JP6166776B2 - 拡張ボリュームの高分解能イメージング - Google Patents

Description

本発明は、拡張ボリュームの高分解能イメージングのための方法およびシステムに関する。

ボリュームイメージングの用途は、ヘルスケアから製造、基礎研究や防衛まで、社会のあらゆる分野で見出すことができる。大抵の場合、現在の技術では、所定の時間枠に捕捉できる取得ボリュームおよび分解能が制限される。光学顕微鏡を例に取ると、共焦点走査が最近まではゴールドスタンダードであったが、それでもまだその取得時間は走査速度によって制限され、当該走査速度も同様にレーザー出力およびサンプルの損傷閾値により制限されている。直交平面の光学切片化による選択的平面照明顕微鏡（ＳＰＩＭ）、超顕微鏡、またはデジタル走査型レーザーシート顕微鏡（ＤＳＬＭ）などの様々な形態の光シート顕微鏡が、この問題に対処している。撮像すべきボリュームを段階的に照明すると共に、例えば適切に設置された電荷結合素子カメラ（ＣＣＤ）などの検出器アレイを用いて、被照明部分からできるだけ多くの情報を迅速に捕捉することで、不要なバックグラウンド信号および光損傷が防止される。その様々な実装では、この技術は、急速な高コントラスト四次元の光学切片化を可能とし、生生物の研究に既に革命をもたらしている。

ガウシアンビームに基づく従来の光シート顕微鏡に伴う問題は、高い等方性分解能が、強固に集束される光シート、従って、高い開口数（ＮＡ）での照明を必要とすることである。しかしながら、これは、光シートを狭く集束させ続ける距離を制限するので、有効な視野が制限される。よって、標準ガウシアン光シートの単一の走査で大きなボリュームを効率的に撮像する能力は、高分解能イメージングとは両立し得ない。

最大分解能で大きなボリュームをイメージングすることは、生物学的研究でのイメージングなどの多くの研究分野への鍵となっており、生物学研究としては、細胞小器官、細胞、細胞組織および有機体全体レベルにおける、古細菌、原核生物または真核生物の何れであるかを問わない。例としては、胎生学、幹細胞研究や発生生物学についての細胞運命マッピング、神経生物学、細胞スフェロイドを含む。大きいボリュームの高分解能イメージングは、コロイド物理の分野においても使用することができ、また、三次元メタマテリアルなどのナノ構造のイメージングのために使用することができる。

いくつかの解決策が提案されている。概して、これらの解決策は、二光子励起に限定されるか、多数の試料の露光を要求し、付随する結果として、反復走査を妨げ得るイメージング速度および光損傷を伴う。ベッセルビームが、光シート顕微鏡でのイメージングボリュームの拡大に使用されてきた。ゼロ次数のベッセルビームの直角な強度プロファイルは、中心点と、ビーム中心から離れた一連の同心円状の輪とを有する。これらの輪は、距離分解能を顕著に悪化させる。

ベッセルビームコアの共焦点検出により、距離分解能を改善することができる。しかしながら、ベッセルビームコアの共焦点検出が通常の共焦点顕微鏡に対して勝る利点は、光の大部分が光シートビームの共焦点検出により放棄されることと、画像が一平面ごとの代わりに一行ごとに得られるために、走査速度がカメラにより制限されることとにより、小さい。従来の研究により、伝播不変の非回折ベッセルビームを用いることで走査ボリュームが拡大され得ることが示されたが、単一光子励起については、代償として、生物学的イメージングに適合する照射レベルにおける信号対雑音比および分解能が著しく減少する。

本発明は、走査方向に非対称強度プロファイル、例えば平方エアリー関数、を持つ光シートを生成する手段を提供する。このような光シートは、非平面的でもよく、光学的操作または拡大ボリュームの高分解能イメージングに用いる事ができる。非対称の光シートは、非回折性の、伝播不変のビームから生成されてもよく、伝播の方向に対して直角な平面内でほぼ同じ強度プロファイルを維持する任意のビームとして定義される。プロファイルは、伝播方向に直角に並進または加速しうる。本発明の光シートの非回折な性質は、視野を拡大するのに使用することができ、よって、光シート顕微鏡のイメージングボリュームを拡大するのに使用することができる。

非対称な光シートを使用することで、イメージングボリューム全体に亘って高分解能とすることが可能となる。完璧に非回折で、伝播不変なビームは理論的にしか存在しない。しかしながら、視野の有意な拡張を許容するのに十分な準非回折に近似したビームは存在する。例えば、三次の位相変調フーリエ変換を用いて直ちに生成される、非対称なエアリービームは、高等方性分解能を維持しながら、視野を倍率１桁分拡張することができる。

