CN109297949B - 显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法及装置 - Google Patents
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Abstract
一种显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法，包括先取得生物样品；然后将生物样品放置在载玻片上进行显微成像获取显微影像，通过显微影像获取疑似病变细胞的数量和位置；再对疑似病变细胞进行基于长焦深的透射拉曼光谱成像并通过横向平面上二维扫描获取疑似病变细胞的化学成分的分布和变化；结合已有的标准细胞拉曼数据库进行数据分析，得到疑似病变细胞的类型；对疑似病变细胞所在位置周边进行透射拉曼光谱检测，由此确定病变细胞浸润情况，从而判定病变细胞的病变程度。还提供了一种检测装置，包括载物平台；光谱收集机构；拉曼光谱光源机构。本发明通过对组织中疑似病灶处逐个细胞快速分析，得到肿瘤细胞的分子变化，有效诊断癌细胞种类和分化程度。
Description
技术领域
本发明涉及物理领域，尤其涉及光学技术，特别是一种显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法及装置。
背景技术
肿瘤在全世界范围内已成为多发性疾病之一，而且大多数肿瘤类型都是晚期癌变。通过早期确定肿瘤是恶性还是良性来及时治疗具有决定性意义。用于此目的的已知技术有超声检查、钼靶、磁共振断层扫描或正电子发射断层扫描等。此外，诸如肿瘤的生物标志物可以用于恶性肿瘤和良性肿瘤的鉴定。这些生物标志物中的一些可以在血液，尿液或精液中检测到。然而肿瘤的诊断最终必须依赖于病理学家对于组织切片的分析，这也成为了肿瘤诊断的黄金标准。病理学家将用显微镜镜检的方法，仔细观看病变组织或细胞，寻找肿瘤的痕迹。根据镜检的结果，病理学家将告诉患者肿瘤所处的阶段，以及肿瘤是否发生转移。这些分析直接决定了患者要采取的治疗手段。
然而人工诊断比较容易出错。即便是对于同一名病人，不同病理学家给出的诊断也往往会有很大不同，尤其是对于乳腺癌。在我国女性恶性肿瘤发病率中是第一位的，它的年发病率在万分之四左右，并且发病率每年还在以3％～4％的速度增长。对于74岁以下的女性而言，一生中会有3％的概率患乳腺癌。据有关数据统计，我国乳腺癌患者的五年生存率不到60％。对于提升乳腺癌的生存率来说，乳腺癌的早筛早诊非常重要。研究表明不同病理学家对乳腺癌诊断的一致率只有75.3％。在某些异型乳腺癌中，诊断的一致率竟下降到了48％，不足一半。可想而知，不少患者面临着误诊的风险，这也无疑让正在与死神赛跑的患者绕了弯路，使病情雪上加霜。尽管病理学家并非尽善尽美，但要培养出这样一名人才却绝非一朝一夕之功。在经过基础的医学院学习后，这些专家必须经过数年的训练，才能掌握足够的经验，学会分析病理切片的技巧。在医疗资源不足的地区，想要得到诊断，都是一种奢望。特别地，当肿瘤还处于早期阶段，组织结构上未见病变时，传统的肿瘤检测手段则很难检测出来，这也是为什么发现肿瘤一般都是晚期的原因。目前，对样品(例如体液，活检标本或组织切片)的有效和客观分析仍然是一个挑战。许多用于分析这些样品的常规方法耗时，昂贵且通常不够客观。因此临床医学诊断急需要一个快速准确分析肿瘤细胞的方法和装置，通过该方法和装置可以鉴定肿瘤。特别地，需要能够基于定量测量客观地确定是否存在良性或恶性肿瘤的方法和装置。
