JPH04106470A - 粒子免疫測定方法及びその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微粒子を用いた免疫測定方法およびその装置
、特にその測定信号のＳ／Ｎ比を向上させる方法及び装
置に関するものである。

〔従来の技術〕

微粒子を使用した免疫測定方法として、表面に抗体を結
合させたラテックス粒子と抗原とを反応させ、抗原抗体
反応によって生成するラテックス粒子の凝集状態を吸光
度または散乱光強度により測定して抗原濃度を測定する
方法が知られている（ふんせき、　１６．６０５（１９
８７））。しかし、ラテックス粒子の凝集状態は一定で
はなく分布を持つため、反応液全体の平均値を測定する
これらの方法では、抗原濃度の算出に精度的な問題があ
り、極低濃度の抗原量の定量等が困難であった。　そこ
で、反応液をフローセルに導いて、セル内を流れる微粒
子の散乱光または蛍光強度を測定する方法が開発された
（検査と技術、　１６．６０７　（１９８８）、特開昭
６２−８１５６７号公報、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ、　１８．３３（１９７７））。

この方法によれば、個々の凝集塊の大きさを計測するこ
とができることから、抗原濃度の算出精度を向上させる
ことができる。また、蛍光微粒子を用いて抗原抗体反応
を起こさせ、その凝集像を画像処理することにより凝集
状態を解析し抗原濃度を算定する方法も知られている（
特開昭６４−３５３７３号公報）。

上記従来方法は、ホモジニアス系でラテックス粒子表面
の抗体（または抗原）と抗原（または抗体）とが反応し
て凝集をおこすことを利用している。そのため、抗原過
剰領域で抗原抗体反応が抑制される現象、いわゆるプロ
ゾーン現象が避けられない。また、試料中に共存する散
乱体や、色素等の吸収体・蛍光体の影響を完全に除去す
ることは困難である。さらに、抗原と抗体結合ラテック
ス粒子とが１対１に結合するとは限らないため、凝集塊
の数を計数する従来方式では特に極低濃度領域での算出
値に誤差が発生しやすいという問題かある。

プロゾーン現象や共存物質の影響を受けない免疫測定方
法として、特開昭５６−１５１３５７号公報に示される
ようなヘテロジニアス系の反応かある。しかし、そのも
のにおいても測定値のＳ／Ｎ比を向上させるための特別
の手段については特に配慮が成されていない。

微粒子の計測には、光散乱強度の計測、蛍光性の微粒子
を使用した場合は蛍光強度の計測が一般に使用される。

光散乱強度計測では、溶液中にゴミ等が存在する場合に
は正確な測定を行うことができない。しかも、通常の反
応時には溶液中にゴミ等が混入することが多いため、必
ずしも有効な測定とはならない。蛍光性の微粒子を使用
した場合は、このようなゴミ等の影響を減少させること
かできるが、蛍光性の微粒子そのものによる散乱光が存
在するため、十分に除去することは困難である。しかも
、この散乱光強度は非常に大きなものであるため、フィ
ルタ等を使用しても完全に除去することができず、蛍光
測定時の迷光となり、測定の精度が低下するという問題
がある。

〔発明か解決しようとする課題〕

本発明の目的は、上記従来技術の持つ問題点を解決し、
微粒子を利用した免疫測定法であって、かつ高感度な測
定ができる免疫測定方法及びそのための装置を提供する
ことにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的を達成するために、本発明は、測定試料中の被
測定物質と特異的に結合する物質を固定化した反応容器
中に、測定試料及び該被測定物質と特異的に結合する物
質を固定化した蛍光性の微粒子を順次または同時に注入
し、被測定物質を介して反応容器に捕捉された該蛍光性
の微粒子を計数する免疫測定方法であって、蛍光性の微
粒子に変調した励起光を照射し、発生する蛍光を検出す
るとともに、検出される信号から励起光と同位相の信号
を除去することにより、蛍光信号のＳ／Ｎ比を向上させ
ることを特徴とする、免疫測定方法及びそのための装置
を開発し提供する。

励起光と同位相の信号の除去する方法としては、位相敏
感検波による方法を用いることが有効であるか、励起光
源としてパルス光を用い、パルス光の照射時から一定の
遅延時間を経た後の蛍光信号を計測することにより励起
光と同位相の信号の除去を行うことも可能である。

本発明は、また、上記目的を達成するための装置として
、測定試料中の被測定物質と特異的に結合する物質を固
定化した反応容器と、該被測定物質と特異的に結合する
物質を固定化した蛍光性の微粒子を使用し、該被測定物
質を介して反応容器に捕捉された該蛍光性の微粒子を計
数する免疫測定装置であって、励起光源からの光を変調
し該蛍光性の微粒子に照射する手段、発生する蛍光を検
出する手段、及び検出される信号から励起光と同位相の
信号を除去する手段、とを有した、免疫測定装置をも開
示し提供する。

