JPH04127061A - 蛍光微粒子による免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明は、微粒子を用いた免疫測定方法に関するもので
ある。

【従来の技術】

微粒子を使用した免疫測定方法として、表面に抗体を結
合させたラテックス粒子と抗原とを反応させ、抗原抗体
反応によって生成するラテックス粒子の凝集状態を吸光
度または散乱光強度により測定して抗原濃度を測定する
方法が知られている。 この方法は例えば、［ぶんせき、１６（１９８７）、第
６０５頁から第６１１頁」に記載されている。 また、「検査と技術、−匹（１９８８）　、第６０７頁
から第６１３頁」には、凝集反応液をフローセルに導い
て、フローセル内を流れる微粒子の散乱光を測定する方
法が示されている。 さらに、特開昭５６−１５１３５７のようにヘテロジニ
アス系の反応によって微粒子を測定抗原と結合させて、
散乱光強度等で定量する方法が提示されている。

【発明が解決しようとする課題】

ラテックス粒子による凝集状態を散乱光または透過光強
度で測定する方法では、反応液全体の平均値で定量する
。しかし、凝集反応では１反応によって種々の凝集塊が
形成される。このため、平均値による定量では、抗原濃
度の算出に精度的な問題があり、極低濃度の抗原量の定
量等が困難である。 凝集液をフローセル下で散乱光により測定する方法では
、個々の凝集塊の大きさを計測することができ、抗原濃
度の算出精度を向上させることができる。しかし、流体
中のゴミやフローセル、または流体自体からの散乱光の
影響を除去することが困難である。また、試料中に共存
する散乱体や、色素等の吸収体・蛍光体の影響を完全に
除去することも困難である。 また、凝集法では、抗原過剰領域で抗原抗体反応が抑制
される現象、いわゆるプロゾーン現象が避けられない。 また、試料中に共存する散乱体や。 色素等の吸収体・蛍光体の影響を完全に除去することは
困難である。さらに、抗原と微粒子とが１対１に対応し
ないため、凝集塊の数を計数する従来方式では特に極低
濃度領域での計数値の誤差が発生しやすいという問題が
ある。 ヘテロジニアス系の反応では、上記のような凝集反応そ
のものに由来する問題が低減され、高感度な定量が期待
できる。しかし、上記従来例では、測定を高感度に行う
ための方法については明記されていない。 微粒子の計測には、光散乱強度の計測、蛍光性の微粒子
を使用した場合は蛍光強度の計測が一般に使用される。 光散乱強度計測では、溶液中にゴミ等が存在する場合に
は正確な測定を行うことができない。しかも、通常の反
応時には溶液中にゴミ等が混入することが多いため、必
ずしも有効な測定とはならない。蛍光性の微粒子を使用
した場合は、このようなゴミ等の影響を減少させること
ができるが、蛍光性の微粒子そのものによる散乱光が存
在するため、十分に除去することは困難である。しかも
、この散乱光強度は非常に大きなものであるため、フィ
ルタ等を使用しても完全に除去することができず、蛍光
測定時の迷光となり、測定精度を低下させるという問題
がある。 本発明の目的は、上記従来技術の問題点を解決し、微粒
子を利用し、高感度で測定ができる免疫測定方法を提供
することにある。

