mul de tripsina en tampón de
fosfato, pH 8,0, a 37ºC durante 30 minutos. La superficie con
glicopéptidos unidos se lava a conciencia con solución salina
tamponada con fosfato y agua para eliminar el exceso de reactivo y
de péptidos no unidos. Se mezcla con las perlas una alícuota de 1
\mul de ácido sinapínico, y la muestra se analiza mediante
espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser.
Tras obtener varios espectros de masas (cada uno una media de 50
disparos de láser) los glicopéptidos restantes sobre la superficie
de la sonda se lavan libres de ácido sinapínico con metanol, y se
digieren en secuencia o en combinación con
N-acetilneuraminidasa (NANasa III, Glyko, tampón de
fosfato de sodio 50 mM, pH 6,0, 37ºC, 1 h), manosidasa (MANasa I,
Glyko, fosfato de sodio 50 mM, pH 6,0, 37ºC 18 h), fucosidasa
(FUCasa I, Glyko, fosfato de sodio 50 mM, pH 5,0, 37ºC 18 h),
N-acetilglucosaminidasa (HEXasa I, Glyko, fosfato de
sodio 50 mM, pH 5,0, 37ºC 4 h), O-glicosidasa
(Glyko, fosfato de sodio 50 mM, pH 5,0, 37ºC 18 h) o
N-glicanasa (PNGasa F, Glyko, fosfato de sodio 100
mM, pH 8,6, 37ºC, 18 h). Los glicopéptidos fragmentados sobre la
superficie se lavan finalmente con disolución salina tamponada con
fosfato y con agua para eliminar los reactivos y los productos de
reacción. Se añade a la superficie una alícuota de 1 \mul de ácido
sinapínico, y se analiza nuevamente mediante espectrometría de
masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. Se observan
secuencias nacientes de los glicopéptidos. Las secuencias se deducen
mediante las diferencias en la masa entre dos picos.
Todas las patentes y publicaciones mencionadas en
esta memoria descriptiva son indicativas de los niveles de aquellos
expertos en la técnica a los que pertenece la invención.
El experto en la técnica apreciará fácilmente que
la presente invención se adapta bien para llevar a cabo los objetos
y obtener los fines y ventajas mencionadas, así como aquellos
inherentes en ella. Los oligonucleótidos, compuestos, métodos,
procedimientos y técnicas descritos aquí son presentemente
representativos de las realizaciones preferidas, están destinadas a
ser ejemplares y no pretenden ser limitaciones del alcance. A los
expertos en la técnica se les ocurrirán cambios en ella y otros
usos, que están englobados en el alcance de protección como se
define mediante las reivindicaciones anejas.
Claims (29)
1. Una sonda que se inserta de forma retirable en
un espectrómetro de masas, teniendo la sonda una superficie de
presentación de la muestra para exponer un analito a una fuente de
energía que emite energía capaz de desorber/ionizar al analito
desde la sonda para la detección del analito, en la que dicha
superficie está derivatizada con un reactivo de afinidad que es
capaz de unirse al analito y que se selecciona de iones metálicos,
ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, proteínas y sus
combinaciones, y en la que se proporciona un material matriz para
ayudar a la desorción/ionización sobre dicha superficie en
asociación con el reactivo de afinidad.
2. Una sonda según la reivindicación 1, en la que
dicha superficie de presentación de la muestra se selecciona de
metal revestido con un polímero sintético, vidrio, material
cerámico, polímeros sintéticos y biopolímeros.
3. Una sonda según la reivindicación 2, en la que
dicha superficie de presentación de la muestra es un metal que tiene
un revestimiento de dextrano o agarosa reticulados, nailon,
polietileno o poliestireno.
4. Una sonda según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el analito comprende
biomoléculas y dicho reactivo de afinidad está adaptado para aislar
selectivamente dichas biomoléculas a partir de una muestra biológica
no diferenciada.
5. Una sonda según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el reactivo de afinidad es
un anticuerpo.
6. Una sonda según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que el reactivo de afinidad es una
lectina.
7. Una sonda según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que el reactivo de afinidad es un ion
Cu(II) o un ion Fe(III).
8. Una sonda según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que los reactivos de afinidad
dispuestos en una disposición predeterminada están proporcionados
sobre dicha superficie de presentación de la muestra para la
adsorción selectiva de diferentes analitos.
9. Una sonda según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el material matriz tiene un
pH por encima de 6,0.
10. Una sonda según la reivindicación 9, en la
que el material matriz es ácido nicotínico o ácido sinapínico.
11. Una sonda según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el analito está unido al
reactivo de afinidad.
12. Un espectrómetro de masas para detectar un
analito, que comprende:
- (a) una sonda según la reivindicación 11;
- (b) una fuente de energía para dirigir energía a la superficie de presentación de la muestra de la sonda, para desorber/ionizar el analito; y
- (c) medios para detectar el analito desorbido.
13. Un espectrómetro de masas según la
reivindicación 12, que comprende además:
- un tubo de espectrómetro;
- medios de vacío para aplicar vacío al interior de dicho tubo;
- medios de potencial eléctrico dentro del tubo para aplicar un potencial acelerador a las moléculas del analito desorbidas; y
- una muestra de analito unida mediante el reactivo de afinidad sobre dicha superficie de presentación de la muestra de la sonda, con lo que al menos una porción de dichas moléculas del analito no consumidas en dicho análisis de espectrometría de masas permanece accesible para procedimientos químicos, biológicos o físicos analíticos subsiguientes;
en el que dicha fuente de energía comprende un
medio de haz de láser para producir un haz de láser dirigido a
dicha muestra de analito para dar suficiente energía para desorber
e ionizar una porción de dichas moléculas de analito de la
mencionada muestra de analito;
y
\newpage
en el que dicho medio de detección comprende
medios asociados con dicho espectrómetro para detectar el impacto
de moléculas del analito ionizadas aceleradas, sobre ellos.