その装置において、励起光と同位相の信号を除去する手
段は、位相敏感検波手段であることが望ましいが、励起
光源としてパルス光発生手段を用い、該パルス光の照射
時から一定の遅延時間を経過した後の蛍光信号を計測す
る手段を用いることにより行うことも可能であるである
。さらに、本発明の装置では、反応容器に捕捉された該
蛍光性の微粒子を反応容器から離して粒子浮遊液を調製
する手段、及び調製された粒子浮遊液を通過させるフロ
ーセルとを設け、そのフローセルを通過する粒子浮遊液
に対し励起光を照射するように構成することも可能であ
り、また、反応容器に捕捉されている蛍光性の微粒子に
対し、励起光を照射するようにすることもできる。後者
の場合にあっては、照射手段に対して、反応容器を相対
的に移動するように構成すれば、より測定が容易となる
。

さらに、発生する蛍光を検出する手段を、複数系設ける
ことにより、波長の異なる複数の蛍光信号を同時に計測
し得るようにしてもよ（、それにより簡単に多項目の抗
原などの同時測定が可能となる。また、励起光源として
半導体レーザーを用いることにより、装置全体を小型化
することができる。

〔作　用〕

本発明においては、測定試料中の被測定物質と特異的に
結合する物質を固定化した反応容器中に、測定試料及び
該被測定物質と特異的に結合する物質を固定化した蛍光
性の微粒子を注入し、被測定物質を反応容器に捕捉する
とともにこの捕捉した被測定物質に対して蛍光性微粒子
か結合する。このように被測定物質の分子数に対応して
蛍光性微粒子が一定数結合することから、高感度に被測
定物質を計測することができる。また微粒子が蛍光性で
あることにより、ゴミ等の粒子の影響を少なくすること
ができ、高精度な計測か可能になる。

またプロゾーン現象も生じない。

なお、測定試料中の被測定物質および被測定物質と特異
的に結合する物質の組み合わせとしては、抗原（または
抗体）と抗体（または抗原）か代表的な組み合わせであ
る。さらにその他に、例えばホルモンとレセプター、糖
とレクチンの組み合わせ、またはハイブリダイゼーショ
ン反応による特定のＤＮＡとプローブＤＮＡの組み合わ
せ等も可能である。

微粒子の材質としては、ポリスチレン、アクリル、スチ
レン−ブタジェン共重合体、スチレン−アクリル酸共重
合体等の材質の粒子が使用できる。

またその粒径は特に限定されないが、反応効率、蛍光計
測の観点で、０．１〜１μｍ程度の範囲が適当である。

この粒子の表面に抗体（または抗原）等を結合させるに
は、通常知られている物理吸着、化学結合等が利用でき
る。

また、上記反応容器に捕捉した蛍光性微粒子を、反応容
器から離すことで粒子浮遊液を調製し、この粒子浮遊液
をフローにすることで蛍光性微粒子を１個１個計数する
ことが可能になる。つまり、粒子浮遊液をフローにして
励起光を照射することで、蛍光性微粒子の通過に基づく
蛍光信号のパルスを得ることができる。つまり、蛍光信
号のパルスの計数により蛍光性微粒子の総数が計数でき
、蛍光性微粒子の総数と被測定物質の分子数が対応する
ことから、被測定物質の数を計数することかできる。な
お、反応容器に捕捉された微粒子の結合をはずすには、
機械的な方法として、振動を与える方法やへら等で削り
採る方法、化学的な方法として、酸、尿素等で抗体等を
変性させ解離させる方法等があり、どのような方法でも
効果的な測定が可能である。

しかしながら、上記の蛍光性微粒子の蛍光測定において
、フローセル等の測光セル等がらの励起光の散乱、また
測定溶液中に存在するゴミ等からの散乱による蛍光のＳ
／Ｎ比の低下が生じる場合がある。一般に散乱光はカッ
トフィルタ等により除去することができる。しかし、微
粒子の大きさが小さくなり、つまり蛍光分子数が少なく
なり、蛍光強度が小さくなるとカットフィルタの漏れ等
による散乱光強度が相対的に増大し、カットフィルタの
みでは不十分になる。そのため、いかに散乱光を抑える
かが重要な課題となる。

本発明においては、そのための手段として、蛍光測定の
際、変調した励起光を照射し、検出される信号に対して
励起光と同位相の信号を除去することで、蛍光測定の信
号対雑音の比っまりＳ／Ｎ比を向上させることとした。