あるいは、非対称および／または伝播不変の光シートは、任意の対称的な光シートから、当該光シートの生成後に照明経路を変調することで生成することができる。変調素子の位置は、照明経路内の任意の適当な場所とすることができ、その光学部品（照射対象、光シート生成素子、またはレーザー源の一部）のいずれかに組み込むことができる。非対称強度プロファイルは、伝播方向に直角に走査中に、対称および／または伝播不変な光シートの強度を時間変調することで生成することもできる。

本発明の光シート光学系は、光シートイメージングシステムおよび／または光シート分光法システム、例えばラマン分光法システム、並びに／または光シート顕微鏡システムおよび／もしくは粒子（不活性または生物学的粒子または細胞など）に光学力を及ぼすための光シートシステム、例えば光トラッピングシステムまたは導光システム、として使用するために構成することができる。

「光シート」は、本明細書において、照明や照射のパターンまたは一連のパターンの一般的な意味で用いられる。「光シート顕微鏡」または「光シートイメージング」は、例えそれが必ずしも顕微鏡スケールではないとしても、「光シート」がボリュームにどのように投影されるか、または照射された部分から情報がどのように収集されるかについて、それぞれ使用される。

好ましくは、伝播不変で非回折性の非対称ビームは、自己回復特性を有する、すなわち、ビームは障害物を通過した後で自己を修復することができる（例として、「エアリー波束を用いた光学媒介粒子クリアリング」Ｂａｕｍｇａｒｔｌ他著ネイチャーフォトニクス、２００８年１１月２日参照）。理想的には、ビームは、その変調伝達関数（ＭＴＦ）での低い空間周波数について、ゼロを有さないまたは最小数有するべきである。

光シートは、平方エアリー関数などの非対称で直角な強度プロファイルを有する。伝播不変で非回折性の非対称フィールドは、２次以上の成分、例えば多項テイラー展開内に３次以上の成分、を有する位相項を含むフーリエ変換を有する。例えばエアリービームはフーリエ変換内に三次の位相項を有する。対称強度プロファイルは、焦点が外れると振動を開始し、ゼロを経由する実光学伝達関数を有し得る。このようなゼロは、画像情報の回復不能な損失を表し、よって対称光シートの視野を制限する。対照的に、任意の非対称プロファイルは、複素数光学伝達関数をもたらし、たとえ焦点外れ時に伝達関数が振動を開始しても、実部および虚部の両方が同時にゼロとなることは極めて稀である。

イメージングに使用されると、本発明の光シートは、変調伝達関数のゼロを無くして視野を拡大することができ、よって可能な限り多くの情報を維持することができる。記録された一連の画像は、シャープである必要はなく、人間観察者には不鮮明に見えてもよい。必要な情報を含む場合、典型的にはリアルタイムに処理される、単純な一次元の線形デコンボリューションなどのデジタル手段によりシャープな画像が再構築されてもよい。この光学−デジタル混合アプローチによる付加的な自由度は、光シートを設計して、最終処理された画像の質を最大化するために利用することができる。画像デコンボリューションステップは、画像を人間観察者のために得る場合にのみ必要である。試料の自動検査などの、マシンビジョンアプリケーションは、画像デコンボリューションステップを省き、記録データから直接所望の情報を得ることができる。

本発明の１つの実施形態によると、エアリービームのような、伝播不変で非回折性の非対称ビームを用いる光シートを形成する手段を備える、ボリュームを撮像するための光シート顕微鏡が提供される。多光子励起の光シート顕微鏡が非対称ビームから利益を得ることができるが、単一の光子励起が用いられるのが好ましい。

光シートイメージングにエアリービームを用いることにより、単一光子励起での、広い視野に亘る高分解能が提供される。撮像セクションごとに一回だけ露光が要求される；しかしながら、隣接する一連の記録された撮像セクションは、再構築された画像ボリュームの各二次元スライスに関する情報を含む。よって、光学的な鮮明さは、デジタルデコンボリューションを用いることによってのみ得られる。技術は、相互作用の全体的な視野を提供しながら、例えば、細胞小器官の標本の分解能を研究することを可能とする。この技術の線形特性は、蛍光イメージングを超えて、ラマンイメージングやコヒーレント反ストークラマン散乱（ＣＡＲＳ）のような散乱および分光法などの他のイメージング様式への延長を促進する。

