JP2007163323A - 測定方法、及び、バイオセンサー - Google Patents

Abstract

【課題】参照領域における信号を用いて測定領域における信号をより正確に較正することを目的とする。
【解決手段】アナライト溶液ＹＡについての測定信号Ｓ１−０、参照信号Ｓ２−０、を取得し、メモリ９０Ｄに記憶されているサンプル対応関係ＳＡ１〜ＳＡ５の中から、参照信号Ｓ２−０に最も近似する参照信号Ｓ２を有するものを２つ選択して読み出す。そして、選択した２つのサンプル対応関係間の直線関係、すなわち、傾きＳＬを求め、この傾きＳＬを参照信号Ｓ２を較正するための較正係数とする。
【選択図】図１１

Description

本発明は、測定領域で得られた測定信号を参照領域で得られた参照信号で補正して、生理活性物質と検体物質との間の相互作用を測定する測定方法、及び、この測定方法を用いたバイオセンサーに関する。

従来より、エバネッセント波を利用した測定装置の１つとして、表面プラズモンセンサーが知られている（特許文献１参照）。一般的に、表面プラズモンセンサーは、プリズムと、このプリズムの一面に配置され生理活性物質が固定される金属膜と、光ビームを発生させる光源と、光ビームをプリズムに対して、プリズムと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、を備え、光検出手段の検出結果に基づいて、生理活性物質についての解析を行なうものである。

この表面プラズモンセンサーによる測定では、金属膜の上に固定化された生理活性物質に対して検体物質を含む反応液を供給すると共に、金属膜の反応液が供給されている側と逆側の面へ光ビームを入射し、その反射光から得られる屈折率から得られる信号情報に基づいて、生理活性物質と反応液中の検体物質との相互作用が測定される。

このように、屈折率から得られる信号情報を用いて、生理活性物質と反応液中の検体物質との相互作用を測定する場合には、通常、生理活性物質の固定されている測定領域の他に、生理活性物質の固定されていない参照領域を設け、参照領域から得られる信号情報を用いて、測定領域から得られる信号情報を較正し、検体物質と生理活性物質との相互作用を示す正確なデータを得る。

ところで、前述の反応液を調製する際に、屈折率の大きい物質が用いられることがある。例えば、疎水性の解析分子を溶解させるために、有機溶剤として、ジメチル・スルホキシド（ＤＭＳＯ）が用いられるが、ＤＭＳＯは屈折率が大きく、また、測定領域には生理活性物質の膜厚があることから、参照領域と測定領域とで、ＤＭＳＯ濃度の変化によって屈折率信号変化が異なってしまう。そのため、非特許文献１では、ＤＭＳＯ濃度の異なる複数の較正液の、測定領域における信号変化（測定信号）と、参照領域における信号変化（参照信号）との対応関係を求め、使用する測定セルの初期較正が行なわれている。

複数の較正液についての測定信号と参照信号変化との対応関係は、ほぼ直線関係を示すため、この初期較正では、複数の対応関係について最小自乗法等を用いて、近似直線を算出し、算出された近似直線に基づいて較正している。

しかしながら、測定信号と参照信号変化との対応関係は、装置の癖などに起因してバラツキを生じることがあるため、近似直線から離れた測定信号−参照信号の対応関係の方が、較正値として適当な場合もある。表面プラズモンセンサーによる測定の際の測定領域、参照領域における信号変化は、屈折率１×１０^−６の変化に伴う信号変化を示すＲＶの単位のごく僅かな量の信号変化であるため、より正確な較正が求められる。
特許第２７５８９０４号公報 Ｂｉａｃｏｒｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｔｒａｉｎｉｎｇ

本発明は上記事実を考慮してなされたものであり、測定領域で得られる測定信号をより正確に参照信号に基づいて較正することの可能な、測定方法、及び、バイオセンサーを提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、請求項１に記載の測定方法は、３種類以上の異なる較正液の各々について、測定領域において得られる測定信号と、参照領域において得られる参照信号との間の、サンプル対応関係を求め、前記測定領域に固定される生理活性物質へ供給される検体物質の前記参照領域における参照信号を検体物質参照信号として求め、前記サンプル対応関係の中から、前記検体物質参照信号に最も近似する参照信号を有する２つの前記サンプル対応関係を選択対応関係として選択し、前記２つの選択対応関係の間の直線関係、及び、前記検体物質参照信号に基づいて、前記測定信号を較正するものである。

また、請求項５に記載のバイオセンサーは、３種類以上の異なる較正液の各々について、測定領域において得られる測定信号と、参照領域において得られる参照信号との間の、サンプル対応関係を求めるサンプル取得手段と、前記測定領域に固定される生理活性物質へ供給される検体物質の前記参照領域における参照信号を検体物質参照信号として求める検体物質参照信号取得手段と、前記サンプル対応関係の中から、前記検体物質参照信号に最も近似する参照信号を有する２つの前記サンプル対応関係を選択対応関係として選択する選択手段と、前記２つの選択対応関係の間の直線関係、及び、前記検体物質参照信号に基づいて、前記測定信号を較正する較正手段と、を備えたものである。

