WO2021199604A1

WO2021199604A1 - 光学測定装置及び光学測定方法

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Publication number: WO2021199604A1
Application number: PCT/JP2021/002101
Authority: WO
Inventors: 直樹岩田; 房宣近藤; 朋和松村; 照雄竹下
Original assignee: 浜松ホトニクス株式会社
Priority date: 2020-04-01
Filing date: 2021-01-21
Publication date: 2021-10-07
Also published as: US20230124033A1; KR20220159970A; TW202141021A; JP2021162508A; EP4123292A4; CN115380204A; JP6923702B1; EP4123292A1

Abstract

光学測定装置は、照射光学系と、検出光学系と、キャンセル回路と、を備え、蛍光検出処理では、試料を照射対象として、試料に照射光を照射し、照射光が照射された試料から生じる蛍光、及び、照射光が照射された試料からの散乱光を含む測定対象光を検出光として検出し、事前処理におけるキャリブレーション処理の実施結果を考慮して、測定対象光に応じた測定信号から散乱光に応じた信号成分を除去し、事前処理では、測定信号における散乱光に対応する信号よりも信号量が大きい、キャリブレーション信号に基づき、測定信号から散乱光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理を実施する。

Description

光学測定装置及び光学測定方法

　本発明の一態様は、試料の光学特性を測定するための光学測定装置及び光学測定方法に関する。

　特許文献１には、基板上に置かれた蛍光サンプルに対して励起光を照射し、蛍光を測定した際に含まれる蛍光ノイズ成分（基板からの蛍光成分）を除去すべく、減衰信号を生成して差し引く技術が開示されている。具体的には、特許文献１では、基板の蛍光と等しい位相の減衰信号を生成し、測定した蛍光信号から該減衰信号を差し引くことにより、蛍光ノイズ成分を除去している。

特表２０１０－５１８３９４号公報

　上述したように、特許文献１では、励起光を試料に照射することにより生じる蛍光から、試料の測定対象部以外から生じる蛍光ノイズ成分が除去されている。ここで、試料に光を照射し、試料からの光を検出した際に含まれるノイズ成分には、試料（照射されたもの）から生じる光（例えば蛍光）に起因するものだけでなく、照射光（例えば励起光）自体（例えば散乱光）がノイズ成分となることも考えられる。特許文献１の技術では、照射光自体がノイズ成分となった場合を考慮しておらず、当該ノイズ成分を除去することができない。

　一方、本発明者らは、検出光に含まれる蛍光及び散乱光（照射光自体に起因する光）の位相の違いに着目し、検出光から、照射光と等しい位相を持つ信号成分である散乱光の信号成分を除去することにより、照射光自体に起因するノイズ成分を除去する光学測定装置を見出した。このような光学測定装置においては、例えば、事前にキャリブレーション処理が実施される。キャリブレーション処理では、試料における蛍光を生じにくい部分に照射光を照射することによりキャリブレーション処理用光（理想的には散乱光のみを含む光）を検出し、該キャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号に基づき、検出信号から、概ね散乱光成分に応じた信号成分のみを除去することができる。

　ここで、キャリブレーション処理では、上述したキャリブレーション信号（散乱光に応じた信号）を用いて、装置の出力が０になるような処理が行われる。しかしながら、実際の装置においては、キャリブレーション処理において装置の出力が完全に０になるように処理することは難しく、キャリブレーション誤差が生じてしまうことが分かった。このため、キャリブレーション処理の結果に基づき蛍光検出処理を行った場合においては、検出信号から散乱光成分を完全に除去することは難しく、蛍光だけでなく散乱光も検出されてしまう。このことから、蛍光検出の精度を向上させること（検出信号から散乱光をより適切に除去すること）が求められていた。

　本発明者らは、上述した課題を解決する手法について鋭意研究を行った。本発明者らは、キャリブレーション誤差が、装置の制御精度及び検出精度等の限界によって生じるものであり、光検出器への入射光量及び試料の差異に影響されずに同一装置であれば一定の値となることに着目した。そして、キャリブレーション誤差は、キャリブレーション信号自体が大きくなるほど、小さくなることを見出した。

　本発明の一態様は上記実情に鑑みてなされたものであり、照射光自体に起因するノイズ成分を除去し、蛍光測定を高精度に行うことが可能な光学測定装置及び光学測定方法を提供することを目的とする。

　すなわち、本発明の一態様に係る光学測定装置は、測定対象物の光学特性を測定する光学測定装置であって、照射対象に照射光を照射する照射光学系と、照射光に起因する検出光を検出する光検出部と、信号処理部と、を備え、蛍光検出処理と、該蛍光検出処理に先行して実施される事前処理と、を実施し、蛍光検出処理では、照射光学系が、測定対象物を照射対象として、測定対象物に照射光を照射し、光検出部が、照射光が照射された測定対象物から生じる蛍光、及び、照射光が照射された測定対象物からの散乱光を含む測定対象光を検出光として検出し、信号処理部が、測定対象光に応じた測定信号から、事前処理におけるキャリブレーション処理における散乱光に応じた信号成分を除去し、事前処理では、信号処理部が、光検出部において検出される照射光又は照射光の散乱光に係る信号であって、測定信号における散乱光に対応する信号よりも信号量が大きい、キャリブレーション信号に基づき、測定信号から散乱光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理を実施する。

　本発明の一態様に係る光学測定装置では、蛍光検出処理と、該蛍光検出処理に先行して実施される事前処理とが実施される。蛍光検出処理では、事前処理におけるキャリブレーション処理の実施結果に基づき測定対象光に応じた測定信号から散乱光に応じた信号成分が除去されている。そして、事前処理では、上述した測定信号における散乱光に対応する信号よりも信号量が大きい、照射光又は散乱光に係る信号がキャリブレーション信号とされキャリブレーション処理が実施されている。上述したように、キャリブレーション処理におけるキャリブレーション誤差は一定値であり、キャリブレーション誤差は、キャリブレーション信号自体が大きくなるほど、小さくなる。このため、本発明の一態様に係る光学測定装置のように、キャリブレーション信号の信号量が大きくされる（測定信号における散乱光に対応する信号よりも大きくされる）ことにより、キャリブレーション誤差を抑制することができる。よって、照射光自体に起因するノイズ成分を除去し、蛍光測定を高精度に行うことができる。

　事前処理では、照射光学系が、照射対象に照射光を照射し、光検出部が、照射光が照射された照射対象からの照射光の散乱光を含む光であって、蛍光検出処理において検出される測定対象光に含まれる散乱光よりも光量が大きいキャリブレーション処理用光を検出光として検出し、信号処理部が、キャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号に基づきキャリブレーション処理を実施してもよい。このような構成によれば、蛍光検出に用いる光学系を利用して、キャリブレーション処理用光を検出し、容易にキャリブレーション信号を生成することができる。

　事前処理では、照射光学系が、測定対象物を照射対象として、測定対象物に照射光を照射してもよい。このような構成によれば、キャリブレーション信号を容易に生成することができる。

　事前処理では、照射光学系が、測定対象物とは異なるキャリブレーション処理用のリファレンス部材を照射対象として、リファレンス部材に照射光を照射してもよい。測定対象物とは異なるリファレンス部材に照射光が照射されることにより、より適切なキャリブレーション処理用光を検出することができる。これにより、キャリブレーション処理の実施結果に基づき、蛍光検出処理において測定信号から散乱光に応じた信号成分をより適切に除去することができる。

　リファレンス部材は、照射光を反射する反射部材を含んでいてもよい。このような構成によれば、検出光の光量を容易に大きくすることができる。

　反射部材は、照射光の照射により蛍光を発生しないことが好ましい。このような構成によれば、照射光の照射によっても、反射部材に起因する蛍光が発生しない（或いは、無視できる程度にしか蛍光を発生しない）ため、測定信号から散乱光成分に応じた信号成分のみを確実に除去することができる。

　反射部材は、照射光を拡散する反射拡散体を含んでいてもよい。このような構成によれば、反射拡散体によって様々な角度の散乱光を容易に生じさせることができ、検出光の光量をより容易に大きくすることができる。

　反射部材は、照射光を反射する反射基材と、反射基材に支持され、照射光を拡散する拡散体と、を含んでいてもよい。このような構成によれば、反射基材と拡散体との協働によって、検出光の光量をより容易に大きくすることができる。

　反射部材は、ミラーを含んでいてもよい。このような構成によれば、光検出部に対するミラーの反射角度を調整することにより、検出光の光量をより容易に大きくすることができる。

　上述した光学測定装置は、光検出部への光路上の位置である第１位置及び光路から外れた位置である第２位置間を移動可能に構成されており、光の入射効率を上げる又は下げる機能を有する光学部材を更に備えていてもよい。このような光学部材が設けられていることにより、簡易な構成で、光検出部によって検出されるキャリブレーション処理用光の光量を適切に大きく（測定対象光に含まれる散乱光よりも大きく）することができる。このことで、適切にキャリブレーション信号の信号量を大きくし、蛍光検出の精度をより向上させることができる。

　事前処理では、照射光学系が、光検出部を照射対象として、光検出部に照射光を照射し、光検出部が、照射光であって蛍光検出処理において検出される測定対象光に含まれる散乱光よりも光量が大きいキャリブレーション処理用光を検出光として検出し、信号処理部が、キャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号に基づきキャリブレーション処理を実施してもよい。このように、事前処理において照射光が直接光検出部に検出されることにより、容易にキャリブレーション処理用光の光量を大きくすることができる。このことで、適切にキャリブレーション信号の信号量を大きくし、蛍光検出の精度をより向上させることができる。

　照射光学系は、蛍光検出処理時よりも、事前処理時における、照射する照射光の光量を大きくしてもよい。このような構成によれば、キャリブレーション処理用光の光量を容易に大きく（測定対象光に含まれる散乱光よりも大きく）することができる。このことで、適切にキャリブレーション信号の信号量を大きくし、蛍光検出の精度をより向上させることができる。

　照射光学系は、変調信号に応じた照射光を照射し、事前処理では、信号処理部が、照射光学系から照射された照射光の散乱光が検出光として光検出部に検出されるまでに相当する遅延に応じて変調信号の位相を変化させてキャリブレーション信号を生成してもよい。このように、照射光に係る変調信号について照射光学系の遅延に応じたキャリブレーション信号が生成されることにより、キャリブレーション処理用光を検出することなく、実際に散乱光をキャリブレーション処理用光として検出した場合と同様のキャリブレーション信号（散乱光と同様の位相を持つキャリブレーション信号）を得ることができる。

　本発明の一態様に係る光学測定方法は、測定対象物の光学特性を測定する光学測定方法であって、キャリブレーション処理を実施する工程と、測定対象物に照射光を照射する工程と、照射光が照射された測定対象物から生じる蛍光、及び、照射光が照射された測定対象物からの散乱光を含む測定対象光を検出する工程と、測定対象光に応じた測定信号から、キャリブレーション処理における散乱光に応じた信号成分を除去する工程と、を含み、キャリブレーション処理を実施する工程では、検出される照射光又は照射光の散乱光に係る信号であって、測定信号における散乱光に対応する信号よりも信号量が大きい、キャリブレーション信号に基づき、測定信号から散乱光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理を実施する。

