JP5258360B2 - イムノクロマト測定方法およびイムノクロマト測定キット - Google Patents
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Description
本発明は、抗原と抗体との特異的反応を利用して特定の抗原または抗体よりなる被検出物質を検出する免疫測定法の１つであるイムノクロマト測定方法およびイムノクロマト測定方法に用いられるイムノクロマト測定キットに関するものである。
従来、抗原−抗体による特異的反応を利用して特定の抗原または抗体よりなる被検出物質を検出する免疫測定法としては、試料中の被検出物質を、微粒子に感作させた抗体または抗原と免疫反応により結合させ、結合によって生じる微粒子の凝集状態を測定する凝集法が簡便な免疫測定法であり、特に目視判定が可能である点で一般的に用いられている。
これらの免疫測定法では、競合型反応、サンドイッチ型反応が広く使われている。これらのうち、いわゆるサンドイッチ型反応の測定法として、イムノクロマトグラフ法が知られている。例えば、特許文献１にはイムノクロマトグラフ法における標識微粒子の好ましい形態が提案されており、特許文献２において固相アッセイのための装置および方法が提案されている。
イムノクロマト法における試料中の抗原よりなる被検出物質を検出するための典型的な操作は以下の手順でなされる。
被検出物質である抗原に対する抗体により感作させた微粒子を固相微粒子としてクロマトグラフ媒体（例えば、ニトロセルロースからなるメンブレン）に固定化することにより、あるいはこの抗体そのものをクロマトグラフ媒体に直接固定化することにより、検査領域を有するクロマトグラフ媒体を調製する。一方、標識微粒子に被検出物質と特異的に結合可能な抗体を感作させて感作標識微粒子を調製する。この感作標識微粒子を、試料と共に、クロマトグラフ媒体上でクロマトグラフ的に移動させる。
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以上の操作により、クロマトグラフ媒体に形成された検査領域において、固定化された抗体が固定化試薬となり、これに被検出物質である抗原を介して感作標識微粒子が特異的に結合し、その結果、感作標識微粒子が検査領域に捕捉されることにより生ずる信号の有無または程度を目視で判定することにより、試料中の被検出物質の存在の有無または量を測定する。なお、標識微粒子を調製するため微粒子としては、従来、金、白金、銅、酸化鉄などのコロイド状金属粒子またはコロイド状金属酸化物粒子、硫黄などのコロイド状非金属粒子および染料粒子が用いられている。
特開平６−１６７４９７号公報
特開平５−１０９５０号公報
さて、一般にクロマトグラフ媒体としては、比較的屈折率の高いニトロセルロースなどの有機高分子からなる、膜厚１ｍｍ程度のメンブレンが用いられている。
一般に、図４に示すように、信号（標識微粒子Ｍ）の有無または程度は検査領域を厚み方向上方から目視して判定するが、この場合、メンブレン（屈折率が１．４８）１０２とメンブレン内の空隙を満たしている溶媒（たとえば、水：屈折率が１．３３）Ｓとの屈折率の差が大きいために、両者の界面において光散乱が生じて不透明になり、標識微粒子Ｍは厚み方向の全域ｄに亘って分布しているにも拘わらず、表面近傍（表面からｄｓ）の領域１０６の斜線を付した標識微粒子Ｍしか視認できていない。また検体液を滴下後、溶媒が乾燥した状態で目視する場合、メンブレンと空気（屈折率が１）との屈折率差はさらに大きいため、空隙に水が存在する場合以上に光散乱が生じ、さらに薄い表面のみしか視認できない。
検体液中の抗原が非常に少ないような場合には、表面近傍に吸着する抗原の数が限られることから、正確な目視判定が困難で高い検出感度を得ることができないという問題がある。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、目視判定に優れ、高い検出感度が得られるイムノクロマト測定法を提供することを目的とする。また、本発明は、そのようなイムノクロマト測定法を実施するためのイムノクロマト測定キットを提供することを目的とする。
本発明のイムノクロマト測定法は、検体液中における被検出物質の存在の有無を検出するイムノクロマト測定法であって、