上記では、まず、３種類以上の異なる較正液の各々について、測定領域において得られる測定信号と、参照領域において得られる参照信号との間のサンプル対応関係を求める。次に、使用する検体物質についての参照信号を検体物質参照信号として求める。次に、サンプル対応関係の中から、検体物質参照信号に最も近似する参照信号を有する２つのサンプル対応関係を選択対応関係として選択する。そして、２つの選択対応関係の間の直線関係と、前記検体物質参照信号とで、測定信号を較正する。

本発明の測定方法、バイオセンサーによれば、実際に使用する検体物質の信号値に近い信号値で、測定信号と参照信号との対応関係を決定する較正直線が採用されるので、より正確に測定信号を較正することができる。

なお、本発明の測定方法、バイオセンサーは、請求項２、６に記載のように、前記検体物質参照信号の値が、前記３種類以上のサンプル対応関係についての参照信号の値の範囲内であること、が好ましい。

また、本発明の測定方法、バイオセンサーは、請求項３、７に記載のように、前記測定信号及び前記参照信号が、屈折率変化を示す信号であること、を特徴とすることができる。

このような測定信号及び参照信号を用いる測定方法として、表面プラズモン測定、漏洩モード測定をあげることができる。

また、本発明の測定方法、バイオセンサーは、請求項４、８に記載のように、前記３種類以上のサンプル対応関係における参照信号の屈折率の差が０．０００００１以上０．０１以下であること、が好ましい。

サンプル対応関係における参照信号の屈折率の差は、小さいほど、測定時の参照信号の値に近いものを選択対応関係として用いることができ、正確に較正することができる。一方、あまり小さいと、参照信号の値の範囲内のサンプル対応関係を得るために、多くのサンプル対応関係を求める必要が生じる。そこで、両者のバランスを考慮して、屈折率の差は０．０００００１以上０．０１以下であることが好ましく、０．００００１以上０．００５以下であることがさらに好ましく、０．００００１以上０．０００５以下であることが最も好ましい。測定信号と参照信号の関係の乱れは、光学的な要因によるものと考えられるため、光学的な乱れの周期に沿うように屈折率の差を設定することが好ましいが、上記の数値範囲は、この周期に沿ったものである。

本発明は上記構成としたので、より正確に測定信号を較正して、正確な測定を行なうことができる。

以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。

本実施形態のバイオセンサー７０は、金属膜の表面に発生する表面プラズモンを利用して、生理活性物質としてのリガンドＤと検体物質としてのアナライトＡの間の相互作用を測定する、いわゆる表面プラズモンセンサーである。バイオセンサー７０では、リガンドＤに、各種の反応液を供給して、リガンドＤと反応液中のアナライトＡとの結合の有無、結合速度、結合量、等を測定する。

図１に示すように、バイオセンサー７０は、トレイ保持部７２、搬送部７４、アナライト溶液プレート保持部７６、液体供給部７８、光学測定部８０、較正液調整部８４、及び、制御部９０を備えている。

トレイ保持部７２は、載置台７２Ａ、及び、ベルト７２Ｂを含んで構成されている。載置台７２Ａは、矢印Ｉ方向に架け渡されたベルト７３に取り付けられており、ベルト７２Ｂの回転により矢印Ｉ方向に移動可能とされている。載置台７２Ａ上には、トレイ３０が２枚、位置決めして載置される。トレイ３０には、センサースティック４０が８本収納されている。センサースティック４０は、測定対象となるリガンドＤの固定されるチップであり、詳細については後述する。載置台７２Ａの下には、センサースティック４０を後述するスティック保持部材７４Ｃの位置まで押し上げる、押上機構７２Ｄが配置されている。

センサースティック４０は、リガンドＤが固定されるものである。図２及び図３に示すように、センサースティック４０は、誘電体ブロック４２、流路部材４４、保持部材４６、接着部材４８、及び、蒸発防止部材４９、で構成されている。

誘電体ブロック４２は、光ビームに対して透明な透明樹脂等で構成されており、断面が台形の棒状とされたプリズム部４２Ａ、及び、プリズム部４２Ａの両端部にプリズム部４２Ａと一体的に形成された被保持部４２Ｂを備えている。プリズム部４２Ａの互いに平行な２面の内の広い側の上面には、図４にも示すように金属膜５０が形成されている。この金属膜５０上に、バイオセンサー７０で解析するリガンドＤが固定される。誘電体ブロック４２は、いわゆるプリズムとしても機能し、バイオセンサー７０での測定の際には、プリズム部４２Ａの対向する互いに平行でない２つの側面の内の一方から光ビームが入射され、他方から金属膜５０との界面で全反射された光ビームが出射される。

金属膜５０の表面には、図４に示すように、リンカー層５０Ａが形成されている。リンカー層５０Ａは、リガンドＤを金属膜５０上に固定化するための層である。リンカー層５０Ａ上には、リガンドＤが固定され、アナライトＡとリガンドＤとの相互作用を測定する測定領域Ｅ１と、リガンドＤが固定されないか、または、リガンドＤが失活されている参照領域Ｅ２とが形成されている。この参照領域Ｅ２は、上述したリンカー層５０Ａを製膜する際に形成することができる。形成方法としては、例えば、リンカー層５０Ａに対して表面処理を施して、リガンドＤと結合する結合基を失活させる。これにより、リンカー層５０Ａの半分が測定領域Ｅ１となり、残りの半分が参照領域Ｅ２となる。このように、結合基を失活させるためには、上記、ブロッキングに用いたエタノールアミン−ヒドロクロライドを用いることができる。参照領域Ｅ２の別の構成方法としては、参照領域Ｅ２にカルボキシルメチルデキストランの代わりに、例えば、アルキルチオールを配するようにすれば、アルキル基を表面に配することが出来、アルキル基は、アミノカップリング法でリガンド結合させることは出来ないので、参照領域Ｅ２として使うことができる。