　本発明の一態様によれば、照射光自体に起因するノイズ成分を除去し、蛍光測定を高精度に行うことができる。

本発明の実施形態に係る光学測定装置の概略構成図である。蛍光と散乱光との位相差を説明する図である。散乱光のキャンセル手法について説明する図である。蛍光測定手法について説明する図である。光学測定装置による蛍光測定処理を示すフローチャートである。光学測定装置の概略構成図である。ノイズ成分の除去について説明する図である。試料を模式的に示す図である。Ｓ／Ｎの定義について説明する図である。キャリブレーション処理で用いる信号について説明する図である。キャリブレーション処理を説明する図である。変調周波数毎の蛍光成分の割合を示す表である。キャリブレーション処理を示すフローチャートである。キャリブレーション処理の効果を説明する図である。キャリブレーション誤差について説明する図である。キャリブレーション誤差について説明する図である。第１の態様における蛍光測定の概要を説明する図である。第２の態様における蛍光測定の概要を説明する図であり、リファレンス部材としてミラーを用いる場合の散乱光取得について説明する図である。第２の態様における蛍光測定の概要を説明する図であり、リファレンス部材として反射拡散体を用いる場合の散乱光取得について説明する図である。第２の態様における蛍光測定の概要を説明する図であり、リファレンス部材としてすりガラスを用いる場合の散乱光取得について説明する図である。第３の態様における蛍光測定の概要を説明する図である。第４の態様における蛍光測定の概要を説明する図であり、光路切り替えによる励起光取得について説明する図である。第４の態様における蛍光測定の概要を説明する図であり、別の検出光学系を用いた励起光取得を説明する図である。第４の態様における蛍光測定の概要を説明する図であり、別の照射光学系を用いた励起光取得を説明する図である。第５の態様の光学測定装置の概略構成図である。蛍光測定処理を示すフローチャートである。

　以下、本発明の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。なお、各図においては同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明を省略する。

　図１は、本実施形態に係る光学測定装置１の概略構成図である。光学測定装置１は、試料に照射された光に応じて試料から生じる光を検出する装置である。本実施形態では、光学測定装置１は、試料に照射された励起光（照射光）に応じて試料から生じる蛍光を検出する蛍光測定装置であるとして説明する。励起光とは試料を励起する光であり、蛍光とは励起光に応じて試料が放出する光であり、励起光と波長が異なる光である。また、本実施形態では、光学測定装置１は、イムノクロマト法を用いた測定に係る蛍光を検出する装置であるとして説明する。イムノクロマト法とは、抗原抗体反応を利用した免疫測定法であり、例えば、インフルエンザウイルスの検出等に用いられる。

　図１に示されるように、イムノクロマト法を用いた測定では、試料として免疫クロマト試験片１００が用意される。免疫クロマト試験片１００は、試薬ホルダ１０１内に、測定対象物となるイムノクロマトメンブレンを収容している。免疫クロマト試験片１００のイムノクロマトメンブレンの特定の位置（測定対象部）には、所定の抗原に対する捕捉抗体（例えばインフルエンザウイルス抗原に対する抗体）が固定されている。試薬ホルダ１０１には、イムノクロマトメンブレンに検体を滴下するための開口部である検体点着ウィンドウ、及び捕捉抗体が固定された測定対象部を測定するための開口部である測定ウィンドウが設けられている。試薬ホルダ１０１の検体点着ウィンドウに検体が滴下されると、検体中の抗原が、まず蛍光試薬で標識された検出抗体と結合し、次いで捕捉抗体との間で抗原抗体反応を起こしてトラップされる。光学測定装置１は、免疫クロマト試験片１００の測定ウィンドウから露出したイムノクロマトメンブレンに対して励起光を照射し、測定対象部における抗原‐抗体複合物（詳細には、抗体の蛍光試薬）から蛍光を検出することにより、蛍光強度を測定する。なお、蛍光試薬としては、例えばユウロピウム、Ｑ－ｄｏｔ（登録商標）、有機色素等を用いることができる。

　ここで、光学測定装置１において後述する検出光学系２０に入射し、検出される検出光には、蛍光だけでなく、励起光自体に起因する光が含まれることが考えられる。このような光は、例えば、励起光の散乱光が挙げられる。このような散乱光は、例えば、励起光が免疫クロマト試験片１００に照射され、散乱することで発生する励起光の一部であり、励起光と等しい位相を持つ（位相差のない）光である。免疫クロマト試験片１００のイムノクロマトメンブレンや試薬ホルダ１０１は一般的に白色であるため、上述した散乱光が生じやすくなっている。また、測定する試料や検出光学系の配置によっては、励起光そのものが検出される場合もある。以下では、光学測定装置１において検出される検出光には、蛍光及び散乱光が含まれるとして説明する。

　図１に示されるように、光学測定装置１は、照射光学系１０と、検出光学系２０（光検出部）と、光源駆動回路３０と、ＩＶ変換アンプ４０と、波形生成回路５０と、キャンセル回路６０（信号処理部）と、タイミング生成器７０と、ＡＤ変換器８０と、ＣＰＵ９０と、を備える。

　照射光学系１０は、測定対象物である免疫クロマト試験片１００（試料）に向けて励起光（照射光）を照射する。照射光学系１０は、光源１１と、アパーチャー１２と、励起光フィルタ１３と、コリメートレンズ１４と、を有している。光源１１は、免疫クロマト試験片１００（試料）に励起光を照射する。光源１１は、例えば半導体発光素子である。本実施形態では、光源１１は発光ダイオード（ＬＥＤ）であるとして説明するがこれに限定されず、例えば光量を確保すべくＬＤが用いられてもよい。アパーチャー１２は、光源１１から出射された光を、所望の光束断面を有する光に整形するための光束整形部材である。励起光フィルタ１３は、アパーチャー１２を介して到達した励起光について、励起に必要な波長をフィルタリングする波長選択フィルタである。励起光フィルタ１３は、例えば誘電体多層膜フィルタや色ガラスフィルタ等の光学フィルタであり、より詳細には特定の波長帯（蛍光試薬の励起波長）のみを透過させる誘電体多層膜フィルタからなるバンドパスフィルタである。コリメートレンズ１４は、励起光フィルタ１３によるフィルタリング後の励起光を、免疫クロマト試験片１００（詳細にはイムノクロマトメンブレンの測定対象部）上に結像させるレンズである。

　検出光学系２０は、励起光に起因する検出光を検出する。具体的には、検出光学系２０は、免疫クロマト試験片１００からの蛍光を検出する。しかしながら、現実的には、検出光学系２０には、免疫クロマト試験片１００からの蛍光（イムノクロマトメンブレンの測定対象部からの蛍光）に加え、上述した励起光自体に起因する散乱光も含んだ光である検出光が入射され、当該検出光を検出することになる。検出光学系２０は、光検出素子２１と、蛍光フィルタ２２と、集光レンズ２３とを有している。検出光は、集光レンズ２３によって集光され、蛍光フィルタ２２を介して光検出素子２１へと入射する。蛍光フィルタ２２は、免疫クロマト試験片１００からの検出光について、蛍光以外の光が光検出素子２１に到達することを抑制するために設けられる波長選択フィルタである。蛍光フィルタ２２は、例えば誘電体多層膜フィルタや色ガラスフィルタ等の光学フィルタであり、より詳細には特定の波長帯のみを透過させる誘電体多層膜フィルタと色ガラスフィルタを組み合わせたバンドパスフィルタである。しかしながら、例えば励起光波長及び蛍光波長が近い場合等においては、蛍光フィルタ２２によって蛍光波長を持つ蛍光を適切に透過させながら励起光波長を持つ散乱光のみを効率よく遮断することは困難である。また、一般的に、効率の良い波長選択フィルタとして汎用される誘電体多層膜フィルタは光の入射角度によって特性が変化してしまう。そのため本実施形態においては、蛍光フィルタ２２を、誘電体多層膜フィルタと色ガラスフィルタとの組み合わせによって構成することで、斜め方向からの散乱光を色ガラスフィルタによって効果的に遮断している。しかしながら、やはり波長選択のみでは十分な効果が得難く、様々な条件を持った散乱光の進入を効率よく防ぐことは困難である。以下では、蛍光フィルタ２２を設けることによっても、光検出素子２１に到達する検出光には散乱光が含まれてしまっているとして説明する。

　光検出素子２１は、蛍光フィルタ２２によるフィルタリング後の検出光を検出する光センサである。光検出素子２１は、例えば半導体受光素子である。本実施形態では、光検出素子２１はフォトダイオード（ＰＤ）であるとして説明するがこれに限定されず、後述する光源１１からの励起光の変調周波数に対応して高速応答できるものであれば、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）又は光電子増倍管（ＰＭＴ）等であってもよい。光検出素子２１は、詳細には、励起光が照射された免疫クロマト試験片１００（詳細にはイムノクロマトメンブレンの測定対象部における抗原‐抗体複合物の蛍光試薬）から生じる蛍光、及び、励起光に起因する光であって励起光と位相差がない上述した散乱光が含まれる検出光を検出する。光検出素子２１は、検出光に応じた検出信号をＩＶ変換アンプ４０に出力する。

　光源駆動回路３０は、ＬＥＤである光源１１に駆動電流を出力することにより光源１１を駆動させる回路である。光源駆動回路３０は、タイミング生成器７０から、基準となるサイン波状の周波数信号の入力を受ける。光源駆動回路３０は、入力された基準となる周波数信号に基づいて駆動電流の周波数を変調する。すなわち、光源駆動回路３０は、励起光を出力する光源１１の変調周波数を設定する。これに応じて、光源１１から出力される励起光の周波数が変調し、光源１１からの光量（励起光量）がサイン波状に変化する。なお、変調周波数は、用いられる蛍光試薬の蛍光寿命に基づいて決定されてもよい。例えば、蛍光試薬として蛍光寿命が数ミリ秒であるユウロピウムが用いられる場合には変調周波数が１ｋＨｚ程度とされ、蛍光寿命が数１０ナノ秒であるＱ－ｄｏｔが用いられる場合には変調周波数が１００ＭＨｚ程度とされ、蛍光寿命が数ナノ～数十ナノ秒である有機色素が用いられる場合には変調周波数が１ＧＨｚ程度とされてもよい。