过去几年，人工智能与深度学习正在快速改变整个世界。在医疗健康领域，用于疾病诊断和病理分析的人工智能层出不穷。近日，来自谷歌、腾讯、百度的科学家们相继开发出了能用来诊断癌症病理切片的人工智能影像分析，它的表现有时超过了专业的病理学家。然而一张40倍放大的电子化病理切片通常由超过百亿个像素点组成。淋巴结附近微转移肿瘤细胞群可能最小只有不到1000像素的直径。而一旦发现微转移肿瘤细胞群，病人的治疗方案和预后可能就会有极大差别。虽然，人工智能影像分析提高了的分析病理切片能力，可以尽可能不漏掉任何一处具有临床价值的病灶，但是仅仅依据图像学分析手段依然有很多不足，一是分析一张切片十分复杂和耗时；二是癌症初期肿瘤细胞和正常细胞十分相似，单从图像分析难以判断；三是肿瘤细胞的分类和分化程度难以准确判断。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种解决上述技术问题的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法及装置。
为解决上述技术问题，本发明的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法，包括如下步骤：
步骤1，取得生物样品；
步骤2，将生物样品放置在载玻片上进行显微成像获取显微影像，通过显微影像获取疑似病变细胞的数量和位置；
步骤3，对疑似病变细胞进行基于长焦深的透射拉曼光谱成像并通过横向平面上二维扫描获取疑似病变细胞的化学成分的分布和变化；
步骤4，结合已有的标准细胞拉曼数据库进行数据分析，得到疑似病变细胞的类型；
步骤5，对疑似病变细胞所在位置周边进行透射拉曼光谱检测，得到病变细胞生物分子、标志物或代谢产物的分布情况，由此确定病变细胞浸润情况，从而判定病变细胞的病变程度
进一步，所述的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法，步骤1中，通过穿刺或磨擦法或灌洗法或自然分泌液采集法或直视采集法取得生物样品。
进一步，所述的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法，步骤1中，生物样品为含有肿瘤细胞或正常细胞或炎症细胞或坏死细胞以及它们的混合体。
本发明还提供了一种实现上述方法的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测装置，包括：
载物平台，载玻片放置在载物平台上；
照明机构，设置在载物平台上方；照明光源，第一分束镜、收集透镜依次设置在照明光源的光照射方向上；
CCD成像机构，设置在载物平台下方；CCD摄像头，第二分束镜、物镜依次设置在CCD摄像头的成像方向上。
光谱收集机构，光谱收集机构设置在载物平台上方；
拉曼光谱光源机构，拉曼光谱光源机构设置在载物平台下方，拉曼光谱光源机构与光谱收集机构对应；其中，
光谱收集机构包括：
光谱仪，光谱仪面向载物平台设置；
耦合透镜、滤光器、第一分束镜及收集透镜，耦合透镜、滤光器、第一分束镜及收集透镜依次设置在光谱仪的光路上；
拉曼光谱光源机构包括：
拉曼光谱激发光源，拉曼光谱激发光源面向载物平台设置；
准直透镜、光束整形器、第二分束镜、物镜，准直透镜、光束整形器、第二分束镜、物镜依次设置在拉曼光谱激发光源的光路上。
进一步，还包括电机，电机通过驱动机构与载物平台连接，带动载物平台相对运动，从而检测生物样品中不同位置的拉曼光谱。
进一步，第一分束镜和收集透镜的水平面呈45度的夹角。
进一步，第二分束镜和物镜的水平面呈45度的夹角。
本发明还提供了另一种实现上述方法的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测装置，包括：
载物平台，载玻片放置在载物平台上；
照明机构，设置在载物平台上方；照明光源，第一分束镜、收集透镜依次设置在照明光源的光照射方向上；
CCD成像机构，设置在载物平台下方；CCD摄像头，第二分束镜、物镜依次设置在CCD摄像头的成像方向上。
光谱收集机构，光谱收集机构设置在载物平台上方；
拉曼光谱光源机构，拉曼光谱光源机构设置在载物平台下方，拉曼光谱光源机构与光谱收集机构对应；其中，
