JP6333326B2 - スペクトルイメージングによる生体試料の分析方法 - Google Patents

Description

［関連出願］
本出願は、2011年6月24日に出願された「スペクトルイメージングによる生体試料の分析方法」と題された米国特許出願番号第13/067777号の利益を請求する。この出願は、2011年6月24日に出願された「スペクトルイメージングによる生体試料の分析方法」と題されたPCT/US2011/041884、及び2010年6月25日に出願された「スペクトル組織病理法による組織病理法的試料のデジタル染色」と題された米国仮特許出願第61/358,606号と関連を有している。前述の出願の各々の全ては引用により本願明細書に引用したものとする。

本発明の態様は、医療診断、予後および／または予測の分類を提供するためのスペクトルイメージングによる生体試料の分析方法に関する。生体試料は、手術的な方法、生検および培養サンプルによって得られた医学的試料を含むことができる。

異常またはガン性細胞の検出のための生体試料分析には、様々な病理法的方法が用いられる。例えば、標準的な組織病理法は、顕微鏡を使用した病理法者による、染色組織切片の視覚分析が含まれる。一般に、組織切片は生検によって患者から除去され、そのサンプルは、スナップ凍結されてクライオミクロトームを使用して切片化されるか、或いは、それらはホルマリン固定され、パラフィン埋め込みされ、ミクロトームによって切片化される。組織切片は、その後適切な基板に載置される。パラフィンに埋め込まれた組織は、次にパラフィン分離化される。その組織切片は、例えば、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用して染色され、また、カバースリップで処理される。

組織サンプルは、次いで、高解像度目視検査（例えば１０×〜４０×の倍率）で、視覚的に検査される。拡大された細胞は、病理法者のメモリにおける視覚的データベースと比較される。病理法者による染色組織切片の視覚の分析は、核および細胞の形態論、組織構造、染色パターン、および異常又はガン性細胞の存在を検出するための免疫反応細胞の浸入といった特徴の精査を含んでいる。

初期の転移、または微小転移巣として知られ０．２〜２ｍｍのサイズ未満で測定されるガン細胞の小クラスタの疑いがある場合、隣接する組織切片が、サイトケラチン特有染色のような免疫組織化学的な（ＩＨＣ）薬品／対比染色で染色されることがある。この種の方法は、リンパ節組織のような正常組織がこれらの染色に反応しないことから、組織病理法の感度を高める。このようにして、病気にかかっていないものと病気にかかっている組織との対比を強調することができる。

微小転移巣を検出するための第一の方法は、標準的な組織病理法であった。例えば標準的な組織病理法によるリンパ節の微小転移巣の検出は、リンパ節組織内における異常が、寸法上小さく、かつ目立った特徴を持っていないことに起因して、骨の折れる作業である。それでも、リンパ節が転移細胞に侵されていないと判明すれば、ガンの広がりが封じ込められているかもしれないため、これらの微小転移巣の検出は疾患の広がりの病期分類のためには最も重要である。一方で、リンパ節における微小転移巣の見逃しから結果された誤った陰性診断は、より攻撃的な治療が推奨されなければならなかったところ、余りに楽観的な診断を提示する。

標準的な組織病理法は、進行疾患の診断において良好に確立されているが、それには多数の不利益が内在している。特に、この方法による疾患の診断および格付は、興味ある試料と、本質的に主観である病理法者のメモリ内のデータベースとの比較に基づいているので、異なる病理法者による同一組織切片に対する独立した診断にはバラツキがあるのが一般的である。診断の相違は、珍しいガンの診断時或いは疾患の非常な初期段階において起きる。加えて、標準的な組織病理法は、長い時間を要し、コストが高く、また検出者の鑑識眼に依存し、それにより結果の再現が困難になっている。更に、オペレータの疲労、および病理法者の習熟度レベルのバラツキが、診断に影響を与えることがある。

加えて、腫瘍の違いが僅かである場合は、ガンタイプの区別を助けるために数多くの免疫組織化学的な染色が必要となることがある。この種の染色は、複数の平行した細胞ブロックに対して実行され得る。この染色プロセスは法外に高価であることがあり、また、細胞サンプルは、単一の細胞ブロックにおいて僅かな診断細胞を提供するだけであることがある。