プリズム部４２Ａの両側面には、上側の端辺に沿って保持部材４６と係合される係合凸部４２Ｃが、下側の端辺に沿ってプリズム部４２Ａの上面と垂直な仮想面の延長上に構成される垂直凸部４２Ｄが、各々７箇所に形成されている。また、誘電体ブロック４２の下面の長手方向に沿った中央部には、係合溝４２Ｅが形成されている。

流路部材４４は、誘電体ブロック４２のプリズム部４２Ａと略同じ長さの棒状とされ、図４に示すように、誘電体ブロック４２の金属膜５０との間に、液体流路４５を構成する。液体流路４５は、流路部材４４の流路壁４４Ａと金属膜５０とで囲まれて構成されており、供給された液体を金属膜５０上で貯留可能とされている。流路部材４４には、液体流路４５と連通された供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂが形成されている。液体流路４５は、流路部材４４の長手方向に６個並んで配置されている。したがって、１本のセンサースティック４０には、独立した６個の液体流路４５が構成される。流路部材４４の側壁には、保持部材４６の内側の図示しない凹部に圧入されて保持部材４６との密着性を確保するための凸部４４Ｂが形成されている。

保持部材４６は、長尺とされ、上面板４６Ａ及び２枚の側面板４６Ｂで構成されている。側面板４６Ｂには、誘電体ブロック４２の係合凸部４２Ｃと係合される係合孔４６Ｃが形成されている。保持部材４６は、流路部材４４を間に挟んで係合孔４６Ｃと係合凸部４２Ｃとが係合されて、誘電体ブロック４２に取り付けられる。これにより、流路部材４４は、誘電体ブロック４２に取り付けられる。上面板４６Ａには、流路部材４４の供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂと対向する位置に、流路部材４４に向けて狭くなるテーパー状のピペット挿入孔４６Ｄが形成されている。また、隣り合うピペット挿入孔４６Ｄとピペット挿入孔４６Ｄとの間には、位置決め用のボス４６Ｅが形成されている。

保持部材４６の上面には、蒸発防止部材４９が接着部材４８を介して接着されている。接着部材４８のピペット挿入孔４６Ｄと対向する位置にはピペット挿入用の孔４８Ｄが形成され、ボス４６Ｅと対向する位置には位置決め用の孔４８Ｅが形成されている。また、蒸発防止部材４９のピペット挿入孔４６Ｄと対向する位置には十字状の切り込みであるスリット４９Ｄが形成され、ボス４６Ｅと対向する位置には位置決め用の孔４９Ｅが形成されている。ボス４６Ｅを孔４８Ｅ及び４９Ｅに挿通させて、蒸発防止部材４９を保持部材４６の上面に接着することにより、蒸発防止部材４９のスリット４９Ｄと流路部材４４の供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂとが対向するように構成される。ピペットチップＣＰの非挿入時には、スリット４９Ｄ部分が供給口４５Ｂを覆い、液体流路４５に供給されている液体の蒸発が防止される。

図１に示すように、バイオセンサー７０の搬送部７４は、上部ガイドレール７４Ａ、下部ガイドレール７４Ｂ、及び、スティック保持部材７４Ｃ、を含んで構成されている。上部ガイドレール７４Ａ及び下部ガイドレール７４Ｂは、トレイ保持部７２及び光学測定部８０の上部で、矢印Ｉ方向と直交する矢印Ｊ方向に水平に配置されている。上部ガイドレール７４Ａには、スティック保持部材７４Ｃが取り付けられている。スティック保持部材７４Ｃは、センサースティック４０の両端部の被保持部４２Ｂを保持可能とされていると共に、上部ガイドレール７４Ａに沿って移動可能とされている。スティック保持部材７４Ｃに保持されたセンサースティック４０の係合溝４２Ｅと下部ガイドレール７４Ｂとが係合され、スティック保持部材７４Ｃが矢印Ｊ方向に移動することにより、図２に示すように、センサースティック４０が光学測定部８０上の測定部８２に搬送される。この測定部８２で、センサースティック４０に固定されたリガンドＤとアナライトＡとの相互作用が測定される。測定部８２では、下部ガイドレール７４Ｂが測定のために一部離間されている
アナライト溶液プレート保持部７６は、載置台７６Ａ、及び、ガイドレール７６Ｂを含んで構成されている。ガイドレール７６Ｂは、矢印Ｊ方向に沿って配置されている。載置台７６Ａは、ガイドレール７６Ｂに取り付けられ、アナライト溶液ＹＡがセットされたアナライト溶液プレート７７を載置可能とされている。載置台７６Ａは、ガイドレール７６Ｂに沿って移動可能とされている。