光谱收集机构包括：
光谱仪，光谱仪面向载物平台设置；
耦合透镜、滤光器、第一分束镜及收集透镜，耦合透镜、滤光器、第一分束镜及收集透镜依次设置在光谱仪的光路上；
拉曼光谱光源机构包括：
拉曼光谱激发光源；
准直透镜、第二整形器、激光扫描器、第一整形器、第二分束镜、物镜，准直透镜、第二整形器、激光扫描器、第一整形器、第二分束镜、物镜依次设置在拉曼光谱激发光源的光路上。
进一步，所述的激光扫描器可以使入射激光在两个方向偏转，从而使拉曼光谱激发激光能够在生物样品上进行平面二维扫描，从而检测生物样品中多个位置的拉曼光谱；
第一分束镜和收集透镜的水平面呈45度的夹角。
第二分束镜和物镜的水平面呈45度的夹角。
本发明还提供了一种实现上述方法的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测装置，包括：
载物平台，载玻片放置在载物平台上；
照明机构，设置在载物平台下方；照明光源，第一分束镜、收集透镜依次设置在照明光源的光照射方向上；
CCD成像机构，设置在载物平台上方；CCD摄像头，第二分束镜、物镜依次设置在CCD摄像头的成像方向上。
光谱收集机构，光谱收集机构设置在载物平台下方；
拉曼光谱光源机构，拉曼光谱光源机构设置在载物平台上方，拉曼光谱光源机构与光谱收集机构对应；其中，
光谱收集机构包括：
光谱仪，光谱仪面向载物平台设置；
耦合透镜、滤光器、第一分束镜及收集透镜，耦合透镜、滤光器、第一分束镜及收集透镜依次设置在光谱仪的光路上；
拉曼光谱光源机构包括：
拉曼光谱激发光源，拉曼光谱激发光源面向载物平台设置；
准直透镜、光束整形器、第二分束镜、物镜，准直透镜、光束整形器、第二分束镜、物镜依次设置在拉曼光谱激发光源的光路上。
进一步，还包括电机，电机与载物平台连接，带动载物平台相对运动，从而检测生物样品中不同位置的拉曼光谱。
进一步，第一分束镜和收集透镜的水平面呈45度的夹角。
进一步，第二分束镜和物镜的水平面呈45度的夹角。
本发明还提供了另一种实现上述方法的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测装置，包括：
载物平台，载玻片放置在载物平台上；
照明机构，设置在载物平台下方；照明光源，第一分束镜、收集透镜依次设置在照明光源的光照射方向上；
CCD成像机构，设置在载物平台上方；CCD摄像头，第二分束镜、物镜依次设置在CCD摄像头的成像方向上。
光谱收集机构，光谱收集机构设置在载物平台下方；
拉曼光谱光源机构，拉曼光谱光源机构设置在载物平台上方，拉曼光谱光源机构与光谱收集机构对应；其中，
光谱收集机构包括：
光谱仪，光谱仪面向载物平台设置；
耦合透镜、滤光器、第一分束镜及收集透镜，耦合透镜、滤光器、第一分束镜及收集透镜依次设置在光谱仪的光路上；
拉曼光谱光源机构包括：
拉曼光谱激发光源；
准直透镜、第二整形器、激光扫描器、第一整形器、第二分束镜、物镜，准直透镜、第二整形器、激光扫描器、第一整形器、第二分束镜、物镜依次设置在拉曼光谱激发光源的光路上。
进一步，所述的激光扫描器可以使入射激光在两个方向偏转，从而使拉曼光谱激发激光能够在生物样品上进行平面二维扫描，从而检测生物样品中多个位置的拉曼光谱；
第一分束镜和收集透镜的水平面呈45度的夹角。
第二分束镜和物镜的水平面呈45度的夹角。
本发明的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法及装置通过对组织中疑似病灶处逐个细胞快速分析，得到肿瘤细胞的分子变化，有效诊断癌细胞种类和分化程度。样品用量很少，不需要对生物样品进行固定、脱水、包埋、切片、染色、标记等繁琐的前处理程序，不仅操作简单，而且不会损伤样品从而能够获得样品最真实的信息，辅助病理医生提升筛查效率，有效降低漏诊和误诊。为病理医生和研究人员提供了一种新型的癌症早期诊断方法，有助于我国基层医院普及基于细胞分子的肿瘤精准检查。