主として細胞形態学と組織構造上の特徴とに依存する標準的な組織病理法により診断の変異性を克服するために、細胞および組織の生化学組成のスナップショットを得るための分光法が用いられてきた。これにより、様々な条件および疾患によって生ずる、生体試料の生化学組成における変化の検出が可能となる。組織または細胞サンプルを分光法にかけることにより、そのサンプルの各所における化学組成の変化が検出でき、それにより異常又はガン性細胞の存在を示すことができる。分光法の赤外線細胞病理法（細胞の疾患の研究）への適用は「スペクトル細胞病理法」（ＳＣＰ）と称され、また、赤外線分光法の組織病理法（組織の疾患の研究）に対する適用は「スペクトル組織病理法」（ＳＨＰ）と称される。

個別尿路および培養細胞へのＳＣＰは、B. bard他、Vibr. Spectrosc., 48, 10 (2008)、およびM. Romeo他、Biochim Biophys Acta, 1758, 915 (2006)において述べられている。イメージングデータセットに基づき、口腔粘膜および頸部細胞に適用されるＳＣＰは、WO 2009/146425において述べられている。経口粘膜細胞におけるＳＣＰによる疾患進行の実証は、K. Papamarkakis他、Laboratory Investigations, 90, 589 (2010)において述べられている。ガン領域効果を検出するためのＳＣＰの感度および頸部細胞のウイルス感染に対する感度の実証は、K. Papamarkakis他、Laboratory Investigations, 90, 589, (2010)において述べられている。

階層的クラスタ分析（ＨＣＡ）による肝臓組織のＳＨＰを使用した、第一の監視されていない組織イメージングの実証は、M. Diem他、Biopolymers, 57, 282 (2000)において述べられている。リンパ節における転移ガンの検出は、M. J. Romeo他、Vibrational Spectrosc., 38, 115 (2005)およびM. Romeo他、Vibrational Microspectroscopy of Cells and Tissues, Wiley-Interscience, Hoboken, NJ (2008)において述べられている。コロン組織のガンを診断するための、ＨＣＡ派生データに向けられたニューラルネットワークの使用は、P. Lasch他、J. Chemometrics, 20, 209 (2007)において述べられている。リンパ節における微細転移巣および個別の転移ガン細胞の検出は、B. Bird他、The Analyst, 134, 1067 (2009)、B. Bird他、BMC J. Clin. Pathology, 8, 1 (2008)、およびB. Bird他、Tech. Cancer Res. Treatment, 10, 135 (2011) において述べられている。

分光法は、それらが病理法者に、初期の病期を示すことのある生体サンプルの化学組成のわずかな変化に対する注意を呼びかけるという点で有利である。対照的に、標準的な組織病理法から明らかな組織の形態的な変化は、現れるまでにより長い時間を要し、疾患の早期発見をより一層困難にする。加えて、分光法によれば、病理法者は、同じサンプルを視覚的に調査する場合に比して、より大きな組織または細胞材料のサンプルを、より短い時間で検査することができる。更に、分光法は、客観的であり、デジタル的に記録格納され、再生可能であり、かつ、数学的／統計的な分析に従順である計測器ベースの測定値に依存する。このため、分光的な方法により得られた結果は、標準組織病理的な方法により得られたものよりも正確で厳格である。

さまざまな技術が、スペクトルデータを得るために用いることができる。例えば、散乱効果を用いてシステムの分子振動を評価するラマン分光法は、細胞または組織サンプルを分析するために用いることができる。この方法は、N. Stone他、Vibrational Spectroscopy for Medical Diagnosis, J. Willey & Sons, (2008)およびC. Krafft他、Vibrational Spectrosc. (2011)に記述されている。

ラマンの散乱効果は、１０^１０の入射光子当たりに大凡１つだけがラマン散乱を被るという点で弱いと考えられている。従って、ラマン分光法は、十分に焦点の絞られた可視又は近赤外のレーザが励起のために用いられる場合に最も機能する。これは、今度は、スペクトル情報の収集スポットを決定付ける。このスポットのサイズは、顕微鏡対物レンズの開口数、および用いられるレーザの波長に応じて、約０．３μｍから２μｍの範囲に渡り得る。一つのデータセットは何百万ものスペクトルを含むことがあり、長いデータ取得時間を必要とするため、この小さなスポットサイズは、大きな組織切片のデータ収集を排除している。このようにして、ラマン分光法を用いるＳＨＰは、オペレータに対して、小さな関心領域を選択することを要求する。このアプローチは、組織の広域の無作為な分析といったスペクトルイメージングの効果を否定してしまう。

