JP2018189946A - システム、試料インターフェース及び試料の像を形成する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】蛍光顕微鏡法において試料による散乱から生じる問題を抑制する。【解決手段】システム１０Ａは、空間変調されたイメージング場１００ａを提供する構造化照明ステージ１１０Ａを含む。システムは、空間変調されたイメージング場の周波数を調整する空間周波数変調ステージ１２０Ａ、空間変調されたイメージング場１００ｂを試料１３５に導く試料インターフェースステージ１３０、及び試料からの複数の蛍光放射信号１００ｃを受光するように構成されるセンサー１５０を含む。システムは、また、試料散乱信号を減らし、空間変調されたイメージング場を含む試料の一部からの蛍光放射信号を提供するように構成されるプロセッサー３０を含む。システムを用い試料の像を形成する方法も提供される。【選択図】図１

Description

本発明は、システム、試料インターフェース及び試料の像を形成する方法に関する。

ここで開示される実施の形態は、顕微鏡法による組織のイメージングの分野に一般的に関連する。より具体的には、ここで開示される実施の形態は、組織の高分解能の蛍光イメージングに関連する。

蛍光顕微鏡法を用いる深部組織のイメージングは、高密度の組織により誘起される強い散乱から生じる問題をもたらす。それは、典型的には蛍光信号をあいまいにする。共焦点蛍光技術は、イメージング信号における散乱の干渉を減らすことに成功してきたが、信号強度を犠牲にしており、そのために、限定された収集時間の間に得ることができる画質を制限している。散乱の干渉の影響に加えて、顕微鏡法によるアプローチは、高倍率システムにおいて典型的に用いられる大きい開口数（ＮＡ）の結果として生じる実視野（ＦＯＶ）の縮小を克服しなければならない。それは、対物レンズの焦点面において像の端に大きな収差を引き起こす。横収差は、空間分解能の低下を引き起こす。それは、典型的には、移動する部品を含み像の収集時間を増やす、組み込まれる走査機構により相殺される。

背景技術の欄において提供される説明は、先行技術であると考えられるべきではない。それは、背景技術の欄において言及されているか、又は背景技術に関連づけられているにすぎないためである。背景技術の欄は、主題となる技術の１個以上の局面を表した情報を含みうる。

非特許文献１は、光シート顕微鏡に関するものである。

グレイサー(Glaser)、他１名、「高速な体積イメージングのための光シート顕微鏡法システム、及び大きな組織試料の病理学(A light sheet microscopy system for rapid, volumetric imaging and pathology of large tissue specimens)」、バイオロジカルオプティックス２０１６，ＯＳＡテクニカルダイジェスト（オンライン）(Biomedical Optics 2016, OSA Technical Digest (online))、（米国）、米国光学会（Optical Society of America）、論文ＣＴｈ１Ａ．４．(paper CTh1A.4.)

以下で説明する発明は、上記の問題を解決することを目的とする。以下で説明する発明が解決しようとする課題は、蛍光顕微鏡法において試料による散乱から生じる問題を抑制することである。

第１の形態においては、システムは、空間変調されたイメージング場を提供する構造化照明ステージ、空間変調されたイメージング場の周波数を調整する空間周波数変調ステージ、及び空間変調されたイメージング場を試料に導く試料インターフェースステージを含む。さらに、システムは、試料からの複数の蛍光放射信号を受光するように構成されるセンサー、及び試料散乱信号を減らし、空間変調されたイメージング場を含む試料の一部からの蛍光放射信号を提供するように構成されるプロセッサーを含む。

第２の形態においては、システムは、２個の光線を空間的に分離するように構成される第１の光学要素、及び２個の光線を空間的に結合するように構成される第２の光学要素を含む。第２の光学要素は、フォーカス要素、並びに２個の光線のうちの第１及び第２をフォーカス要素の第１及び第２の点に導くように構成される、直線的に動くことができる反射器をさらに含む。フォーカス要素の第１及び第２の点は、フォーカス要素の対称軸について互いに軸対称に配置される。

第３の形態においては、倒立蛍光顕微鏡法のための試料インターフェースは、平坦側を形成する平面を有し当該平坦側を形成する平面の向こう側に曲率中心を持つ波面整合レンズ、及び波面整合レンズの平坦側に隣接して配置される試料カバーガラスを含む。

試料インターフェースは、また、波面整合レンズを通して２個の光線を導くことにより試料上に照明場を形成するように構成される照明対物レンズ、及び入射面と垂直をなす方向に沿って照明場により試料において励起された蛍光信号を収集するように構成される顕微鏡対物レンズも含む。２個の光線は、試料カバーガラスに対する入射角で入射面を形成する。システムは、入射角が約６０°及び約３０°のうちの１個である点、照明対物レンズの光軸が波面整合レンズの曲率中心で顕微鏡対物レンズの光軸と交差する点、及び照明場が空間周波数を有する構造化された照明場を入射面上に含む点でさらに特徴づけられる。

さらに別の形態においては、試料の像を形成する方法は、空間変調されたイメージング場を提供すること、及び空間変調されたイメージング場の周波数を調整することを含む。方法は、試料インターフェースで空間変調されたイメージング場を試料に導くこと、及び試料からの蛍光放射信号を受光すること、及び複数の蛍光放射信号を結合して試料散乱信号を減らし試料の像を得ることをさらに含む。

本発明によれば、蛍光顕微鏡法において試料による散乱から生じる問題を抑制することができる。

いくつかの実施の形態に係る、構造化照明（ＳＩ）で試料を照明し試料からの像を収集するシステムを図示する図である。 いくつかの実施の形態に係る、ＳＩシステムを含む、倒立光シート顕微鏡法のためのシステムを図示する図である。 いくつかの実施の形態に係る、ＳＩシステムのための、空間位相を調整する光学配置を図示する図である。 いくつかの実施の形態に係る、ＳＩシステム中の空間周波数を調整する光学配置を図示する図である。 いくつかの実施の形態に係る、ＳＩシステム中の試料インターフェースの配置を図示する図である。 いくつかの実施の形態に係る、倒立光シート顕微鏡法のためのシステム中の試料インターフェースを図示する斜視図である。 いくつかの実施の形態に係る、ＳＩシステムのための試料インターフェースの配置を図示する断面図である。 いくつかの実施の形態に係る、ＳＩシステムのための試料インターフェースの配置におけるスポットダイアグラムを図示する図である。 いくつかの実施の形態に係る、ＳＩシステムにおける２次元（２Ｄ）断面の再構築を図示する図である。 いくつかの実施の形態に係る、ＳＩシステムにおける強い蛍光バックグラウンドの効果的な除去を含む試料像を図示する図である。 いくつかの実施の形態に係る、組織試料のための、ＳＩシステムにおける強い蛍光バックグラウンドの除去を図示する図である。 いくつかの実施の形態に係る、試料の像を形成する方法のためのフローチャート中のステップを図示する図である。

本開示は、米国仮特許出願第６２／５００３５９号、及び米国特許出願第１５／８４３６９２号に関連する。その内容の全体は、参照されて本開示に組み込まれる。

下記の詳細な説明は、様々な実装の説明を意図し、主題となる技術が実施されうる唯一の実装を表現することを意図しない。当業者が実現するであろうように、説明された実装が、いずれも本開示の範囲から外れることなく、様々な異なる方法により修正されてもよい。したがって、図面及び説明は、当然に例示であって限定的ではないとみなされるべきである。添付された図面は、さらなる理解を提供するために含められ、組み込まれ、本明細書の一部を構成する。添付された図面は、開示された実施の形態を図示し、説明とともに、開示された実施の形態の原理を説明するために役立てられる。