附图说明
图1为本发明显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测装置实施例一结构示意图；
图2为本发明显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测装置实施例二结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法及装置作进一步详细说明。
实施例1
本发明通过影像分析给出生物样本中疑似肿瘤细胞，再通过基于贝塞尔光束的透射拉曼光谱对肿瘤细胞成像，快速准确提供肿瘤细胞全面的图像，为肿瘤分化程度诊断提供客观依据。
如图1所示，本发明显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测装置，本发明公开了一种显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测装置。该装置包括一个带有电机15可以放置载玻片7的载物运动平台8，以便提供样品和拉曼光谱检测系统的光学部件之间的相对运动，从而检测组织样品中多个部位的拉曼光谱。
还包括有一个光谱仪1，在光谱仪1的收集透射拉曼散射光的方向上依次设置有一个耦合透镜2，滤光器3，第一分束镜4、收集透镜5。收集透镜5在载玻片7的垂直方向的上端设置，第一分束镜4设置在收集透镜5的上端，第一分束镜4和收集透镜5的水平面呈45度的夹角。
还包括有一个透射拉曼光谱激发光源13，在透射拉曼光谱激发光源13发射激光照射样品的光路中，依次设置有一个准直透镜12、光束整形器11、第二分束镜10、物镜9。物镜9在载玻片7的垂直方向的下端设置，第二分束镜10设置在物镜9的下端，第二分束镜10和物镜9的水平面呈45度的夹角。
还包括有一个CCD摄像头14，在CCD摄像头14成像方向上依次设置有一个第二分束镜10、物镜9。还包括有一个照明光源16，在照明光源16光照射方向上依次设置有一个第一分束镜4、收集透镜5。
方法包括如下过程：
1：通过已知常规方法(如穿刺或磨擦法或灌洗法或自然分泌液采集法或直视采集法)取得生物样品6，其中含有肿瘤细胞或正常细胞或炎症细胞或坏死细胞以及它们的混合体。
2：生物样品6放置在载玻片7上进行显微成像，通过显微影像分析给出疑似病变细胞，以减少无关信息的干扰。
3：疑似病变细胞进行基于贝塞尔光束的透射拉曼光谱成像，通过原位正常细胞和病变细胞的拉曼光谱比对，并结合已有的各类细胞拉曼数据库对比，得到病变细胞类型，给出是肿瘤细胞或炎症细胞或坏死细胞。
4：对肿瘤细胞所在位置周边进行透射拉曼光谱检测，得到肿瘤细胞生物分子或肿瘤细胞标志物或肿瘤细胞代谢产物的分布情况，确定肿瘤细胞浸润情况，由此得到肿瘤细胞是良性肿瘤细胞或是恶性肿瘤细胞。
进一步，基于贝塞尔光束的透射拉曼光谱成像，是通过具有贝塞尔光束特征分布的激光聚焦于生物样品6时，可以保持长距离聚焦。检测到的透射拉曼信号是沿着输入贝塞尔光束的聚焦长度上的整个拉曼散射强度的积分，是整个聚焦区域内体积的总化学组成。
该方法是显微成像技术、图像分析技术和微区拉曼光谱技术以及生物信息技术的结合，对单个细胞的拉曼化学指纹图谱(细胞生化信息)的获取并与参照细胞拉曼数据库比对，从而原位、无需标记、高通量地识别、分选具有特定生化状态的肿瘤细胞，只需要几十个肿瘤细胞即可准确判定肿瘤细胞类型和分化程度。对肿瘤的精准诊断具有革命性的意义。
本发明原理：