14. Un método para detectar un analito, que
comprende:
- (a) proporcionar un espectrómetro de masas como se define en la reivindicación;
- (b) desorber al menos una porción del analito de la superficie de presentación de la muestra, de la sonda del espectrómetro de masas exponiendo al analito a energía procedente de la fuente de energía; y
- (c) detectar el analito desorbido con los medios de detección.
15. Un método según la reivindicación 14, que
comprende además, tras la etapa (c) de detección, la etapa de
realización de un procedimiento químico o biológico en la porción
de dicho analito no desorbida, para alterar la composición de dicha
porción de dicho analito no desorbida; y repetir las etapas (b) y
(c) con respecto a dicho analito alterado.
16. Un método según la reivindicación 14, que
comprende:
- (i) proporcionar una sonda que se puede insertar de forma retirable en un espectrómetro de masas, teniendo la sonda una superficie de presentación de la muestra, para exponer un analito a una fuente de energía que emite energía capaz de desorber/ionizar al analito de la sonda para la detección del analito;
- (ii) derivatizar dicha superficie de presentación de la muestra, con un reactivo de afinidad que es capaz de unirse al analito y que se selecciona de iones metálicos, ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, proteínas y sus combinaciones;
- (iii) exponer dicha superficie derivatizada, de presentación de la muestra, a una fuente de dicho analito para unir dicho analito a ella;
- (iv) depositar sobre dicha superficie de presentación de la muestra un material matriz, que ayuda a la desorción/ionización, en asociación con el reactivo de afinidad;
- (v) colocar la superficie derivatizada de presentación de la muestra con dichas moléculas del analito unidas a ella en un extremo de un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo y aplicar vacío y un campo eléctrico para formar un potencial acelerador dentro del espectrómetro;
- (vi) hacer golpear al menos una porción de las moléculas del analito unidas a dicha superficie derivatizada de presentación de la muestra, dentro del espectrómetro, con uno o más pulsos de láser a fin de desorber iones de dichas moléculas de analito de dicha sonda;
- (vii) detectar la masa de los iones mediante su tiempo de vuelo en dicho espectrómetro de masas; y
- (viii) presentar en una pantalla tal masa detectada.
17. Un método para preparar una sonda como se
define en la reivindicación 1, comprendiendo dicho método:
- (i) proporcionar una sonda que se puede insertar de forma retirable en un espectrómetro de masas, teniendo la sonda una superficie de presentación de la muestra para exponer un analito a una fuente de energía que emite energía capaz de desorber/ionizar el analito de la sonda para la detección del analito;
- (ii) derivatizar dicha superficie de presentación de la muestra, con un reactivo de afinidad que es capaz de unirse al analito y que se selecciona de iones metálicos, ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, proteínas y sus combinaciones; y
- (iii) depositar sobre dicha superficie de presentación de la muestra un material matriz que ayuda a la desorción/ionización, en asociación con el reactivo de afinidad;
18. Un método para capturar un analito en una
sonda para un espectrómetro de masas, comprendiendo dicho
método:
- - proporcionar una sonda que se puede insertar de forma retirable en un espectrómetro de masas, teniendo la sonda una superficie de presentación de la muestra para exponer un analito a una fuente de energía que emite energía capaz de desorber/ionizar el analito de la sonda para la detección del analito, en la que dicha superficie se derivatiza con un reactivo de afinidad que es capaz de unirse al analito y que se selecciona de iones metálicos, ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, proteínas y sus combinaciones,
\newpage
- - exponer dicha superficie de presentación de la muestra de la sonda a una muestra que contiene dicho analito; y
- - depositar sobre dicha superficie de presentación de la muestra un material matriz que ayuda a la desorción/ionización, en asociación con el reactivo de afinidad;
19. Un método según la reivindicación 18, en el
que dicha superficie de presentación de la muestra se selecciona de
metal revestido con un polímero sintético, vidrio, material
cerámico, polímeros sintéticos y biopolímeros.
20. Un método según la reivindicación 19, en el
que dicha superficie de presentación de la muestra es metal que
tiene un revestimiento de dextrano o agarosa reticulados, nailon,
polietileno o poliestireno.
21. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 20, en el que el analito comprende
biomoléculas, y dicho reactivo de afinidad está adaptado para
aislar selectivamente dichas biomoléculas a partir de una muestra
biológica no diferenciada.
22. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 21, en el que el reactivo de afinidad es un
anticuerpo.
23. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 21, en el que el reactivo de afinidad es una
lectina.
24. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 21, en el que el reactivo de afinidad es un
ion Cu(II) o un ion Fe(III).
25. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 24, en el que los reactivos de afinidad
dispuestos en una disposición predeterminada se proporcionan sobre
dicha superficie de presentación de la muestra para la adsorción
selectiva de diferentes analitos.
26. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 25, en el que el material matriz que ayuda a
la desorción/ionización tiene un pH por encima de 6,0.
27. Un método según la reivindicación 26, en el
que el material matriz es ácido nicotínico o ácido sinapínico.
28. Uso de una sonda como se define en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en espectrometría de
masas.
29. Uso según la reivindicación 28, en el que la
sonda se usa en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo con
desorción/ionización por láser.
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