赤外分光法を使用したＳＨＰは、これらに限定されるものではないが、脳、肺、口腔粘膜、子宮頸管粘膜、甲状腺、結腸、皮膚、胸部、食道の、前立腺の、およびリンパ節の組織における異常検出にも用いられてきた。ラマン分光法のような赤外分光法は、分子振動に基づいているが、吸収効果であり、特定の基準が満たされれば、１％から５０％の間で入射赤外線光子は吸収されると思われる。その結果、赤外分光法によれば、ラマン分光法と比較して、より優れたスペクトル品質を伴ってより迅速にデータを取得することができる。加えて、赤外分光法は、組織の小さい構成変化を検出する際に極めて感度が高い。このため、赤外分光法を使用したＳＨＰは、微小転移巣を容易に検出し得るものであることから、転移が形成されるまで未検知のままとされることがしばしばである乳ガンのようなガンの診断、処置、および予後において特に有益である。それはまた、数個の個別細胞と同程度小さい転移ガン細胞の小クラスタを検出することができる。更に、赤外分光法を用いて達成可能な空間分解能はヒト細胞のサイズと同等であり、大規模な赤外線アレー検出器が組み込まれた商用の機器であれば、数分で何万ものピクセルスペクトルを集めることができる。

赤外分光法を用いたＳＨＰ方法は、Bird他、"Spectral detection of micro-metastases in lymph node histo-pathology", J. Biophoton, 2, No. 1-2, 37-46 (2009)（以下"Bird"）に記述されている。この方法は、リンパ節における微小転移巣および個々の転移細胞を正確に指し示すために赤外線微小分光法（ＩＲＭＳＰ）および多変量解析を利用する。

Birdは、各々が７００から４０００ｃｍ^−１の間に１６５０のスペクトル輝度位置を含む、２５，６００のスペクトルを含有する未加工のハイパースペクトルイメージデータの複数セットを研究した。これらのデータセットは、各々約４００のＭバイトを占めて、取り込まれ、かつ前処理された。データ処理は、９００から１８００ｃｍ^−１の波数レンジの制限と他の処理を含んでいた。「指紋」赤外線スペクトル領域は、１７００から１４５０ｃｍ^−１の間で「タンパク質領域」に更に分割され、それは、タンパク質のペプチド結合のアミドＩおよびアミドII振動帯域によって支配される。この領域は、異なるタンパク質第二および第三構造に非常に敏感であり、かつ、豊富な異なるタンパク質に拠る細胞生態における特定イベントを病期分類するために用いることができる。９００から１３５０ｃｍ^−１の低い波数範囲、「リン酸塩領域」は、ＤＮＡおよびＲＮＡと同様に、リン脂質で見つかるリン酸ジエステル結合のいくつかの振動を含んでいる。

Birdでは、組織範囲を伴わないピクセルを除去するために、統合アミドＩ帯域の最小輝度基準が課される。次いで、ベクトルの正規化とスペクトルベクトルの二次導関数への変換が実行される。その後、データセットは個々に、スペクトル類似性を定めるためのユークリッド距離およびクラスタリングのためのウォードのアルゴリズムを用いて階層的クラスタ分析（ＨＣＡ）にかけられる。ピクセルクラスタメンバーシップは擬似カラースペクトルイメージに変換される。

Birdの方法によれば、スペクトル解析にかけられるべき染色されていない隣接組織切片上の領域に対応する領域を強調するために、染色組織切片を有するスライドにマークが付される。結果として生じるスペクトルおよび視覚のイメージは、スペクトルと視覚のイメージを物理的に重ねるためにスペクトルイメージと視覚イメージの特定の特徴を整列配置するユーザによってマッチングされる。

Birdの方法では、スペクトルイメージと視覚イメージの対応切片は、目視観察とスペクトルデータとの間のあらゆる相関を決定するために調べられる。特に、染色された視覚イメージ内で病理法者によって観察される異常又はガン性細胞は、染色された視覚イメージに重ねられたスペクトルイメージの対応部分を調査するさいにも観察され得る。このようにして、擬似カラースペクトルイメージのパターンの輪郭は、染色された視覚イメージの既知の異常又はガン性細胞に対応できる。染色された視覚イメージ内で病理法者によって観察された潜在的な異常又はガン性細胞は、擬似カラースペクトルイメージの精度を検査するために用いることができる。