　一般的に、蛍光寿命は、蛍光強度がピーク値から１／ｅ（約３７％）に落ちるまでの時間とされる。この蛍光寿命の定義から逆算すると、例えば蛍光寿命が数ミリ秒であるユウロピウムを用いる場合の最適な変調周波数は１ｋＨｚ、蛍光寿命が数ナノ～数十ナノ秒である有機色素を用いる場合の最適な変調周波数は１００ＭＨｚ～１ＧＨｚ程度が好ましいと考えられる。しかし、ユウロピウム試薬を用いて実際に変調周波数に対する蛍光由来の信号出力を測定したところ、蛍光寿命から定まる周波数よりも低周波で変調したほうが、蛍光強度が高くなり、励起光に対する蛍光信号の割合も大きくなることが判明した（図１２参照）。図１２に示されるように、蛍光寿命から定まる周波数である１ｋＨｚよりも低周波側において、蛍光強度が高くなっている。具体的には、蛍光寿命を１／ｅではなく、「蛍光強度のピーク値が１％に落ちるまでの時間」と定義し、その時間から変調周波数を求めることによって、蛍光強度を高くすることができた。この場合、ユウロピウムであれば蛍光寿命が約１０ｍｓとなり、ここから定まる光源１１の変調周波数は約１００Ｈｚとなる。

　上述したように、光源駆動回路３０は、光源１１の変調周波数を、蛍光強度を考慮して決定してもよい。具体的には、光源駆動回路３０は、光源１１の変調周波数を、蛍光強度がピーク値から１／ｅに落ちるまでの時間である蛍光寿命に対応する値（詳細には、１／蛍光寿命）よりも低くする。光源駆動回路３０は、光源１１の変調周波数を、蛍光寿命に対応する値よりも低く、且つ、商用周波数（５０Ｈｚ，６０Ｈｚ）よりも高く設定し、例えば、１００Ｈｚ付近であって商用周波数の倍波を避けることによりノイズの影響を低減した１１０Ｈｚ程度に設定する。光源駆動回路３０は、光源１１の変調周波数を、１００Ｈｚ付近の他の値、例えば９０Ｈｚ、８０Ｈｚ，７０Ｈｚ，または１３０Ｈｚ等に設定してもよい。

　ＩＶ変換アンプ４０は、光検出素子２１から出力された電流信号（検出信号）を電圧信号に変換する。ＩＶ変換アンプ４０は、電圧信号に変換した検出信号を波形生成回路５０に出力する。

　波形生成回路５０は、ＩＶ変換アンプ４０から出力された検出信号に基づいて、検出信号の波形を生成する回路である。波形生成回路５０は、タイミング生成器７０から、基準となる周波数信号の入力を受ける。タイミング生成器７０は、光源駆動回路３０及び波形生成回路５０に対して同じタイミングで基準となる周波数信号を入力する。波形生成回路５０は、生成した波形（検出信号）の情報をキャンセル回路６０に出力する。

　キャンセル回路６０は、波形生成回路５０によって生成された波形（検出信号）を処理する信号処理部である。キャンセル回路６０は、蛍光と散乱光における位相の違い（位相差）に基づき、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去する。なお、キャンセル回路６０は、光源駆動回路３０及び波形生成回路５０と同じタイミングで、タイミング生成器７０から基準の周波数信号の入力を受けることにより、励起光（すなわち散乱光）の位相の情報を取得する。これにより、キャンセル回路６０において、蛍光と散乱光における位相差に基づく、散乱光の信号成分の除去が可能になっている。キャンセル回路６０の処理の詳細について、図２～図４を参照して説明する。

　図２は、蛍光と散乱光との位相差を説明する概念図である。図２に示されるように、光源部Ｌからサイン波状の励起光が照射された試料Ｓからのサイン波状の検出光（光検出部Ｄにおいて検出される検出光）には、サイン波状の散乱光及び蛍光が含まれている。なお、光源部Ｌからの励起光は、サイン波状に限らず、矩形波等の周期的変調波形でもよく、その場合、検出光（散乱光及び蛍光）も励起光と同様の周期的変調波形を有する。そして、散乱光は励起光と位相差がない光であるのに対して、蛍光は、励起光に応じて試料Ｓから生じる光であり、散乱光に対して数１０ミリ秒からナノ秒程度、位相が遅れて検出されることとなる。本発明者らは、このような位相差に着目し、検出光から散乱光のみを除去し蛍光のみを取り出す手法を見出した。なお、図２においては、光源部Ｌの光軸上に試料Ｓ及び光検出部Ｄが配置されているため、励起光の光軸と交わる方向に放出された蛍光を検出する図１と異なり、励起光の光軸と同軸方向に放出された蛍光を検出している。このような場合、検出光に含まれるのは蛍光及び散乱光に加え、励起光そのものが含まれる可能性もある。また、光検出部Ｄに入射する、励起光に起因する光の光量も大きくなる可能性が高い。そのため、本手法による蛍光の取出しが有効になる。

　図３は、散乱光の除去（キャンセル）手法について説明する図である。図３は、検出光のうち散乱光の波形のみを示している。なお、この波形は励起光の波形と等しい。図３において横軸は時間、縦軸は振幅を示している。図３に示される、散乱光の位相に応じた波形について、例えば１周期の１／４の時間単位で分離（時間領域を分離）し、各時間領域１～４についてそれぞれ積分すると、各時間領域１～４における散乱光の出力を得ることができる。ここで、各時間領域１～４の積分値それぞれに、ある乗数を掛けて全て足し合わせると、出力の合計を０とすることができる。すなわち、各時間領域１～４の出力の絶対値は同じであり、時間領域１及び２の振幅の範囲は正、時間領域３及び４の振幅の範囲は負であるところ、図３に示されるように、時間領域１について乗数「－１」が掛けられて増幅されると時間領域１の出力は「正×負」で負の値となり、時間領域２について乗数「＋１」が掛けられて増幅されると時間領域２の出力は「正×正」で正の値となり、時間領域３について乗数「＋１」が掛けられて増幅されると時間領域３の出力は「負×正」で負の値となり、時間領域４について乗数「－１」が掛けられて増幅されると時間領域４の出力は「負×負」で正の値となる。このため、所定の乗数が掛けて増幅された各時間領域１～４の積分値を全て足し合わされると、各値が相殺されて、出力の合計が０となる。このように、散乱光に応じた信号成分については、散乱光の位相に応じた所定の時間単位で分離し、分離した各成分をそれぞれ増幅し、増幅した各成分を合成することによって、除去する（出力を０とする）ことができる。

　図４は、蛍光測定手法について説明する図である。図４は、検出信号に含まれる散乱光及び蛍光の波形を示している。図４において横軸は時間、縦軸は振幅を示している。上述したように、散乱光に応じた信号成分については、散乱光の位相に応じた所定の時間単位で分離し、分離した各成分をそれぞれ増幅し、増幅した各成分を合成することによって、除去する（出力を０とする）ことができた。ここで、図４に示されるように、蛍光については散乱光に対して位相差を有しているため、散乱光の位相に応じた所定の時間単位で分離すると、各時間領域１～４の積分値が同じ値とならないため、散乱光と同様の乗数を掛けてそれぞれ増幅し足し合わされた値は０ではない値が出力される。このように、散乱光及び蛍光について、同じ時間領域に分離して増幅し合成することによって、散乱光の信号成分を除去しながら蛍光の出力強度を検波出力することができる。

　このように、キャンセル回路６０は、検出信号について、散乱光の位相に応じた所定の時間単位で分離し、分離した検出信号の各成分をそれぞれ増幅し、増幅した各成分を合成することにより、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去し、蛍光の信号成分を得ることができる。キャンセル回路６０は、散乱光に応じた信号成分を除去した信号（すなわち蛍光の信号成分のみとなった信号）である蛍光信号をＡＤ変換器８０に出力する。なお、所定の時間単位として１周期の１／４の時間を例示したがこれに限定されず、合成後において散乱光に応じた信号成分を除去可能な時間単位であればどのような時間単位であってもよい。また、増幅における乗数として「＋１」及び「－１」を例示したがこれに限定されず、合成後において散乱光に応じた信号成分を除去可能な乗数であればどのような乗数であってもよい。

　ＡＤ変換器８０は、キャンセル回路６０から出力された蛍光信号について、ＡＤ変換を行いデジタル値に変換し、ＣＰＵ９０に出力する。ＣＰＵ９０は、ＡＤ変換器８０から出力されたデジタル信号（蛍光信号）について、所定の制御・信号処理を行う。ＣＰＵ９０は、信号処理結果を例えばシリアル通信で外部のコンピュータに転送してもよい。また、ＣＰＵ９０は、タイミング生成器７０から出力される信号、すなわち光学測定装置１における各種動作タイミングを決定する信号を生成してタイミング生成器７０に出力してもよい。なお、ＣＰＵ９０に替えてＦＰＧＡが用いられてもよい。以上の処理によって、光学測定装置１は、検出光から散乱光の影響を除去し、蛍光試薬の蛍光に関する信号のみを得ることができる。

　次に、光学測定装置１が行う蛍光測定処理（光学測定方法）について、図５を参照して説明する。

　図５は、光学測定装置１による蛍光測定処理を示すフローチャートである。図５に示されるように、蛍光測定処理では、最初に、照射光学系１０（光源部）の光源１１が、免疫クロマト試験片１００（試料）に向けて励起光を照射する（ステップＳ１）。免疫クロマト試験片１００（詳細には、イムノクロマトメンブレンの測定対象部における抗原‐抗体複合物）に対して励起光が照射されることにより、抗原‐抗体複合物の蛍光試薬から蛍光が放出される。一方、励起光が免疫クロマト試験片１００で散乱され、散乱光が生じる。

　つづいて、検出光学系２０（光検出部）の光検出素子２１が、上述した蛍光及び散乱光を含む検出光を検出する（ステップＳ２）。光検出素子２１は、検出光をＩＶ変換アンプ４０に出力する。そして、ＩＶ変換アンプ４０において光検出素子２１から出力された電流信号（検出信号）が電圧信号に変換され、波形生成回路５０において検出信号の波形が生成された後に、キャンセル回路６０（信号処理部）が、蛍光と散乱光における位相差に基づき、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去する（ステップＳ３）。具体的には、キャンセル回路６０は、検出信号について、散乱光の位相に応じた所定の時間単位で分離し、分離した検出信号の各成分をそれぞれ増幅し、増幅した各成分を合成することにより、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去し、蛍光の信号成分を得る。その後、ＡＤ変換器８０において蛍光信号がデジタル値に変換され、ＣＰＵ９０において所定の制御・信号処理が行われることにより、蛍光に関する信号を得ることができる。

　なお、光学測定装置１では、キャンセル回路６０において検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去するとして説明したが、これに限定されない。すなわち、図６に示される光学測定装置１Ａのように、キャンセル回路６０を設けずに、ＡＤ変換器８０におけるＡ／Ｄ変換後に、ＣＰＵ９０Ａ（信号処理部）において検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去する処理を行ってもよい。この場合には、キャンセル回路６０を設ける必要がないため、装置の小型化に寄与することができる。