それにより、蛍光測定の精度が高まり、被測定物質の定
量精度が高まる。

すなわち、励起光を強度変調した場合には、散乱光の強
度は励起光と同位相で変化する。これに対して、蛍光は
、一定の蛍光寿命をもつため、蛍光強度は、励起光に対
してその位相が遅れる。したがって、検出される蛍光信
号を例えば位相敏感検波して、励起光と位相の異なる信
号を計測することにより、散乱光に由来する信号つまり
雑音を抑えることができ、蛍光のＳ／Ｎ比が改善できる
。

−例として、励起光強度を正弦波状に変調した場合、励
起光強度と蛍光強度の位相差（φ）と、変調角周波数（
ω）、蛍光寿命（τ、簡単のため蛍光寿命τで単純指数
関数的に減衰する場合とする）の間には、 ｔａｎ　　φ＝ω・τ の関係が成立する。そこで蛍光信号を位相敏感検波して
励起光と異なる位相で検出する場合を考えると、検波さ
れる相対蛍光信号強度は、ω・τの大きさに伴って、増
大することになり、ω・τ＝０、１の場合でも、散乱光
に対して十分なＳ／Ｎ比を得ることができる。通常の蛍
光物質の蛍光寿命は主にｌｎｓ〜１０ｎｓであり、例え
ばフルオレセインでは５ｎｓ程度である。また、励起光
の強度変調は、音響光学素子、電気光学素子等により、
またレーザ装置でのモードロック、キャビティダンプ等
により、かなりの高周波数で変調可能であり、数百Ｍ＆
まで十分に可能である。このような装置によれば、ω・
τ〉０．１となることから、本方法により、Ｓ／Ｎ比の
高い、高精度な蛍光測定が可能になる。しいては、被測
定物質の量を、高感度、高精度に計測することが可能に
なる。

また、励起光をパルス変調した場合でも同様の効果が達
成できる。さらに、パルス光を励起光として照射した場
合、一定の遅延時間を経た後の信号を計測することでも
Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。前述のように、散
乱光は励起光と同位相で変化するため、散乱光は励起パ
ルス光と同じ時間幅のパルス光となる。それに対して蛍
光は蛍光寿命に応じた応答を示し、励起パルス幅が蛍光
寿命に対して十分に短い場合、蛍光は励起パルス幅に対
して十分に長い時間幅を有するパルス光となる。そのた
め、励起パルス光を照射した後、定時間径た後の信号を
測定することにより、散乱光成分を除去することができ
、Ｓ／Ｎ比の高い蛍光測定か可能となる。

本発明によりイムノグロブリン、α−フェトプロティン
、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）　、フェリチン、風疹抗体、
エイズウィルス抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣ
Ｇ）　、甲状腺刺激ホルモン等の種々の抗原、抗体、ホ
ルモン、ＤＮＡ等の生体関連物質を高感度に測定できる
。

〔実施例〕

以下、本発明の詳細な説明する。

〔実施例１〕 被測定物質としてヒトＡＦＰ抗原を例にとり、フロー法
により定量する方法及び測定装置について説明する。

（固定化抗体の調製） マイクロプレートのウェルを反応容器とし、内面にヒト
ＡＦＰに対する抗体を固定化する。平底のマイクロプレ
ートの各ウェルに濃度１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＡＦＰ抗
体溶液５０μｍを注入し、２時間間欠的に攪拌し反応さ
せて抗ヒトＡＦＰ抗体をウェルに固定化した。

（微粒子標識抗体の調製） 表面にカルボキシル基を有する蛍光性のラテックス微粒
子を標識物として使用する。直径か０．２μｍで、５４
０ｎｍの最大蛍光波長を有する蛍光微粒子の表面に、カ
ルボジイミド法により、抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化しく
固定化量約０．７■／ｇ）、微粒子標識抗ヒトＡＦＰ抗
体を調製した。

（反応手順） 測定抗原であるヒトＡＦＰを含む試料血清５０μｌを抗
ヒトＡＦＰ抗体を固定化した反応容器（ウェル）に注入
して、２時間反応させ、測定抗原（ヒトＡＦＰ）を反応
容器（ウェル）に捕捉した。

その後、０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むり
ん酸緩衝液（０，５％ＢＳＡ−ＰＢＳ）で洗浄し、反応
しなかった抗原等を除去した。

次に、微粒子濃度か０．５％になるように調製した微粒
子標識抗ヒトＡＦＰ抗体溶液１００μｌを注入し、２時
間静置して反応させ、反応容器（ウェル）に捕捉したヒ
トＡＦＰに微粒子標識抗体を結合させた。最後に０．５
％ＢＳＡ−ＰＢＳで静かに洗浄し、余分の微粒子標識抗
体を除去した。

（微粒子計測手順） 上述の操作で反応容器（ウェル）に測定抗原であるヒト
ＡＦＰの量に比例した蛍光微粒子を捕捉することができ
る。この微粒子の総数をフロー法で計数する。まず、酸
性の条件下で超音波処理により、容器と微粒子との結合
を断ち、微粒子懸濁液を得た。