液体供給部７８は、上部ガイドレール７４Ａ、及び、ガイドレール７６Ｂよりも上方で、矢印Ｉ方向に架け渡された横断レール７８Ａ、及び、ヘッド７８Ｂを含んで構成されている。ヘッド７８Ｂは、横断レール７８Ａに取り付けられ、測定部８２とアナライト溶液プレート７７との間を移動可能とされている。また、ヘッド７８Ｂは、図示しない駆動機構により、鉛直方向（矢印Ｚ方向）にも移動可能とされている。ヘッド７８Ｂは、先端部に交換可能な２本のピペットチップＣＰが取り付けられ、いわゆるピペットとしての機能を有している。

較正液調整部８４には、調製用トレイ８６、及び、原液用トレイ８８が載置されている。原液用トレイ８８には、水を貯留する水容器８８Ａ、バッファー液を貯留するバッファー液容器８８Ｂ、及び、有機溶剤を貯留する溶剤容器８８Ｃが、矢印Ｉ方向に並ぶように収納されている。本実施形態では、有機溶剤として、ジメチル・スルホキシド（ＤＭＳＯ）が用いられている。ＤＭＳＯの屈折率は、２５℃で１．４８程度である。各容器には、ヘッド７８Ｂに取り付けられたピペットチップＣＰを差し込んで容器内の液を吸引するための開口Ｈが形成されている。なお、バッファー液としては、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの、ＰＨバッファー能を有するものが、適宜選択され使用される。

調製用トレイ８６には、ＤＭＳＯ濃度の異なる５種類の較正液を各々調製して貯留しておくことの可能な、５個の較正液容器８６Ａ〜８６Ｅが、矢印Ｉ方向に並ぶように収納されている。これらの容器にも、ヘッド７８Ｂに取り付けられたピペットチップＣＰを差し込んで容器内に液を注入、及び容器内の液を吸引するための開口Ｈが形成されている。

光学測定部８０は、図６に示すように、光源８０Ａ、第１光学系８０Ｂ、第２光学系８０Ｃ、受光部８０Ｄ、信号処理部８０Ｅ、を含んで構成されている。光源８０Ａからは、光ビームＬが出射される。光ビームＬは、第１光学系８０Ｂを介して、２本の光ビームＬ１、Ｌ２となり、測定部８２に配置された誘電体ブロック４２の測定領域Ｅ１と参照領域Ｅ２に入射される（図５参照）。測定領域Ｅ１及び参照領域Ｅ２において、光ビームＬ１、Ｌ２は、金属膜５０と誘電体ブロック４２との界面に対して種々の入射角成分を含んで、かつ全反射角以上の角度で入射される。光ビームＬ１、Ｌ２は、誘電体ブロック４２と金属膜５０との界面で全反射される。全反射された光ビームＬ１、Ｌ２も、種々の反射角成分をもって反射される。この全反射された光ビームＬ１、Ｌ２は、第２光学系８０Ｃを経て受光部８０Ｄで受光されて、各々光電変換され、光検出信号が信号処理部８０Ｅへ出力される。信号処理部８０Ｅでは、入力された光検出信号に基づいて所定の処理が行なわれ、測定領域Ｅ１及び参照領域Ｅ２における全反射減衰角の屈折率の変化に対応する信号変化が、測定信号Ｓ１、参照信号Ｓ２として求められる。測定信号Ｓ１、参照信号Ｓ２は、制御部９０へ出力される。

なお、バイオセンサー７０は、センサースティック４０、および異なる濃度のブドウ糖溶液を使用して、予め屈折率の変化に対応する信号変化を測定し、屈折率１０^−６の変化が１ＲＶになるよう補正を行っている。測定信号Ｓ１、参照信号Ｓ２は、ＲＶで表示する。使用するブドウ糖溶液は予め旋光度を測定することで、正確な濃度を得ることができる。

制御部９０は、バイオセンサー７０の全体を制御する機能を有し、図６に示すように、光源８０Ａ、信号処理部８０Ｅ、及び、バイオセンサー７０の図示しない駆動系と接続されている。制御部９０は、図７に示すように、バスＢを介して互いに接続される、ＣＰＵ９０Ａ、ＲＯＭ９０Ｂ、ＲＡＭ９０Ｃ、メモリ９０Ｄ、及び、インターフェースＩ／Ｆ９０Ｅ、を有し、各種の情報を表示する表示部９２、各種の指示、情報を入力するための入力部９４と接続されている。

メモリ９０Ｄには、バイオセンサー７０を制御するための各種プログラムや、各種データが記録されている。また、メモリ９０Ｄには、後述する初期較正で使用する、較正係数算出のための各種プログラムが記憶されている。較正係数算出プログラムは、信号変化に応じて参照信号を較正するための較正係数を算出するためのものである。

次に、バイオセンサー７０での、測定について説明する。

まず、較正液調整部８４で、水、ＤＭＳＯ、ＰＢＳを用いて、較正液Ｋ１〜Ｋ５の順にＤＭＳＯ濃度が高くなる５種類の較正液を調製し、較正液容器８６Ａ〜８６Ｅへ貯留する。ここでは、較正液Ｋ３をランニングバッファーとして使用するため、較正液Ｋ３の測定信号Ｓ１、参照信号Ｓ２をベース（０）として、この信号との変化量を求める。較正液Ｋ１〜Ｋ５は、測定時に使用するアナライト溶液ＹＡについての参照信号Ｓ２が内挿されるように調製する。すなわち、アナライト溶液ＹＡについての参照信号Ｓ２が、較正液Ｋ１〜Ｋ５の参照信号Ｓ２の範囲内になるように調製する。