【課題を解決するための手段］ 上記目的は、標識物質として蛍光性の微粒子を使用し、
蛍光測定時の液体の屈折率と微粒子の屈折率の比が０．
８６以上となる組合せの液体と微粒子を選定し、この液
体中の微粒子からの蛍光を測定することで達成できる。 【作用】 蛍光性の微粒子を使用し、蛍光強度により微粒子の量を
算定することで、測定溶液中に混在するゴミ等の影響を
除去することができる。さらに、屈折率が微粒子の屈折
率に対して０．８６以上の液体中で蛍光測定することに
よって、微粒子からの散乱を大幅に減少させることがで
き、蛍光強度を正確に測定することができる。 物質による光の散乱は、屈折率等の複雑な関数となる。 簡単な系では、例えば、屈折率ｎ□の物質から０２の物
質に光が垂直に入射するとき、その面での光の反射光強
度Ｒは、 Ｒ＝　（ｎ、−ｎ、）”／（ｎ２＋ｎ１）”となる、つ
まり、ｎ２の値と０１の値が近いほど反射光強度が小さ
くなる０反射光は散乱光の基であり、この反射光強度を
減少させることで、散乱光強度を減少させることができ
る。このことから、ｎ２とｎ□の差を小さくすることで
散乱光強度を抑えることができる。 第１図に、種々の屈折率の液体中に、蛍光性の微粒子と
、非蛍光性の微粒子を分散させた試料を訓製し、蛍光性
の微粒子の分散液からの蛍光強度と、非蛍光性の微粒子
の分散液からの蛍光強度すなわち背景光強度を測定した
結果を示す。ここで、液体中の微粒子の濃度は一定とし
た。図は、（蛍光強度）／（背景光強度） の相対値と。 （液体の屈折率）／（微粒子の屈折率）との関係を図示
したものである。このように、液体と微粒子の屈折率比
を変化させることにより、蛍光強度と背景光強度の比は
大きく変化し、上記屈折率比が１に近づくに従って、蛍
光強度の比率が増大し、蛍光強度をより正確に演Ｃ定す
ることができる。 通常、ポリスチレンの微粒子を緩衝液中で測定すること
が一般的である。この場合の（液体の屈折率）／（微粒
子の屈折率）は約０．８４であるが、第１図より、（液
体の屈折率）／（微粒子の屈折率）を０．８６以上にす
ることによって、（蛍光強度）／（背景光強度）が２倍
以上になり、より高感度に蛍光測定が可能になる。液体
の屈折率と微粒子の屈折率が等しい場合にその効果が最
大になる。例えば、屈折率が１．４９の微粒子と、屈折
率が１．４７のグリセリン液の組合せ等が有効である。 また、（液体の屈折率）　／　（９粒子の屈折率）がよ
り大きくなると散乱光強度は逆に大きくなる。蛍光測定
に有効な（液体の屈折率）／（ＩＩＩ［粒子の屈折率）
の上限は、同様の理由で１゜１５である。 なお、蛍光測定方法には、微粒子を反応容器に結合させ
た状態で蛍光測定する場合、液体中に分散させた状態で
蛍光測定する場合、液体中に分散させてフローセルで蛍
光測定する場合等種々の状態での蛍光計測に有効である
。 さらに、フローセルに導いて測定する方法では。 シースフローセルを利用することが望ましい。シースフ
ローにより、微粒子を１個１個計測部を通過させること
で、微粒子の全数計数が可能になり、計数精度が向上す
る。 なお、反応に使用する微粒子には、測定試料中の被測定
物質と特異的に結合する物質を結合させる必要がある。 ：／ＩＩＪ定試料中の被測定物質および被測定物質と特
異的に結合する物質の組み合わせとしては、抗原（また
は抗体）と抗体（または抗原）が代表的な組み合わせで
ある。さらにその他に、例えばホルモンとレセプター、
糖とレクチンの組み合わせ、またはハイブリダイゼーシ
ョン反応による特定のＤＮＡとプローブＤＮＡの組み合
わせ等も可能である。また、この微粒子の表面に抗体（
または抗原）等を結合させるには、通常知られている物
理吸着、化学結合等が利用できる。 本発明によりイムノグロブリン、α−フェトプロティン
（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、フェリチン、風
疹抗体、エイズウィルス抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピ
ン（ＨＣＧ）、甲状腺刺激ホルモン等の種々の抗原、抗
体、ホルモン、ＤＮＡ等の生体関連物質を高感度に測定
できる。