　次に、上述した実施形態において説明した特定の信号成分（ノイズ）の除去に関して、図７～図１４を参照してより具体的に説明する。

　図７は、ノイズ成分の除去について説明する図である。図７（ａ）は励起光に起因する散乱光に応じた信号成分（ノイズ）の除去を行わなかった場合の検出光の強度、図７（ｂ）は励起光に起因する散乱光に応じた信号成分（ノイズ）の除去を行った場合の検出光の強度を示している。図７（ａ）及び図７（ｂ）において縦軸は検出光の強度を示しており、横軸は試料５００の測定領域である測定部５０１における位置を示すチャンネルである。１チャンネルは例えば０．０２ｍｍである。図７（ｃ）は、図７（ａ）及び図７（ｂ）のチャンネルの位置に対応する試料５００の領域を示す図である。図７（ｃ）に示した試料５００を拡大した模式図が図８である。図８に示されるように、試料５００は、検体が滴下される滴下部５０２と、蛍光試薬で標識された検出抗体を保持する保持部５０３と、捕捉抗体を測定対象部５０４に固定した測定部５０１とが上流から下流に向けて配置されている。蛍光試薬は、例えばDTBTA-Eu3＋である。測定部５０１は、例えば白色のイムノクロマトメンブレンの一部であるため、励起光を散乱し易い。

　このような試料５００に対して、滴下部５０２に検体を滴下すると、検体は毛細管現象により下流側へ移動する。検体中に被検出物質がある場合、保持部５０３の検出抗体と被検出物質とが反応して複合体を形成し、この複合体が測定部５０１を下流側に移動していく。そして、複合体が測定部５０１上の測定対象部５０４に達したときに、複合体が測定対象部５０４の捕捉抗体に捕捉され、被検出物質、検出抗体、及び捕捉抗体の３つによる複合体が形成される。この状態で測定領域である測定部５０１に対して集光位置（チャンネル）を変化させながら励起光が照射されることにより、図７（ａ）及び図７（ｂ）に示されるようなチャンネル毎の検出光強度を導出することができる。図７（ａ）及び図７（ｂ）において検出光強度が他と比べて大きくなっているチャンネルは、複合体が捕捉されている測定対象部５０４の位置に対応するチャンネルである。

　図７（ａ）に示されるように、散乱光に応じた信号成分（ノイズ）の除去が行われていない場合には、検出光には蛍光だけでなく散乱光が含まれるため、検出光強度が大きくなっている。そして、このようなノイズは励起光量を大きくすることに伴って大きくなるため、図７（ａ）に示されるように、励起光量を２倍にするとノイズも同様に２倍程度になっている。一般的にＳ／Ｎを向上させる方法として、励起光量を増加させることにより蛍光シグナル量を増加させる方法が考えられるが、上述したように、図７（ａ）のように励起光量に応じてノイズも増加する態様においては、Ｓ／Ｎを向上させることが難しい。さらに、励起光量を増加させることによってダイナミックレンジが狭まるという問題もある。

　一方で、図７（ｂ）に示されるように、散乱光に応じた信号成分（ノイズ）の除去を行った場合には、検出光には概ね蛍光のみが含まれており、検出したい信号（蛍光に基づく信号）のみを検出することができている。この場合には、ノイズがほぼ０であるため、図７（ｂ）に示されるように、励起光量を増加させても（例えば２倍にしても）、光検出器が飽和しない限り、励起光（散乱光）の影響をほぼ０にキャンセルすることができ、ノイズが極端に大きくなることがない。以上のように、図７（ｂ）に示されるようなノイズの除去を行う構成においては、励起光を増加させた場合にノイズ成分をほぼ０にキャンセルした状態でシグナル成分のみを増加させることができるため、Ｓ／Ｎの向上につながる。当該構成は、ノイズ成分に非常に強いため、励起光量を増加させることやＩＶ変換アンプの増倍率を上げることが可能となる。

　図９は、Ｓ／Ｎの定義について説明する図である。図９は、チャンネル毎の検出光の強度（測定領域の各位置における検出光の強度）の一例を示している。図９に示されるように、検出光の強度１０ｃｏｕｎｔ付近に±４程度のゆらぎ成分が存在している。このようなベース光量のゆらぎ（標準偏差）は、蛍光物質等が何も塗布されていない測定部５０１（或いは、計測状態と同様にぬれた状態とされた測定部５０１）に励起光をスキャンして取得される値である。以下では、当該ベース光量のゆらぎをノイズＮと定義する。また、シグナルＳは、「測定対象部５０４のピーク蛍光強度から全チャネルにおける測定対象部５０４の位置を除いたノイズ成分の平均値を差し引いた値」と定義する。Ｓ／Ｎは、上記で定義したシグナルをノイズで割った値と定義する。

　なお、図９に示される例では、ノイズの値が１０ｃｏｕｎｔほどオフセットしている。後述するキャリブレーション処理を行うことによって、原理的にはノイズの値はほぼ０にキャンセルされる。しかし、ノイズの値に応じたバックグラウンドはばらつきがあるところ、ソフトでの解析の観点からは信号が常にプラスの値となることが好ましいため、バックグラウンドのオフセット処理を行っている。なお、オフセット量は、信号がダイナミックレンジ内（０～４０９６ｃｏｕｎｔ内）に収まるように設定される。オフセット量は、ダイナミックレンジの観点から極力少なくしつつ、測定部５０１に励起光をスキャンすることにより得られるバックグラウンドの信号が常に（ほぼ確実に）プラスの値となるように設定されている。具体的には、オフセット量は、例えば、蛍光物質等が何も塗布されていない測定部５０１（或いは、計測状態と同様にぬれた状態とされた測定部５０１）に励起光をスキャンして取得される検出光の強度平均値＋該強度平均値の６σの値とされてもよい。なお、回路系に突発的なノイズが飛び込んでくる場合に備えて、上記で計算されるオフセット量に適当なマージンを加えて最終的なオフセット量とされてもよい。オフセット量は、ダイナミックレンジを犠牲にせず且つ信号がマイナスに出力されないように選択され、例えば＋２０ｃｏｕｎｔ程度であってもよい。

　次に、散乱光に応じた信号成分（ノイズ）の除去手法について、具体的に説明する。光学測定装置１では、ロックイン回路であるキャンセル回路６０においてキャリブレーション処理が行われ、該キャリブレーション処理の実施結果が考慮されて、検出信号から散乱光に応じた信号成分（ノイズ）が除去される。

　具体的には、光学測定装置１を用いた光学測定方法では、最初に、試料５００又は試料５００とは異なるキャリブレーション処理用のリファレンス部材（例えば、図１８のミラー６００Ａ等）に励起光が照射されるように、照射光学系１０の光学ヘッドが配置される。つづいて、照射光学系１０からの励起光が試料５００又はミラー６００Ａ等に照射されることによる散乱光（試料５００又はミラー６００Ａ等において散乱した励起光成分）が検出光学系２０の光検出素子２１において検出される。ここで検出光学系２０に検出される光は、基本的には、試料５００又はミラー６００Ａ等における蛍光を含まない散乱光のみの光であり、キャリブレーション処理に用いられるキャリブレーション処理用光である。

　つづいて、キャリブレーション処理が実施される。具体的には、光学測定装置１のキャンセル回路６０が、上述したキャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号に基づき、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理を実施する。キャリブレーション処理の詳細については後述する。そして、キャリブレーション処理の完了後、試料５００の測定領域（測定部５０１）上を照射光学系１０の光学ヘッドでスキャンすることにより、測定部５０１の蛍光情報が取得される。具体的には、キャンセル回路６０が、上述したキャリブレーション処理の実施結果を考慮して、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去することにより、蛍光情報を取得する。

　次に、キャリブレーション処理の詳細について説明する。光学測定装置１のキャンセル回路６０は、例えばＦＰＧＡ（Field Programmable Gate Array）を利用したロックイン回路である。キャリブレーション処理において、キャンセル回路６０は、光源駆動回路３０によって設定される光源１１の変調周波数（例えばＤＤＳ（Direct Digital Synthesizer）の周波数）に合わせた、キャンセル回路６０の動作周波数で周期を刻む周期信号に対して位相をずらしたロックイン用のスイッチ信号を生成する。そして、ロックイン回路として機能するキャンセル回路６０は、測定信号であるキャリブレーショ信号、及び、参照信号であるスイッチ信号を入力として、散乱光に応じた信号成分を出力し、該散乱光に応じた信号成分の電圧値が０に近似する所定範囲内（スラッシュレベル）となるように、スイッチ信号の位相を調整する。

　図１０は、キャンセル回路６０のＦＰＧＡ内部でキャリブレーション処理に用いる信号を示している。図１０に示される周期信号は、上述したようにＤＤＳの周波数に合わせて周期を刻むクロック信号である。基準信号は、周期信号から任意の位相にある（周期信号に対して位相をずらした）、周期信号と同じ周波数の信号であり、後述するＸＹ信号用のトリガである。ＸＹ信号は、上述したロックイン用のスイッチ信号であり、基準信号をトリガにして作られる信号である。Ｘ信号（第１信号）は、基準信号と位相差がない信号である。Ｙ信号（第２信号）は、基準信号に対して９０度位相がずれた信号である。キャンセル回路６０は、実際にはＸ信号及びＹ信号に加えて、更に、Ｘ信号を反転させたＸ´信号（第３信号）と、Ｙ信号を反転させたＹ´信号（第４信号）とを生成する。Ｘ信号、Ｙ信号、Ｘ´信号、及びＹ´信号は、それぞれ独立した専用の回路によって生成される。散乱光に応じた信号成分の電圧値がスラッシュレベルとなるようにスイッチ信号の位相を調整するとは、すなわち、キャンセル回路６０からの出力が０Ｖ（またはそれに近似する値）になるまで、周期信号に対して基準信号の位相をずらし続けることである。

　図１１は、周期信号に対して基準信号の位相をずらして出力が０Ｖになるように調整する処理を説明する図である。いま、周期信号、基準信号、及びスイッチ信号の初期状態の位相関係が図１１（ａ）に示される状態であったとする。そして、スイッチ信号に基づいて図１１中の網掛けの区間で積分処理がなされ、出力（散乱光に応じた信号成分の電圧値）がスラッシュレベルではなく且つ正の値であったとする。この場合、図１１（ｂ）に示されるように、スイッチ信号の位相を遅らせるように基準信号の位相が調整される。すなわち、キャンセル回路６０は、キャリブレーション処理において、散乱光に応じた信号成分の電圧値がスラッシュレベルではなく正の値である場合には、スイッチ信号の位相を遅らせるように調整する。

　いま、スイッチ信号の位相調整がなされた図１１（ｂ）の状態においても、網掛けの区間の積分処理の結果、出力（散乱光に応じた信号成分の電圧値）がスラッシュレベルではなく且つ正の値であったとする。この場合、図１１（ｃ）に示されるように、更にスイッチ信号の位相を遅らせるように基準信号の位相が調整される。