前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質が付与された検査領域を一部に有するクロマトグラフ媒体の該検査領域に、前記被検出物質と特異的に結合する、視認可能に標識された第２の結合物質を含む前記検体液を浸透させ、
該検体液を前記検査領域に浸透させると共に、または浸透させた後に、前記クロマトグラフ媒体の屈折率との屈折率差Δｎが−０．１≦Δｎ≦０．１の屈折率を有する視認用溶液を、該クロマトグラフ媒体に浸透させ、前記検査領域に前記視認用溶液が浸透している状態で前記検査領域を視認することを特徴とする。
前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質が付与された検査領域を一部に有するクロマトグラフ媒体の該検査領域に、前記被検出物質と特異的に結合する、視認可能に標識された第２の結合物質を含む前記検体液を浸透させ、
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前記屈折率差Δｎが−０．０７≦Δｎ≦０．０７であることが好ましい。さらには、前記屈折率差Δｎが−０．０２≦Δｎ≦０．０２であることがより好ましい。
前記視認用溶液としては、ジメチルスルホキシド溶液、グリセリンおよびその水溶液、ベンゼン、パラフイン油が好ましく、その中でも特にジメチルスルホキシド溶液が好ましい。
本発明のイムノクロマト測定キットは、クロマトグラフ媒体と、該クロマトグラフ媒体の一部に設けられた検査領域に付加された、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質と、該クロマトグラフ媒体を内包し、該クロマトグラフ媒体に検体液を注入するための注入口および前記検査領域を視認するための窓部を備えたケースと、前記クロマトグラフ媒体の、前記注入口から前記検査領域に至るまでの一部に付加された、前記被検出物質と特異的に結合する、視認可能に標識された第２の結合物質とを備えた検体保持具、および
前記検査領域における反応を視認する前に、前記検査領域に浸透させる、前記クロマトグラフ媒体の屈折率との屈折率差Δｎが−０．１≦Δｎ≦０．１の屈折率を有する視認用溶液を備えたことを特徴とする。
前記検査領域における反応を視認する前に、前記検査領域に浸透させる、前記クロマトグラフ媒体の屈折率との屈折率差Δｎが−０．１≦Δｎ≦０．１の屈折率を有する視認用溶液を備えたことを特徴とする。
前記屈折率差Δｎは−０．０７≦Δｎ≦０．０７であることが好ましい。さらには、前記屈折率差Δｎが−０．０２≦Δｎ≦０．０２であることがより好ましい。
前記視認用溶液としては、ジメチルスルホキシド溶液、グリセリンおよびその水溶液、ベンゼン、パラフイン油が好ましく、その中でも特にジメチルスルホキシド溶液が好ましい。
本発明のイムノクロマト測定法によれば、検体液を検査領域に浸透させると共に、または浸透させた後に、クロマトグラフ媒体の屈折率との屈折率差Δｎが−０．１≦Δｎ≦０．１の屈折率を有する視認用溶液を、該クロマトグラフ媒体に浸透させ、検査領域に視認用溶液が浸透している状態で検査領域を目視するものであり、クロマトグラフ媒体と視認用溶液との屈折率差は非常に小さいものであるから両者の界面で屈折率差により生じる光散乱を十分に抑制することができ、クロマトグラフ媒体の厚み方向の目視可能な領域が広がる。したがって、目視判定に優れ、高い検出感度を得ることができる。
本発明のイムノクロマト測定キットを用いれば、本発明のイムノクロマト測定法を実施することができ、目視判定に優れ、高い検出感度で測定を行うことができる。
以下、本発明に係る実施形態のイムノクロマト測定法およびイムノクロマト測定用キットについて説明する。図１（Ａ）はイムノクロマト測定用キットの検体保持具の平面模式図、同図（Ｂ）は検体保持具の概略構成を示す側断面図である。
イムノクロマト測定用キット１は、クロマトグラフ媒体２と、クロマトグラフ媒体２の一部に設けられた検査領域３に付加された、被検出物質Ａと特異的に結合する第１の結合物質Ｂ1と、該クロマトグラフ媒体２を内包し、該クロマトグラフ媒体２に検体液Ｓを注入するための、少なくとも検体液注入時には開口する注入口４および検査領域３を視認するための透明部材からなる窓部５を備えたケース６と、クロマトグラフ媒体２の、注入口４から検査領域３に至るまでの一部領域７に付加された、被検出物質Ａと特異的に結合する、視認可能に標識された第２の結合物質Ｂ２とを備えた検体保持具１０、および検査領域３における反応を視認する前に、検査領域３に浸透させる、クロマトグラフ媒体２の屈折率との屈折率差Δｎが−０．１≦Δｎ≦０．１の屈折率を有する視認用溶液１４を内包するアンプル１５備えている。