第１図に微粒子懸濁液中の蛍光微粒子を検出するための
測定装置の概略図を示す。反応容器１内の微粒子懸濁液
２を吸引ノズル３、電磁バルブ４を介してシリンジピペ
ッタ５で吸引する。電磁バルブ４を切り換えて、吸引し
た微粒子懸濁液をシースフローセルｌＯに一定流速で排
出する。また、シース液ボトル６内のシース液７を電磁
バルブ８を介してシリンジピペッタ９て吸引し、電磁バ
ルブ８を切り換えて、吸引したシース液を同じシースフ
ローセル１０に一定流速で排出する。微粒子懸濁液をシ
ースフローセルＩＯに排出してる間及びその前後には、
シース液がシースフローセル１０に流れているようにタ
イミングを設定した。また微粒子懸濁液とシース液とが
シースフローになるようにそれぞれの流速を設定した。

微粒子懸濁液はシースフローとなってシースフローセル
１０中を流れ、シースフローセル測光部１１を通過して
蛍光測定を受け、廃液ボトル１２に廃棄される。シース
フロー部での微粒子懸濁液の流速は２ｍ／秒となるよう
にした。次に蛍光測光部について説明する。蛍光微粒子
を励起するための励起光として波長４８８ｎｍのアルゴ
ンレーザ光を使用した。アルゴンレーザ装置１３から発
するレーザ光（波長４８８ｒ＋ｍ）は、ドライバー１４
により駆動される光変調器１５を通過し、振幅変調され
、レンズ１６により集光されて、シースフローセル測光
部１１に照射される。シースフローセル測光部１１から
発する光（微粒子の通過で発する蛍光、ゴミ等からの散
乱光、セルによる散乱光）はレンズ１７で集められ、蛍
光検出用フィルタ１８で散乱光を可能なかぎり除去し、
透過する蛍光を再度レンズ１９により集光して光検出器
である光電子増倍管２０で検出する。なお、蛍光検出用
フィルタ１８には、励起光カットフィルタと蛍光波長を
透過するバンドパス干渉フィルタを使用した。光電子増
倍管２０の出力は、増幅器２１で増幅した後、位相敏感
検波器２２で位相敏感検波し、励起光と９０°位相のず
れた信号のみを検波する。位相敏感検波するための励起
光の変調周波数とその位相はドライバー１４から与えら
れる。位相敏感検波器２２で検波された出力は平滑器２
３で平滑化され、波高分析器２４で信号処理される。こ
の装置により、散乱光成分が除去され、蛍光微粒子の通
過に基づく蛍光パルスを明確に識別することができた。

第２図は、上記反応及び測定によって得た試料液中のヒ
トＡＦＰ濃度と計数した蛍光微粒子数の関係図である。

非特異吸着等に基づく微粒子をも計数され、また各濃度
域での反応効率か異なるために、測定領域全体にわたっ
て濃度と微粒子数は比例しないが、図かられかるように
、ヒトＡＦＰを高感度に定量することができた。゛また
、プロゾーン現象も見られなかった。

本実施例によれば、散乱光の影響の少ない蛍光測定がで
き、蛍光微粒子を高精度に計数することができる。また
、本例では、微粒子懸濁液を全量測定した。全量を測定
することにより、微粒子数の総数が計数でき、測定抗原
の量を正確に定量することができる。また、微粒子懸濁
液の一部分を測定することも可能である。この場合は、
微粒子懸濁液中の微粒子の濃度が測定されるが、この場
合でも測定抗原の定量が可能である。

また、本実施例では、反応容器に捕捉された蛍光微粒子
をすべてはがして計数した。この操作では、物理吸着等
の非特異吸着によって反応容器に結合している微粒子を
もはがされることになる。

そこで測定抗原と結合して捕捉された微粒子のみを選択
的にはがして計数することによって、定量感度をさらに
向上させることができる。

〔実施例２〕 被測定物質としてヒトＡＦＰ抗原を例にとり、反応容器
に蛍光微粒子を捕捉した状態で定量する方法及び測定装
置について説明する。

実施例１と同様にして、固定化抗体を調製し、微粒子標
識抗体を調製し、反応を行って、反応容器（ウェル）に
測定抗原であるヒトＡＦＰの量に比例した蛍光微粒子を
捕捉する。捕捉した蛍光微粒子数をそのままの状態で計
測する。