しかしながら、Birdの方法は、スペクトルおよび視覚のイメージ上の特定マークを視覚的にマッチさせる際のユーザの熟練度に依存しているため不正確である。この方法は、しばしば厳密ではない。加えて、Birdの方法では、物理的に重ねることにより視覚およびスペクトルのイメージをマッチングさせることはできるが、その２つのイメージからのデータが互いに接合しない。イメージが単に物理的に重ねあわされるだけであるので、重畳されたイメージは将来の分析のために一緒に格納されることはない。

更に、組織の異なる隣接切片がスペクトルおよび視覚のイメージとされるので、Birdの重ねられたイメージは同じ組織切片を示さない。この場合、視覚イメージの形態とスペクトルイメージの色パターンとに相違が生じ得ることから、スペクトルおよび視覚のイメージのマッチングが困難になる。

Birdの重ね合わせ法に関しては、他にも、視覚イメージが赤外線スペクトルイメージと同じ空間領域にないという課題がある。このため、Birdの視覚イメージとスペクトルイメージは空間分解能が異なっている。一般に、赤外線イメージの空間分解能は、視覚イメージの分解能に比して劣る。この分解能の違いを釈明するために、赤外線領域において使用されるデータは、興味ある視点の周辺で領域を選択することにより、また、単一ポイントでなくその領域を診断することにより、拡大され得る。視覚イメージのあらゆる点に対して、診断出力を得るために入力されなければならない点よりも大きな赤外線イメージの領域が存在する。分解法の違いを釈明するこのプロセスは、Birdでは実行されない。その代わりに、Birdは、視覚イメージの点を選択するときにそれが重ね合わせを通してスペクトルイメージの情報の同一点であると仮定し、従って診断用のマッチングが報告される。イメージは視覚的に同一であり得るが、それらは診断的には同一ではない。

診断的なマッチングを主張するためには、使用されるスペクトルイメージが、興味ある診断的サインを認識するために訓練された管理診断アルゴリズムから出されなければならない。このようにして、スペクトルイメージクラスタは、アルゴリズム分類スキームによって、ユーザが選択し得るマッチングではない診断マッチングを生成するための生化学的な分類によって駆動されるものに限られている。対照的に、Birdは、診断をするために「管理された」被染色視覚イメージと比較する「管理されていない」ＨＣＡイメージを使用するだけであった。ＨＣＡイメージは、ガン領域を概説するために病理法者によって境界（幾何学的）マッチングが視覚的に受け入れられるまで系統樹を手作業で切断することを含むクラスタリングに割り当てられたルールおよび制限に基づいて、未だ診断であると決定されていない一般的なスペクトルの特徴の領域を識別する。この方法は、単に視覚的な比較を提供するだけである。

染色またはラベルのような外部タグの分布に通常は基づく、または自発蛍光としても知られる固有蛍光における変化を利用する、蛍光データの分析に基づく他の方法が存在する。これらの方法は、生化学組成および組成変化を認識する観点から、通常は、より診断的ではない。加えて、これらの方法は、ラマンおよび赤外線のような振動分光の技術の指紋感度を欠いている。

スペクトル獲得技術の一般的問題は、生体サンプルをテストする際に莫大な量のスペクトルデータが集められることである。その結果、データを分析するプロセスは、コンピュータ的に複雑で時間のかかるものとなる。スペクトルデータは、散乱やベースラインアーティファクトのような、細胞や組織の微視的に獲得される赤外線スペクトルにおいてしばしば観察される交絡したスペクトルの特徴をしばしば含んでいる。このため、興味のある細胞材料を分離して、交絡したスペクトルの特徴を除去するために、スペクトルデータを前処理にかけることが有用である。

交絡したスペクトルの特徴の１つのタイプは、サンプルの形態論依存効果であるミー（Ｍｉｅ）散乱である。この効果は、サンプルが不均一であり、かつサンプルを調べる光の波長とほぼ同サイズの粒子を含む場合に、赤外線吸収または反射測定値と干渉する。ミー散乱は、赤外線吸収の特徴が重畳される幅の広い波状の散乱特徴によって明らかになる。

ミー散乱は、吸収および反射線形の混合を調停することもできる。原則として、純粋な吸収線形は、吸収率の周波数依存性に対応するものであり、通常はガウス分布、ローレンツ分布、またはそれらの混合である。吸収曲線は、複素屈折率の虚部に対応する。反射の貢献は、複素屈折率の実部に対応して、線形において分散的である。分散的な貢献は、数的ＫＫ変換による吸収線形から、又は複素フーリエ変換（ＦＴ）の実部として得ることができる。