図においては、同じ又は似た参照符号により示される要素及びステップが、そうでないことが示されないかぎり、同じ又は似た要素及びステップに関連づけられる。１個以上の実装においては、各図に描かれた要素の全部が要求されなくてもよく、１個以上の実装は、図に描かれない追加の要素を含んでもよい。主題となる開示から離れることなく要素の配置及びタイプにおける変形がなされてもよい。主題となる開示の範囲内において追加の要素、異なる要素、及びより少ない要素が利用されてもよい。

（概略）
ここで開示される実施の形態は、厚い試料のイメージングのための、構造化照明を用いる倒立光シート蛍光顕微鏡を含む。波面整合レンズは、組織インターフェースに組み込まれる。これにより、分解能を犠牲にすることなく、使用しうる倒立配置が可能になる。高速１次元（１Ｄ）空間光変調器を用いる構造化照明の生成により、パターン化された像を高速に取得すること、並びにアウトフォーカス信号及び散乱信号の両方を除去することが促進される。ここで開示される実施の形態により、動物組織試料中の蛍光ビーズを用いる像に対して分解能及びコントラストが向上することが証明される。

光シート蛍光顕微鏡法（ＬＳＦＭ）は、厚い試料中の光学的断面を高速に取得することができるという技術上の能力により、生命科学におけるイメージングを変えてきた。ＬＳＦＭにおける光学的切断においては、共焦点顕微鏡法のような他の光学的切断技術と比較して、より低いピーク強度が用いられる。これにより、光脱色が小さくなるという追加の利点が生じる。また、ＬＳＦＭの高速性、及び好適な光脱色性により、ＬＳＦＭは、体積再構築及びタイムラプスイメージングのための力強い道具になる。厚い試料においてイメージングを行うためには、ふたつの特徴が望まれる：試料は、透明であることが望まれ、ＬＳＦＭに固有のマウントされなければならないことに対して素性がよいことが望まれる。ここで開示される実施の形態は、これらの特徴を満足しうる。これにより、ここで開示される実施の形態は、ＬＳＦＭの多くの応用に利益を与えうる。共焦点顕微鏡法又は広視野顕微鏡法において試料がディッシュ又はマルチウェルプレートに制限される場合は、倒立配置が望まれることが多くなりうる。いくつかの実施の形態においては、試料ステージ上の空間を空け、ディッシュの底にある窓を直接的に通したイメージングを可能にするために、正立対物レンズが望まれうる。ここで開示されるいくつかの実施の形態と一致する顕微鏡システムにおいては、顕微鏡は、水平面の上に開かれてもよく、照明光線及びイメージング光線の交点を含んでもよい。いくつかの実施の形態においては、試料を支持する平坦ガラス窓が用いられてもよい。平坦ガラス窓は、ガラスボトムディッシュ又はマルチウェルプレートに置き換えられてもよい。

いくつかの実施の形態においては、イメージング配置を慎重に選ぶことにより、平坦ガラス窓ごしの傾いたイメージングによる収差及び分解能の低下が軽減されうる。例えば、いくつかの実施の形態においては、「ウオータープリズム」「シリンドリカルレンズ」及び「デフォーマブルミラー」を挿入することにより、小さな収差が得られうる。いくつかの実施の形態においては、単一の垂直な対物レンズを含めることにより、イメージング配置の光学的な複雑さが減少しうる。

図１は、いくつかの実施の形態に係る、空間変調されたイメージング場１００ｂで試料１３５を照明し、試料１３５からの像を収集するシステム１０Ａを図示する。構造化照明（ＳＩ）ステージ１１０Ａは、空間変調されたイメージング場１００ａを提供するように構成される。空間周波数変調ステージ１２０Ａは、空間変調されたイメージング場１００ａの周波数を調整し、調整された空間周波数を有する空間変調されたイメージング場１００ｂを形成する。システム１０Ａは、また、空間変調されたイメージング場１００ｂを試料１３５に導く試料インターフェースステージ１３０を含んでもよい。センサー１５０は、試料１３５からの複数の蛍光放射信号１００ｃを受光するように構成される。限定されないが、センサー１５０が、（例えば、ｓＣＭＯＳ等のＣＭＯＳカメラ、又はＣＣＤカメラにおけるもののように）検知画素の２Ｄ配列を含んでもよい。いくつかの実施の形態においては、センサー１５０が、最終像（例えば、３Ｄ像）を再構築するために用いられる、試料１３５の斜めの断面を撮影してもよい。

いくつかの実施の形態においては、空間周波数変調ステージ１２０Ａは、少数の回折素子（例えば、回折格子、回折プリズム等）を含む。この特徴は、複数の照明波長が望まれる実施の形態において特に望まれる。さらに、システム１０Ａのいくつかの実施の形態は、近赤外（ＮＩＲ）波長領域（例えば、約７５０ｎｍから約２５００ｎｍ）において動作するように構成されてもよい。なぜならば、ＮＩＲ波長領域は、組織試料からの光散乱が少ないスペクトル領域であるからである。したがって、ステージ１１０Ａ及び１２０Ａは、システムを再構築することを強いることなく、複数の照明波長に対してＮＩＲ領域において高速に動作するように構成されてもよい。

蛍光放射信号１００ｃは、空間変調されたイメージング場１００ｂにおいて光強度パターンにより生成される。プロセッサー３０は、空間変調されたイメージング場１００ｂを含む、試料１３５の一部からの、ノイズを含まない蛍光放射信号１００ｃを決定する。プロセッサー３０は、適切に選択された空間変調されたイメージング場から得られる１個以上の蛍光放射信号を結合することにより試料散乱信号を減らすように構成される。いくつかの実施の形態においては、プロセッサー３０は、メモリー４０に格納される試料像１５１を生成する。

図２は、いくつかの実施の形態に係る、構造化照明（ＳＩ）システムを含む、倒立光シート顕微鏡法のためのシステム１０Ｂを図示する。限定されないが、照明光線は、２個の波長６６０ｎｍ及び７８５ｎｍを含む単一の光線を含んでもよい。レンズ１１ａ及び１１ｂは、照明光線を拡張する。レンズ１１ｃは、２個の回折光線であって当該２個の回折光線の間に選択された位相シフトを有するものを空間的に分離して空間変調されたイメージング場を形成するように構成される空間光変調器（ＳＬＭ）２０を含むＳＩステージ１１０Ｂ（例えば、図１におけるＳＩステージ１１０Ａ）上の焦点に照明光線を集める。レンズ１１ｃは、アクロマティックシリンドリカルレンズであってもよい。本開示と一致する実施の形態のＳＬＭ２０は、空間的に構造化されたパターンを形成する装置である。空間的に構造化されたパターンは、光線と相互作用した場合に、空間的に構造化されたパターンから生じる特定の伝搬方向における干渉パターンに基づいて、所定の反射光線、屈折光線又は回折光線を形成する。いくつかの実施の形態においては、ＳＬＭ２０は、グレーティングライトバルブ（ＧＬＶ（登録商標））又は反射型液晶素子（ＬＣｏＳ）を含んでもよい。いくつかの実施の形態においては、ＳＬＭ２０は、限定されないが、処理速度を考慮した特別な光変調器として改造されたものであってもよい。ＳＬＭ２０の例は、以下でより詳細に論じられる。いくつかの実施の形態においては、ＳＩステージ１１０Ｂは、二重スリット（Ｓ）１０３に向かってレンズ１０１を通過する複数の回折次数を生成する。これにより、１次光線（例えば、＋１回折次及び−１回折次）が試料照明に進むことができる。空間周波数変調ステージ１２０Ｂ（例えば、図１における空間周波数変調ステージ１２０Ａ）においては、＋１次回折光線及び−１次回折光線が第１のプリズムｋ１により分離される。さらに、空間周波数変調ステージ１２０Ｂは、スリット（Ｓ）１０３において選択された回折光線の各々のサイズを小さくする又は調整するために、ミラー１２ｂ，１２ｃ，１２ｄ及び１２ｅを含んでもよい。回折光線は、第２のプリズムｋ２上にイメージングされてもよく、レンズ１１ｈ及び１１ｉを含むリレー光学系を通過してもよい。