第３図に反応容器内の蛍光微粒子を測定するための測定
装置の概略図を示す。反応容器２５内に捕捉された蛍光
微粒子２６を波長４８８ｎｍのアルゴンレーザ光を励起
光として蛍光検出する。アルゴンレーザ装置２７から発
するレーザ光（波長４８８ｎｍ）は、ドライバー２８に
より駆動される光変調器２９を通過し、振幅変調される
。振幅変調されたレーザ光は、励起光を反射して蛍光を
透過させるダイクロシックミラー３０によって上方に反
射させ、レンズ３１により集光し、反応容器２５内に捕
捉された蛍光微粒子２６に下から照射する。反応容器内
から発する光（蛍光微粒子からの蛍光、ゴミ等からの散
乱光、反応容器による反射光）は再びレンズ３１で集め
られ、ダイクロシックミラー３０及び蛍光検出用フィル
タ３２をとおして散乱光を可能なかぎり除去し、透過す
る蛍光をレンズ３４により集光して光検出器である光電
子増倍管３５で検出する。なお、蛍光検出用フィルタ３
２には、励起光カットフィルタと蛍光波長を透過するバ
ンドパス干渉フィルタを使用し、モータ３３により任意
のフィルタに交換できるようにした。光電子増倍管３５
の出力は、増幅器３６で増幅した後、位相敏感検波器３
７で位相敏感検波し、励起光と９０°位相の異なる信号
を検波する。

位相敏感検波するための励起光の変調周波数とそｑ位相
はドライバー１４から与えられる。位相敏感検波器３７
で検波された出力は平滑器３８で平滑化され、信号処理
器３９で処理され、蛍光強度の計測、濃度への換算など
を行う。また、反応容器２５は、容器移動機構部４０に
よって順次移動され、各反応容器の測定が自動的に行わ
れる。　本装置により、蛍光微粒子数を蛍光強度の総量
として測定することができた。また、測定抗原であるヒ
トＡＦＰ抗原の濃度との相関も良好であった。

一般に、本方式のように励起光を反応容器の下から照射
し、照射方向と同じ方向の蛍光を検出する系では、容器
からの反射光強度が大きく、蛍光検出用フィルタでは十
分に除去することかできない。しかし、高周波で変調し
た励起光と位相敏感検波によって、不要な散乱光成分を
大幅に除去することができ、蛍光微粒子からの蛍光強度
を高精度に検出することができ、ヒトＡＦＰ抗原を高精
度に定量することができる。

また、反応容器に捕捉された蛍光微粒子の全体からの蛍
光強度を測定した後、ヒトＡＦＰ抗原と結合して捕捉さ
れた微粒子のみを選択的にはがし、残った蛍光微粒子か
らの蛍光強度を測定して差し引くことにより、バックグ
ランドになる非特異吸着に基づく蛍光強度の影響を補正
することができ、高感度な計測が可能になる。

〔実施例３〕 被特定物質としてＡＦＰとＣＥＡの２種類の抗原を同時
に定量する多項目計測方法について説明する。

（固定化抗体の調製） マイクロプレートのウェルを反応容器とし、内面にＡＦ
ＰとＣＥＡに対する抗体を固定化する。

平底のマイクロプレートのウェルに濃度１０μｇ／ｍｌ
の抗ヒトＡＦＰ抗体溶液２５μｌと濃度ｌＯμｇ／ｍｌ
の抗ＣＥＡ抗体溶液２５μｌを注入し、２時間間欠的に
攪拌し反応させて抗ヒトＡＦＰ抗体および抗ＣＥＡ抗体
をウェルに固定化した。

（微粒子標識抗体の調製） 標識用微粒子として、表面にカルボキシル基を有し、直
径が０．２μｍと０．４μｍで、最大蛍光波長がどちら
も５４０ｎｍである二種類のラテックス微粒子を使用し
た。直径が０．２μｍで、５４０ｎｍの最大蛍光波長を
有する蛍光微粒子の表面に、カルボジイミド法により、
抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化しく固定化量約０．７■／ｇ
）、微粒子標識抗ヒトＡＦＰ抗体を調製した。さらに、
直径が０．４μｍで、５４０ｎｍの最大蛍光波長を有す
る蛍光微粒子の表面に、カルボジイミド法により、抗Ｃ
ＥＡ抗体を固定化しく固定化量約０．７■／ｇ）、微粒
子標識抗ＣＥＡ抗体を調製した。

（反応手順） ＡＦＰとＣＥＡを含む試料血清５０μｌを抗ヒトＡＦＰ
抗体と抗ＣＥＡ抗体を固定化した反応容器（ウェル）に
注入して、２時間反応させ、測定抗原（ＡＦＰおよびＣ
ＥＡ）を反応容器（ウェル）に捕捉する。その後、０．
５％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄し、反応しなかった抗原等を
除去する。

次に、微粒子濃度が０．５％になるように調製した微粒
子標識抗ヒトＡＦＰ抗体溶液６０μｌおよび微粒子標識
抗ＣＥＡ抗体溶液６０μｌを注入し、２時間静置して反
応させ、反応容器（ウェル）に捕捉したヒトＡＦＰおよ
びＣＥＡに微粒子標識抗体を結合させる。最後に０．５
％ＢＳＡ−ＰＢＳで静かに洗浄し、余分の微粒子標識抗
体を除去する。