拉曼光谱分析法是基于印度科学家C.V.拉曼(Raman)所发现的拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。单细胞拉曼光谱能提供细胞内核酸、蛋白质、脂质含量等大量信息，可在不损伤细胞的条件下实时动态地监测细胞分子结构变化，对分子结构上的细微差异都能在拉曼谱图上体现出来。对细胞分析时无需外加标记，即可获得整个单细胞的化学物质指纹图谱，从而迅速识别细胞的种类、生理特性和代谢产物变化等。在区分肿瘤细胞与健康细胞等具有分化能力的细胞过程中，显著优于其它方法。这对于早期鉴别肿瘤细胞有着非常重要的意义。本发明通过影像分析给出生物样本中疑似肿瘤细胞，再通过基于贝塞尔光束的透射拉曼光谱成像。基于贝塞尔光束的肿瘤细胞拉曼投影成像，是通过具有贝塞尔光束特征分布的激光聚焦于生物样本时，可以保持长距离聚焦。检测到的拉曼信号是沿着输入贝塞尔光束的聚焦长度上的整个拉曼散射强度的积分，是整个聚焦区域内体积的总化学组成。只需横向平面上二维扫描就可以产生整个体积中化学成分总量的投影图像，快速定量进行三维体积中的化学成分分析，从而快速准确检测整个细胞化学成分的分子变化和分布，确切地得到肿瘤细胞和正常细胞中的区别。同时在指定的肿瘤细胞和组织分界区域测量透射拉曼光谱，研究肿瘤细胞和组织之间浸润关系，提供肿瘤细胞更全面的图像，为肿瘤分化程度诊断提供了全新的见解。
具体操作实例
1：样品准备
通过细针穿刺方法从疑似前列腺肿瘤患者抽取病变样品，为了比较本发明的检测肿瘤细胞的性能，同时以常规镜检方法需要制备细胞染色涂片，两种样品准备方法的比较如下表：
2：拉曼光谱采集
把放有生物样品6的载玻片7放置在载物运动平台8上，通过照明光源16照亮生物样品6，然后利用CCD摄像头14显微影像分析给出疑似病变细胞，以减少无关信息的干扰。使用激光波长为1064nm拉曼光谱激发光源13和光谱仪1进行疑似病变细胞的透射拉曼成像。使用1064纳米红外激光，可以完全避免生物样品6的荧光干扰。拉曼光谱激发光源13发出激光，通过准直透镜12准直，再通过光束整形器11变成环形光束。光束整形器11采用双轴锥棱镜。环形激光通过第二分束镜10和物镜9以贝塞尔光束特征分布聚焦到生物样品6上，样品处激光功率50mW，激光焦斑2.8um。基于贝塞尔光束特征分布聚焦，可以保持长距离聚焦。检测到的透射拉曼信号是沿着输入贝塞尔光束的聚焦长度上的整个拉曼散射强度的积分，是整个聚焦区域内体积的总化学组成。生物样品6产生的拉曼散射光通过收集透镜5收集，然后通过第一分束镜4、滤波器3和耦合透镜2进入光谱仪1。完成透射拉曼光谱采集，拉曼光谱积分时间1秒。通过电机15带动载物运动平台8运动，从而使拉曼光谱激发激光能够在细胞样品上进行平面二维扫描，从而检测整个细胞样品的拉曼光谱。再通过原位正常细胞和病变细胞的拉曼光谱比对，并结合已有的各类细胞拉曼数据库对比，得到病变细胞类型，给出是肿瘤细胞或炎症细胞或坏死细胞。
对肿瘤细胞所在位置周边进行分块处理，分块尺寸10um。检测相应分块处透射拉曼光谱，通过拉曼光谱鉴定肿瘤细胞生物分子或肿瘤细胞标志物或肿瘤细胞代谢产物的分布情况，由此确定得到肿瘤细胞是良性肿瘤细胞或是恶性肿瘤。该过程可以通过电机15控制载物运动平台8运动到指定位置进行透射拉曼光谱测量。分块可以规则排列，也可以利用不规则的排列来执行检测，可以定义各种发布图案的分块。
3：数据处理
首先我们通过同样的装置检测来自细胞培养物的前列腺肿瘤细胞透射拉曼光谱，建立标准拉曼数据库。然后使用主成分分析法分析所得透射拉曼光谱数据。主成分分析法被用作无监督的多变量数据分析技术，该技术突出显示组织中的重要差异，而无需事先了解组织生物化学。主成分分析法是一种数据简化技术，它将光谱数据浓缩为一组变量，称为主成分。第一个组件解释了数据集中的最大方差，后续组件表示与前面组件正交的最高剩余方差。检查主成分的各个负载使我们能够了解导致观察到的变化的特定生化信息。然后从主成分生成彩色图像，以揭示作为主要成分分离的元素的空间组织。
4：结论
我们在疑似前列腺肿瘤患者中收集标本，制备了常规染色涂片和适合拉曼光谱检测涂片，利用镜检和显微影像结合拉曼光谱的肿瘤细胞诊断方法检测了样本。结果表明显微影像和拉曼光谱结合的肿瘤细胞快速诊断方法区分前列腺肿瘤细胞的敏感性和特异性达到100％。这项技术说明了非侵入性快速拉曼光谱测绘测量的潜力，以及能够对组织病理学进行分类的稳健，为病理医生提供了强有力的辅助诊断工具。