エアリー波束が、自由粒子のシュレディンガー方程式の「非回折」解法としてのＢｅｒｒｙ，Ｍ．Ｖ．およびＢａｌａｚｓ，Ｎ．Ｌ．著、「非拡散波束」ＡＭ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．４７，２６４−２６７（１９７９）によって理論的に示された。外部ポテンシャルの非存在下で、波束は、伝播方向に垂直に、自由に加速しうる。シュレディンガー方程式と近軸波動方程式との間の数学的類似性は、最近証明されたように、光学ドメイン内の有限エネルギーのエアリービームを理解するために使用され得る、Ｓｉｖｉｌｏｇｌｏｕ，Ｇ．Ａ．、Ｂｒｏｋｙ，Ｊ．、Ｄｏｇａｒｉｕ，Ａ．およびＣｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ，Ｄ．Ｎ．著「加速エアリービームの観測」Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．９９，２１３９０１（２００７）参照。ビームは中心最大値を取り、横断運動を呈する多数のサイドローブを有する。

直感にはそぐわないが、エアリービームは、光フィールドに関する伝播方向と直角に加速する［Ｂｅｒｒｙ，Ｍ．Ｖ．およびＢａｌａｚｓ，Ｎ．Ｌ著 「非拡散波束」 ＡＭ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．４７，２６４−２６７（１９７９）］。粒子軌道は、直角な加速に比例して、放物線軌道に沿うように誘導され得る。エアリービームと同様に、他の放物線ビームまたはビーム／ビームアレイ／走査ビームの好適な組み合わせを使用することができる。放物線ビームの例は、Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ａ．他著、「加速放物線ビーム」Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ１６，１２８６６−１２８７１（２００８）に説明されている。

本発明の非対称光シートは、任意の形態の静的または動的な、屈折性、反射性または回折性の光学素子を用いて形成することができ、あるいは、ビームは、特定のレーザーから直接照射することができる。動的変調は、例えば空間光変調器を用いて、収差が生じたシステムまたは試料について、光シートを補正できるという付加的な利点を提供するが、静的変調は、好適な表面／屈折率変調または回折格子を有する透過性または反射性の光学素子の形態で、低コストに得られる。変調素子は、多数の機能を発揮することができ、例えば光シート生成素子、レーザー、レンズ、または照射される他の任意の部品に組み込むことができる。

非対称光シートが試料ボリュームを通して様々な位置で画像を捕捉するように、非対称光シートを動かすまたは配置するための手段、および、検出対物レンズの焦点平面が非対称ビーム光シートに対して好適に位置付けられることを確保する手段を提供することができる。

光シートは、光シートの直角構造から形成される多数の光表面から構成することができ、光シートからの情報は、検出器アレイを用いて収集することができる。多数の表面は、エアリー光シートなどから生成された非対称光シートのサイドローブから形成することができる。

調整の助けとして、第２の対象物および検出器が、照射軸上の光シートの軌道内に配置されてもよい。

選択される光シートは湾曲していてもよいが、このことはイメージングシステムの視野を広げるための必要条件ではない。しかしながら、湾曲したものは、顕微鏡の被写体に光学的な「曲げ」力を適用するために使用され得る。

ここで、本発明の様々な形態を、単なる例示として、かつ添付図面を参照して、説明する。

エアリービーム光シート顕微鏡の簡単な概略図である。 数個の随意要素を持つエアリービーム光シート顕微鏡の別の構成を示す図である。 異なる光シートタイプのための変調伝達関数を示す図である。 それぞれの光シートタイプを用いて得られたシミュレーション画像および実験画像と共に、同一の４つの異なる光シートを示す図であり、これら画像は、記録された生データと、デコンボリューションデータ量との双方に対するy軸の最大強度の投影を示している。 様々な光シートを用いて撮像されたヒト胚腎臓細胞の一群の蛍光ミトコンドリアを示す図である。 光シート顕微鏡のイメージングボリュームを拡大するのに使用され得る様々な代替の非対称光シートタイプを示す図である。

（図面の詳細な説明）
図１は、光シート顕微鏡の動作原理の簡単な概略図である。これは、照明の伝播方向（ｘ）、ビームを拡大させて光シートを形成する方向（ｙ）、および検出軸（ｚ）を示している。ｚ軸に沿って配置された検出器が、光シートを試料に対して変位させながら、被照射「平面」からの一連の画像を記録する。