　いま、スイッチ信号の位相調整がなされた図１１（ｃ）の状態においても、網掛けの区間の積分処理の結果、出力（散乱光に応じた信号成分の電圧値）がスラッシュレベルではなく且つ正の値であったとする。この場合、図１１（ｄ）に示されるように、更にスイッチ信号の位相を遅らせるように基準信号の位相が調整される。

　いま、スイッチ信号の位相調整がなされた図１１（ｄ）の状態において、網掛けの区間の積分処理の結果、出力（散乱光に応じた信号成分の電圧値）がスラッシュレベルではなく且つ負の値であったとする。この場合、図１１（ｅ）に示されるように、スイッチ信号の位相を進めるように基準信号の位相が調整される。すなわち、キャンセル回路６０は、キャリブレーション処理において、散乱光に応じた信号成分の電圧値がスラッシュレベルではなく負の値である場合には、スイッチ信号の位相を進めるように調整する。

　そして、スイッチ信号の位相を進めるように調整された結果、図１１（ｅ）に示されるように、網掛けの区間の積分処理の結果、出力（散乱光に応じた信号成分の電圧値）がスラッシュレベル（０に近似する所定範囲内の値）になると、キャリブレーション処理が完了する。

　キャリブレーション処理が完了すると、キャンセル回路６０は、蛍光成分及び散乱光成分（励起光成分）を含んだ検出光に応じた検出信号と、キャリブレーション処理において位相が調整されたスイッチ信号とを入力として、検出信号から散乱光成分に応じた信号成分を除去する。

　図１３は、キャリブレーション処理を示すフローチャートである。図１３に示されるように、キャリブレーション処理では、最初に、ＡＤ変換器への入力が所定のオフセット電圧に切り替えられて０レベルが記憶される（ステップＳ１１）。そして、スイッチの切り替えによりキャンセル回路６０（ロックイン回路）の信号がＡＤ変換器に入力される（ステップＳ１２）。この状態で、一度強制的に基準信号の位相がずらされる（ステップＳ１３）。キャンセル回路６０（ロックイン回路）の出力は周期信号に対する基準信号の位相が０度と１８０度のときに０Ｖとなるが、初期状態で偶然１８０度に位相が合っていた場合、誤ってキャリブレーション処理を完了してしまい、出力される信号の正負が反転してしまうため、後段の回路の構成によっては出力される信号を検出できなくなる場合がある。この点、スタート時に強制的に基準信号の位相をずらすことにより、誤ってキャリブレーション処理が完了してしまうことを防止できる。また、このようにして開始時の位相を合わせることにより、出力される信号の正負が固定される。その結果、出力される信号をデジタル値に変換した際の符号ビットが必要なくなり、ＡＤ変換器のダイナミックレンジを有効に使用することができる。また、負の出力で計測したいときは、キャリブレーション完了の位相を０度ではなく１８０度にしてもよい。

　ステップＳ１３が完了すると、現在のＡＤ変換器の入力値が記録され（ステップＳ１４）、キャリブレーションのループ処理が実行される。まず、現在のＡＤ変換器の入力値と０レベルとが比較されて、ＡＤ変換器の入力値が０レベルよりも小さいか（負の値であるか）否かが判定される（ステップＳ１５）。ステップＳ１５においてＡＤ変換器の入力値が負の値であると判定されると、ＤＤＳの周波数に応じた周期信号に対するキャンセル回路６０のスイッチ信号（すなわち基準信号）の位相が進められる（ステップＳ１６）。一方で、ステップＳ１５においてＡＤ変換器の入力値が正の値であると判定されると、周期信号に対するキャンセル回路６０のスイッチ信号（すなわち基準信号）の位相が遅らされる（ステップＳ１７）。

　そして、ＡＤ変換器の入力値について、符号が変化せずにスラッシュレベルとなったか否かが判定される（ステップＳ１８）。ステップＳ１８において符号が変化せずにスラッシュレベルになったと判定されると、キャリブレーション処理が終了する。一方で、ステップＳ１８において条件を満たしていないと判定されると、位相をずらしたことによりＡＤ変換器の入力の符号が変わったか否かが判定される（ステップＳ１９）。ステップＳ１９において変わっていないと判定された場合には再度ステップＳ１４の処理が行われ、変わっていると判定された場合には制御による位相の変化幅が現状の半分に変更されて（ステップＳ２０）、再度ステップＳ１４の処理が行われる。以上が、キャリブレーション処理である。

　本態様では、蛍光を含まず散乱光を含むキャリブレーション処理用光を検出し、キャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号に基づき、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理を実施し、該キャリブレーション処理の実施結果を考慮して、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去する。検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理を、散乱光を含むキャリブレーション処理用光に基づき予め行うことによって、検出信号から散乱光に応じた信号成分を適切に除去することができる。

　このようにして散乱光（ノイズ）を適切に除去することの効果について、図１４を参照して説明する。図１４（ａ）は散乱光に応じた信号成分（ノイズ）の除去を行わなかった場合の検出光の強度、図１４（ｂ）は散乱光に応じた信号成分（ノイズ）の除去を行った場合の検出光の強度を示している。図１４は、蛍光試薬としてDTBTA-Eu3＋を塗布したメンブレンを計測した場合の結果を示している。図１４（ａ）に示されるように、ノイズの除去が行われていない場合においては、励起光（散乱光）のバックグラウンド（ＢＫＧ）のために約３３０ｃｏｕｎｔｓのオフセットが必要になっている。そして、ノイズ（標準偏差）は２．１６、シグナル強度は４０４ｃｏｕｎｔｓであった。これに対して、図１４（ｂ）に示されるように、ノイズの除去が行われている場合においては、励起光がメンブレンに散乱することを考慮したオフセットが必要とならず、ソフト上の処理（信号の値を全てプラスにする処理）のための最低限のオフセットのみが行われている。そして、ノイズ（標準偏差）は０．６９、シグナル強度は１４７５ｃｏｕｎｔｓとすることができた。このように、ノイズの除去が行われている場合においてはオフセット量が小さいため、光源からの励起光量及びＩＶ変換アンプの増幅率を上げることができ、シグナル強度を好適に上げることができる。この結果、ノイズの除去が行われない場合のＳ／Ｎが１８７であるのにたいして、ノイズの除去が行われる場合のＳ／Ｎを２１４０とすることができ、Ｓ／Ｎを１０倍以上向上させることができる。

　キャリブレーション処理において、光源１１の変調周波数に合わせたキャンセル回路６０の動作周波数で周期を刻む周期信号に対して位相をずらしたロックイン用のスイッチ信号を生成し、キャリブレーション信号及びスイッチ信号を入力として、散乱光に応じた信号成分を出力し、該散乱光に応じた信号成分の電圧値が０に近似する所定範囲内となるように、スイッチ信号の位相を調整し、検出信号、及び、キャリブレーション処理において位相が調整されたスイッチ信号を入力として、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去してもよい。このように、ロックイン回路を用いて、キャリブレーション処理において散乱光に応じた信号成分の電圧値が０に近似する値となるようにスイッチ信号の位相が調整されることにより、位相調整後のスイッチ信号を入力として、検出信号から散乱光に応じた信号成分を適切に除去することができる。

　キャリブレーション処理において、散乱光に応じた信号成分の電圧値が所定範囲内ではなく該所定範囲の値よりも大きい場合には、スイッチ信号の位相を遅らせるように調整し、散乱光に応じた信号成分の電圧値が所定範囲内ではなく該所定範囲の値よりも小さい場合には、スイッチ信号の位相を進めるように調整してもよい。これにより、キャリブレーション処理において散乱光に応じた信号成分の電圧値を、適切に０に近い値に調整することができる。

　光源１１の変調周波数を、蛍光の強度がピーク値から１／ｅに落ちるまでの時間である蛍光寿命に対応する値よりも低くしてもよい。変調周波数が蛍光寿命に対応する値程度に高くされた場合には、連続する信号が互いに重なってしまう場合があり蛍光強度を最大化することができない。この点、変調周波数が蛍光寿命に対応する値よりも低くされることにより、蛍光強度を適切に高めることができる。

　光源１１の変調周波数を、蛍光寿命に対応する値よりも低く、且つ、商用周波数よりも高くしてもよい。これにより、変調周波数が蛍光寿命に対応する値よりも高くなり蛍光強度が弱まることを回避しながら、ノイズの増加を回避することができる。

　ロックイン用のスイッチ信号として、Ｘ信号と、該Ｘ信号に対して位相が９０度ずれたＹ信号と、Ｘ信号を反転させたＸ´信号と、Ｙ信号を反転させたＹ´信号とを、それぞれ独立した専用の回路を用いて生成してもよい。独立した専用の回路で反転信号が生成されることにより、例えばnot回路により反転信号を生成する場合に問題となる微小な遅延（not回路の通過に伴う微小な遅延）が発生することを防止できる。

　キャンセル回路６０（ロックイン回路）は、２種類の動作周波数が所定の割合で切り替えて設定されてもよい。これにより、動作周波数が１種類とされる場合よりも、ロックイン回路の動作周波数を光源１１の変調周波数に合わせやすくなり、これらの同期制度を向上させることができる。

　キャリブレーション処理用光は、試料５００における、測定対象部５０４に固定された捕捉抗体よりも下流側の領域に励起光が照射されることにより検出されてもよい。蛍光成分は捕捉抗体よりも上流側に滞留しやすいところ、補足抗体の下流側の領域に励起光が照射されてキャリブレーション処理用光が検出されることにより、適切に、蛍光成分の影響を低減したキャリブレーション処理用光を検出することができる。

　上述したキャリブレーション処理において、キャリブレーション信号及びスイッチ信号を入力として、散乱光に応じた信号成分を出力し、該散乱光に応じた信号成分の電圧値が０に近づくようにスイッチ信号の位相を調整することにより、原理的には、その後の蛍光検出処理において、検出信号から散乱光に応じた信号成分を完全に除去することができることになる。しかしながら、実際には、装置の制御精度及び検出精度等を原因として、キャリブレーション信号（散乱光に応じた信号）を用いて装置の出力が完全に０になるようにスイッチ信号の位相を調整することは難しく、キャリブレーション誤差が生じてしまう。

　図１５及び図１６は、キャリブレーション誤差について説明する図である。図１５において、信号波Ｗ１はキャリブレーション信号を示しており、方形波Ｗ２はスイッチ信号を示している。キャリブレーションとは、方形波Ｗ２と信号波Ｗ１との差の積分を０に近づけることである。信号波Ｗ１に対して方形波Ｗ２を移動させることにより、図１５中において斜線で示した２つの領域の面積差が０になる（方形波Ｗ２と信号波Ｗ１との差の積分を０に近づける）ことが試みられるが、図１５に示されるように、完全には面積差が０にならず、キャリブレーション信号及びスイッチ信号の位相のずれに起因するずれ領域ＣＥが生じる。当該ずれ領域ＣＥの面積は、図１５からも明らかなように、「キャリブレーション信号の振幅（信号量）」と「キャリブレーション信号及びスイッチ信号の位相のずれ」とが掛け合わされて導出される。当該ずれ領域ＣＥの面積をキャリブレーション誤差と規定すると、キャリブレーション誤差は以下の式で示される。
　キャリブレーション誤差＝キャリブレーション信号の振幅（信号量）×キャリブレーション信号及びスイッチ信号の位相のずれ・・・（１）