实施例2
本发明通过影像分析给出生物样本中疑似肿瘤细胞，再通过基于贝塞尔光束的透射拉曼光谱对肿瘤细胞成像，快速准确提供肿瘤细胞全面的图像，为肿瘤分化程度诊断提供客观依据。
如图2所示，本发明还公开了一种显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测装置。该装置包括一个可以放置载玻片7的载物平台，生物样品6放置在载玻片7上。
还包括有一个光谱仪1，在光谱仪1收集透射拉曼散射光的方向上依次设置有一个耦合透镜2，滤光器3，第一分束镜4、收集透镜5。收集透镜5在载玻片7的垂直方向的上端设置，第一分束镜4设置在收集透镜5的上端，第一分束镜4和收集透镜5的水平面呈45度的夹角。
还包括有一个透射拉曼光谱激发光源13，在透射拉曼光谱激发光源13发射激光照射样品的光路中，依次设置有一个准直透镜12、第二整形器19、激光扫描器18、第一整形器17、第二分束镜10、物镜9。物镜9在载玻片7的垂直方向的下端设置，第二分束镜10设置在物镜9的下端，第二分束镜10和物镜9的水平面呈45度的夹角。
还包括有一个CCD摄像头14，在CCD摄像头14成像方向上依次设置有一个第二分束镜10、物镜9，第二分束镜10的下端设置有一个CCD摄像头14，第二分束镜10、物镜9和CCD摄像头14在一个中轴线上。
还包括有一个照明光源16，在照明光源16光照射方向上依次设置有一个第一分束镜4、收集透镜5。
进一步，激光扫描器18可以使入射激光在两个方向偏转，从而使拉曼光谱激发激光能够在生物样品6上进行平面扫描。
具体操作实例
1：样品准备
通过细针穿刺方法从疑似前列腺肿瘤患者抽取病变样品，为了比较本发明的检测肿瘤细胞的性能，同时以常规镜检方法需要制备细胞染色涂片，两种样品准备方法的比较如下表：
2：拉曼光谱采集
把放有生物样品6的载玻片7放置在载物运动平台8上，通过照明光源16照亮生物样品6，然后利用CCD摄像头14显微影像分析给出疑似病变细胞，以减少无关信息的干扰。使用激光波长为1064nm拉曼光谱激发光源13和光谱仪1进行疑似病变细胞的透射拉曼成像。使用1064纳米红外激光，可以完全避免生物样品6的荧光干扰。拉曼光谱激发光源13发出激光，通过准直透镜12准直，再通过第二整形器19、激光扫描器18、第一整形器17变成环形光束。环形光束通过第二分束镜10和物镜9以贝塞尔光束特征分布聚焦到生物样品6上，样品处激光功率50mW，激光焦斑2.8um。基于贝塞尔光束特征分布聚焦，可以保持长距离聚焦。检测到的透射拉曼信号是沿着输入贝塞尔光束的聚焦长度上的整个拉曼散射强度的积分，是整个聚焦区域内体积的总化学组成。生物样品6产生的拉曼散射光通过收集透镜5收集，然后通过第一分束镜4、滤波器3和耦合透镜2进入光谱仪1。完成透射拉曼光谱采集，拉曼光谱积分时间1秒。通过激光扫描器18可以使入射激光在两个方向偏转，从而使拉曼光谱激发激光能够在细胞样品上进行平面二维扫描，从而检测整个细胞样品的拉曼光谱。再通过原位正常细胞和病变细胞的拉曼光谱比对，并结合已有的各类细胞拉曼数据库对比，得到病变细胞类型，给出是肿瘤细胞或炎症细胞或坏死细胞。
对肿瘤细胞所在位置周边进行分块处理，分块尺寸10um。检测相应分块处透射拉曼光谱，通过拉曼光谱鉴定肿瘤细胞生物分子或肿瘤细胞标志物或肿瘤细胞代谢产物的分布情况，由此确定得到肿瘤细胞是良性肿瘤细胞或是恶性肿瘤。该过程可以通过电机15控制载物运动平台8运动到指定位置进行透射拉曼光谱测量。分块可以规则排列，也可以利用不规则的排列来执行检测，可以定义各种发布图案的分块。
3：数据处理