なお、使用する較正液は、その数が多い程、あるいは、較正液間の屈折率の差が狭いほど、正確な較正を行うことができる。ただし、数が多いと、測定に長時間を要するため、３種類以上、１００種類以下が好ましく、５種類以上、２０種類以下が更に好ましい。また、較正液Ｋ１〜Ｋ５の屈折率の差は、０．０００００１以上０．０１以下であることが好ましく、０．００００１以上０．００５以下であることがさらに好ましく、０．００００１以上０．０００５以下であることが最も好ましい。

次に、較正液Ｋ１〜Ｋ５についての、測定信号Ｓ１と参照信号Ｓ２を求める。測定信号Ｓ１及び参照信号Ｓ２は、以下のようにして測定される。

まず、測定に用いるセンサースティック４０を測定部８２へ搬送して、１の液体流路４５を所定の測定位置に配置する。

入力部９４からサンプル対応関係取得の開始指示が入力されると、制御部９０では、図８に示す信号取得処理が実行される。信号取得処理は、較正液Ｋ１〜Ｋ５で満たされる液体流路４５の測定領域Ｅ１及び参照領域Ｅ２へ光ビームＬを入射させて、反射光から得られる各々の領域の測定信号Ｓ１と参照信号Ｓ２を得て、これらをメモリ９０Ｄへ記憶しておく処理である。

まず、ステップＳ２２で、光源８０Ａへ光ビームＬの出射指示信号を出力する。これにより、光源８０Ａから光ビームＬが出射される。出射された光ビームＬは、第１光学系８０Ｂで２本の光ビームＬ１、Ｌ２となり、液体流路４５の測定領域Ｅ１、参照領域Ｅ２へ各々入射される。また、ステップＳ２４で、受光部８０Ｄ及び信号処理部８０Ｅへ、作動指示信号を出力する。これにより、測定領域Ｅ１、参照領域Ｅ２で全反射され第２光学系８０Ｃを経た光ビームＬ１、Ｌ２は、受光部８０Ｄで受光され、受光された光は、測定領域Ｅ１、参照領域Ｅ２毎に光電変換されて光検出信号が信号処理部８０Ｅへ出力される。信号処理部８０Ｅでは、光検出信号に所定の処理が加えられ、測定領域Ｅ１、参照領域Ｅ２についての測定信号Ｓ１、参照信号Ｓ２が生成され、これらが継続して制御部９０へ出力される。

制御部９０では、ステップＳ２６で、所定時間経過したかどうかを判断し、所定時間の経過後、ステップＳ２８で、入力された測定信号Ｓ１、参照信号Ｓ２をメモリ９０Ｄへ記憶する。ステップＳ２６、Ｓ２８は、すべての較正液の供給が終了するまで繰り返される。これにより、測定信号Ｓ１、参照信号Ｓ２が時間毎に記録される。

一方、上記の信号取得処理中に、液体流路４５へ較正液Ｋ１〜Ｋ５の供給が順に行なわれる。制御部９０は、信号取得処理中の所定のタイミングで、図９に示す較正液供給処理を実行する。

まず、ステップＳ４０で、較正液Ｋ１の供給指示信号をヘッド７８Ｂへ出力する。これにより、ヘッド７８Ｂで、信号取得処理実行中の液体流路４５へ較正液Ｋ１が供給される。較正液Ｋ１の供給は、具体的には以下のように行なわれる。まず、ヘッド７８Ｂが較正液Ｋ１のセットされた較正液容器８６Ａ上部に移動すると共に下降して、ヘッド７８Ｂに取り付けられている一方のピペットチップＣＰの先端を較正液Ｋ１が貯留された較正液容器８６Ａの開口Ｈへ挿入し、ピペットチップＣＰ内に較正液Ｋ１を吸引する。次に、ヘッド７８Ｂを上昇させて測定部８２の上部に移動すると共に下降して、当該ピペットチップＣＰの先端を液体流路４５の供給口４５Ａへ挿入する。同時に、他方のピペットチップＣＰを排出口４５Ｂへ挿入する。液体流路４５へ、吸引していた較正液Ｋ１を注入すると共に、排出口４５Ｂ側のピペットチップＣＰで保存液を吸引する。これにより、液体流路４５に供給されていた保存液（リガンドＤ維持用に予め充填されていたもの）が、排出口４５Ｂから排出され、保存液が較正液Ｋ１で置換される。ここでは、保存液として、較正液Ｋ３と同様のものが使用されている。これにより、液体流路４５が較正液Ｋ１で満たされ、較正液Ｋ１についての、測定信号Ｓ１、参照信号Ｓ２が得られる。

次にステップＳ４２で、所定時間が経過したかどうかを判断する。ここでの所定時間は、較正液Ｋ１の測定信号Ｓ１、参照信号Ｓ２を得るために十分な時間をいう。

次に、ステップＳ４４で、すべての較正液の供給が終了したかどうかを判断し、判断が否定された場合には、ステップＳ４６で、次の較正液の供給指示信号をヘッド７８Ｂへ出力し、ステップＳ４２へ戻る。これにより、較正液Ｋ１のときと同様にして次の較正液の供給が行われる。ステップＳ４４での判断が肯定された場合には、本処理を終了する。