　ここで、キャリブレーション誤差は、装置の制御精度及び検出精度等の限界によって生じるものであり、検出光学系への入射光量及び試料の差異に影響されずに同一装置であれば一定の値となる。上記（１）式において、左辺のキャリブレーション誤差の値が一定であるとすると、キャリブレーション信号の振幅（信号量）が大きくなるほど、キャリブレーション信号及びスイッチ信号の位相のずれが小さくなることになる。すなわち、キャリブレーション誤差が一定であるとすると、図１６（ａ）に示されるように信号波Ｗ１で示されるキャリブレーション信号の振幅（信号量）を比較的大きくした場合には、図１６（ｂ）に示されるように信号波Ｗ１で示されるキャリブレーション信号の振幅（信号量）を比較的小さくした場合と比べて、キャリブレーション信号及びスイッチ信号の位相のずれが小さくなる。以下では、このような考えに基づき、キャリブレーション信号の振幅（信号量）を極力大きくすることによって、キャリブレーション信号及びスイッチ信号の位相のずれを小さくし、蛍光検出処理において散乱光に応じた信号成分をより好適に除去する態様について説明する。

　キャリブレーション信号の振幅（信号量）を大きくするための具体的な態様として、以下では、図１７～図２６を参照して、第１～第５の態様を説明する。各態様では、共通して、蛍光検出処理を行う前に、キャリブレーション処理を含む事前処理を実施する。すなわち、各態様において、光学測定装置は、蛍光検出処理と、該蛍光検出処理に先行して実施される事前処理とを実施する。第１の態様では、事前処理における照射光の光量を大きくすることにより、キャリブレーション信号の振幅を大きくする。第２の態様では、事前処理において、試料とは異なるリファレンス部材に照射光を照射することにより、キャリブレーション信号の振幅を大きくする。第３の態様では、光学系の配置によって事前処理において検出される散乱光の光量を大きくすることにより、キャリブレーション信号の振幅を大きくする。第４の態様では、事前処理において照射光を直接検出することにより、キャリブレーション信号の振幅を大きくする。第５の態様では、事前処理において疑似信号を生成することにより、キャリブレーション信号の振幅を大きくする。

［第１の態様］
　図１７は、第１の態様における蛍光測定の概要を説明する図である。図１７（ａ）に示されるように、第１の態様における蛍光測定では、最初に、照射光学系１０の光源１１が、測定対象物である試料５００（詳細には、試料５００の測定対象部５０４以外の領域）に照射光を照射し、検出光学系２０の光検出素子２１が、照射光が照射された試料５００からの散乱光を含むキャリブレーション処理用光を検出する。そして、信号処理部であるキャンセル回路６０（図１参照）が、キャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号に基づきキャリブレーション処理を実施する。以上が、第１の態様における事前処理である。

　その後、図１７（ｂ）に示されるように、光源１１が、測定対象物である試料５００（詳細には、試料５００の測定対象部５０４）に励起光（照射光）を照射し、光検出素子２１が、励起光が照射された試料５００から生じる蛍光、及び、励起光が照射された試料５００からの散乱光を含む測定対象光を検出する。そして、信号処理部であるキャンセル回路６０（図１参照）が、キャリブレーション処理の実施結果を考慮し、測定対象光に応じた測定信号から散乱光に応じた信号成分を除去する。以上が第１の態様における蛍光検出処理である。図１７（ａ）及び図１７（ｂ）を正面図とすると、図１７（ｃ）は右側面図である。図１７（ｃ）に示されるように、試料５００からの蛍光を取得する際には、試料５００の測定領域上を照射光学系１０の光学ヘッドでスキャンすることにより、試料５００の測定対象部５０４の蛍光情報が取得される。

　ここで、第１の態様においては、照射光学系１０の光源１１が、蛍光検出処理時において照射する励起光（照射光）の光量よりも、事前処理時において照射する照射光の光量を大きくする。事前処理時における照射光の光量が大きくされることにより、散乱光を主に含むキャリブレーション処理用光の光量を大きくすることができる。このことで、キャリブレーション処理用光に応じた信号であるキャリブレーション信号の振幅（信号量）を適切に大きくすることができる。具体的には、キャリブレーション信号の信号量は、蛍光検出処理における測定対象光に応じた測定信号における散乱光に対応する信号の信号量よりも大きくされる。そして、キャンセル回路６０が、検出光学系２０の光検出素子２１において検出される散乱光に係る信号であって、測定信号における散乱光に対応する信号よりも信号量が大きい、キャリブレーション信号に基づいて、測定信号から散乱光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理を実施する。

　次に、第１の態様に係る作用効果について説明する。

　第１の態様に係る光学測定装置１は、照射対象に照射光（励起光）を照射する照射光学系１０と、照射光（励起光）に起因する検出光を検出する検出光学系２０と、キャンセル回路６０と、を備え、蛍光検出処理と、該蛍光検出処理に先行して実施される事前処理と、を実施し、蛍光検出処理では、照射光学系１０が、試料５００を照射対象として、試料５００に励起光を照射し、検出光学系２０が、励起光が照射された試料５００から生じる蛍光、及び、励起光が照射された試料５００からの散乱光を含む測定対象光を検出光として検出し、キャンセル回路６０が、測定対象光に応じた測定信号から、事前処理におけるキャリブレーション処理における散乱光に応じた信号成分を除去し、事前処理では、キャンセル回路６０が、検出光学系２０において検出される照射光又は照射光の散乱光に係る信号であって、測定信号における散乱光に対応する信号よりも信号量が大きい、キャリブレーション信号に基づき、測定信号から散乱光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理を実施する。

　このように、光学測定装置１では、蛍光検出処理と、該蛍光検出処理に先行して実施される事前処理とが実施される。蛍光検出処理では、事前処理におけるキャリブレーション処理の実施結果に基づき測定対象光に応じた測定信号から散乱光に応じた信号成分が除去されている。そして、事前処理では、上述した測定信号における散乱光に対応する信号よりも信号量が大きい、照射光又は散乱光に係る信号がキャリブレーション信号とされたキャリブレーション処理が実施されている。上述したように、キャリブレーション処理におけるキャリブレーション誤差は一定値であり、キャリブレーション誤差は「キャリブレーション信号の振幅」と「キャリブレーション信号及びスイッチ信号の位相のずれ」とが掛け合わされて導出される。このため、本実施形態に係る光学測定装置１のように、キャリブレーション信号の信号量（振幅）が大きくされる（測定信号における散乱光に対応する信号よりも大きくされる）ことにより、キャリブレーション信号及びスイッチ信号の位相のずれの影響を小さくすることができる。このことによって、キャリブレーション処理においてキャリブレーション信号（散乱光に応じた信号）を用いて装置の出力である電圧値をより０に近づけることができ、蛍光検出処理において、測定信号から散乱光に応じた信号成分を適切に除去することが可能になる。このことで、蛍光検出の精度をより向上させることができる。

　第１の態様では、事前処理において、照射光学系１０の光源１１が、照射対象に照射光を照射し、検出光学系２０の光検出素子２１が、照射光が照射された照射対象からの照射光の散乱光を含む光であって、蛍光検出処理において検出される測定対象光に含まれる散乱光よりも光量が大きいキャリブレーション処理用光を検出光として検出し、キャンセル回路６０が、キャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号に基づきキャリブレーション処理を実施している。このような構成によれば、蛍光検出に用いる光学系を利用して、キャリブレーション処理用光を検出し、容易且つ適切にキャリブレーション信号を生成することができる。すなわち、既存の装置構成を利用して、シンプルな構成で適切にキャリブレーション信号を生成することができる。

　また、第１の態様では、事前処理において、照射光学系１０の光源１１が、測定対象物である試料５００を照射対象として照射光を照射している。例えば試料５００において蛍光が発生しにくい部分に照射光を照射することによって、試料５００を照射対象とすることによっても、散乱光を主に含む（蛍光を多く含まない）キャリブレーション処理用光を検出することができる。このような構成によれば、既存の装置構成を利用して、単純な構成で適切にキャリブレーション信号を容易に生成することができる。

　照射光学系１０の光源１１は、蛍光検出処理時よりも、事前処理時における、照射する照射光の光量を大きくしている。このような構成によれば、キャリブレーション処理用光の光量を容易且つ適切に大きく（測定対象光に含まれる散乱光よりも大きく）することができる。このことで、適切にキャリブレーション信号の信号量を大きくし、蛍光検出の精度をより向上させることができる。

［第２の態様］
　次に、第２の態様の蛍光測定について説明する。第２の態様では、事前処理において、照射光学系１０の光源１１が、試料５００とは異なるキャリブレーション処理用のリファレンス部材を照射対象として、該リファレンス部材に照射光を照射することにより、キャリブレーション信号の振幅を大きくしている。以下、リファレンス部材の具体的な構成例について説明する。

　図１８は、リファレンス部材としてミラー６００Ａを用いる場合の散乱光取得について説明する図である。図１８に示されるように、リファレンス部材はミラー６００Ａを含んでいてもよい。ミラー６００Ａは、照射光を反射することができるミラーであればどのようなミラーであってもよいが、より好ましくはミラー６００Ａが照射光の照射により蛍光を発生しない（ミラー６００Ａに起因する蛍光が発生しない、或いは、無視できる程度にしか蛍光を発生しない）材料から形成されるとより好ましい。ミラー６００Ａは、例えば表面が汚れにくいミラーであってもよい。ミラー６００Ａは、光源１１から照射された照射光を反射する。ミラー６００Ａは、反射した照射光（散乱光）が光検出素子２１に検出されるように、傾斜角度が調整されている。ミラー６００Ａは、調整機構（不図示）によって所定の傾斜角度に固定されている。光検出素子２１に対するミラー６００Ａの傾斜角度が適切に調整されることにより、光検出素子２１において検出される光量を大きくすることができる。

　図１９は、リファレンス部材として反射拡散体６００Ｂを用いる場合の散乱光取得について説明する図である。図１９に示されるように、リファレンス部材は反射拡散体６００Ｂを含んでいてもよい。反射拡散体６００Ｂは、例えば、それ自身が照射光の照射により蛍光を発生しない（反射拡散体６００Ｂに起因する蛍光が発生しない、或いは、無視できる程度にしか蛍光を発生しない）材料から形成された部材であって、光検出素子２１への入射光量が比較的安定する白色部材からなる反射拡散板である。反射拡散体６００Ｂは、光源１１から照射された照射光を様々な角度に拡散するように反射する。反射拡散体６００Ｂは、反射した照射光（散乱光）が大きな光量で光検出素子２１に検出される位置に配置されている。反射拡散体６００Ｂは、例えば樹脂やセラミックからなる一体成型部材であるのが好ましいが、切削加工や複数部材の組み合わせ等により形成されていてもよく、例えば板状部材の表面に照射光を特定角度に散乱可能なフィルム等を設けることによって構成されていてもよい。