首先我们通过同样的装置检测来自细胞培养物的前列腺肿瘤细胞透射拉曼光谱，建立标准拉曼数据库。然后使用主成分分析法分析所得透射拉曼光谱数据。主成分分析法被用作无监督的多变量数据分析技术，该技术突出显示组织中的重要差异，而无需事先了解组织生物化学。主成分分析法是一种数据简化技术，它将光谱数据浓缩为一组变量，称为主成分。第一个组件解释了数据集中的最大方差，后续组件表示与前面组件正交的最高剩余方差。检查主成分的各个负载使我们能够了解导致观察到的变化的特定生化信息。然后从主成分生成彩色图像，以揭示作为主要成分分离的元素的空间组织。
4：结论
我们在疑似前列腺肿瘤患者中收集标本，制备了常规染色涂片和适合拉曼光谱检测涂片，利用镜检和显微影像结合拉曼光谱的肿瘤细胞诊断方法检测了样本。结果表明显微影像和拉曼光谱结合的肿瘤细胞快速诊断方法区分前列腺肿瘤细胞的敏感性和特异性达到100％。这项技术说明了非侵入性快速拉曼光谱测绘测量的潜力，以及能够对组织病理学进行分类的稳健，为病理医生提供了强有力的辅助诊断工具。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
本发明检测的生物样品，不仅包括肿瘤细胞，同样也适用于检测其它病原体细胞，如细菌、真菌和衣原体等。
Claims (7)
1.一种显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1，取得生物样品；
步骤2，将生物样品放置在载玻片上进行显微成像获取显微影像，通过显微影像获取疑似病变细胞的数量和位置；
步骤3，对疑似病变细胞进行基于贝塞尔光束的长焦深的透射拉曼光谱成像并通过横向平面上二维扫描获取疑似病变细胞的化学成分的分布和变化；
步骤4，结合已有的标准细胞拉曼数据库进行数据分析，得到疑似病变细胞的类型；
步骤5，对疑似病变细胞所在位置周边进行透射拉曼光谱检测，得到病变细胞生物分子、标志物或代谢产物的分布情况，由此确定病变细胞浸润情况，从而判定病变细胞的病变程度；
实现上述的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法的装置，包括：
载物平台，载玻片放置在载物平台上；
照明机构，设置在载物平台上方；照明光源，第一分束镜、收集透镜依次设置在照明光源的光照射方向上；
CCD成像机构，设置在载物平台下方；CCD摄像头，第二分束镜、物镜依次设置在CCD摄像头的成像方向上；
光谱收集机构，光谱收集机构设置在载物平台上方；
拉曼光谱光源机构，拉曼光谱光源机构设置在载物平台下方，拉曼光谱光源机构与光谱收集机构对应；其中,
光谱收集机构包括：
光谱仪，光谱仪面向载物平台设置；
耦合透镜，滤光器，第一分束镜及收集透镜，耦合透镜、滤光器、第一分束镜及收集透镜依次设置在光谱仪的光路上；
拉曼光谱光源机构包括：
拉曼光谱激发光源，拉曼光谱激发光源面向载物平台设置；
准直透镜、双轴锥棱镜光束整形器、第二分束镜、物镜，准直透镜、双轴锥棱镜光束整形器、第二分束镜、物镜依次设置在拉曼光谱激发光源的光路上；
或者
实现上述的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法的装置，包括：
载物平台，载玻片放置在载物平台上；
照明机构，设置在载物平台上方；照明光源，第一分束镜、收集透镜依次设置在照明光源的光照射方向上；
CCD成像机构，设置在载物平台下方；CCD摄像头，第二分束镜、物镜依次设置在CCD摄像头的成像方向上；
光谱收集机构，光谱收集机构设置在载物平台上方；
拉曼光谱光源机构，拉曼光谱光源机构设置在载物平台下方，拉曼光谱光源机构与光谱收集机构对应；其中，
光谱收集机构包括：
光谱仪，光谱仪面向载物平台设置；
耦合透镜，滤光器，第一分束镜及收集透镜，耦合透镜、滤光器、第一分束镜及收集透镜依次设置在光谱仪的光路上；
拉曼光谱光源机构包括：
拉曼光谱激发光源；