〔微粒子計測手順〉 酸性下で超音波処理を施すことにより、容器と微粒子と
の結合を断ち、微粒子懸濁液を得る。この微粒子懸濁液
を実施例１と同じ装置（第１図）で行った。

第４図は、測定された蛍光信号パルスのヒストグラム（
蛍光強度に対する数量）の１例である。

蛍光強度と微粒子の径は相関することから、ヒストグラ
ムは２つの分布を示している。蛍光強度の小さい方が、
抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化した０、　２μｍ径の微粒子
であり、蛍光強度の大きい方が、抗ＣＥＡ抗体を固定化
した０、　４μｍ径の微粒子である。このように、異な
る２種類の蛍光微粒子からの蛍光パルスを明確に分離す
ることができた。

ヒストグラムより、０．２μｍ径と０．４μｍ径の微粒
子の総数が計数でき、さらに、この総数がらヒ）ＡＦＰ
またはＣＥＡ濃度を算定することができる。

本例では、２種類の微粒子を使用して２種類の抗原を定
量したが、原理的に２種類以上の異なる粒径の微粒子を
それぞれ計数することが可能である。本実施例によれば
、同一の容器で、同時に、さらに簡単に、複数の測定物
質を定量することができる。

〔実施例４〕 被測定物質としてＡＦＰとＣＥＡの２つの抗原を例にと
り、多項目計測方法について説明する。

（固定化抗体の調製） マイクロプレートのウェルを反応容器とし、内面にＡＦ
ＰとＣＥＡに対する抗体を固定化する。

平底のマイクロプレートのウェルに濃度ｌＯμｇ／ｍｊ
＋の抗ヒトＡＦＰ抗体溶液２５μｌと濃度ＩＯμｇ／−
の抗ＣＥＡ抗体溶液２５μｌを注入し、２時間間欠的に
攪拌し反応させて抗ヒトＡＦＰ抗体および抗ＣＥＡ抗体
をウェルに固定化した。

（微粒子標識抗体の調製） 表面にカルボキシル基を有する蛍光性のラテックス微粒
子を標識物として使用する。直径が０．４μｍで、５４
０ｎｍの最大蛍光波長を有する蛍光微粒子の表面に、カ
ルボジイミド法により、抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化しく
固定化量約０．７■／ｇ）、微粒子標識抗ヒトＡＦＰ抗
体を調製した。さらに、直径が０．４μｍで、５８０ｎ
ｍの最大蛍光波長を有する蛍光微粒子の表面に、カルボ
ジイミド法により、抗ＣＥＡ抗体を固定化しく固定化量
約０．７■／ｇ）、微粒子標識抗ＣＥＡ抗体を調製した
。

（反応手順） ＡＦＰとＣＥＡを含む試料血清５０μｌを抗ヒトＡＦＰ
抗体と抗ＣＥＡ抗体を固定化した反応容器（ウェル）に
注入して、２時間反応させ、測定抗原（ＡＦＰおよびＣ
ＥＡ）を反応容器（ウェル）に捕捉する。その後、０．
５％ＢＳＡ−ＰＢＳて洗浄し、反応しなかった抗原等を
除去する。

次に、微粒子濃度が０．５％になるように調製した微粒
子標識抗ヒトＡＦＰ抗体溶液６０μ！および微粒子標識
抗ＣＥＡ抗体溶液６０μｌを注入し、２時間静置して反
応させ、反応容器（ウェル）に捕捉したヒトＡＦＰおよ
びＣＥＡに微粒子標識抗体を結合させる。最後に０．５
％ＢＳＡ−ＰＢＳで静かに洗浄し、余分の微粒子標識抗
体を除去する。

（微粒子計測手順） 上述の操作で反応容器（ウェル）に、ヒトＡＦＰの量に
比例した５４０ｎｍの最大蛍光波長を有する微粒子と、
ＣＥＡの量に比例した５８０ｎｍの最大蛍光波長を有す
る蛍光微粒子を捕捉することかできる。これらの微粒子
の各総数をフロー法で計数する。まず、酸性条件で超音
波処理を施し、容器と微粒子の結合をはがし、２種類の
蛍光微粒子を含む微粒子懸濁液を得た。−第５図に、異
なる蛍光波長を有する２種類の蛍光微粒子を計数するだ
めの測定装置の概略図を示す。本測定装置は、第１図の
装置にもう１系統の蛍光検出系を加えた装置であり、５
８０ｎｍの波長の蛍光強度を測定するためのレンズ４１
、蛍光検出用フィルター４２、レンズ４３、光電子増倍
管４４、増幅器４５、位相敏感検波器４６、平滑器４７
、波高分析器４８を付加したものである。