レーザーの出力ビームは、レンズＬ₁およびＬ₂を通過し、シリンドリカルレンズまたは音響光学偏向器（ＡＯＤ）のような走査装置とすることができる光シート生成素子（ＬＳＧ）により光シートに変換される。レンズＬ₁およびＬ₂は、ＬＳＧの直径に合わせてビームを調整する。その後、ビームは、レンズＬ₃およびＬ₄を通過し、マスクＭＫ₁を用いて光シートを拡大してイメージングボリュームに整形する。ＭＫ₁は、取り外し可能または切り替え可能な、静的または動的な空間光変調器（ＳＬＭ）であってもよい。この変調は、光シート生成素子のような他の光学素子の前に、後に、または一体化させて、照明経路の任意の位置に導入することができる。この特定の構成では、レンズＬ₃およびＬ₄はビームをマスクＭＫ₁のサイズに調整する。レンズＬ₅およびＬ₆は、マスクＭＫ₁から出力されたビームを対物レンズＯＢＪ₁のサイズに調整する。

空間光変調器Ｍ₁を通って伝播された光は、試料を照射し、対物レンズＯＢＪ₁により試料の特定部位に焦点が合わされる。試料の画像スタックが、同じ対物レンズ、または第２の対物レンズＯＢＪ₂およびカメラ（ＣＡＭ１）を用いて捕捉される。任意に、第３の対物レンズＯＢＪ₃および第２のカメラ（ＣＡＭ２）を、システムの較正のために使用することができる。チューブレンズ（ＴＬ₁およびＴＬ₂）を、対物レンズ（ＯＢＪ₂およびＯＢＪ₃）からの光をカメラ（ＣＡＭ₁およびＣＡＭ₂）の活動領域に焦点を合わせるために、それぞれ使用してもよい。マスクＭＫ₁は、エアリービームのような、準非回折性、すなわち伝播不変で自己回復性のビームを生成する。これは、ｘ軸に沿うイメージングボリュームを、従来のガウシアン光シートを用いて達成できる大きさに対して少なくとも１桁分の大きさで拡張させることができる。

任意に、マスクＭＫ₂を、第２の対物レンズＯＢＪ₂の後側開口に、またはその近傍に挿入することで検出経路の被写界深度を増大させ、それにより位置合わせを容易にして製造コストの削減につなげることができる。光シートを用いる検出焦点の一致を改善するために、追加的な光学素子により意図的に焦点平面に湾曲を導入することもまた可能である。

図２は、標準顕微鏡のスライドまたは皿などの水平面上で水浸試料のイメージングを可能とする別の配置の概略図を示す。これは、図２に示すように照射および検出対物レンズを水平試料台に対して４５度に配置することで可能となる。試料を「走査方向」矢印により示されるように斜めに並進させることで、三次元のボリューム画像を図１で前述したように記録することができる。

より詳細には、図２は、マスクＭＫ₁に合うように（マスクＭＫ₂は本例では使用されない）、レンズＬ₁およびＬ₂により拡大される光ビームを放射するレーザーを示す。先立って、マスクは、取り外し可能または切り替え可能な静的または動的な空間光変調器（ＳＬＭ）でもよい。ビームは、マスクＭＫ₁を通過し、レンズＬ₃を通過し、アイリスＩ１に焦点が合わされ、レンズＬ₄を通過し、光シート生成素子（ＬＳＧ）の直径に合わせて整形される。ＬＳＧは、シリンドリカルレンズでもよく、音響光学偏向器（ＡＯＤ）のような走査デバイスでもよい。ＬＳＧにより形成された光シートは、その後、レンズＬ₅を通過し、アイリスＩ₂に焦点が合わされ、別のレンズＬ₆を通過し、偏光制御を提供する４分の１波長板上に光シートの視準が合わされる。そこから、光シートは、第１のミラーＭ₁により第２のミラーＭ₂に向けて反射され、そこから、水平試料台に対して４５度に配置された照明対物レンズＯＢＪ１に向かう。試料台上の試料を通過した光は、検出対物レンズＯＢＪ₂を通過して第３のミラーＭ₃に向かい、そこから、第４のミラーＭ₄に向かい、そこから、カメラＣＡＭ₁に向かう。

ミラーＭ₁からＭ₄は、試料と共に対物レンズの垂直方向の位置合わせを容易にするのに使用できる。一例では、ミラーＭ₂およびＭ₃は、対物レンズＯＢＪ₁およびＯＢＪ₂の軸に対してそれぞれ固定させることができる。ミラーＭ₁およびＭ₄の適切な位置合わせにより、配置を変えることなく、試料台に対して対物レンズＯＢＪ₁やＯＢＪ₂およびミラーＭ２やＭ３の何れもを垂直方向に並進させることができる。試料台を対物レンズの軸方向に並進することによって、位置合わせの微調整を容易にすることもできる。