【実施例】

以下、本発明を実施例により説明する。 ［実施例１コ 被測定物質として、ヒトα−フェトプロティン（ヒトＡ
ＦＰ）抗原を例にとり、ペテロジニアスサンドイッチイ
ムノアッセイ法により反応容器に蛍光微粒子を捕捉し、
この蛍光微粒子の量を蛍光計測により測定することで、
定量する方法及び測定装置について説明する。 〈固定化抗体の調製〉 マイクロプレートのウェルを反応容器とし、内面にヒト
ＡＦＰに対する抗体を固定化する。平底のマイクロプレ
ートの各ウェルに濃度ｌＯμｇ／ｍＱの抗ヒトＡＦＰ抗
体溶液５０μＱを注入し、２時間間欠的に撹拌し反応さ
せて抗ヒトＡＦＰ抗体をウェルに固定化した。 〈微粒子標識抗体の調製〉 表面にカルボキシル基を有する蛍光性の微粒子（屈折率
が１．６のポリスチレン製の蛍光微粒子）を標識物とし
て使用する。直径が０．５μｍで、５４０ｎｍの最大蛍
光波長を有する蛍光微粒子の表面に、カルボジイミド法
により、抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化しく固定化量約０．
７ｍｇ／ｇ）、微粒子標識抗ヒトＡＦＰ抗体を調製した
。 く反応手順〉 測定抗原であるヒトＡＦＰを含む試料血清５０μＱを抗
ヒトＡＦＰ抗体を固定化した反応容器（ウェル）に注入
して、２時間反応させ、測定抗原（ヒトＡＦＰ）を反応
容器（ウェル）に捕捉した。その後、０．５％牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を含むりん酸緩衝液（０，５％ＢＳ
Ａ−ＰＢＳ）で洗浄し、反応しなかった抗原等を除去し
た。 次に、微粒子濃度が０．５％になるようにｖＲ製した微
粒子標識抗ヒトＡＦＰ抗体溶液１００μＱを注入し、２
時間静置して反応させ、反応容器（ウェル）に捕捉した
ヒトＡＦＰに微粒子標識抗体を結合させ、最後に０．５
％ＢＳＡ−ＰＢＳで静かに洗浄し、余分の微粒子標識抗
体を除去した。 〈微粒子計測手順〉 上述の操作で反応容器（ウェル）に測定抗原であるヒト
ＡＦＰの量に比例した蛍光微粒子を捕捉することができ
る。捕捉した蛍光微粒子数を蛍光計測により測定する。 反応容器内に残っている緩衝液を除去し、高屈折率液体
としてグリセリンを注入して蛍光測定を行う。第２図に
反応容器内の蛍光微粒子を測定するための測定装置の概
略図を示す。反応容器１内に注入した高屈折率液体２で
あるグリセリン中に存在する蛍光微粒子３を波長４８８
ｎｍのアルゴンレーザ光を励起光として蛍光検出する。 反応容器はＸ−Ｙ移動台４に保持され、任意の反応容器
を所定の計測位置に移動させるようにした。アルゴンレ
ーザ装ｗ５から発するレーザ光（波長４８８ｎｍ）を、
光チョッパ６により断続し、振幅変調させる。振幅変調
されたレーザ光は、励起光を反射して蛍光を透過させる
ダイクロイックミラー７によって上方に反射させ、レン
ズ８により集光し、反応容器１内の高屈折率液体２中の
蛍光微粒子３に下から照射する。 反応容器内から発する光′（蛍光微粒子からの蛍光、そ
の他の散乱光等）は再びレンズ８で集められ、ダイクロ
イックミラー７及び蛍光検出用フィルタ９をとおして散
乱光を除去し、透過する蛍光をレンズ１１により集光し
て光検出器である光電子増倍管１２で検出する。 なお、蛍光検出用フィルタ９には、励起光カットフィル
タと蛍光波長を透過するバンドパス干渉フィルタを使用
した。この蛍光検出用フィルタ９は測定対象によって最
適な蛍光波長が選べるように、モータ１０により任意の
フィルタに切りかえられるようにした。光電子増倍管１
２の出力は、増幅器１３で増幅した後、ロックイン増’
［ｒ５１４で測定する。ロックイン増幅器１４で、光チ
ョッパ６で変調された周波数と同じ周波数の信号成分を
同期増幅することにより、測定精度を高めるようにした
。 第３図は、上記反応及び測定によって得た試料液中のヒ
トＡＦＰ濃度と、測定した蛍光強度との関係図である。 このように高屈折率液体を使用し、その液体中の蛍光微
粒子からの蛍光強度を測定することで、ヒトＡＦＰを高
感度に定量することができた。 本方法及び本装置により、微粒子等からの散乱光の影響
を除き、蛍光微粒子数を蛍光強度の総量として測定する
ことができる。 また、高屈折率液体を使用することで、微粒子からの散
乱光ばかりでなく１反応容器からの反射光をも減少させ
ることができる。反応容器とその中の液体との界面でも
反射が生じるが１本方法のように高屈折率液体を使用す
ることで反応容器と液体との屈折率差が小さくなり、そ
の界面での反射が少なくなるため、蛍光測定が容易にな
る。ポリスチレン製のマイクロプレートの場合、微粒子
と同じ屈折率であるため、同じ効果が生じる。またガラ
ス製の容器を使用すれば、屈折率差をより小さくでき、
より高感度な測定が可能になる。 ［実施例２コ 微粒子の材質として屈折率が１．４９のものを使用した
方法について説明する。 ヒトＡＦＰ抗原を、ペテロジニアスサンドイッチイムノ
アッセイ法により反応容器に蛍光微粒子を捕捉し、この
蛍光微粒子の量を蛍光計測により測定し、定量した。 く固定化抗体のｍ製〉 反応容器として、ガラス板に凹部を形成したものを使用
した。凹部の底面をアミノシラン化し、ゲルタールアル
デヒドで抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化した。 く微粒子標識抗体のｔＭ製〉 表面にカルボキシル基を有し、屈折率が１．４９のアク
リル系の蛍光性微粒子を標識物質とした。 微粒子内部に閉じ込めた蛍光物質はクマリン系の色素で
あり、蛍光波長は約５２０ｎｍ前後であった。また微粒