クロマトグラフ媒体２はここでは、ニトロセルロースからなるメンブレンにより構成されており、メンブレン２はケース６内にその検査領域３がケース６の窓部５から視認できるようにして内包されている。本実施形態において被検出物質Ａは所定の抗原であり、クロマトグラフ媒体２の検査領域３には被検出物質である所定の抗原Ａと特異的に結合する第１の結合物質として１次抗体Ｂ１が付加されている。また、メンブレン２の注入口４に対応する部分から検査領域３に至るまでの一部領域７には、所定の抗原Ａと特異的に結合する、視認可能に標識された第２の結合物質として金微粒子Ｍにより標識された標識２次抗体Ｂ２が付加されている。１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２とは被検出物質である抗原Ａに対して互いに別の部位に結合するものが用いられている。
さらに、メンブレン２の検査領域３よりも下流側には２次抗体Ｂ１と結合する参照用抗体Ｂ３が付加された検査終了確認領域８が設けられており、この確認領域８もケース６の窓部５から視認できるよう構成されている。また、ケース６内の最も下流側端部には検体液Ｓが逆戻りすることないように吸水する吸水パッド９が備えられている。
ここでは、２次抗体を標識する標識物質として金微粒子Ｍを用いるものとしたが、標識物質は着色ラテックス、酵素など、視認可能なものであればよい。
１次抗体Ｂ１、２次抗体Ｂ２および参照用抗体Ｂ３は、それぞれメンブレン２の所定領域に付加されているが、その付加形態は単にそれぞれの領域に付与しただけでもよい。しかし、２次抗体Ｂ２および参照用抗体Ｂ３は検体液や視認用溶液のメンブレン内の浸透移動により流されてしまうと反応結果を視認できなくなる恐れがあるため、アミノ結合などの手法によりメンブレン２のそれぞれの領域に固定されていることが望ましい。
メンブレン２の屈折率との屈折率差Δｎが−０．１≦Δｎ≦０．１の屈折率を有する視認用溶液１４は、例えば、ニトロセルロースの屈折率（１．４８）と同等（ここで、同等とは、屈折率差Δｎが−０．０２≦Δｎ≦０．０２の範囲をいうものとする。）の屈折率（１．４６）を有するジメチルスルホキシド溶液が好適である。なお、視認用溶液１４は、メンブレン２の屈折率との屈折率差Δｎが−０．１≦Δｎ≦０．１のもので、抗原抗体の結合状態に影響を与えないものであればよく、ジメチルスルホキシド溶液に限るものではない。たとえば、オイル系の溶液や溶媒中の塩濃度を変化させることにより屈折率が調整された溶液などを用いてもよい。
本発明に係る実施形態のイムノクロマト測定用キット１を用いた、検体液中に所定の抗原Ａが存在するか否かについてのイムノクロマト測定工程について説明する。
図２はイムノクロマト測定方法の工程を模式的に示す図である。図２においては、メンブレン内における、抗原と標識２次抗体の移動、１次抗体、参照用抗体との結合状態等を視認しやすくするため、それぞれ１つもしくは数個だけを模式的に示している。
図２はイムノクロマト測定方法の工程を模式的に示す図である。図２においては、メンブレン内における、抗原と標識２次抗体の移動、１次抗体、参照用抗体との結合状態等を視認しやすくするため、それぞれ１つもしくは数個だけを模式的に示している。
検体液Ｓは、例えば、被検出物質が含まれているか否かを検査する対象となる血液、尿、鼻水などである。
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である検体液Ｓを滴下する。ここでは、この検体液Ｓ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。
ｓｔｅｐ２：検体液Ｓがメンブレン２内を毛細管現象により浸透移動し、検体液Ｓ中の抗原Ａはメンブレン２の注入口４近傍に付加されている標識２次抗体Ｂ２と結合し、メンブレン２内を検出領域３側へと浸透移動する。この際、抗原Ａと結合していない標識２次抗体Ｂ２も一緒に検出領域３側へと流される。