図８の信号取得処理では、ステップＳ３０で、較正液供給処理が終了したかどうかを判断し、終了した場合には信号取得処理を終了する。

上記の信号取得処理、及び、較正液供給処理により、較正液Ｋ１〜Ｋ５についてのサンプル対応関係が得られる。図１０には、サンプル対応関係の例が示されている。横軸を参照信号Ｓ２、縦軸を測定信号Ｓ１としたグラフ上に、較正液Ｋ１〜Ｋ５についてのサンプル対応関係ＳＡ１〜ＳＡ５がプロットされている。サンプル対応関係ＳＡ１〜ＳＡ５に基づいて、近似直線を求めることもできるが、サンプル対応関係ＳＡ１〜ＳＡ５は、バラツキを有している。

次に、リガンドＤとアナライトＡとの相互作用を測定する測定処理を行う。測定処理と同時に、較正係数ＳＬを求めるための較正係数算出処理が行われる。ここで、較正係数ＳＬは、屈折率変化に伴う測定信号Ｓ１と参照信号Ｓ２との対応関係を較正するための係数である。

まず、図１１に示すように、前述の信号取得処理と同様にして、ステップＳ２２〜２４を実行する。そして、ステップＳ６０で、アナライトＡを含んだアナライト溶液ＹＡを供給するための供給指示信号をヘッド７８Ｂへ出力する。これにより、アナライト溶液ＹＡが液体流路４５へ供給される。

ステップＳ６２で、アナライト溶液ＹＡについての測定信号Ｓ１−０、参照信号Ｓ２−０、を取得する。次に、ステップＳ６４で、メモリ９０Ｄに記憶されているサンプル対応関係ＳＡ１〜ＳＡ５の中から、参照信号Ｓ２−０に最も近似する参照信号Ｓ２を有するものを２つ選択して読み出す。そして、ステップＳ６６で、選択した２つのサンプル対応関係間の直線関係、すなわち、傾きＳＬを求める。例えば、サンプル対応関係ＳＡ３、ＳＡ４が選択された場合には、図１０に示すように、ＳＡ３とＳＡ４との間の直線関係、すなわち、傾きＳＬ（３−４）が求められる。この傾きＳＬ（３−４）が、参照信号Ｓ２を較正するための較正係数となる。

ステップＳ６８で、傾きＳＬ（３−４）、参照信号Ｓ２を用いて、測定信号Ｓ１を較正し結合量Ｔを求める。ここでの較正は、数式１により行われる。

Ｔ ＝ （測定信号Ｓ１）−（参照信号Ｓ２）×（傾きＳＬ）… 数式１
ステップＳ７０で、終了指示があったかどうかを判断し、終了指示があれば、本処理を終了する。終了指示がない場合には、ステップＳ７２で所定時間の経過を待って、ステップＳ７４で、測定信号Ｓ１−０、参照信号Ｓ２−０を取得し、ステップＳ６８へ戻って、上記処理を繰り返す。これにより、所定時間毎の結合データＴを取得することができる。

本実施形態によれば、較正係数ＳＬを、実際に測定する際のアナライト溶液ＹＡにおける参照信号Ｓ２−０に最も近い参照信号を有する２つサンプル対応関係ＳＡに基づいて算出するので、より正確な較正係数ＳＬを求めることができる。

なお、本実施形態では、バイオセンサーとして、表面プラズモンセンサーを一例として説明したが、バイオセンサーとしては、表面プラズモンセンサーに限定されるものではない。その他の例えば、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した光学的測定技術など、あらゆるバイオセンサーに本発明は適用することができる。

また、全反射減衰を利用する他のバイオセンサーとしては、漏洩モード検出器をあげることができる。漏洩モードセンサは、誘電体と、この上に順に層設されたクラッド層と光導波層とによって構成された薄膜とからなり、この薄膜の一方の面がセンサ面となり、他方の面が光入射面となる。光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させると、その一部が前記クラッド層を透過して前記光導波層に取り込まれる。そして、この光導波層において、導波モードが励起されると、前記光入射面における反射光が大きく減衰する。導波モードが励起される入射角は、表面プラズモン共鳴角と同様に、センサ面上の媒質の屈折率に応じて変化する。この反射光の減衰を検出することにより、前記センサ面上の反応を測定することができる。

上記実施形態で説明したバイオセンサーでの実施例について説明する。

（１）デキストラン測定チップの作製
金属膜５０として５０ｎｍの金が蒸着された本発明の誘電体ブロック４２をＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（ＴＥＣＨＮＯＶＩＳＩＯＮ ＩＮＣ．）で３０分間処理した後、エタノール／水（８０／２０）中１６−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールの５．０ｍＭ溶液を金属膜に接触するように添加し、２５℃で１８時間表面処理を行った。その後、エタノールで５回、エタノール／水混合溶媒で１回、水で５回洗浄を行った。

次に、１６−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールで被覆した表面を１０質量％のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：０．４Ｍ水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの１：１混合溶液）に接触させ、２５℃の振盪インキュベーター中で４時間反応を進行させた。表面をエタノールで２回、水で５回洗浄した。

次に、２５質量％のデキストラン（Ｔ５００，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）水溶液４０．５ｍｌに４．５ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベーター中で２５℃で２０時間インキュベートした。表面を５０℃の水で１０回洗浄した。