いくつかの実施の形態においては、ＳＩステージ１１０Ｂは、コヒーレントであり互いの間に選択された位相遅延を有する２個の照明光線を生成するように構成される。ＳＬＭ２０は、到来する照明光線から、＋１回折次及び−１回折次に相当する２個の回折光線を生成し、さらに＋１次回折光線及び−１次回折光線の間に選択された位相シフトを適用するように構成される。いくつかの実施の形態においては、システム１０Ｂは、回折の０次が伝搬モードである場合は、回折の０次をブロックしてもよい。いくつかの実施の形態においては、回折の０次は、正反射又は面内変調を含んでもよい。システム１０は、それらを像の収集のために（例えば、参照光線又は校正光線として）用いてもよい。いくつかの実施の形態においては、二重スリット１０３は、ＳＬＭ２０からの＋１次回折光線及び−１次回折光線の光路を分離する。いくつかの実施の形態においては、ＳＬＭ２０は、数１００ｋＨｚでスイッチングすることができる可動リボンで到来する波面の位相を操作する１Ｄ空間変調器を含んでもよい。さらに、いくつかの実施の形態においては、ＳＬＭ２０は、複数の波長を同時に維持する。したがって、いくつかの実施の形態においては、各パターンが異なる照明波長で動作している状態で、構造化照明の配置において２個の異なるパターンをシフトすることが可能である。さらに、ＳＬＭ２０は、高い動作スピードを維持したまま、可動リボンに対して大きな変位（例えば、赤色及びＮＩＲスペクトルにおける長い波長のλ／４という、ＧＬＶリボンの各々の最大の要求される変位）を提供してもよい。いくつかの実施の形態においては、ＧＬＶは、２λ／３に略等しい量だけ各ＧＬＶリボンの変位を提供してもよい。各ＧＬＶリボンに提供される変位の程度は、用いられる光学要素の用途及び他の仕様に応じて変化してもよい。したがって、いくつかの実施の形態においては、青色及び緑色の光と比較された場合に、高密度の組織におけるより低い散乱の影響のために、より長い照明波長を用いることが望まれうる。

空間周波数変調ステージ１２０Ｂは、二重スリット１０３からの＋１次回折光線及び−１次回折光線の間の干渉パターンの空間周波数を調整するように構成される。ステージ１２０Ｂは、ナイフエッジプリズムｋ１及びｋ２を含んでもよい。ナイフエッジプリズムｋ１及びｋ２のうちの少なくとも１個は、軸に沿って動くことができてもよい（図２参照）。したがって、いくつかの実施の形態においては、軸に沿うプリズムｋ１又はｋ２のうちの１個の直線的な変位は、＋１次回折光線と−１次回折光線との間の干渉パターンの空間周波数を決定しうる。

システム１０Ｂは、また、＋１次回折光線及び−１次回折光線により形成された干渉パターンの一部を選択する視野絞り（ＦＳ）１７をステージ１２０Ｂの後に含んでもよい。いくつかの実施の形態においては、ＦＳ１７は、試料１３５中の関心領域の外側にある照明光線の位置からの望まれない散乱の影響を減らしてもよい。さらに、いくつかの実施の形態においては、ダブプリズム（ＤＰ）１５は、照明システムの光軸の周りに干渉パターンを回転して試料インターフェース（ＳＩ）１３０中の試料１３５上に照明場を届ける。いくつかの実施の形態においては、ＤＰ１５は、光線がミラー１２ｆに到達する前に干渉パターンを９０°回転する。ここで、ミラー１２ｆは、試料インターフェース１３０に向かってレンズ１１ｍと共役である。いくつかの実施の形態においては、ミラー１２ｆ−１２ｇ並びにレンズ１１ｊ，１１ｋ及び１１ｍにより形成される光学的な一連のものが、少なくとも１個又は２個又はそれ以上の開口絞り（ＡＳ）１９を含むが、試料インターフェース１３０に対する垂直から約６０°の角度に照明場を提供するように構成される。

試料インターフェース１３０は、試料１３５上においてイメージング場１００ｂにより形成される像を収集する検知対物レンズ（ＤＯ）１３３を含んでもよい。いくつかの実施の形態においては、像は、イメージング場１００ｂにより試料１３５上に誘起される蛍光信号により形成され、ＤＯ１３３により収集される。いくつかの実施の形態においては、試料インターフェース１３０は、チューブレンズ（ＴＬ）及びフィルターＦを、像をセンサー１５０に中継する前に含んでもよい。フィルターＦは、照明波長をブロック又は抑制し試料１３５からの蛍光放射光のセンサー１５０への通過を許すように構成されるバンドパスフィルター（６６０ｎｍ）又はロングパスフィルター（７８５ｎｍ）であってもよい。

いくつかの実施の形態においては、システム１０Ｂは、プロセッサー３０に通信可能に結合されたメモリー４０を含む。メモリー４０は、指示、命令及びデータを格納する、任意のタイプの非一時的なコンピューター読み取り可能な媒体を含んでもよい。プロセッサー３０は、メモリー４０に格納されている指示を実行するように構成されてもよい。指示は、プロセッサー３０により実行された場合に、光シート蛍光顕微鏡法（ＬＳＦＭ）による像の収集をシステム１０Ｂに実行させる。したがって、プロセッサー３０は、位相シフトステージ１１０Ｂ中のＳＬＭ２０、又は空間周波数変調ステージ１２０Ｂ中のナイフエッジプリズムｋ１及びｋ２のうちの少なくとも１個を制御するように構成されてもよい。プロセッサー３０は、また、試料インターフェース１３０を制御するように構成されてもよい。さらに、プロセッサー３０は、センサー１５０に像を収集させるように構成されてもよい。加えて、プロセッサー３０は、センサー１５０からの像を受信し像を処理してもよい。したがって、プロセッサー３０は、例えば、処理された像をメモリー４０に格納してもよい。プロセッサー３０は、電気回路により実装されてもよい。電気回路は、限定されないが、少なくとも１個のプロセッサー（例えば、中央演算処理装置（ＣＰＵ））のような少なくとも１個の半導体集積回路、少なくとも１個の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、及び／又は少なくとも１個のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）を含む。メモリー４０は、多くの形式をとり得る。多くの形式は、限定されないが、ハードディスクのような任意のタイプの磁気メディア、ＣＤ及びＤＶＤのような任意のタイプの光学メディア、揮発性メモリー及び不揮発性メモリーのような任意のタイプの半導体メモリーを含む。揮発性メモリーは、ＤＲＡＭ及びＳＲＡＭを含んでもよい。不揮発性メモリーは、ＲＯＭ及びＮＶＲＡＭを含んでもよい。半導体メモリーは、また、少なくとも１個のプロセッサーとともに電気回路の一部であることができる半導体回路である。ＡＳＩＣは、図２に示される要素の機能の全部又は一部を実行するようにカスタマイズされた集積回路（ＩＣ）である。ＦＰＧＡは、製造された後に図２に示される要素の機能の全部又は一部を実行するように構成されるように設計される集積回路である。