子の直径は０．５μｍのものを使用した。この蛍光微粒
子の表面に、カルボジイミド法により、抗ヒトＡＦＰ抗
体を固定化しく固定化量的０．７ｍｇ／ｇ）、微粒子標
識抗ヒトＡＦＰ抗体を調製した。 く反応手順〉 実施例１とほぼ同様の方法で反応させた。測定抗原であ
るヒトＡＦＰを含む試料血清５０μＱを抗ヒトＡＦＰ抗
体を固定化した反応容器に注入して、２時間反応させ、
ヒトＡＦＰを反応容器に捕捉した。その後、０．５％Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳで洗浄し、反応しなかった抗原等を除去し
た。 次に、微粒子濃度が０．１％になるように調製した微粒
子櫟識抗ヒトＡＦＰ抗体溶液１００μＱを注入し、２時
間静置して反応させ、反応容器に捕捉したヒトＡＦＰに
微粒子標識抗体を結合させた。最後に０．５％ＢＳＡ−
ＰＢＳで静かに洗浄し、余分の微粒子標識抗体を除去し
た。 〈微粒子計測手順〉 上述の操作で反応容器に測定抗原であるヒトＡＦＰの量
に比例した蛍光微粒子を捕捉することができる。捕捉し
た蛍光微粒子数を蛍光計測により測定する。反応容器内
に残っている緩衝液を除去し、高屈折率液体としてグリ
セリンを注入し、第２図に示した測定装置で蛍光強度を
測定した。 本例では、微粒子の屈折率が１，４９、グリセリンの屈
折率が１．４７．反応容器（ガラス）の屈折率が１．５
２である。このように微粒子と微粒子の回りの液体の屈
折率の差が非常に小さいため、微粒子からの散乱光の発
生を除去することができる。また１反応容器と微粒子と
の屈折率差、及び液体との屈折率差も小さく、全体的に
散乱光及び反射光の発生を抑えることができ、蛍光測定
が容易になり、蛍光測定精度を向上させることができた
。 本実施例のように、屈折率の小さい微粒子を標識物質に
使用することで散乱光強度を抑えることができ、ノイズ
の少ない蛍光計測を行うことができ、定量精度が向上す
る。 ［実施例３］ 被測定物質として、ヒトＡＦＰ抗原を例にとり、ペテロ
ジニアスサンドイッチイムノアッセイ法により反応容器
に蛍光微粒子を捕捉し、この蛍光微粒子の数をフロー法
により定量する方法及び測定装置について説明する。 実施例２と同様にして、固定化抗体を調製し、微粒子標
識抗体を調製し、さらに反応を行った。 〈微粒子計測手順〉 上述の操作で反応容器に測定抗原であるヒトＡＦＰの量
に比例した蛍光微粒子を捕捉することができる。この微
粒子の総数をフロー法で計数する。 まず、微粒子の結合を酸性下で超音波処理により切断し
、微粒子懸濁液を得た。この懸濁液をメンブレンフィル
タを通して、微粒子を捕集する。次に捕集した微粒子を
９０％エタノールに分散させ、測定を行うための微粒子
懸濁液を得た。 第４図に微粒子懸濁液中の蛍光微粒子を検出するための
測定装置の概略図を示す。反応容器１５内の微粒子懸濁
液１６を吸引ノズル１７、電磁バルブ１８を介してシリ
ンジピペッタ１９で吸引する。電磁バルブ１８を切り換
えて、吸引した微粒子懸濁液をシースフローセル２４に
一定流速で排出する。また、シース液ボトル２０内のシ
ース液２１を電磁バルブ２２を介してシリンジピペッタ
２３で吸引し、電磁バルブ２２を切り換えて、吸引した
シース液を同じシースフローセル２４に一定流速で排出
する。微粒子懸濁液をシースフローセル２４に排出して
る間及びその前後には、シース液がシースフローセル２
４に流れているようにタイミングを設定した。 微粒子懸濁液はシースフローとなってシースフローセル
２４中を流れ、シースフローセル測光部２５を通過して
蛍光測定を受け、廃液ボトル２６に廃棄される。シース
フロ一部での微粒子懸濁液の流速は５ｍ／秒となるよう
にした。 次に蛍光測光部について説明する。 蛍光微粒子を励起するための励起光として波長４８８ｎ
ｍのアルゴンレーザ光を使用した。アルゴンレーザ装置
２７から発するレーザ光（波長４８８ｎｍ）は、レンズ
２８により集光されて、シースフローセル測光部２５に
照射される。シースフローセル測光部２５から発する光
（微粒子の通過で発する蛍光等）はレンズ２９で集めら
れ、蛍光検出用フィルタ３０で散乱光を可能ながぎり除
去し、透過する蛍光を再度レンズ３１により集光して光
検出器である光電子増倍管３２で検出する。 なお、蛍光検出用フィルタ３ｏには、励起光カットフィ
ルタと蛍光波長を透過するバンドパス干渉フィルタを使
用した。光電子増倍管３２の出力は。 増幅器３３で増幅した後、波高分析器３４で信号処理さ
れ、信号パルスの波高等を分析して微粒子の識別を行う
。 本方法により、発生する散乱光強度が抑えられ、蛍光測
定が容品になり、ノイズパルスを減少させることができ
、蛍光微粒子の通過に基づく蛍光パルスを明確に識別す
ることができた。 本実施例によれば、散乱光の影響の少ない蛍光測定がで
き、蛍光微粒子を高精度に計数することができる。また
、本例では、微粒子−懸濁液を全量測定した。全量を測
定することにより、微粒子数の総数が計数でき、ヒトＡ
ＦＰ抗原の量を正確に定量することができる。また、微
粒子懸濁液の一部分を測定することも可能である。この
場合は、微粒子懸濁液中の微粒子の濃度が測定されるが
。 この場合でも測定抗原の定量が可能である。 また、本実施例では、反応容器捕捉された蛍光微粒子を
すべてはがして計数した。この操作では。 物理吸着等の非特異吸着によって反応容器に結合してい
る微粒子をもはがされることになる。そこで測定抗原と
結合して捕捉された微粒子のみを選択的にはがして計数
することによって、定量感度をさらに向上させることが
できる。