図２の照明経路は図１で示すものの変形例である。様々な光学素子が、偏光を制御し、光にフィルターをかけるために含められる。図１および図２のＭＫ₁およびＬＳＧが異なる順番であることは、多くの光学素子の順番が変更可能であることを示す。図２の任意的なアイリスＩ₁およびＩ₂は、より柔軟性を許容し試料への不要な照射を阻止する第１の回折次数を選定する。図１のように、レンズＬ₁からＬ₆は様々な素子間で光を中継する望遠鏡を形成する。選択的な偏光調整素子λ／４は、例えば直線偏光をより均一な蛍光の励起を生みだす円偏光に変換することで、光の偏光を制御するために、導入することができる。光フィルターＦは、例えば励起光を遮断して蛍光放射を選択するためのものであり、ＯＢＪ₂とカメラＣＡＭ₁との間に導入することができる。必要または都合に応じて、照明経路および検出経路の素子は、それぞれミラーよりもＯＢＪ₁およびＯＢＪ₂により近づけることができる。

図３：光シート顕微鏡の様々なビームタイプの性能を評価するために、変調伝達関数（ＭＴＦ）の研究を行われてきた。ＭＴＦにより与えられる、空間周波数の関数としての相対フリンジコントラストは、様々な照明タイプのためのコントラストと分解能との間の関係への洞察を提供する。ＭＴＦは、光学伝達関数の絶対値として計算され、正規化された光シート強度のｚ軸部分のフーリエ変換として定義される。図３は、様々なタイプの光シートの、（ａ）照明焦点位置、および（ｂ）焦点外れ平面（ｘ＝２５μｍ）におけるＭＴＦを示す。空間周波数（νｚ）は、送信された最高空間周波数：２ＮＡ／λについて規格化される。ここで、λおよびＮＡは、それぞれ、照明波長および開口数を表す。ベッセルビームの２つの近似：「ベッセル１０％」および「ベッセル５％」が比較され、これらは、それぞれ、半径の相対開口の割合が１０％および５％の環状開口を用いて生成される。

図３（ａ）は、開口ガウシアンのＭＴＦが光シートウエストで最高のコントラストを提供することを示す（黒のダッシュ点線）。しかしながら、図３（ｂ）で見られるように、光シートウエストから離れると、コントラストは顕著に低下し、多くのゼロ値さえ取る。よって、従来の開口ガウシアン光シートは、光シートウエスト近傍においてのみ価値がある。ベッセルおよびエアリービームでは、焦点が合っている場合と外れている場合での変化がはるかに小さく、よって、関連する視野の拡大を放棄しつつ、光シートウエストの近傍でのイメージングに制限されない。しかしながら、ベッセルビーム（青の実線および赤の点線）のＭＴＦはエアリービーム（緑の実線）より顕著に低い。さらに、より小さい開口の割合５％のベッセルビームは、コントラストについて比例的な減少を示し、最終的に実際に到達しうる分解能を制限し、さらに、理論上のベッセルビームではコントラストがゼロに収束することが示され得る。最小のアニュラスと共に生成されたベッセルビームが最大視野を放棄するので、これは残念なことである。概して、広い視野は、分解能を犠牲にすることによってのみ、ベッセルビーム光シートを用いて得ることができる。エアリービームは、このような制限的なトレードオフから免れる。エアリービームの非対称性に起因して、その伝達関数は、厳密には実数ではなく、空間周波数依存の複素引数を有する。伝達関数の複素数特性は、焦点ずれに誘導された変化によりその実部および虚部が同時にゼロとなることが、非常に引き起こされにくくする。結果として、非対称ビームについて、低いＭＴＦ値は大きな焦点ずれおよび高い空間周波数に対してのみ発生する。ベッセルビームに関連して顕著にコントラストが減少するのと異なり、位相シフトは、信号のノイズ比に影響を与えず、単一線形デコンボリューションによって直ちに説明される。

エアリービームは、伝播中に、たとえ散乱体のような障害物が存在していても、その直角な平面内で強度プロファイルをある程度維持する（自己回復性または自己修復性）。エアリービームは、サイドローブを有し、放物線軌道を辿るので、エアリービームは光シートイメージングに訴求しないようにも思われる。しかしながら、実際には、伝播不変で非回折性のエアリービームを使用することで、光シートイメージングの有効視野を、従来の開口ガウシアンビームを用いて達成できるより少なくとも倍率１桁分広げることが見出された。