以降は、表記の単純化のために、レンズ１１ａから１１ｎを、まとめて「レンズ１１」と呼ぶ。同様に、ミラー１２ａから１２ｈを、まとめて「ミラー１２」と呼ぶ。いくつかの実施の形態においては、レンズ１１は、アロマティック球面レンズ、非球面レンズ、アナモフィックレンズ又はこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。ミラー１２は、平面ミラー、球面ミラー、凹面ミラー、凸面ミラー又はこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。さらに、いくつかの実施の形態においては、システム１０Ｂ中の動く要素のうちの少なくとも１個が、オペレーターにより手動で動かされてもよい。以降は、ＳＩシステム１０Ａ及び１０Ｂを、ＳＩシステム１０と呼ぶ。同様に、ＳＩステージ１１０Ａ及び１１０Ｂを、以降は、ＳＩステージ１１０と呼ぶ。さらに、空間周波数変調ステージ１２０Ａ及び１２０Ｂを、以降は、空間周波数変調ステージ１２０と呼ぶ。ＳＩシステム１０は、散乱されアウトフォーカスした蛍光の影響を減らして画質を実質的に向上するために、ＳＩステージ１１０及び空間周波数変調ステージ１２０を用いる。

図３は、いくつかの実施の形態に係る、ＳＩシステム１０Ｂのための、空間位相φを調整するように構成されるＳＩステージ１１０Ｂを図示する。３個のＳＬＭ画素の配置２０１ａ，２０１ｂ及び２０１ｃは、矩形波の位相状態２１１ａ，２１１ｂ及び２１１ｃにそれぞれ対応し（例えば、φ＝０，φ＝２π／３及びφ＝４π／３）、ＳＬＭ２０に割り当てられる。各状態に対して、これらの並びは、空間周波数変調ステージ１２０Ｂの配置により決定される固定された空間周波数、及びＳＬＭ２０の配置により決定される位相φを有する、正弦波の場のプロファイルを像面に生成する。いくつかの実施の形態においては、空間周波数の調整は、空間周波数変調ステージ１２０Ｂにおいて、光線分離に直接的に影響する第２のプリズムｋ２を平行移動することにより得られてもよい。いくつかの実施の形態においては、第２のプリズムｋ２の平行移動は、オペレーターにより手動で行われてもよい。位相φを変更するためには、各状態を定義する、ステージ１１０ＢのＳＬＭ２０中の３個の「オフ」画素、及び３個の「オン」画素の周期的テンプレートが、一の状態から次の状態へ単一の画素だけシフトされる（図３における位相変化を示す矢印を見よ）。「オン画素」は、最大の１次回折効率のための、「オフ画素」に対するλ／４の変位を持たされる。全体として、この配置は、位相０，２π／３及び４π／３を有する３個の周波数調整可能なＳＩ強度パターンを生成する。

図４は、いくつかの実施の形態に係る、空間周波数変調ステージ１２０Ｂを用いるＳＩシステム１０Ｂ中の、空間周波数を調整するように構成される空間周波数変調ステージ１２０Ｂを図示する。到来する光線２００−１及び２００−２（以降は、まとめて光線２００と呼ぶ）は、プリズム２０１により、ミラー２１１ａ及び２１１ｂを越える経路２２０−１、並びにミラー２１１ｃ及び２１１ｄを超える経路２２０−２に分離される。結局は、光線２００は、プリズム２０２に反射されレンズ２０７を透過した後に、角度φ２５０で集まる。光線２００−１と光線２００−２との間の正弦波の干渉パターン１００ａ及び１００ｂは、到来する光線２００により形成される２個の光シートを空間的に重ね合わせることにより生成される。パターン１００ａ及び１００ｂの空間周波数が同じでなくてもよいことに注意せよ。角度φ２５０は、光線２００がレンズ２０７の軸について対称に当たるため、光線２００の分離Ｄ２２５により生ずる。いくつかの実施の形態においては、プリズム２０２は、空間周波数変調ステージ１２０Ｂの光軸について動くことができる。空間周波数変調ステージ１２０Ｂは、次に分離Ｄ２２５を調整して空間変調の周期を修正する。したがって、分離Ｄ２２５が大きくなるほど、角度φ２５０が大きくなり、変調されたイメージング場１００ｂの空間周期が小さくなる（例えば、空間周波数が高くなる）。空間周波数変調ステージ１２０Ｂの望まれる特徴は、単にプリズム２０２の変位を選択することにより、したがって光線２００の波長を限定することなく、得られる周波数変調が調整されうることである。このため、ＳＩシステム１０Ｂは、複数の照明波長で動作するように構成されてもよい。

ＳＩステージ１１０Ｂ及び空間周波数変調ステージ１２０Ｂにより生じる、３個の位相シフトされたパターン１００ｂで、３個の像Ｉ_１，Ｉ_２及びＩ_３が収集され（各々は、同じ周波数及び異なる位相φを有する照明パターン１００ｂに対応する）、試料像Ｉ_ＳＩが以下により再構築されてもよい。

この後処理の構成は、ＳＩパターンにかかわらず散乱光からの寄与が大部分は同じままであるという利点を有する。これにより、成分を引き去ることができる。さらに、式（１）は、アウトフォーカスのバックグラウンドを除去することができる。光シートの厚さが対物被写界深度より厚い場合は、十分に高いＳＩパターンの空間周波数に対しては、パターンが、試料面の上下において対物レンズの変調伝達関数（ＭＴＦ）によりぼかされ、それによりそれらのバックグラウンドの寄与が引き去られる。Ｉ_ＳＩを非ＳＩ像と比較するために、ＳＩがない場合のイメージングによく一致する足し算像ＩＳＵＭ＝Ｉ_１＋Ｉ_２＋Ｉ_３が定義されてもよい。

センサー１５０中の各画素を通って試料１３５が走査されるため、３個の像（Ｉ_１，Ｉ_２及びＩ_３）は、ＳＬＭ２０の各状態に対応して収集される。式（１）を用いて、斜めのＳＩ像が再構築される（例えば、Ｉ_ＳＩ）。斜めに撮影された像により、再構築における各水平線は、特定の組織深さにマッピングされる。マッピング及び水平（ＸＹ）面に沿う試料１３５の走査により、２個のイメージングモードが可能になる：２Ｄ斜め断面を積み重ねることによる３Ｄ体積再構築、及び一連の再構築線を結集することによる高速２Ｄ ＸＹ断面である。

図５は、いくつかの実施の形態に係る、システム１０中の試料インターフェース１３０を図示する。ＤＯ１３３は、０．４８という開口数（ＮＡ）まで絞られてよい。これにより、ＤＯ１３３は、６６０ｎｍ及び７８５ｎｍで励起することができる蛍光体から生じる放射スペクトルに対して対象をややオーバーサンプリングすることができる。対象空間において、期待されるレイリー分解能は、７００ｎｍの蛍光信号放射に対して０．８２μｍであり（６６０ｎｍにおける照明波長）、８２０ｎｍの蛍光信号放射に対して０．９６μｍでありうる（７８５ｎｍにおける照明波長）。試料インターフェース１３０が１７．４倍の倍率を提供する場合は、予想されるセンサーサンプリングは、０．３７μｍである。いくつかの実施の形態においては、光線−光学系シミュレーションソフトウェアが、選択されたＮＡに対する試料インターフェース配置１３０に対する最適化された配置を提供する。シミュレーションソフトウェアは、検出対物レンズが理想レンズであると仮定して、図５に示される要素を含んでもよい。これにより試料インターフェース配置１３０の影響を分離することができる。

試料インターフェース１３０は、像の走査のための、望まれる方向（例えば、Ｘ方向又はＹ方向）に沿って試料３０１を動かす機械要素を含んでもよい。いくつかの実施の形態においては、機械アクチュエーターが試料インターフェース１３０と試料ステージとの間の相対角度（θ）３３０を調整してもよい（例えば、ＸＺ軸に対する６０°−３０°配置を形成するイメージング配置を調整すること）。