続いて、ブロモ酢酸３．５ｇを２７ｇの２Ｍ水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、２８℃の振盪インキュベーターで１６時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後上述の手順を１回繰り返した。

（２）ＣＡ固定チップの作成
上記のデキストラン上の溶液を除去した後、２００ｍＭ ＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド ハイドロクロライド）と５０ｍＭ ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の混合溶液７０μｌを添加し、１０分間放置した。混合溶液を除去した後、１００μｌの水で３回、１００μｌのＡｃｅｔａｔｅ５．０バッファー（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）で３回洗浄した。Ａｃｅｔａｔｅ５．０バッファーを１００μｌ入れた状態から、測定チップ上の液をＣＡ溶液（ＳＩＧＭＡ社製Ｂｏｖｉｎｅ Ｃａｒｂｏｎｉｃ Ａｎｈｙｄｒａｓｅ（以下ＣＡと略す）が１００ｍｇ／ｍｌになるようＡｃｅｔａｔｅ５．０に溶解したもの）に入れ替え１５分間放置し、ＣＡを固定した。液体流路内を１Ｍ エタノールアミン溶液に置き換え、１０分間放置した後、１００μｌのＡｃｅｔａｔｅ５．０バッファーで１０回洗浄し、ＣＡ固定チップを作成した。

また、参照領域Ｅ２に対応する部分については、ＣＡを失活させて、アナライトとの結合を阻止しておく。
（３）流路系の作成
ＣＡ固定チップを構成する誘電体ブロック４２に対し、流路部材４４、保持部材４６、接着部材４８、及び、蒸発防止部材４９を配置してセンサースティック４０を構成した。ＣＡ固定領域（測定領域Ｅ１）から得られる信号を測定信号Ｓ１、参照領域Ｅ２から得られる信号を参照信号Ｓ２とする。
（４）較正液Ｋ１〜Ｋ５の調製
１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（和光純薬製）、ＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ社製）を使用し、表１に記載の比率で混合して較正液Ｋ１〜Ｋ５を調製した。較正液Ｋ３をランニングバッファーとする。各較正液の２５℃での屈折率を屈折率計（ＡＴＡＧＯ製ＲＸ−５０００α）を使用して測定した。結果を表１に示す。
（５）Ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ溶液１〜１２の調製
１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、ＤＭＳＯ、Ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ製）の１００ｕＭ ＤＭＳＯ溶液、純水をそれぞれ１００ｕｌ， ９９ｕｌ， １ｕｌ， ８００ｕｌ混合し、１ｍｌのＩｎｄａｐａｍｉｄｅ溶液１（１ｕＭ）を作成した。この操作を同様に繰り返してＩｎｄａｐａｍｉｄｅ溶液２〜１２を作成した。
（６）較正液の測定
液体流路４５内をランニングバッファーで満たした。続いて較正液Ｋ１で液体流路４５を満たし、測定信号Ｓ１、参照信号Ｓ２、それぞれのランニングバッファーとの信号差を測定した。較正液Ｋ２、Ｋ４、Ｋ５についても同様に測定を行った。測定値を表１に示す。

（７）Ｉｎｄａｐａｍｉｄｅの測定
液体流路４５をランニングバッファーで満たした。続いて液体流路４５をＩｎｄａｐａｍｉｄｅ溶液１に置き換えた。置き換え開始５秒前から置き換え２分後の測定信号Ｓ１−１、参照信号Ｓ２−１それぞれを測定した。Ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ溶液２〜１２についても同様に測定を行った。

（８）Ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ結合量の算出１（比較例１）
ランニングバッファーを基準とした較正液Ｋ１〜Ｋ５の参照信号Ｓ２を横軸に、測定信号Ｓ１を縦軸にプロットし、最小自乗法にて傾き（ＳＬ）を求めた（図１２（Ａ）参照）。続いて、Ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ溶液１での結合量Ｔ１を、ｎｄａｐａｍｉｄｅ溶液１での測定信号Ｓ１をＳ１−１、参照信号Ｓ２をＳ２−１として、式１に基づいて算出した。

Ｔ１ ＝（Ｓ１−１）−（（Ｓ２−１）× ＳＬ） … 式１
Ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ溶液２〜１２についても同様に算出した。

（９）Ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ結合量の算出２（比較例２）
較正液Ｋ１およびＫ５の参照信号Ｓ２を横軸に、測定信号Ｓ１を縦軸にプロットし、２点間の傾き（ＳＬ１−４）を求めた（図１２（Ｂ）参照）。続いて、Ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ溶液１での結合量Ｔ２を、式２に基づいて算出した。

Ｔ２ ＝（Ｓ１−１）−（（Ｓ２−１）×（ＳＬ１−４）） … 式２
Ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ溶液２〜１２についても同様に算出した。

（１０）Ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ結合量の算出３（実施例）
ランニングバッファーを基準とした較正液Ｋ１〜Ｋ５の参照信号Ｓ２を横軸に、測定信号Ｓ１を縦軸にプロットし、較正液Ｋ１−Ｋ２間の傾き（ＳＬ１−２）、較正液Ｋ２−ランニングバッファーＫ３間の傾き（ＳＬ２−３）、ランニングバッファーＫ３−較正液Ｋ４間の傾き（ＳＬ３−４）、較正液Ｋ４−Ｋ５間の傾き（ＳＬ４−５）をそれぞれ求めた（図１２（Ｃ）参照）。続いて、Ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ溶液１での結合量Ｔ３を、式３に基づいて算出した。