　図２０は、リファレンス部材としてミラー６１１（反射基材）とすりガラス６１０（拡散体）とを用いる場合の散乱光取得について説明する図である。図２０に示されるように、リファレンス部材は照射光を透過するガラス部材であるすりガラス６１０及び照射光を反射するミラー６１１を含むリファレンス部材６００Ｃを含んでいてもよい。リファレンス部材６００Ｃにおいて、すりガラス６１０は、ミラー６１１に支持（積層）されるように設けられ、ミラー６１１よりも先に照射光が入射するように設けられている。すりガラス６１０は、例えば３８０ｎｍ以上の照射光を透過する材料で形成されており、表面（照射光の入射面）に凸凹状の凸凹部６１０ａが形成されている。または、すりガラス６１０の表面に照射光を特定角度に散乱可能なフィルム等を設けてもよい。ミラー６１１は、照射光を反射するものであればよく、例えばアルミ等からなる板状金属部材や、アルミ等の金属膜でその表面を被覆した板状部材であり、すりガラス６１０を収容するように箱状の部材としてもよい。また、ミラー６１１及びすりガラス６１０は、ともに照射光の照射により蛍光を発生しない（ミラー６１１及びすりガラス６１０に起因する蛍光が発生しない、或いは、無視できる程度にしか蛍光を発生しない）材料から形成されるとより好ましい。図２０に示されるように、リファレンス部材６００Ｃでは、すりガラス６１０に入射した照射光が凸凹部６１０ａにおいて拡散しながらすりガラス６１０の内部を透過してミラー６１１に到達し、ミラー６１１において反射され、再度すりガラス６１０の内部を透過してすりガラス６１０の表面に到達し、その凸凹部６１０ａにおいて様々な方向に拡散して出射される（様々な角度の散乱光が生じる）。様々な角度の散乱光が生じることによって、十分な光量の散乱光が光検出素子２１において検出されることになる。なお、リファレンス部材６００Ｃにおいては、表面が粗面化された反射材を用いてもよく、その場合、反射材の表面の粗面部が照射光を拡散する拡散体に相当する。

　次に、第２の態様に係る作用効果について説明する。

　第２の態様では、事前処理において、照射光学系１０の光源１１が、試料５００とは異なるキャリブレーション処理用のリファレンス部材（ミラー６００Ａ、反射拡散体６００Ｂ、又はリファレンス部材６００Ｃ）を照射対象として、該リファレンス部材に照射光を照射する。試料５００とは異なるリファレンス部材に照射光が照射されることにより、より適切なキャリブレーション処理用光を検出することができる。これにより、キャリブレーション処理の実施結果に基づき、蛍光検出処理において測定信号から散乱光に応じた信号成分をより適切に除去することができる。

　リファレンス部材６００は、図１８～図２０に示されるように照射光を反射する反射部材（ミラー６００Ａ、ミラー６１１、反射拡散体６００Ｂ）を含んでいてもよい。このような構成によれば、検出光の光量を容易に大きくすることができる。さらに、反射部材は、照射光の照射により蛍光を発生しないのが好ましい。このような構成によれば、照射光の照射によっても、反射部材に起因する蛍光が発生しない（或いは、無視できる程度にしか蛍光を発生しない）ため、蛍光検出処理において、測定信号から散乱光成分に応じた信号成分のみを確実に除去することができる。

　リファレンス部材６００は、図１９に示されるように、照射光を拡散する反射拡散体６００Ｂを含んでいてもよい。このような構成によれば、反射拡散体６００Ｂによって様々な角度の散乱光を容易に生じさせることができ、検出光の光量をより容易に大きくすることができる。また、このような構成では、リファレンス部材を単純な構成とすることができるため、加工性やコストの点で優位である。

　リファレンス部材６００は、図２０に示されるように、照射光を反射するミラー６１１と、ミラー６１１に支持され、照射光を拡散するすりガラス６１０を含んでいてもよい。このような構成によれば、ミラー６１１とすりガラス６１０との協働によって、検出光の光量をより容易に大きくすることができる。また、すりガラス６１０の表面には凸凹部６１０ａが形成されているので、様々な角度の散乱光を容易に生じさせることができ、検出光の光量をより容易に大きくすることができる。

　リファレンス部材６００は、図１８に示されるように、ミラーを含んでいてもよい。このような構成によれば、光検出素子２１に対するミラーの反射角度を調整することにより、検出光の光量をより容易に大きくすることができる。

［第３の態様］
　次に、第３の態様の蛍光測定について説明する。第３の態様では、光学系の配置によって事前処理において検出される散乱光（キャリブレーション処理用光）の光量を大きくすることにより、キャリブレーション信号の振幅を大きくしている。

　図２１は、第３の態様における蛍光測定の概要を説明する図である。第３の態様では、試料５００から光検出素子２１までの光路に配置可能な蛍光フィルタ９００（光学部材）が設けられている。蛍光フィルタ９００は、光学的には、例えば図１に示される蛍光フィルタ２２と同様の機能を有するものであり、蛍光以外の光が光検出素子２１に到達することを抑制するために設けられる波長選択フィルタである。蛍光フィルタ９００は、光検出素子２１への光路上の位置である第１位置（図２１（ｂ）参照）及び光路から外れた位置である第２位置（図２１（ａ）参照）間を移動可能に構成されている。

　図２１（ａ）は事前処理時の蛍光フィルタ９００の状態を示しており、図２１（ｂ）は蛍光検出処理時の蛍光フィルタ９００の状態を示している。図２１（ａ）に示されるように、事前処理時においては、蛍光フィルタ９００が上述した第２位置に退避している。この状態においては、試料５００からの散乱光は蛍光フィルタ９００の影響を受けずに光検出素子２１に到達する。一方で、図２１（ｂ）に示されるように、蛍光検出処理時においては、蛍光フィルタ９００が上述した第１位置に配置されている。この状態においては、蛍光以外の光である試料５００からの散乱光は蛍光フィルタ９００の影響によって、光検出素子２１には少量しか到達しない。このように、事前処理時と蛍光検出時とで蛍光フィルタ９００の配置を変更することにより、蛍光検出時と比較して事前処理時において光検出素子２１で検出される散乱光（キャリブレーション処理用光）の光量を大きくし、キャリブレーション信号の振幅を適切に大きくすることができる。

　次に、第３の態様に係る作用効果について説明する。

　第３の態様では、光学測定装置１が、蛍光フィルタ９００を備えている。蛍光フィルタ９００は、通常の蛍光検出時においては光検出素子２１への光路上の位置である第１位置に配置されて、蛍光以外の光（散乱光等）が光検出素子２１に到達することを抑制している。蛍光フィルタ９００は、移動可能に構成されており、事前処理時においては光検出素子２１への光路から退避させられ、光路から外れた位置である第２位置に配置される。これにより、事前処理時においては、散乱光が蛍光フィルタ９００の影響を受けずに光検出素子２１に到達し易くなる。このような構成によれば、簡易な構成で、光検出素子２１によって検出されるキャリブレーション処理用光の光量を適切に大きく（測定対象光に含まれる散乱光よりも大きく）することができる。このことで、適切にキャリブレーション信号の信号量を大きくし、蛍光検出の精度をより向上させることができる。

　なお、キャリブレーション処理用光の光量を大きくするための光学部材は、上記蛍光フィルタ９００に限定されない。例えば、光学部材は、照射光の検出効率が上昇する光学部材であってもよい。この場合には、当該光学部材は、事前処理において光検出素子２１までの光路に配置され、蛍光検出処理において当該光路から退避した位置に配置される。

［第４の態様］
　次に、第４の態様の蛍光測定について説明する。第４の態様では、事前処理において照射光をキャリブレーション処理用光として直接検出することにより、キャリブレーション信号の振幅を大きくしている。すなわち、第４の態様では、事前処理において、照射光学系１０の光源１１が光検出素子２１を照射対象として、光検出素子２１に照射光を照射し、光検出素子２１が、照射光をキャリブレーション処理用光として直接検出する（試料５００等を介さずに直接検出する）。

　図２２は、第４の態様における蛍光測定の概要を説明する図であり、光路切り替えによる照射光取得について説明する図である。図２２に示される例では、照射光学系１０の光源１１から光検出素子２１に至る光路９５０が形成されており、該光路９５０に配置可能にシャッター９３０が設けられている。このような構成では、事前処理時においては、図２２に示されるように、シャッター９３０が光路９５０から退避した位置に配置される。この状態においては、光源１１から出射された照射光は、シャッター９３０の影響を受けずに光検出素子２１に至る。一方で、蛍光検出処理時においては、シャッター９３０が光路９５０上に移動する。この状態においては、光源１１から出射された励起光（照射光）は、試料５００方向にのみ照射されることになる。このように、シャッター９３０が用いられることによって、事前処理においてのみ、照射光（キャリブレーション処理用光）が光検出素子２１に直接検出される。そして、信号処理部であるキャンセル回路６０が、キャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号に基づきキャリブレーション処理を実施する。照射光は散乱光と同じ位相を持つ光である。このため、照射光をキャリブレーション処理用光として検出することによっても、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理を適切に行うことができる。なお、蛍光検出処理時においても、試料５００からの散乱光（励起光と同じ位相の光）が光検出素子２１において検出されるが、光源１１から直接照射光が照射される場合（事前処理の場合）と比較すると、光量は少なくなる。すなわち、図２２に示される構成によれば、事前処理において照射光をキャリブレーション処理用光として直接検出することにより、キャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号の振幅を大きくすることができる。

　図２３は、第４の態様における蛍光測定の概要を説明する図であり、光検出素子２１（検出光学系２０）とは別の検出光学系７２０を用いた照射光取得を説明する図である。図２３に示される態様の照射光取得では、照射光学系１０の光源１１が光検出素子２１とは別の検出光学系７２０の光検出素子７２１に照射光を照射する。これにより、光検出素子７２１が、照射光であるキャリブレーション処理用光を直接検出する。このような構成では、事前処理における照射光取得のために検出光学系７２０が設けられ、蛍光検出処理における蛍光取得のために検出光学系２０が設けられている。このような構成においても、図２２の構成の同様に、事前処理において照射光をキャリブレーション処理用光として直接検出することにより、キャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号の振幅を大きくすることができる。

　図２４は、第４の態様における蛍光測定の概要を説明する図であり、照射光学系１０とは別の照射光学系９１０を用いた照射光取得を説明する図である。図２４に示され態様の照射光取得では、照射光学系１０の光源１１とは別の照射光学系９１０の光源９１１が、検出光学系２０の光検出素子２１に照射光を照射する。これにより、光検出素子２１が、照射光であるキャリブレーション処理用光を直接検出する。このような構成では、事前処理における照射光取得のために照射光学系９１０が設けられ、蛍光検出処理における蛍光取得のために照射光学系１０が設けられている。このような構成においても、図２２及び図２３の構成の同様に、事前処理において照射光をキャリブレーション処理用光として直接検出することにより、キャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号の振幅を大きくすることができる。