ガラス窓越しの斜めのイメージングに関連する収差を減らすために、いくつかの実施の形態においては、試料インターフェース１３０は、試料１３５からの蛍光放射を収集しそれをＤＯ１３３に導く波面整合レンズ（ＷＭＯ）を含む。ＷＭＯは、ここで開示されるように、中心が除去された半球レンズ３１０、整合屈折率浸漬流体（ｎ_２）３１３及び透明窓を含んでもよい。ＷＭＯは、攪乱されることなく異なる屈折率の間を光線に進ませるインターフェースとしてふるまう。試料インターフェース配置１３０においては、ＷＭＯは、示されているように、照明光軸及び検出光軸の交点が曲率中心にある状態で組み込まれる。試料３０１（屈折率ｎ_ｔ）からＤＯ１３３への収集経路は、溶融シリカ試料窓３１１３０３（屈折率ｎ_１）、屈折率整合流体３１３のグリセリン（屈折率ｎ_２）、レンズ３１０中の溶融シリカ（ｎ_３）及び水３２０（屈折率ｎ_４）を含む。屈折率ｎ_１−ｎ_３までは、１．４５８−１．４７２の範囲にあり、１．４３１−１．４６７を変動する腎臓、肝臓、腸、筋及び白質の予想されるバルク組織屈折率に概ね一致する。屈折率整合は、また、収差の焦点をガラス窓からＷＭＯ−水界面にシフトする。いくつかの実施の形態においては、試料インターフェース配置１３０は、また、試料１３５からの蛍光放射を収集し、それをＤＯ１３３に導く、中心が除去された半球固体浸漬レンズ（ＳＩＬ）を含んでもよい。

試料面の中心の視野点から生じる複数の光線は、試料１３５に面するＷＭＯの表面と垂直をなしてもよい。これにより、中心の視野点が無収差になり、収集半角を維持することができる。視野点の軸はずれは、比較的に近い屈折率の間でＷＭＯ−水界面において小さな角度で光線が屈折するため、小さな収差しか含まない。収集半角を維持することにより、分解能及び倍率を（ｎ_３／ｎ_４）という因子だけ向上することができる。ここで、ｎ_３及びｎ_４は、それぞれＷＭＯ及び対物液浸の屈折率である。

図６は、いくつかの実施の形態に係る、システム１０中の試料インターフェース１３０を図示する斜視図である。レンズ１１ｍにより導かれる入射光線３００ａは、レンズ３１０を通して試料１３５（単純化のために示されていない）中に変調されたイメージング場１００ｂを形成する。（試料１３５からの）散乱光１００ｃは、レンズ３１０を通してＤＯ１３３により収集される。いくつかの実施の形態においては、入射光線３００ａ、及びＤＯ１３３により収集される散乱光１００ｃにより形成される角度が略直角（例えば、９０°）であることに注意せよ。加えて、イメージング場１００ｂ、及び散乱光１００ｂのための収集円錐体の頂点は、レンズ３１０の平面側の数μｍ外側に位置する焦点領域を形成する。

図７は、いくつかの実施の形態に係る、試料インターフェース１３０を図示する断面図である。２個の視野点４０１ａ及び４０１ｂは、レンズ３１０の焦点領域を形成する。視野点４０１ａ及び４０１ｂは、ＸＹ断面の再構築のために有効にイメージングされるであろう、領域の周囲長上にあるように選択されてもよい。したがって、散乱光線の円錐体４００ａは、視野点４０１ａから生じてもよく、散乱光線の円錐体４００ｂは、視野点４０１ｂから生じてもよい。散乱光線の円錐体４００ａ及び４００ｂ中の光線のうちの少なくともいくつかは、ＤＯ１３３により収集される散乱光１００ｃを形成してもよい。散乱光線の円錐体４００ａ及び４００ｂを、以降は、まとめて光線の円錐体４００と呼ぶ。

図８は、いくつかの実施の形態に係る、ＳＩシステムのためのＳＩ１３０におけるスポットダイアグラム４１０−１から４１０−６（以降は、まとめてスポットダイアグラム４１０と呼ぶ）を図示する。スポットダイアグラム４１０は、異なる視野点から生じ、組織、窓、グリセリン、ＷＭＯ、水及び理想的なＤＯレンズ１３３を含む表面を有する試料インターフェースの断面を仮定する光線の円錐体４００（図７参照）に対する光線追跡シミュレーションにより得られる。例えば、スポットダイアグラム４１０−１，４１０−２及び４１０−３は、試料１３５の表面にある視野点から生成され、（例えば、光線３００ａ及び散乱光１００ｃにより形成される入射面からみて）「左」「中」及び「右」に位置する。また、スポットダイアグラム４１０−４，４１０−５及び４１０−６は、試料１３５の深部（例えば、５０μｍ）にある視野点から生成され、「左」「中」及び「右」に位置する。垂直線は、ＤＯ１３３の表面を定める。スポットダイアグラム４１０は、７６４μｍ長の実視野（ＦＯＶ）の傾いた断面の角にある視野点に関連づけられてもよい。各スポットダイアグラム４５０上の円４５０は、エアリーディスク（例えば、回折限界）を表す。

したがって、いくつかの実施の形態は、１．４５という試料１３５の屈折率を仮定すると、すべての関心視野点に対する（スポットダイアグラム４１０中に円４５０により図示される）レンズ３１０に対する略回折限界の焦点領域を提供する。実例を示すことを目的にするにすぎないが、ＤＯ１３３は、０．４８というＮＡまで絞られてもよい。これにより、６６０ｎｍ及び７８５ｎｍで励起することができる蛍光体から生じる放射スペクトルに対して対象をややオーバーサンプリングすることができる。対象空間においては、期待されるレイリー分解能は、７００ｎｍ及び８２０ｎｍの放射信号に対してそれぞれ０．８２μｍ及び０．９６μｍである。１７．４倍の倍率を有する場合は（図５−図６参照）、予想されるセンサーサンプリングは、０．３７μｍである。すべての関心視野点に対する略回折限界の性能は、１．４５という試料１３５の屈折率を仮定したものである。システム１０の方位分解能は、約２００ｎｍの直径を有する蛍光ビーズを用いた場合は、以下の表１に掲載されている。いくつかの実施の形態においては、ビーズが、水−グリセリン−アガロースゲル中に浮遊させられてもよい。グリセリンをゲルに混合することにより、屈折率が組織の屈折率に近づき、組織−窓界面における屈折による、試料面に対する光シートのずれが限定される。表１を作成するためであり、そして実例を示すことを目的とするにすぎないが、ＸＹ断面の実視野（ＦＯＶ）の左、中及び右の５分の１中の５０個のビーズが、半値全幅（ＦＷＨＭ）を計算するために用いられる。表１のための座標軸の選択は、検知光軸からＹの周りに３０°回転される。そのために、Ｄｘは、方位の点拡がり関数及び軸の点拡がり関数の両方からの寄与を含む。光シートのＦＷＨＭは、約９．０μｍでありうるが、窓の最上表面からの光線反射をイメージングすることにより測定される。