Ｔ３ ＝（Ｓ１−１）−（（Ｓ２−１）×（ＳＬ２−３）） … 式３
Ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ溶液１の参照信号Ｓ２−１に最も近似する参照信号Ｓ２を有する２つの較正液が、較正液Ｋ２、及びランニングバッファーＫ３であるため、較正液Ｋ２−ランニングバッファーＫ３間の傾き（ＳＬ２−３）を使用した。

Ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ溶液２〜１２についても同様に、参照信号Ｓ２−１に最も近似する参照信号Ｓ２を有する２つの較正液間の傾き（ＳＬ１−２， ＳＬ２−３， ＳＬ３−４， ＳＬ４−５いずれか）を使用して結合量Ｔ３を算出した。

信頼性の高いデータを得るには、Ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ溶液の信号値はバラツキが小さいほど好ましく、結合量のＣＶ値が１０％以下であることが好ましい。

表２に、比較例１、２、及び、実施例で用いる傾きの一覧を示し、表３に、Ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ溶液１〜１２についての、測定信号Ｓ１、参照信号Ｓ２、ＣＡとの結合量Ｔの算出結果を示す。

表３に示されるＩｎｄａｐａｍｉｄｅ溶液１〜１２についての、測定信号Ｓ１、参照信号Ｓ２のバラツキより、同様の調合を行っても調合誤差が生じていることが確認できる。このようにバラツキを有するＩｎｄａｐａｍｉｄｅ溶液１〜１２であっても、実施例では、結合量ＴのＣＶ値が８．４％と最も小さく、精度良く結合量を測定できることがわかる。

本実施形態のバイオセンサーの全体斜視図である。 本実施形態のセンサースティックの斜視図である。 本実施形態のセンサースティックの分解斜視図である。 本実施形態のセンサースティックの１の液体流路部分の断面図である。 本実施形態のセンサースティックの測定領域及び参照領域へ光ビームが入射している状態を示す図である。 本実施形態のバイオセンサーの光学測定部付近の概略図である。 本実施形態の制御部とその周辺の概略ブロック図である。 本実施形態の信号取得処理のフローチャートである。 本実施形態の較正液供給処理のフローチャートである。 本実施形態のサンプル対応関係の一例を示すグラフである。 本実施形態の測定処理のフローチャートである。 （Ａ）（Ｂ）は、比較例で用いる傾き（較正係数）を示すグラフであり、（Ｃ）は、本実例で用いる傾き（較正係数）を示すグラフである。

符号の説明

７０ バイオセンサー
４０ センサースティック
５０ 金属膜
７８ 液体供給部
８０ 光学測定部
８４ 較正液調整部
９０ 制御部
Ｅ１ 測定領域
Ｅ２ 参照領域
Ｋ１ 較正液
Ｋ２ 較正液
Ｋ３ 較正液
Ｋ４ 較正液
Ｓ１ 測定信号
Ｓ２ 参照信号
ＳＡ サンプル対応関係
ＳＬ 較正係数

Claims (8)

1. ３種類以上の異なる較正液の各々について、測定領域において得られる測定信号と、参照領域において得られる参照信号との間の、サンプル対応関係を求め、
   前記測定領域に固定される生理活性物質へ供給される検体物質の前記参照領域における参照信号を検体物質参照信号として求め、
   前記サンプル対応関係の中から、前記検体物質参照信号に最も近似する参照信号を有する２つの前記サンプル対応関係を選択対応関係として選択し、
   前記２つの選択対応関係の間の直線関係、及び、前記検体物質参照信号に基づいて、前記測定信号を較正する、測定方法。
2. 前記検体物質参照信号の値は、前記３種類以上のサンプル対応関係についての参照信号の値の範囲内であること、を特徴とする請求項１に記載の測定方法。
3. 前記測定信号及び前記参照信号は、屈折率変化を示す信号であること、を特徴とする請求項１または請求項２に記載の測定方法。
4. 前記３種類以上のサンプル対応関係における参照信号の屈折率の差が０．０００００１以上０．０１以下であること、を特徴とする、請求項３に記載の測定方法。
5. ３種類以上の異なる較正液の各々について、測定領域において得られる測定信号と、参照領域において得られる参照信号との間の、サンプル対応関係を求めるサンプル取得手段と、
   前記測定領域に固定される生理活性物質へ供給される検体物質の前記参照領域における参照信号を検体物質参照信号として求める検体物質参照信号取得手段と、
   前記サンプル対応関係の中から、前記検体物質参照信号に最も近似する参照信号を有する２つの前記サンプル対応関係を選択対応関係として選択する選択手段と、
   前記２つの選択対応関係の間の直線関係、及び、前記検体物質参照信号に基づいて、前記測定信号を較正する較正手段と、
   を備えた、バイオセンサー。
6. 前記検体物質参照信号の値は、前記３種類以上のサンプル対応関係についての参照信号の値の範囲内であること、を特徴とする請求項５に記載のバイオセンサー。
7. 前記測定信号及び前記参照信号は、屈折率変化を示す信号であること、を特徴とする請求項５または請求項６に記載のバイオセンサー。
8. 前記３種類以上のサンプル対応関係における参照信号の屈折率の差が０．０００００１以上０．０１以下であること、を特徴とする、請求項７に記載のバイオセンサー。

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