この検出系で波長５８０ｎｍの波長の蛍光を位相敏感検
波して信号処理する。また同時に、レンズ１７、蛍光検
出用フィルター１８、レンズ１９、光電子増倍管２０、
増幅器２１、位相敏感検波器２２、平滑器２３により波
長５４０ｎｍの波長の蛍光を位相敏感検波し、波高分析
器２４で信号処理する。本測定装置により、各蛍光微粒
子を別々に計数することができ、各微粒子の総数からヒ
トＡＦＰ及びＣＥＡ濃度を算定することかできる。

また、微粒子を反応容器からはがすことなく、測定する
こともできる。２種類の蛍光微粒子が捕捉されている反
応容器を第４図の装置で測定する。

モータ３３により、まず、５４０ｎｍの波長の光を透過
させるフィルタを選択して、蛍光強度を測定する。

次に、モータ３３によりフィルタを切り換えて、今度は
５８０ｎｍの波長の光を透過させるフィルタを選択し、
蛍光強度を測定する。このように２種類の蛍光強度を別
々に測定することで、それぞれの蛍光微粒子の数を算定
することができる。

本装置により、散乱光成分の影響の少ない蛍光測定がで
き、蛍光微粒子の計数、または蛍光微粒子からの蛍光強
度の総和の測定が可能になる。

また、本方法のように、蛍光波長の異なる複数の蛍光微
粒子を使用することで、簡便に、多項目の抗原等の同時
定量が可能になる。

また、実施例３で説明したような粒径の違いをさらに加
えることで、より多数の抗原の同時定量も可能になる。

また非蛍光性の微粒子による散乱光パルス分析機能を付
加してもよい。

以上、実施例１〜４によれば、測定抗原と標識物である
微粒子との結合比率か一定となるため、精度か高く、高
感度な定量が可能になる。また、抗原過剰領域で抗原抗
体反応か抑制される現象、いわゆるプロゾーン現象か生
じないため、高濃度の抗原濃度域での定量も可能である
。

また、例えば、アルミニュウム・フタロシアニンく錯体
等の蛍光体を混入させた微粒子を使用し、高周波変調し
た半導体レーザを励起光源とした装置によっても上記実
施例と同様の効果を得ることができる。アルミニューム
・フタロシアニン錯体等は６００ｎｍから６９０ｎｍ程
度の長波長領域に吸収をもち、７００ｎｏ＋前後の蛍光
を発する。そのため、半導体レーザを励起光源として使
用することか可能になる。さらに、半導体レーザは、小
型であるため、装置の小型化が可能になる。また、安価
に構成することができる。さらに、半導体レーザの変調
は、簡単な構成で達成でき、しかも、ＩＧＨｚ以上の高
周波に変調することもできる。そのため、励起光と蛍光
の位相差をより大きくすることかでき、Ｓ／Ｎ比の高い
高感度な測定が可能になる。

また、半導体レーザー光をパルス的に変調することも容
易にてき、例えば、パルス幅８０ｐｓ、繰返し周波数１
０Ｍｐｐｓのパルス光が比較的簡単に得られ、しかも小
型化できる。このようなパルス光を励起光とし、パルス
光照射後Ｉｎｓから５０ｎｓ程度の間の蛍光信号を測定
することにより散乱光の影響の受けない高感度な測定が
可能となる。

以上のように、長波長の蛍光を有する微粒子を標識物と
することで、より安価な高感度定量装置を得ることがで
きる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、原理的に被測定物質の分子数と蛍光性
微粒子の総数が対応するため、正確な定量が可能になる
。

また、被測定物質と結合した蛍光性粒子を溶液中に懸濁
させ、フロー系で測定することにより微粒子数を１個１
個計数することかでき、微粒子数を高精度に計測するこ
とができる。そのため、被測定物質の量を高精度、高感
度に定量することか可能になる。