　次に、第４の態様の作用効果について説明する。

　第４の態様では、事前処理において、照射光学系１０の光源１１が、検出光学系２０の光検出素子２１を照射対象として、光検出素子２１に照射光を照射し、光検出素子２１が、照射光であって蛍光検出処理において検出される測定対象光に含まれる散乱光よりも光量が大きいキャリブレーション処理用光を検出光として検出し、キャンセル回路６０が、キャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号に基づきキャリブレーション処理を実施する。このように、事前処理において照射光が直接光検出素子２１に検出されることにより、蛍光検出時のように散乱光を検出する場合と比較して、容易且つ適切にキャリブレーション処理用光の光量を大きくすることができる。このことで、適切にキャリブレーション信号の信号量を大きくし、蛍光検出の精度をより向上させることができる。

［第５の態様］
　次に、第５の態様の蛍光測定について説明する。第５の態様では、事前処理において、キャリブレーション処理用光を検出することなく、疑似信号（キャリブレーション信号）を生成することにより、キャリブレーション信号の振幅を大きくしている。

　図２５は、第５の態様の光学測定装置８０１の概略構成図である。第５の態様の光学測定装置８０１は、上述した光学測定装置１（図１参照）と概ね同様の構成であるが、図２５に示されるように、遅延・増幅回路８０２を備えている点において光学測定装置１と異なっている。遅延・増幅回路８０２は、キャンセル回路６０と共に信号処理部として機能する構成である。ここで、上述したように、光源駆動回路３０は、タイミング生成器７０から入力された基準となる周波数信号に基づいて光源１１の変調周波数を設定している。遅延・増幅回路８０２は、タイミング生成器７０から入力される周波数信号に基づいて、光源駆動回路３０から光源１１に設定される変調周波数の信号（変調信号）の位相を変化させた疑似信号（キャリブレーション信号）を生成する。

　具体的には、遅延・増幅回路８０２は、照射光学系１０の光源１１から照射された照射光の散乱光が検出光として検出光学系２０に検出されるまでに相当する遅延を考慮して、上述した変調信号の位相を変化させた疑似信号（キャリブレーション信号）を生成する。このように、疑似信号は、キャリブレーション処理において、検出光学系２０に検出される散乱光（照射光）を模擬した信号である。更に、遅延・増幅回路８０２は、照射光学系１０の光源１１から照射された照射光の散乱光が検出光として検出光学系２０に検出される場合の振幅に基づいて疑似信号（キャリブレーション信号）の振幅を設定する。遅延・増幅回路８０２は、疑似信号（キャリブレーション信号）の振幅が、少なくとも、蛍光検出処理の測定信号における散乱光に対応する信号の振幅よりも大きくなるように、疑似信号の振幅（信号量）を設定する。このように、遅延・増幅回路８０２は、光源１１に設定される変調信号の位相及び振幅を加工した疑似信号を生成することにより、キャリブレーション処理用光を検出することなく（キャリブレーション処理のために光の照射及び検出を行うことなく）、キャリブレーション信号を得る。遅延・増幅回路８０２は、詳細には、位相を変化させるための遅延回路及び振幅を変化させるための増幅回路を有している。

　次に、第５の態様の作用効果について説明する。

　第５の態様では、事前処理において、キャンセル回路６０が、照射光学系１０から照射された照射光の散乱光が検出光として検出光学系２０に検出されるまでに相当する遅延に応じて変調信号の位相を変化させてキャリブレーション信号を生成している。このように、照射光に係る変調信号について照射光学系１０を考慮した遅延に応じたキャリブレーション信号が生成されることにより、キャリブレーション処理用光を検出することなく、実際に散乱光をキャリブレーション処理用光として検出した場合と同様のキャリブレーション信号（散乱光と同様の位相を持つキャリブレーション信号）を得ることができる。また、キャリブレーション信号を生成するため、キャリブレーション信号の信号量をより適切且つ容易に大きくすることができる。このことで、蛍光検出の精度をより向上させることができる。

　最後に、図２６を参照して、第１の態様～第５の態様で説明した蛍光測定処理を説明する。図２６は、蛍光測定処理を示すフローチャートである。

　図２６に示されるように、蛍光測定処理では、最初にキャリブレーション処理が実施される（ステップＳ５１）。具体的には、検出光学系２０において検出される照射光又は散乱光に係る信号であって、蛍光検出処理における散乱光に対応する信号よりも信号量が大きい、キャリブレーション信号に基づいて、蛍光検出処理において測定信号から散乱光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理が実施される。キャリブレーション処理の詳細については、図１０～図１３等を参照して上述したとおりであるので、説明を省略する。

　つづいて、試料５００の測定領域上を照射光学系１０の光学ヘッドがスキャンするように動作して試料５００の測定対象部５０４に励起光（照射光）が照射されることにより（ステップＳ５２）、励起光が照射された試料５００から生じる蛍光及び励起光が照射された試料５００からの励起光の散乱光を含む測定対象光が光検出素子２１において検出される（ステップＳ５３）。そして、キャンセル回路６０において、ステップＳ５１のキャリブレーション処理の実施結果が考慮されて、上述した測定対象光に応じた測定信号から散乱光に応じた信号成分が除去される（ステップＳ５４）。具体的には、上述したように、キャンセル回路６０は、測定信号とキャリブレーション処理において位相が調整されたスイッチ信号とを入力として、測定信号から散乱光に応じた信号成分を除去する。

　１，１Ａ，８０１…光学測定装置、１０，９１０…照射光学系、２０，７２０…検出光学系、６０…キャンセル回路、６００Ａ…ミラー、６００Ｂ…反射拡散体、６１０…すりガラス、６１１…ミラー、８０２…遅延・増幅回路、９００…蛍光フィルタ。

Claims

　測定対象物の光学特性を測定する光学測定装置であって、
　照射対象に照射光を照射する照射光学系と、
　前記照射光に起因する検出光を検出する光検出部と、
　信号処理部と、を備え、
　蛍光検出処理と、該蛍光検出処理に先行して実施される事前処理と、を実施し、
　前記蛍光検出処理では、
　　前記照射光学系が、前記測定対象物を前記照射対象として、前記測定対象物に前記照射光を照射し、
　　前記光検出部が、前記照射光が照射された前記測定対象物から生じる蛍光、及び、前記照射光が照射された前記測定対象物からの散乱光を含む測定対象光を前記検出光として検出し、
　　前記信号処理部が、前記測定対象光に応じた測定信号から、前記事前処理におけるキャリブレーション処理における前記散乱光に応じた信号成分を除去し、
　前記事前処理では、
　　前記信号処理部が、前記光検出部において検出される前記照射光又は前記照射光の散乱光に係る信号であって、前記測定信号における前記散乱光に対応する信号よりも信号量が大きい、キャリブレーション信号に基づき、前記測定信号から前記散乱光に応じた信号成分を除去するための前記キャリブレーション処理を実施する、光学測定装置。
　前記事前処理では、
　　前記照射光学系が、前記照射対象に前記照射光を照射し、
　　前記光検出部が、前記照射光が照射された前記照射対象からの前記照射光の散乱光を含む光であって、前記蛍光検出処理において検出される前記測定対象光に含まれる前記散乱光よりも光量が大きいキャリブレーション処理用光を前記検出光として検出し、
　　前記信号処理部が、前記キャリブレーション処理用光に応じた前記キャリブレーション信号に基づき前記キャリブレーション処理を実施する、請求項１記載の光学測定装置。
　前記事前処理では、
　　前記照射光学系が、前記測定対象物を前記照射対象として、前記測定対象物に前記照射光を照射する、請求項２記載の光学測定装置。
　前記事前処理では、
　　前記照射光学系が、前記測定対象物とは異なるキャリブレーション処理用のリファレンス部材を前記照射対象として、前記リファレンス部材に前記照射光を照射する、請求項２記載の光学測定装置。
　前記リファレンス部材は、前記照射光を反射する反射部材を含む、請求項４記載の光学測定装置。
　前記反射部材は、前記照射光の照射により蛍光を発生しない、請求項５記載の光学測定装置。
　前記反射部材は、前記照射光を拡散する反射拡散体を含んでいる、請求項５又は６記載の光学測定装置。
　前記反射部材は、
　前記照射光を反射する反射基材と、
　前記反射基材に支持され、前記照射光を拡散する拡散体と、を含んでいる、請求項５又は６記載の光学測定装置。
　前記反射部材は、ミラーを含んでいる、請求項５又は６記載の光学測定装置。
　前記光検出部への光路上の位置である第１位置及び前記光路から外れた位置である第２位置間を移動可能に構成されており、光の入射効率を上げる又は下げる機能を有する光学部材を更に備える、請求項２～９のいずれか一項記載の光学測定装置。
　前記事前処理では、
　　前記照射光学系が、前記光検出部を前記照射対象として、前記光検出部に前記照射光を照射し、
　　前記光検出部が、前記照射光であって前記蛍光検出処理において検出される前記測定対象光に含まれる前記散乱光よりも光量が大きいキャリブレーション処理用光を前記検出光として検出し、
　　前記信号処理部が、前記キャリブレーション処理用光に応じた前記キャリブレーション信号に基づき前記キャリブレーション処理を実施する、請求項１記載の光学測定装置。
　前記照射光学系は、前記蛍光検出処理時よりも、前記事前処理時における、照射する前記照射光の光量を大きくする、請求項２～９のいずれか一項記載の光学測定装置。
　前記照射光学系は、変調信号に応じた照射光を照射し、
　前記事前処理では、
　　前記信号処理部が、前記照射光学系から照射された前記照射光の散乱光が前記検出光として前記光検出部に検出されるまでに相当する遅延に応じて前記変調信号の位相を変化させて前記キャリブレーション信号を生成する、請求項１記載の光学測定装置。
　測定対象物の光学特性を測定する光学測定方法であって、
　キャリブレーション処理を実施する工程と、
　測定対象物に照射光を照射する工程と、
　前記照射光が照射された前記測定対象物から生じる蛍光、及び、前記照射光が照射された前記測定対象物からの散乱光を含む測定対象光を検出する工程と、
　前記測定対象光に応じた測定信号から、前記キャリブレーション処理における前記散乱光に応じた信号成分を除去する工程と、を含み、
　前記キャリブレーション処理を実施する工程では、
　　検出される前記照射光又は前記照射光の散乱光に係る信号であって、前記測定信号における前記散乱光に対応する信号よりも信号量が大きい、キャリブレーション信号に基づき、前記測定信号から前記散乱光に応じた信号成分を除去するための前記キャリブレーション処理を実施する、光学測定方法。