従来の光シート顕微鏡をエアリー光シート顕微鏡に変更することは、例えば空間的に光学的厚さが異なる透明素材を用いて、従来の光シート顕微鏡の照明経路内に三次の位相変調を単に組み込むことで成し得る。数学的に、三次の位相変調は、α（ｕ_y ³＋ｕ_z ³）として記載することができる。ここで、αは、要求された視野に合致するように光シートの伝播不変を調整することを可能とするパラメータであり、ｕ_yおよびｕ_zは、それぞれｙ軸およびｚ軸と一致した正規化されたデカルト座標である。マスクを正しい位置においてエアリービームカーブが光シートの平面内に存在し続けるようにすることで、エアリービーム光シート平面を作ることができるであろう。点拡がり関数がｙ方向のビーム強度の時間平均化により形成されるので、光シートＭＴＦは、エアリービームの二次元ＭＴＦの原点を通る部分である。４５度回転して光シート平面内の伝播経路を保持するマスクが低空間周波数でコントラストを実質的にゼロまで減少させることを、算出することができる。このことは、非対称ビームが光シートの生成に使用されるが、光シート自体はｙ軸に沿う時間平均化によって対称的であるため、全く驚くことではない。

様々な実験が、エアリービームの、他のビームタイプと比較した光シート顕微鏡（またはその様々な実装）への有効性を試験するために、実施された。これらの実験で、従来のレーザービーム（コヒレント社製ＶｅｒｄｉＶ６、６Ｗ５３２ｎｍ）は、音響光学偏向器（ＡＯＤ、Ｎｅｏｓ社製ＡＯＢＤ４５０３５−３）の開口を満たし、かつ、最短捕捉時間（８４０秒）よりも大幅に短い２秒間隔でｙ軸に沿ってレーザー焦点を走査することで、光シートを生成するように拡張された。次に、ＡＯＤの開口は、空間光変調器（ＳＬＭ、浜松ホトニクス社製ＬＣＯＳＸ１０４６８−０４）の活動領域をオーバーフィルするように拡大望遠鏡を用いて再撮像された。ＳＬＭの使用により、フォトブリーチおよび試料の動きを最小化しながら、研究中の様々な光シートタイプ間の迅速な動的スイッチングが可能となり、データキューブが様々なビームタイプについて同時に記録されることを可能とした。このことにより、システム内の残存収差を削除することが可能となり、ビームが理論的記述に近似することが確かめられた。

ＳＬＭの活動領域は、第１の回折次数を選択するために焦点にスリット開口を伴う縮小望遠鏡（０．５ｘ）を用いて、照明対物レンズ（ミツトヨ社製２０ｘ／０．４２、作動距離２０ｍｍ）の後側開口に向けて撮像された。ビームは、矩形のプロファイルのホウケイ酸ガラス毛細管（Ｖｉｔｒｏｃｅｌｌ社製８２５０−１００、１ｍｍ幅、壁厚２００μｍ）内の、試料内で焦点が合わされた。毛細管は、ＰＤＭＳで固定化された蛍光ポリスチレンビーズ（Ｄｕｋｅ社製Ｒ９００）で満たされ、光シートおよび検出対物レンズの焦点平面に対する試料の自動的な位置決めを可能とするために、ｘｙｚ−ピエゾ台（ＭａｄＣｉｔｙＬａｂｓ社製、Ｎａｎｏ−ＬＰ２００）に取り付けられた。

蛍光は、好適なチューブレンズおよび蛍光フィルターを有する垂直に取り付けられた対物レンズ（Ｎｅｗｐｏｒｔ社製２０ｘ／０．４０）を介して、ＣＣＤカメラ（Ｂａｓｌｅｒ社製ｐｉＡ６４０−２１０ｇｍ）を用いて検出された。ここで留意すべきは、垂直に設置された対物レンズが標準的であるが、斜めの照明が検出レンズを通る、または第２のレンズや導波経路を設置するなど、他の構成がより好適な場合がある。ピエゾ台の並進およびＳＬＭを用いたホログラフィック偏向の組み合わせを用いることで、光シートが１００ｎｍ刻みで試料を走査した。

デジタルの後処理は、点拡がり関数の限定的な知識、例えばエアリービームの焦点平面への距離が不明確な場合、画像ズレおよびリンギングアーティファクトを引き起こし得るという知識、によりしばしば妨げられる。しかしながら、このことは光シート顕微鏡では問題とならない。なぜならば、側面の検出は、光シートの伝播距離と検出器アレイの位置との間の直接的な関係が存在することを意味するからである。よって、線形デコンボリューションは、エアリービーム光シートの湾曲と、エアリービームの生成に用いられる有限開口から生じる任意の残存位相アーティファクトとを効果的に打ち消しながら、光学伝達関数の振幅と位相との両方を正確に修正することができる。さらに、点拡がり関数の正確な知識は、光シートが必ずしも伝播不変である必要がなく、ＭＴＦが所望の空間周波数および視野においてゼロを取らなければ十分であることを意味する。結果として、大多数の非対称ビームは、光シート顕微鏡の視野を広げるのに使用することができる。いくつかの例が、図６で説明される。