特に、蛍光性の微粒子に変調した励起光を照射し、発生
する蛍光を検出するとともに、検出される信号から励起
光と同位相の信号を除去することにより、散乱光などの
雑音が除去でき、蛍光強度を正確に測定することができ
るので、微粒子の数を正確に計数することができ、さら
に、算定でき、被測定物質の量を高精度、高感度に定量
することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で説明した、微粒子懸濁液中の蛍光
微粒子を検出するための測定装置の概略図、 第２図は、試料液中のヒトＡＦＰ濃度と計数された蛍光
微粒子数の関係図の１例、 第３図は、実施例２で説明した、反応容器内の蛍光微粒
子を測定するための測定装置の概略図、第４図は、実施
例３で説明した、波高分析で得られた蛍光信号パルスの
ヒストグラムの１例、第５図は、異なる蛍光波長を有す
る２種類の蛍光微粒子を計数するための測定装置の概略
図である。 １・・・反応容器、　　　　２・・・微粒子懸濁液、３
・・・吸引ノズル、　　　　４・・・電磁バルブ、５・
・・シリンジピペッタ、 ６・・・シース液ボトル、　　７・・・シース液、８・
・・電磁バルブ、　　　　９・・・シリンジピペッタ、
０・・・シースフローセル、 ｌ・・・シースフローセル測光部、 １・・・廃液ボトル、 ３・・・アルゴンレーザ装置、 ４・・・ドライバー　　　　１５・・・光変調器、６・
・・レンズ、１７・・・レンズ、 ８・・・蛍光検出用フィルタ、 １９・・・レンズ、　　　　　２０・・・光電子増倍管
、２１・・・増幅器、　　　　　２２・・・位相敏感検
波器、２３・・・平滑器、　　　　　２４・・・波高分
析器、２５・・・反応容器、　　　　２６・・・蛍光微
粒子、２７・・・アルゴンレーザ装置、 ２８・・・ドライバー　　　　２９・・・光変調器、３
０・・・ダイクロシックミラー ３１・・・レンズ、 ３２・・・蛍光検出用フィルタ、 ３３・・・モータ、３４・・・レンズ、３５・・・光電
子増倍管、 ３６・・・増幅器、　　　　　３７・・・位相敏感検波
器、３８・・・平滑器、　　　　　３９・・・信号処理
器、４０・・・容器移動機構部、 ４１・・・レンズ、 ４２・・・蛍光検出用フィルタ、 ４３・・・レンズ、　　　　　　４４・・・光電子増倍
管、４５・・・増幅器、　　　　　４６・・・位相敏感
検波器、４７・・・平滑器、　　　　　４８・・−波高
分析器。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、測定試料中の被測定物質と特異的に結合する物質を
   固定化した反応容器中に、測定試料、及び該被測定物質
   と特異的に結合する物質を固定化した蛍光性の微粒子を
   注入し、該被測定物質を介して反応容器に捕捉された該
   蛍光性の微粒子を計数する免疫測定方法であって、該蛍
   光性の微粒子に変調した励起光を照射し、発生する蛍光
   を検出するとともに、検出される信号から励起光と同位
   相の信号を除去することにより、蛍光信号のＳ／Ｎ比を
   向上させることを特徴とする、免疫測定方法。 ２、励起光と同位相の信号の除去を、位相敏感検波によ
   り行うことを特徴とする、請求項１に記載の免疫測定方
   法。 ３、励起光と同位相の信号の除去を、パルス光を励起光
   とし該パルス光の照射時から一定の遅延時間を経た後の
   蛍光信号を計測することによりおこなうことを特徴とす
   る、請求項１に記載の免疫測定方法。 ４、測定試料中の被測定物質と特異的に結合する物質を
   固定化した反応容器と、該被測定物質と特異的に結合す
   る物質を固定化した蛍光性の微粒子を使用し、該被測定
   物質を介して反応容器に捕捉された該蛍光性の微粒子を
   計数する免疫測定装置であって、励起光源からの光を変
   調し該蛍光性の微粒子に照射する手段、発生する蛍光を
   検出する手段、及び検出される信号から励起光と同位相
   の信号を除去する手段、とを有し、蛍光信号のＳ／Ｎ比
   を向上させることを特徴とする、免疫測定装置。 ５、励起光と同位相の信号を除去する手段が、位相敏感
   検波手段であることを特徴とする、請求項４に記載の免
   疫測定装置。 ６、励起光源がパルス光発生手段であり、励起光と同位
   相の信号を除去する手段が該パルス光の照射時から一定
   の遅延時間を経過した後の蛍光信号を計測する手段であ
   る、請求項４に記載の免疫測定装置。 ７、反応容器に捕捉された該蛍光性の微粒子を反応容器
   から離して粒子浮遊液を調製する手段、及び調製された
   粒子浮遊液を通過させるフローセルとをさらに有し、該
   フローセルを通過する粒子浮遊液に対し励起光を照射す
   るようになっている、請求項４ないし６に記載の免疫測
   定装置。 ８、反応容器に捕捉されている蛍光性の微粒子に対し、
   励起光を照射するようになっている、請求項４ないし６
   に記載の免疫測定装置。 ９、該照射手段に対して、反応容器が相対的に移動する
   ようになっている、請求項８に記載の免疫測定装置。 １０、発生する蛍光を検出する手段が、複数系設けられ
   ていて、波長の異なる複数の蛍光信号を同時に計測し得
   るようになっている、請求項４ないし８に記載の免疫測
   定装置。 １１、励起光源が半導体レーザーである、請求項４ない
   し１１に記載の免疫測定装置。