共鳴ミー（ＲＭｉｅ）の特徴は、吸収率が最大である（すなわち、吸収帯域のプロファイルを越える）ときに屈折率が特異な分散を受けるために発生する吸収および反射の帯域形状の混合の結果発生する。ミー散乱は、または屈折率に依存する他のいかなる光学的効果も、反射および吸収の線形を混合し、帯域プロファイルを歪ませ、見かけの周波数シフトを引き起こす。

図１は、ＳＣＰおよびＳＨＰの双方において観測された分散帯域形状による吸収パターンの汚染を示している。図１において、底部のトレースは生物組織の正規の吸収スペクトルを表しており、一方、上部のトレースはＲＭｉｅ効果による分散成分により強度に汚染されたスペクトルを示す。スペクトルの歪は、化学組成から独立しているように見えるが、むしろサンプルの形態論に依存している。結果として生じる帯域の輝度および周波数シフトは、汚染されていないものと汚染されたスペクトルとが帯域シフトの存在のために異なるグループに分類されてしまうほどにスペクトル解析を悪化させている。幅が広い波状の背景の特徴を図２に示す。細胞の赤外線マイクロ分光法（ＩＲ―ＭＳＰ）パターンに重畳された際に、これらの特徴は、細胞核または球状細胞のような球状粒子によるミー散乱に起因して生ずる。

ＩＲ―ＭＳＰスペクトルに重ね合わされた図１における分散性線形の様子はM. Romeo他、Vibrational Spectroscopy, 38, 129, (2005)（以下"Romeo 2005"）において理論分析と共に報告されている。Romeo 2005は、歪曲帯域形状を、分散（反射）成分の赤外線スペクトル吸収特徴への重ね合わせから起こるものと同定している。これらの効果は、計測器を制御するソフトウェアの誤った位相補正に起因するものであった。特に、フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法における獲得された未処理のインターフェログラムはしばしば「チャープ」または非対称であり、ＦＴの前に対称にされる必要である。これは、より短い干渉計ストロークに渡って両側インターフェログラムを集めて、対称インターフェログラムを生み出すための位相補正を計算することにより達成される。

Romeo 2005では、この手順は適切に機能しておらず、それにより歪曲スペクトルの特徴が生み出されていると仮定されていた。歪曲スペクトルの実部と虚部の間の位相を計算し、修正された実部および虚部からパワースペクトルを再構築することにより歪曲スペクトルの特徴を修正する試みが行われた。Romeo 2005も、観察された赤外スペクトルの各吸収帯域で、屈折率が異常分散を受けるという事実を報告した。特定の状況の下では、様々な量の分散性線形が吸収性スペクトルと重ね合わされ、または混ぜ合わされ得る。

吸収および反射帯域の形状間の数学的関係は、それら２つの物理的現象を関連付けるクラマース・クローニッヒ（ＫＫ）変換によって与えられる。Romeo 2005では、観測スペクトル中の分散（反射）および吸収効果の混合が同定され、"Phase Correction"（ＰＣ）と称される処理を経てその効果を修正する方法が述べられている。分散および吸収の貢献を混合する原因が計測器のソフトウェアの不調に誤って起因していたにもかかわらず、交絡効果の原理は適切に同定されていた。しかしながら、下地となる物理現象の不完全な理解のために、提案された修正方法は適切に機能しなかった。

P. Bassan他、Analyst, 134, 1586 (2009)およびP. Bassan他、Analyst, 134, 1171 (2009)は、分散なおよび吸収の効果が「共鳴ミー散乱」（ＲＭｉｅＳ）効果を経て混合され得ることを実証した。スペクトルの歪曲を修正するためのアルゴリズムおよび方法が、P. Bassan他、"resonant Mie Scattering (RMieS) correction of infrared spectra from highly scattering biological samples", Analyst, 135, 268-277 (2010)に記述されている。この方法は、A. Kohler他、Appl. Spectrosc., 59, 707 (2005)およびA. Kohler他、Appl. Spectrosc., 62, 259 (2008)において報告されている"Extended Multiplicative Signal Correction" (EMSC)方法の拡張である。