【発明の効果】

本発明によれば、標識物質として蛍光性の微粒子を使用
し、さらに、蛍光測定時の液体の屈折率が微粒子の屈折
率に対して０．８６以上となる液体中で微粒子を蛍光測
定することにより、微粒子を含む液体から発生する散乱
光強度が少なくなり、その結果として蛍光測定時のノイ
ズが減少し、微粒子の蛍光強度を正確に測定することが
できる。 このため、抗原などの生体関連物質を高感度に定量する
ことができる

【図面の簡単な説明】

第１図は蛍光強度と背景光強度の比の相対値と、液体の
屈折率と微粒子の屈折率の比との関係図、第２図は実施
例１で説明した、反応容器内の蛍光微粒子を測定するた
めの測定装置の概略図、第３図は試料液中のヒトＡＦＰ
濃度と、蛍光強度との関係図の１例、第４図は実施例２
で説明した、微粒子懸濁液中の蛍光微粒子を検出するた
めの測定装置の概略図である。 １・・・反応容器、２・・・高屈折率液体、３・・・蛍
光微粒子、４・・・Ｘ−Ｙ移動台、５・・・アルゴンレ
ーザ装置。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、微粒子を標識物質とし、微粒子を測定することによ
   って被測定物質を定量する免疫測定方法において、蛍光
   性の微粒子を使用し、その蛍光測定時の微粒子の回りの
   液体の屈折率が微粒子の屈折率に対して０．８６以上で
   あることを特徴とする蛍光微粒子による免疫測定方法。