図９は、いくつかの実施の形態に係る、ＳＩシステム１０における、２次元（２Ｄ）像５３０ａ（例えば、式（１）中のＩ_１）、２Ｄ像５３０ｂ（例えば、式（１）中のＩ_２）及び２Ｄ像５３０ｃ（例えば、式（１）中のＩ_３）の再構築を図示する。ここで開示される散乱抑制技術は、高い散乱係数を含む配置（例えば、高密度の生体試料）において望まれうる。ここで開示されるＬＳＦＭのイメージング深さは、より良い散乱抑制とともに用いられる、強調された像のコントラストにより増加させられてもよい。それらのわずかな散乱により、小さくて透明な試料がＬＳＦＭで広く研究されてもよい。さらに、ここで開示されるＬＳＦＭシステムにおいては、より高密度の組織が、散乱が減らされた状態で効率的にイメージングされてもよい。したがって、ここで開示される実施の形態により、セル構成をより均一な屈折率のものに変える（例えば、散乱の影響を減らすこと）、又は散乱構造そのものを代える面倒な光学的透明化技術を実行することなく組織のイメージングを行うことができる。様々な組織透明化方法がＬＳＦＭに適用されてきた。しかし、各ケースにおいては組織がしっかりと固定される。このため、生きた培養組織の観察ができなかった。ＬＳＦＭにおけるバックグラウンドの抑制の他のアプローチは、コントラストを高めるために１次元においてアウトフォーカス光を消去する物理的又は仮想的なスリットを用いる線走査共焦点顕微鏡法を含む。いくつかの実施の形態においてはコントラストが高くなるが、ここで開示されるＳＩシステムのいくつかの実施の形態は、散乱されアウトフォーカスした光を両次元において拒絶するように構成することができ、さらに、バックグラウンドのフロアを低くすることができる。

像Ｉ_１（５３０ａ），Ｉ_２（５３０ｂ）及びＩ_３（５３０ｃ）は、位相シフトされたＳＩパターン（式（１）参照）で収集され、式（１）を経由してＩ_ＳＩ（５４０）を再構築するために使用される。関心試料深さに対応するＩ_ＳＩ（５４０）中の水平線５４５は、ＩＸＹ５５０の線５５５を再構築するために用いられる。Ｉ_ＳＩの平面が試料インターフェース１３０のＸＹ面に対して傾いていてもよいことに注意せよ（図５及び図７に一致する軸ＸＹＺ）。したがって、Ｉ_ＳＩ及びＩ_ＸＹは、像Ｉ_ＸＹ５５０の各線に対して、単一の線５５５に沿って交差してもよい。いくつかの実施の形態においては、線５５５が、センサー１５０の画素行に略一致してもよい（図１−図２）。複数の平面Ｉ_ＳＩ５４０を積み重ねることにより、カメラの画素行５５５の各々が、試料１３５のＸＹ視を形成するように得られてもよい。さらに、いくつかの実施の形態においては、試料１３５の三次元（３Ｄ）像（図１−図２参照）が、Ｘ方向に沿って積み重ねられた複数の平面５４０をつなぎあわせることにより得られてもよい。

図１０は、試料像６０１ａ，６０１ｂ，６０１ｃ及び６０１ｄ（以降は、まとめて像６０１と呼ぶ）を図示する。したがって、像６０１ｂ，６０１ｃ及び６０１ｄは、ＳＩシステムにおける強い蛍光バックグラウンドの効率的な除去を含む。像６０１は、５１２×５１２画素の、高濃度のビーズを含むアガロースゲルに５０μｍはいったところのＸＹ再構築を含む。スケールバーは、１０μｍである。より具体的には、像６０１ａは、散乱の抑制を行うことなく得られるイメージングの結果である足し算像を図示する。像６０１ｂ−６０１ｄは、それぞれイメージング場のパターンの周期３５，１１及び３．７μｍ／サイクルを有する像の再構築を含む。したがって、像６０１ｂ−６０１ｄの空間周波数は、空間周波数変調器１２０を動かすことにより（例えば、プリズム２０２をプリズム２０１へ向かって変位させることにより、図２参照）調整される。

像６１０は、像６０１ａ（構造化照明なし）に対応する断面６１１と像６０１ｄ（高い空間周波数３．７μｍを有する構造化照明）に対応する断面６１２と、の間の重要なバックグラウンドの減少を図示する。像のサンプルは、組織試料中の高濃度の２００ｎｍビーズを用いて収集された。像６０１ｂにおける細かい空間周波数は、像６０１ａにおける足し合わせ照明と大きさのオーダーが略同じであることによりバックグランドの散乱を減少させる。より細かいパターンにより向上した性能は、より小さい構造からの散乱の除去、及び光シートのアウトフォーカス成分の引き去りの両方によるものである。

図１１は、いくつかの実施の形態に係る、組織試料のためのＳＩシステムにおける強い蛍光バックグラウンドの除去を図示する。代表例を示すにすぎず、そして限定されないが、組織試料は、ＤＲＡＱ５（商標）及びＩＲ７８３（商標）により汚染されたマウス肝組織の大きな摘出物であってもよい。ＤＲＡＱ５（商標）は、６６０ｎｍ（例えば、照明波長）で励起され、核の特徴を局所化するが、ＩＲ７８３は、７８５ｎｍ（例えば、照明波長）で励起され、一般的な組織の形態を汚染する。限定されず、そして具体例を示すにすぎないが、図１１は、３１μｍという深さにおけるマウス肝組織のＸＹ再構築を示す。像７０１ａは、足し算像（例えば、ＳＩ散乱除去なし）を含む。像７０１ｂは、散乱の干渉を除去するＳＩシステムで得られる像である。スケールバーは、像７０１ａ−７０１ｂに対しては８０μｍであり、差し込み図（それぞれ像７１１ａ及び７１１ｂ）に対しては２５μｍである。

像７０１ｂにおいては、１１μｍ／サイクルという空間周期（例えば、１／１１サイクル／μｍという空間周波数）を有するイメージング場１００ｂを用いてＸＹ走査が収集された。走査中の線は、１０００フレーム毎秒（ｆｐｓ）でカメラにより読み取られる。システム倍率が約１８倍であるとすると、１ｍｍ^２の領域をイメージングする全時間は、約８秒毎チャンネルである。ここで、各チャンネルは、異なる照明波長に相当してもよい。ＳＬＭの状態の組は、６６０ｎｍの照明波長及び７８５ｎｍの照明波長に対して変更されない。これにより、両チャンネルを同時にイメージングすることが可能になる。したがって、ここで開示されるシステム１０は、光シートの傾いているという特徴、及び試料中の散乱光の存在にもかかわらず、高い分解能及び高いコントラストを維持する。ＷＭＯの組み込みにより、同時に倒立配置を生成しながらサブセルの特徴を調査することができる。ここで、ＳＩにより、これらの特徴がバックグラウンドにより不明瞭にされる程度が限定される。これらの技術の適用は、組織が高速に切断される必要がある病理学研究室、及び実験におけるセルの体積イメージングが連続的な監視を必要とする研究の場面において特に有用である。

図１２は、いくつかの実施の形態に係る、試料の像を形成する方法８００のためのフローチャート中のステップを図示する。方法８００は、試料からの１個以上の像が収集されている間に、少なくとも部分的に、倒立光シート顕微鏡法のためのシステム中のここで開示されたＳＩステージ、空間周波数変調ステージ及び試料インターフェースステージ（例えば、ＳＩステージ１１０、空間周波数変調ステージ１２０及び試料インターフェース１３０を含むＳＩシステム１０）のような要素の任意の１個により実行されてもよい。方法８００中のステップのうちの少なくともいくつかは、コンピューターのメモリーに格納された命令を実行するプロセッサーを持つコンピューターにより実行されうる（例えば、メモリー２０及びプロセッサー３０）。さらに、方法８００において開示されるステップは、コンピューターのメモリーの一部であるか、又は当該メモリーに通信可能に結合されたデータベースにおいてファイルを検索、編集及び／又は格納することを含んでもよい。本開示と一致する方法は、異なる順序で実行される、方法８００に図示されるステップの少なくともいくつかであるが全部ではないステップを含んでもよい。さらに、本開示に一致する方法は、方法８００にあるような、時間的に重なって又はほぼ同時に実行される少なくとも２個以上のステップを含んでもよい。