この方法は、純粋な吸収スペクトルのＫＫ変換により得られた反射成分を多重線形回帰モデルに盛り込むことにより、赤外線スペクトルのデータセットから非共振ミー散乱を除去する。その方法は、未処理のデータセットおよび「基準」スペクトルを入力として利用し、その基準スペクトルは、反射の貢献を計算するためと、ＥＭＳＣ拡大縮小における正規化の特徴としての両方で用いられる。基準スペクトルが先験的に知られていないで、Bassan他は、データセット全体の平均スペクトル、または純粋なたんぱく質基質のスペクトルのような「人工の」スペクトルを「種」基準スペクトルとして用いる。アルゴリズムの初回のパスの後、各修正スペクトルは、それに続くパスにおいて全てのスペクトルを修正するために、反復アプローチにて用いることとしてもよい。このようにして、１０００のスペクトルのデータセットは１０００のＲＭｉｅＳ―ＥＭＳＣ修正スペクトルを生成し、それぞれが、１，０００，０００の修正の実行を求めて、次のパスのための独立した新しい基準スペクトルとして用いられることになる。「ＲＭｉｅＳ―ＥＭＳＣ」アルゴリズムと呼ばれるこのアルゴリズムを実行して修正出力スペクトルを安定なレベルとするためには、何日にもわたって計測される数多くのパス（〜１０）と計算時間が必要であった。

ＲＭｉｅＳ―ＥＭＳＣアルゴリズムが何時間または何日にも及び計算時間を必要とすることから、B. Bird, M. Milijkovic and M. Diem, "Two step resonant Mie scattering correction of infrared micro-spectral data: human lymph node tissue", J. Biophotonics, 3 (8-9) 597-608 (2010) に記述されているように、スペクトルからの散乱および分散線形の除去を実行するための高速２ステップ方法が開発されている。このアプローチは、ヴァンハルスト式（H. C. Van De Hulst, Light Scattering by Small Particles, Dover, Mineola, NY, (1981)参照）を経て計算されるミー散乱曲線と同様に純粋な吸収スペクトルのＫＫ変換から得られる多重分散成分を、拡張多重信号修正（ＥＭＳＣ）（A. Kohler他、Appl. Spectrosc., 62, 259 (2008)参照）として知られる処理を経てデータセット内の全てのスペクトルに適合させること、およびこれらの交絡成分を伴わずに全てのスペクトルを再構築することを含んでいる。

このアルゴリズムは、データセットからの汚染されていない基準スペクトルを用いることにより、ＲＭｉｅＳ―ＥＭＳＣアルゴリズムで用いられる反復アプローチを回避している。これらの汚染されていない基準スペクトルは、データセットの予備クラスタ分析を行い、各々のクラスタにおいて最高のアミドＩ周波数を有するスペクトルを「汚染されていない」スペクトルとして選択することにより見つけられる。上述したように、そのスペクトルは、数値に関するＫＫ変換を経て純粋な反射スペクトルに変換され、ＲＭｉｅＳ修正のための圧縮Ｍｉｅ曲線と共に干渉スペクトルとして用いられる。この方法は、高速ではあるが、２〜３個のスペクトル分類を含むデータセットにしか良好には機能しない。

しかしながら、多くの組織タイプを含むペクトルデータセットの場合、汚染されていないスペクトルを引き出すことは面倒なものになり得る。更にまた、これらの条件下では、データセット内の全てのスペクトルが最適な干渉スペクトルに適合されることが保証されているのか否か不明である。加えて、このアルゴリズムは、修正のための基準スペクトルを必要とし、かつ、大きなデータセットに対して最適に機能する。

上記を考慮すると、医療診断を提供するためのスペクトルイメージングによる生体試料分析について改良された方法の必要性が残る。更に、修正された位相補正アプローチに基づき、入力データを必要とせず、計算的に早く、かつ微視的に獲得された細胞および組織の赤外線スペクトルにおいてしばしば観察される交絡スペクトルの貢献を考慮する改良された前処理方法の必要が存在する。

本発明の一態様は、医療診断を提供するためのスペクトルイメージングによる生体試料の分析方法に関する。その方法は、生体試料のスペクトルおよび視覚イメージを得ること、および、これらに限定されるものではないが、細胞異常、前ガン細胞、およびガン細胞のような生体試料内の異常を検出するためにそのイメージを登録すること、を含む。この方法は、とりわけ、標準的な組織病理法的、細胞学的、および他のスペクトル的な方法に内在する診断および予後の偏見および非信頼性を除去するという点において、上記の障壁を克服する。

本発明の別の態様は、スペクトルデータに位相補正を施すことにより、微視的に獲得された細胞および組織の赤外線のスペクトルにおいてしばしば観察される交絡スペクトル貢献を修正するための方法に関する。この位相補正方法は、反射成分によって汚染される様々な種類の吸収スペクトルを修正するために用いることができる。