図４は、様々なビームタイプを用いた光シート照明の実験およびシミュレーションのデータを示す。ビームが最上行に示される。ｙ軸に沿う最大強度の射影が、（左から右に）開口ガウシアン、２つのベッセルビーム光シート（それぞれ、環状開口幅が開口径で１０％および５％）、およびエアリービーム光シートについて示される。２行目は、実験で用いたものと同じパラメータを用いた光シート顕微鏡性能のシミュレーションを示す。３行目は、シミュレーションデータのデコンボリューションを示す。４行目は、蛍光ミクロスフェアを含むＰＤＭＳ試料の実験データを示す。５行目は、実験データのデコンボリューションを示す。全ての画像は同じスケールおよび座標系（焦点平面がｘ≡０）を持つ。明確のために、擬似色での色分けが、実験画像および光シートプロファイル（逆転スケール）に使用されている。

図４は、ｘ軸に沿う従来のビームおよびベッセルビームの照明による、従来のガウシアン光シートに対して、エアリービーム光シートを用いることで、高い分解能および広い視野が得られることを示す。従来の光シート顕微鏡については、蛍光ビーズは光シートウエストから１０μｍを超えて解像されることはない。焦点平面から更に離れて、ＭＴＦ（図３ｂ参照）内のゼロの値は、取り消し不能のコントラストの損失および結果としてデコンボリューションアーティファクトを導く。ベッセルビーム光シートは、視野を２０μｍまたは４０μｍまで効果的に拡大し、開口がビームを生成していた場合、環状の幅にほぼ逆に依存する。この領域の外側で分解能が突然減少することは、図４の最上行に示されたビーム強度プロファイルを考慮することで理解され得る。約２０μｍおよび４０μｍで、軸上の強度が急に減少する様子を見ることができる。このとき、環状開口の内部端および外部端間の光学経路長の違いに起因して、相殺的干渉がビームの劣化をもたらす。環状幅の減少が、視野の向上をもたらす。しかしながら、このことは、分解能に悪影響を与え得ることにも留意すべきである。このことは、図３に示されるベッセルビームのＭＴＦカーブを比較することで、より定量的に確認することができる。

ベッセルビームとは対照的に、同じ試料がエアリー光シートで撮像されると、対象範囲を完全にカバーする視野が得られ、同時に、全視野に亘って高い距離分解能が維持される。さらに、エアリー光シートのサイドローブに起因して、有用な信号が多数フレームに亘って収集され得るので、単一のフルオロフォアの四次元トラッキングがより低い最大出力で可能となるよって、蛍光飽和、ブリーチングおよび光ダメージが、従来のビームまたはベッセルビームの光シートイメージングと比較して、少ない。このように、エアリー光シートを使用することで、フルオロフォアの使用可能な耐用期間を延ばすことができる。

この技術の生物学的試料への適用性が、アガロースゲルに懸濁させたヒト胚腎臓細胞により、更に示された。分解能の比較を可能とするために、細胞は核酸を導入されて蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄをミトコンドリア内で発現した。その場波面補正が、対象の細胞近傍の蛍光プローブとして、予めアガロースゲルに混合された蛍光ミクロスフェアを用いて実現された。図５は、従来の光シート顕微鏡では到達できないボリュームを超えて広がる細胞群を示す。ｘ軸およびｙ軸の両方の視野が全てのビームについて示される。両ベッセルビーム光シートが開口ガウシアン光シートよりも多くの細胞を解像するのが確認できる一方、エアリービーム光シート顕微鏡のみが、全ての細胞を解像でき、かつ、高分解能を発揮する。

図６は、拡大されたボリュームの光シートイメージングに使用され得る異なる非対称光シートの例を示す。左段：正規化された瞳座標ｕの関数として、ラジアンで指定される、位相変調の方程式。放物線ビームおよびエアリービームの両方が、第１行の方程式により記述される通り、三次の位相プロファイルを有する。第２および第３行は、それぞれ、分数および５次の指数を示す。第４および第５行は、テイラー展開中に無限数の成分を有する測角および指数の関数を示す。最後の式として、第６行は、ガウシアン振幅変調と結合した２次多項式位相変調を示す。