ステップ８０２は、空間変調されたイメージング場を提供することを含む。いくつかの実施の形態においては、ステップ８０２は、ＳＬＭからの１次の２個の回折光線（±１）を二重スリットで選択することを含んでもよい。さらに、いくつかの実施の形態においては、ステップ８０２は、選択された位相を有する矩形波に対応する、ＳＬＭ中の画素を配置することにより空間変調されたイメージング場のための空間位相を選択することを含む。加えて、いくつかの実施の形態においては、ステップ８０２は、複数の空間変調されたイメージング場を提供することを含む。各イメージング場は、複数の空間変調されたイメージング場にわたって２πの位相シフトを生じる空間位相シフトを持つ。

ステップ８０４は、空間変調されたイメージング場の周波数を調整することを含む。いくつかの実施の形態においては、ステップ８０４は、選択された角度でふたつの光線を干渉させる光学要素を直線的に変位させることを含む。

ステップ８０８は、試料からの複数の蛍光放射信号を受光することを含む。いくつかの実施の形態においては、ステップ８０８は、空間周波数及び第１の位相を持つ、構造化された照明場からの第１の蛍光放射信号を受光すること、当該空間周波数及び第２の位相を持つ第２の蛍光放射信号を受光すること、及び当該空間周波数及び第３の位相を持つ第３の蛍光放射信号を受光することを含む。いくつかの実施の形態においては、ステップ８０８は、空間変調されたイメージング場を含む平面、及び試料の動きの平面に交差する線に沿って複数の蛍光放射信号を受光することを含む。いくつかの実施の形態においては、ステップ８０８は、第１の位相を持つ空間変調されたイメージング場を有する第１の蛍光信号を受光すること、第２の位相を持つ空間変調されたイメージング場を有する第２の蛍光信号を受光すること、及び第３の位相を持つ空間変調されたイメージング場を有する第３の蛍光放射信号を受光することを含む。

ステップ８１０は、複数の蛍光放射信号を結合して試料散乱信号を減らし、試料の像を得ることを含む。

ステップ８１２は、小さな試料散乱信号しか持たない複数の２次元像の重ね合わせにより試料の３次元像を形成することを含む。いくつかの実施の形態においては、ステップ８１２は、試料インターフェースのＸＹステージにおいて１個の方向（例えば、Ｘ方向）に沿って試料を変位させること、及びＸＹステージの複数の位置の各々について小さな試料散乱信号しか持たない２次元像を収集することを含む。

ここで用いられるように、一連のアイテムの前の「のうちの少なくとも１個」という句は、任意のアイテムを分離する「及び」又は「又は」という語とともに、リストの各メンバー（例えば、各アイテム）というよりも、リストを全体として修正する。「のうちの少なくとも１個の」という句は、少なくとも１個のアイテムの選択を要求しない。むしろ、当該句は、アイテムのうちの任意の１個のうちの少なくとも１個、及び／又はアイテムの任意の組み合わせのうちの少なくとも１個、及び／又はアイテムの各々のうちの少なくとも１個を含む意味を許容する。一例として、「Ａ，Ｂ及びＣのうちの少なくとも１個」又は「Ａ，Ｂ又はＣのうちの少なくとも１個」という句の各々は、Ａのみ、Ｂのみ若しくはＣのみ、Ａ，Ｂ及びＣの任意の組み合わせ、並びに／又はＡ，Ｂ及びＣの各々のうちの少なくとも１個に言及する。

明細書又は特許請求の範囲において「含む」「持つ」等の語が用いられる範囲に対しては、そのような語は、特許請求の範囲において移行語として用いられた場合に非排他的に解釈される「備える」という語と同様に、非排他的であることを意図している。「代表例」という語は、ここでは「代表例、具体例又は実例として用いられる」ことを意味するために用いられる。ここで「代表例」として記載される任意の実施の形態は、他の実施の形態に対して好適又は有利なものとして解釈する必要はない。局面、当該局面、他の局面、いくつかの局面、１個以上の局面、実装、当該実装、他の実装、いくつかの実装、１個以上の実装、実施の形態、当該実施の形態、他の実施の形態、いくつかの実施の形態、１個以上の実施の形態、配置、当該配置、他の配置、いくつかの配置、１個以上の配置、主題となる技術、開示、本開示、その他の変形及び似たもののような句は、便宜的なものであり、そのような句に関連する開示が主題となる技術にとって本質的であること、又はそのような開示が主題となる技術のすべての配置に適用されることを内在しない。そのような語に関連する開示は、すべての配置、又は１個以上の配置に適用されうる。そのような語に関連する開示は、１個以上の例を提供しうる。局面又はいくつかの局面のような句は、１個以上の局面に言及してもよいし、逆に言及しなくてもよいし。このことは、他の先述した句に同様に適用される。

単数形による要素への言及は、「１個でありただ１個」であることを意図しておらず、具体的に述べられない限り、「１個以上」であることをむしろ意図している。「いくつかの」という語は、１個以上に言及する。見出し及びサブ見出しは、便宜的に用いられ、主題となる技術を限定せず、主題となる技術の説明の解釈に関連して参照されない。第１及び第２並びに似た語のような関係を示す語は、そのような物又は動作の間の関係又は任意の実際の順序を必ずしも要求又は暗示することなく、１個の物又は動作を他のものから区別するために用いられうる。当業者に公知の又は後に公知になる、この開示を通して説明された様々な配置の要素に対する全ての構造的又は機能的な均等物は、明白にここで参照により組み込まれ、主題となる技術により包み込まれることが意図されている。加えて、ここで開示されるものは、そのような開示が上記の説明に明示的に含まれるか否かにかかわらず公衆に提供することを意図していない。

明細書は、多くの詳述を含むが、これらは特許請求の範囲に記載されたものの範囲の限定であると解釈されるべきではない。むしろ、主題の特定の実装の説明であると解釈されるべきである。分離された実施の形態の文脈においてこの明細書中で説明された特定の特徴は、また、単一の実施の形態において組み合わせて実装することができる。逆に、単一の実施の形態の文脈において説明された様々な特徴は、複数の実施の形態に分離して、又は任意の適切なサブコンビネーションにおいて実装することができる。加えて、特徴が、特定の組み合わせにおいて動作するものとして上で説明され、そのようなものとして当初に特許請求の範囲に記載されたにもかかわらず、特許請求の範囲に記載された組み合わせからの１個以上の特徴は、いくつかの場合においては、組み合わせから除かれうる。また、特許請求の範囲に記載された組み合わせが、サブコンビネーション又はサブコンビネーションの変形に向けられてもよい。

この明細書の主題は、特定の局面を用いて説明されてきた。しかし、他の局面が実装されうるとともに下記の特許請求の範囲に記載されたものの範囲に含まれうる。例えば、動作が図面において特定の順序で表されるが、これは、望まれる結果を得るために、そのような動作が、示される当該特定の順序、若しくはシーケンシャルな順序で実行されること、又はすべての図示された動作が実行されることを要求するものと理解すべきではない。特許請求の範囲に記載された動作は、異なる順序で実行することができ、依然として望まれる結果を得ることができる。一例として、添付された図に描かれたプロセスは、望まれる結果を得るために、必ずしも示された特定の順序、又はシーケンシャルな順序を要求しない。特定の状況においては、マルチタスク又は平行処理が有利になりうる。加えて、上で説明された局面における様々なシステム要素の分離は、すべての局面においてそのような分離を要求するものとして理解すべきではない。そして、それは、記載されたプログラム要素及びシステムは、一般的に、１個のソフトウェア製品に一体化されるか、又は複数のソフトウェア製品にパッケージされることができると理解すべきである。