本発明の幾つかの態様によれば、スペクトルイメージングによる生体試料の分析方法は、生体試料のスペクトルイメージを得ること、生体試料の視覚イメージを得ること、および視覚イメージとスペクトルイメージを登録すること、を含む。

本発明の幾つかの態様に係るデータリポジトリの開発方法は、疾患または条件を表示する視覚イメージの領域を識別すること、その視覚イメージの領域をその領域に対応するスペクトルデータに結びつけること、およびスペクトルデータと、対応する疾患または条件との間の結びつきを格納すること、を含む。

本発明の幾つかの態様に係る医療診断の提供方法は、生体試料の分光分析データを得ること、その生体試料の分光分析データを、疾患または条件と結び付けられているリポジトリ内のデータと比較すること、リポジトリのデータと生体試料の分光分析データとの間の如何なる関係をも決定すること、およびその決定と結び付けられた診断を出力すること、を含む。

本発明の幾つかの態様に係る医療診断および予後を提供するシステムは、プロセッサ、プロセッサを介して機能するユーザインターフェース、およびプロセッサによるアクセスが可能なリポジトリを含み、そこにおいては、生体試料の分光分析データが取得され、その生体試料の分光分析データは疾患または条件と結び付けられているリポジトリデータと比較され、リポジトリデータと生体試料の分光分析データとの間のいかなる相関もが決定され、かつ、その決定と結び付けられた診断が出力される。

本発明の幾つかの態様に係るコンピュータプログラム製品は、コンピュータに医療診断を提供させるために格納された制御ロジックを有するコンピュータで使用可能な媒体を含む。制御ロジックは、生体試料の分光分析データを取得するための第一のコンピュータ読み取り可能なプログラムコード手段と、その生体試料の分光分析データを疾患または条件と結び付けられたリポジトリデータと比較するための第二のコンピュータ読み取り可能なプログラムコード手段と、リポジトリデータと生体試料の分光分析データとの間のいかなる相関をも決定するための第三のコンピュータ読み取り可能なプログラムコード手段と、その決定と結び付けられた診断または予後の判定を出力するための第四のコンピュータ読み取り可能なプログラムコード手段と、を含む。