図６の第２段は、位相（青の太い実線、［波長単位］）、および透過振幅（黒の破線、任意の単位）を示す。ビームの振幅は、説明のためにガウシアン・アポディゼーションを用いて変調された最後のタイプを除いて変調されていない。図６の第３段は、変調に伴うことによるビーム（および結果としての光シート）の強度プロファイルを示す。第４段は、それぞれの光シートのウエストにおけるＭＴＦ（青の太い実線）、および比較として従来の開口ガウシアン光シートのＭＴＦ（赤の破線）を示す。第５段は、２波長分の光学経路差（Ｗ₂₀＝２λ）を導入する焦点ずれに対応する焦点外れのＭＴＦを示す。従来の開口ガウシアンＭＴＦとは異なり、変調された光シートのＭＴＦではゼロの値は見られず、焦点外れの平面におけるコントラストは、空間周波数の大部分で、大幅に高くなる。たとえこのリストが包括的では無いとしても、高分解能イメージングボリュームを拡大するために使用された光シートが、エアリービーム光シートに限定される必要がないことは明らかである。具体的な適用または実装が、代替的な非対称光シートから利益を得ることができる。

本発明の範囲から逸脱しない限り、開示された構成の変形が可能であることを、当業者なら理解するであろう。本発明は、選択的平面照明顕微鏡に関して具体的に説明されるが、光のシートを用いる任意の構成、例えば、イメージングのための、蛍光もしくはラマン分光法などの分光法、または、トラッピングもしくはガイディングなどの励起もしくは光学力を加えること、にも同様に適用可能である。同様に、本明細書で説明した光学的放射以外の放射の種類としては、例えば、ミリ波、テラヘルツ波、ｘ線、レーダーまたは音響を用いることができる。従って、具体的な実施形態についての上記説明は、例としてなされたに過ぎず、これらに限定する目的はない。説明された実施に重要な変更を加えない範囲で、軽微な変更を成し得ることは、当業者にとって明らかであろう。

Claims (18)

1. 伝播方向に対して直角な平面内で非対称の強度ビームプロファイルを有する非回折性または準非回折性で伝播不変のビームを用いて光シートを形成する手段を備える、光シート光学系。
2. 前記ビームはエアリービームを含む、請求項１に記載の光シート光学系。
3. 前記ビームのフーリエ変換は、二次以上の多項式を有する位相項を含む、請求項１または２に記載の光シート光学系。
4. 前記ビームのフーリエ変換は、２．５の分数指数または三次指数を有する位相項を含む、請求項３に記載の光シート光学系。
5. 前記ビームのフーリエ変換は、位相変調のテイラー展開において、三次以上の成分を含む、請求項１または２に記載の光シート光学系。
6. 前記ビームのフーリエ変換は、位相変調のテイラー展開において、三次の位相成分を含む、請求項５に記載の光シート光学系。
7. 前記ビームは、自己回復性または自己修復性を有する、請求項１または２に記載の光シート光学系。
8. 前記ビームは、前記光シート光学系の変調伝達関数がゼロにならない、またはゼロが最小数である、請求項１〜７の何れか一項に記載の光シート光学系。
9. 前記ビームを形成するための空間光変調器または他の静的もしくは動的回折光学素子を備える、請求項１〜８の何れか一項に記載の光シート光学系。
10. 前記ビームを動かし、または位置決めして試料ボリューム全体の異なる位置で画像を捕捉する手段を備える、請求項１〜９の何れか一項に記載の光シート光学系。
11. 前記ビームにより形成される多数の光面からの光を検出するための検出経路における位相変調と、当該検出光を用いてボリューム画像を形成するためのイメージング手段と、を備える、請求項１〜１０の何れか一項に記載の光シート光学系。
12. 単一光子励起を用いるように構成された、請求項１〜１１の何れか一項に記載の光シート光学系。
13. 伝播の方向に対して直角な平面内で非対称の強度プロファイルを有する光シートを生成する手段を備える、光シート光学系。
14. 対称の光シートを形成する手段と、前記対称の光シートを前記非対称の光シートに変換する変換手段と、を備える請求項１３に記載の光シート光学系。
15. 前記変換手段は、前記対称の光シートが上を伝播する照明経路内での位相変調を備える、請求項１４に記載の光シート光学系。
16. 前記位相変調は三次位相変調を含む、請求項１５に記載の光シート光学系。
17. 前記変換手段は、前記対称の光シートが上を伝播する照明経路内にマスクを備える、請求項１４〜１６の何れか一項に記載の光シート光学系。
18. 前記光シート光学系は、光シートイメージングシステム；分光システム；顕微鏡システム；光学力を細胞などの任意の不活性または生物学的な粒子などの粒子に働かせるシステム、のうちの１以上のシステムである、請求項１〜１７の何れか一項に記載の光シート光学系。

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