ｓｔｅｐ３：検体液Ｓはメンブレン２に沿って検出領域３側へと徐々に移動し、標識２次抗体Ｂ２と結合した抗原Ａが、検出領域３上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体Ｂ２で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
ｓｔｅｐ４：さらに抗原Ａと結合していない標識２次抗体Ｂ２が参照用抗体Ｂ３と結合する。標識２次抗体Ｂ２が参照用抗体Ｂ３と結合すると検査終了確認領域８において金微粒子からの赤色が視認でき、検体液が確かに検査領域および確認領域まで流れてきていることを確認することができる。
ｓｔｅｐ５：視認用溶液１４を注入口４から注入する。
ｓｔｅｐ６：視認用溶液１４がメンブレン２に沿って下流側へ毛細管現象により浸透移動し、検体液Ｓは吸水パッドへと流され、メンブレン２内は検体液Ｓと入れ替わり視認用溶液１４により満たされる。
このような状態で窓部５から免疫反応の結果を目視する。このとき、メンブレン２と視認用溶液１４との屈折率差は非常に小さいため、両者の界面で生じる光散乱は抑制され、メンブレン２の厚み方向全域を視認することが可能となり、感度を向上させることができる。
なお、視認用溶液１４としてジメチルスルホキシド溶液を用いると、ジメチルスルホキシド溶液が親水性および疎水性を有する両親媒性であることから、疎水結合によりメンブレンに非特異吸着している標識２次抗体を洗浄する効果もあり、非特異吸着によるバックグラウンドノイズを大幅に低減することができ、これにより、さらなるＳ／Ｎ向上が可能となる。
図３は、本実施形態の目視時の状態を示す模式図である。図３においては、検査領域３に固定された抗原と結合している標識２次抗体の標識物質である金微粒子Ｍのみを模式的に示している。検査領域３をメンブレン２の厚み方向ｄの上方から目視した場合、本実施形態においてはメンブレン２とメンブレン内の空隙を満たしている溶液１４との屈折率差が小さいことから、光散乱が抑制されてメンブレン２が透明に見えることから、抗原が検査領域の１次抗体と結合し、該抗原と結合している標識２次抗体の標識物質である金微粒子Ｍがメンブレンの厚みｄに亘る領域１６の範囲を視認することができる。したがって、表面近傍の標識物質のみしか視認できなかった従来と比較して、目視性に優れ、高感度な検査ができる。
一般にイムノクロマト法においては、メンブレン（クロマト媒体）としては空隙径、糸径とも０．１μｍ〜数μｍ程度のニトロセルロース（屈折率 １．４８）繊維を束ねたフィルターが用いられる。厚みは概ね１ｍｍであるので、最下層にある標識物から散乱された光が空中へ出て来るためには、数百回程度の繊維界面での散乱の影響を受けることになる。このように、１ｍｍ厚のメンブレンにおいて最下層にある標識物から散乱された光が数百回程度、空隙と繊維との界面で散乱を受けて上方に透過してくる際の透過率について、メンブレン材質と空隙に充填された媒質との屈折率差Δｎ依存性をシミュレーションした結果を図５に示す。このグラフから、８０％以上の透過率を得るためには、屈折率差Δｎが−０．１≦Δｎ≦０．１、９０％以上の光透過率を得るためには、−０．０７≦Δn≦０．０７となるような屈折率のメンブレンと、視認用溶液との組み合わせを選ぶ必要があることが判る。また、メンブレンと溶媒との屈折率差Δｎが小さいほど透過率１００％に近づき、メンブレンの屈折率と溶媒の屈折率とが同等となる−０．０２≦Δn≦０．０２ではほぼ透過率１００％の優れた目視性を得ることができることが明らかになった。
既述の通り、メンブレンの空隙に満たされる媒質が水あるいは空気層などメンブレンと屈折率差の大きなものである場合、光散乱の影響が大きく透過率が非常に低かったために感度が悪かったが、本発明のように、メンブレンと該メンブレンの空隙に満たされる媒質との屈折率差Δｎが−０．１≦Δｎ≦０．１であれば８０％以上の透過率を得ることができ、さらに屈折率差Δｎが−０．０７≦Δｎ≦０．０７であれば９０％以上の透過率を得ることができるため、感度の優れた測定を行うことができる。