発明の名称、背景技術、図面の簡単な説明、要約及び図面は、ここで、開示に組み込まれ、開示の実例として提供されるが、限定的な説明としては提供されない。それは、それらが特許請求の範囲の範囲又は意義を限定するために用いられないという理解のもので提出される。加えて、詳細な説明においては、説明が実例を提供し、様々な特徴が開示を能率化する目的のために様々な実装において互いにグループ化されることを理解することできる。開示の方法は、特許請求の範囲に記載された主題が各請求項に明白に記載されたものより多くの特徴を要求するという意図を反映するものとして解釈すべきではない。むしろ、特許請求の範囲が反映するように、発明の主題は、単一の開示された配置又は動作のすべての特徴より少ないことにある。特許請求の範囲は、ここで、発明の詳細な説明に組み込まれる。各請求項は、分離して請求された主題としてそれ自身のもとに自立している。

特許請求の範囲は、ここで説明された局面を限定することを意図していないが、文言に一致する全範囲が与えられ、すべての法的均等物を含むべきである。それにもかかわらず、特許請求の範囲は、適用可能な特許法の要件を満足しない主題を含むことを意図していないし、それらはそのように解釈されるべきである。

Claims (20)

1. 空間変調されたイメージング場を提供する構造化照明ステージと、
   前記空間変調されたイメージング場の周波数を調整する空間周波数変調ステージと、
   前記空間変調されたイメージング場を試料に導く試料インターフェースステージと、
   前記試料からの複数の蛍光放射信号を受光するように構成されるセンサーと、
   試料散乱信号を減らし、前記空間変調されたイメージング場を含む、前記試料の一部からの蛍光放射信号を提供するように構成されるプロセッサーと、
   を備えるシステム。
2. 前記構造化照明ステージは、光のシート中に前記空間変調されたイメージング場を形成するアナモルフィック光学要素を備える
   請求項１のシステム。
3. 前記空間変調されたイメージング場の位相を調整する位相シフトステージ
   をさらに備え、
   前記構造化照明ステージは、２個の回折光線であって当該２個の回折光線の間に選択された位相シフトを有するものを空間的に分離して前記空間変調されたイメージング場を形成するように構成される空間光変調器を備える
   請求項１又は２のシステム。
4. 前記空間周波数変調ステージは、前記構造化照明ステージにより提供される第１の回折された照明光線及び第２の回折された照明光線の間に形成される入射角を調整して、前記第１の回折された照明光線と前記第２の回折された照明光線との間の干渉パターンの空間周波数を調整するように構成される、動くことができる光学要素を備える
   請求項１から３までのいずれかのシステム。
5. ２個の光線を空間的に分離するように構成される第１の光学要素と、
   ２個の光線を空間的に結合するように構成される第２の光学要素と、
   を備え、
   前記第２の光学要素は、
   フォーカス要素と、
   前記２個の光線のうちの第１及び第２を前記フォーカス要素の第１の点及び第２の点に導くように構成される、直線的に動くことができる反射器と、
   を備え、
   前記フォーカス要素の前記第１の点及び前記第２の点は、前記フォーカス要素の対称軸について互いに軸対称に配置される
   請求項１から４までのいずれかのシステム。
6. 少なくとも１個のミラーと、
   前記２個の光線のうちの少なくとも１個のコリメーションを維持する、前記第１の光学要素と前記第２の光学要素との間のレンズと、
   をさらに備える請求項５のシステム。
7. 前記第１の光学要素は、くさびのそれぞれの側に前記２個の光線の各々を受光するように構成されるナイフエッジを備える
   請求項５又は６のシステム。
8. 前記直線的に動くことができる反射器は、くさびのそれぞれの側に前記２個の光線の各々を受光するように構成されるナイフエッジを備え、
   前記ナイフエッジは、前記フォーカス要素の光軸に沿って直線的に動くことができる
   請求項５から７までのいずれかのシステム。
9. 平坦側を構成する平面を有し、前記平坦側を構成する平面の向こう側に曲率中心を持つ波面整合レンズと、
   前記波面整合レンズの前記平坦側に隣接して配置される透明窓と、
   前記透明窓に対する入射角で入射面を形成する２個の光線を前記波面整合レンズを通して導くことにより試料上に照明場を形成するように構成される照明対物レンズと、
   前記入射面と垂直をなす方向に沿って、前記照明場により前記試料において励起された蛍光信号を収集するように構成される顕微鏡対物レンズと、
   を備え、
   前記入射角は、約６０°又は約３０°のうちの１個である
   倒立蛍光顕微鏡法のための試料インターフェース。
10. 前記透明窓は、前記照明対物レンズ及び前記顕微鏡対物レンズに対して前記透明窓の平面内において動くように構成される
    請求項９の試料インターフェース。
11. 前記顕微鏡対物レンズ、及び前記波面整合レンズの湾曲した表面の間に挿入される第１の屈折率整合媒体、並びに前記透明窓、及び前記波面整合レンズの前記平坦側の間の第２の屈折率整合媒体をさらに備え、
    前記第２の屈折率整合流体は、前記波面整合レンズの屈折率及び前記透明窓の屈折率に整合するように構成される
    請求項９又は１０の試料インターフェース。
12. 前記照明対物レンズは、前記顕微鏡対物レンズの実視野の寸法と同程度の被写界深度で前記２個の光線を提供する
    請求項９から１１までのいずれかの試料インターフェース。
13. 前記試料に対する前記入射面の前記入射角は、前記顕微鏡対物レンズで収集される像の要求される方位分解能にしたがって選択される
    請求項９から１２までのいずれかの試料インターフェース。
14. 前記２個の光線のための開口及び絞りをさらに備え、
    前記開口及び前記絞りは、前記照明対物レンズの前に配置され、前記試料からの散乱信号を減らすように構成される
    請求項９から１３までのいずれかの試料インターフェース。
15. 空間変調されたイメージング場を提供すること、
    前記空間変調されたイメージング場の周波数を調整すること、
    試料インターフェースを用いて、前記空間変調されたイメージング場を試料に導くこと、
    前記試料からの複数の蛍光放射信号を受光すること、
    前記複数の蛍光放射信号を結合して試料散乱信号を減らし前記試料の像を得ること
    を備える試料の像を形成する方法。
16. 前記試料からの複数の蛍光放射信号を受光することは、空間周波数及び第１の位相を持つ、構造化された照明場からの第１の蛍光放射信号を受光すること、前記空間周波数及び第２の位相を持つ第２の蛍光放射信号を受光すること、並びに前記空間周波数及び第３の位相を持つ第３の蛍光放射信号を受光することを備える
    請求項１５の試料の像を形成する方法。
17. 複数の蛍光放射信号を受光することは、前記空間変調されたイメージング場を含む平面、及び前記試料の動きの面に交差する線に沿って前記複数の蛍光放射信号を受光することを含む
    請求項１５又は１６の試料の像を形成する方法。
18. 前記空間変調されたイメージング場を含む平面に対して傾いた平面に沿って前記試料を動かすこと、及び前記試料の複数の像を得て前記試料の３次元像を形成すること
    をさらに備える請求項１５から１７までのいずれかの試料の像を形成する方法。
19. 前記空間変調されたイメージング場の周波数を調整することは、選択された角度で２個の光線を干渉させる光学要素を直線的に変位させることを含む
    請求項１５から１８までのいずれかの試料の像を形成する方法。
20. 前記試料からの複数の蛍光放射信号を受光することは、第１の位相を持つ前記空間変調されたイメージング場を有する第１の蛍光信号を受光すること、第２の位相を持つ前記空間変調されたイメージング場を有する第２の蛍光信号を受光すること、及び第３の位相を持つ前記空間変調されたイメージング場を有する第３の蛍光放射信号を受光することを備える
    請求項１５から１９までのいずれかの試料の像を形成する方法。