准直透镜、第二整形器、激光扫描器、第一整形器、第二分束镜、物镜，准直透镜、第二整形器、激光扫描器、第一整形器、第二分束镜、物镜依次设置在拉曼光谱激发光源的光路上；
或者
实现上述的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法的装置，包括：
载物平台，载玻片放置在载物平台上；
照明机构，设置在载物平台下方；照明光源，第一分束镜、收集透镜依次设置在照明光源的光照射方向上；
CCD成像机构，设置在载物平台上方；CCD摄像头，第二分束镜、物镜依次设置在CCD摄像头的成像方向上；
光谱收集机构，光谱收集机构设置在载物平台下方；
拉曼光谱光源机构，拉曼光谱光源机构设置在载物平台上方，拉曼光谱光源机构与光谱收集机构对应；其中，
光谱收集机构包括：
光谱仪，光谱仪面向载物平台设置；
耦合透镜，滤光器，第一分束镜及收集透镜，耦合透镜、滤光器、第一分束镜及收集透镜依次设置在光谱仪的光路上；
拉曼光谱光源机构包括：
拉曼光谱激发光源，拉曼光谱激发光源面向载物平台设置；
准直透镜、双轴锥棱镜光束整形器、第二分束镜、物镜，准直透镜、双轴锥棱镜光束整形器、第二分束镜、物镜依次设置在拉曼光谱激发光源的光路上；
或者
实现上述的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法的装置，包括：
载物平台，载玻片放置在载物平台上；
照明机构，设置在载物平台下方；照明光源，第一分束镜、收集透镜依次设置在照明光源的光照射方向上；
CCD成像机构，设置在载物平台上方；CCD摄像头，第二分束镜、物镜依次设置在CCD摄像头的成像方向上；
光谱收集机构，光谱收集机构设置在载物平台下方；
拉曼光谱光源机构，拉曼光谱光源机构设置在载物平台上方，拉曼光谱光源机构与光谱收集机构对应；其中，
光谱收集机构包括：
光谱仪，光谱仪面向载物平台设置；
耦合透镜、滤光器、第一分束镜及收集透镜，耦合透镜、滤光器、第一分束镜及收集透镜依次设置在光谱仪的光路上；
拉曼光谱光源机构包括：
拉曼光谱激发光源；
准直透镜、第二整形器、激光扫描器、第一整形器、第二分束镜、物镜，准直透镜、第二整形器、激光扫描器、第一整形器、第二分束镜、物镜依次设置在拉曼光谱激发光源的光路上。
2.根据权利要求1所述的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法，其特征在于，步骤1中，通过穿刺或磨擦法或灌洗法或自然分泌液采集法或直视采集法取得生物样品。
3.根据权利要求1所述的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法，其特征在于，步骤1中，生物样品为含有肿瘤细胞或正常细胞或炎症细胞或坏死细胞以及它们的混合体。
4.根据权利要求1所述的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法，其特征在于，还包括电机，电机通过驱动机构与载物平台连接，以带动载物平台运动。
5.根据权利要求1所述的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法，其特征在于，第一分束镜和收集透镜的水平面呈45度的夹角。
6.根据权利要求1所述的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法，其特征在于，第二分束镜和物镜的水平面呈45度的夹角。
7.根据权利要求1所述的显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法，其特征在于，所述的激光扫描器将入射激光在两个方向偏转，从而利用拉曼光谱激发激光在生物样品上进行平面二维扫描，检测生物样品中两个以上位置的拉曼光谱。
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