なお、上記実施形態においては、抗原抗体の結合反応の後に、視認用溶液をメンブレンに注入してメンブレン２内の溶媒を入れ替えるものとしたが、検体液を視認用溶液と混合した混合液（その屈折率はメンブレンとの屈折率差が−０．１≦Δｎ≦０．１となるように調製されている。）を注入し、反応結果を目視するようにしてもよい。しかしながら、ジメチルスルホキシド溶液を検体液と混合させた混合液を用いた場合、ジメチルスルホキシドの存在により、抗原抗体の結合反応が阻害され、反応が遅延する恐れがあることから上記実施形態のように、抗原抗体の結合反応が終了した後に、溶媒を入れ替える方法がより好ましい。
また、上記実施形態の測定キット１の検体保持具１０においては、メンブレン２の一部に予め標識２次抗体を付加してあるものとして説明したが、標識２次抗体はメンブレンに付加されていなくてもよい。その場合には、検体液を注入し、抗原と１次抗体とを結合させた後に、標識２次抗体を含む溶液を注入口から注入し、１次抗体と結合している抗原に標識２次抗体を結合させるようにしてもよいし、予め標識２次抗体を含む溶液と検体液とを混合し、検体液中の抗原と標識２次抗体とを結合させた状態で、注入口から注入するようにしてもよい。
いずれの場合においても、最終的な目視による反応確認の際には、メンブレン２とメンブレン内に満たされている溶媒との屈折率差Δｎを−０．１≦Δｎ≦０．１にしておくことにより、メンブレン２と溶媒との屈折率差による光散乱を抑制することができ、メンブレン厚み方向に透明となるため、検査領域３における標識物質Ｍの濃度を確実に目視でき、高い感度の測定ができる。
１ イムノクロマト測定用キット
２ クロマトグラフ媒体（メンブレン）
３ 検査領域
４ 注入口
５ 窓部
６ ケース
１０ 検体保持具
１４ 視認用溶液
Ａ 被検出物質
Ｂ1 第１の結合物質
Ｂ2 第２の結合物質
Ｓ 検体液
２ クロマトグラフ媒体（メンブレン）
３ 検査領域
４ 注入口
５ 窓部
６ ケース
１０ 検体保持具
１４ 視認用溶液
Ａ 被検出物質
Ｂ1 第１の結合物質
Ｂ2 第２の結合物質
Ｓ 検体液
Claims (6)
- 検体液中における被検出物質の存在の有無を検出するイムノクロマト測定法であって、
前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質が付与された検査領域を一部に有するクロマトグラフ媒体の該検査領域に、前記被検出物質と特異的に結合する、コロイド状金属粒子またはコロイド状金属酸化物粒子からなる標識物質により視認可能に標識された第２の結合物質を含む前記検体液を浸透させ、
該検体液を前記検査領域に浸透させた後に、前記クロマトグラフ媒体の屈折率との屈折率差Δｎが−０．１≦Δｎ≦０．１の屈折率を有する視認用溶液を、該クロマトグラフ媒体に浸透させ、前記検査領域に前記視認用溶液が浸透している状態で前記検査領域を視認することを特徴とするイムノクロマト測定法。 - 前記屈折率差Δｎが−０．０７≦Δｎ≦０．０７であることを特徴とする請求項１記載のイムノクロマト測定法。
- 前記視認用溶液がジメチルスルホキシド溶液であることを特徴とする請求項１または２記載のイムノクロマト測定法。
- クロマトグラフ媒体と、該クロマトグラフ媒体の一部に設けられた検査領域に付加された、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質と、該クロマトグラフ媒体を内包し、該クロマトグラフ媒体に検体液を注入するための注入口および前記検査領域を視認するための窓部を備えたケースと、前記クロマトグラフ媒体の、前記注入口から前記検査領域に至るまでの一部に付加された、前記被検出物質と特異的に結合する、コロイド状金属粒子またはコロイド状金属酸化物粒子からなる標識物質により視認可能に標識された第２の結合物質とを備えた検体保持具、および
前記検査領域における反応を視認する前に、前記検査領域に浸透させる、前記クロマトグラフ媒体の屈折率との屈折率差Δｎが−０．１≦Δｎ≦０．１の屈折率を有する視認用溶液を備えたことを特徴とするイムノクロマト測定キット。 - 前記屈折率差Δｎが−０．０７≦Δｎ≦０．０７であることを特徴とする請求項４記載のイムノクロマト測定キット。
- 前記視認用溶液がジメチルスルホキシド溶液であることを特徴とする請求項４または５記載のイムノクロマト測定キット。
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