図１は、ＳＣＰおよびＳＨＰの双方で一般的に観察される分散帯域形状による吸収パターンの汚染を例示する。 図２は、球状粒子によるミー散乱に起因する細胞のＩＲ−ＭＳＰスペクトルにおいて一般的に観察される幅の広い波状の背景特徴を示す。 図３は、本発明の幾つかの態様に係るスペクトルイメージングによる生体サンプルの分析方法を例示するフローチャートである。 図３Ａは、本発明の幾つかの態様に係るスペクトルイメージを得る方法における複数ステップを例示するフローチャートである。 図３Ｂは、本発明の幾つかの態様に係るスペクトルデータの前処理の方法における複数ステップを例示するフローチャートである。 図４Ａは、本発明の幾つかの態様に係るスペクトルイメージおよび視覚イメージにイメージ登録を施す方法の一例を例示するフローチャートである。 図４Ｂは、本発明の幾つかの態様に係るスペクトルイメージおよび視覚イメージにイメージ登録を施す方法の一例を例示するフローチャートである。 図４Ｃは、本発明の幾つかの態様に係るスライド保持器の例を例示している。 図５Ａは、本発明の幾つかの態様に係るイメージ登録精製方法の一例を例示するフローチャートである。 図５Ｂは、本発明の幾つかの態様に係る閾値をセットするためのグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）インターフェースの一例である。 図５Ｃは、本発明の幾つかの態様に係る最適化ウィンドウの一例を例示するＧＵＩインターフェースの一例である。 図６Ａは、本発明の幾つかの態様に係る線形背景に重畳された典型的なスペクトルを示す。図６Ｂは、本発明の幾つかの態様に係る第二の派生的スペクトルの一例を示す。 図７は、本発明の幾つかの態様に係るインターフェログラムの実部の一部を示す。 図８は、位相補正の後に最大輝度を生成する位相角が本発明の幾つかの態様に係る破損していないスペクトルであるとみなされることを示す。 図９Ａは、本発明の幾つかの態様に係る基線傾斜を模倣する散乱効果により汚染された吸収スペクトルを示す。図９Ｂは、フォワードＦＴの虚部がスペクトル境界で強く曲げられた効果を見せ、それが、本発明の幾つかの態様に係る、結果として生じた修正スペクトルを汚染することを示す。 図１０Ａは、本発明の幾つかの態様に係る嚢の下で乳ガン微小転移巣が確認されたリンパ節を示しているＨ＆Ｅベースの病理組織である。 図１０Ｂは、本発明の幾つかの態様に係る図１０Ａのリンパ節切片に実行された階層的クラスタ分析（ＨＣＡ）によるデータ分割を示す。 図１０Ｃは、本発明の幾つかの態様に係る各スペクトルにおけるアミドＩ振動帯域のピーク周波数を示す描画である。 図１０Ｄは、本発明の幾つかの態様に係るＲＭｉｅＳ修正を用いた位相補正後の図１０Ａと同じリンパ節切片のイメージを示す。 図１１Ａは、本発明の幾つかの態様に係る図１０ＤのＲＭｉｅＳ修正を用いた位相補正後のＨＣＡの結果を示す。 図１１Ｂは、本発明の幾つかの態様に係る図１１Ａのリンパ節切片のＨ＆Ｅベースの病理組織である。 図１２Ａは、染色された頸部イメージの切片の視覚微視的イメージである。 図１２Ｂは、本発明の幾つかの態様に係る組織を染色する前に集められた赤外線データセットの階層的クラスタ分析から作成された赤外線スペクトルイメージである。 図１３Ａは、本発明の幾つかの態様に係るＨ＆Ｅ染色腋窩リンパ節切片の一切片の視覚微視的イメージである。 図１３Ｂは、本発明の幾つかの態様に係る組織を染色する前に集められた赤外線データセットの多層パーセプトロンネットワーク分析から作成された赤外線スペクトルイメージである。 図１４Ａは、本発明の幾つかの態様に係る小細胞肺ガン組織の視覚イメージである。 図１４Ｂは、本発明の幾つかの態様に係る図１４Ａに示される組織のＨＣＡベースのスペクトルイメージである。 図１４Ｃは、本発明の幾つかの態様に係る図１４Ａの視覚イメージと図１４Ｂのスペクトルイメージの登録イメージである。 図１４Ｄは、本発明の幾つかの態様に係る図１４Ｃの登録イメージのためのグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）の一例である。 図１５Ａは、本発明の幾つかの態様に係るＨ＆Ｅで染色されリンパ節組織切片の視覚微視的イメージである。図１５Ｂは本発明の幾つかの態様に係る、嚢とリンパ節の内部とを区別する図１５Ａに示される切片の広範囲デジタル染色イメージである。図１５Ｃは本発明の幾つかの態様に係る、嚢、転移性乳ガン、組織球、活性化されたＢリンパ球およびＴリンパ球を区別する図１５Ａに示される切片の診断的デジタル染色イメージである。 図１６は、本発明の幾つかの態様に係る広範囲および診断的デジタル染色法の間の関係の概略図である。 図１７Ａは、本発明の幾つかの態様に係る腋窩リンパ節からのＨ＆Ｅ染色組織切片の視覚イメージである。図１７Ｂは、本発明の幾つかの態様に係る乳ガン微小転移巣のＳＨＰベースのデジタル的染色領域である。図１７Ｃは、本発明の幾つかの態様に係るＢリンパ球によって占有されたＳＨＰベースのデジタル的染色領域である。図１７Ｄは、本発明の幾つかの態様に係る組織球によって占有されたＳＨＰベースのデジタル的染色領域である。 図１８は、本発明の幾つかの態様に係るＳＨＰを経た個々のガン細胞およびガン細胞の小クラスタの検出を例示する。 図１９Ａは、本発明の幾つかの態様に係る、肺腺ガン、小細胞ガン、および扁平上皮ガンの細胞から記録された細胞スペクトルを備える未処理スペクトルデータセットを示す。 図１９Ｂは、本発明の幾つかの態様に係る、肺腺ガン、小細胞ガン、および扁平上皮ガンの細胞から記録された細胞スペクトルを備える修正スペクトルデータセットを示す。 図１９Ｃは、本発明の幾つかの態様に係る、肺腺ガン、小細胞ガンおよび扁平上皮ガンのための標準スペクトルを示す。 図１９Ｄは、図１９Ｃのスペクトルから算出されるＫＫ変換スペクトルを示す。 図１９Ｅは、本発明の幾つかの態様に係る、ＥＭＳＣ修正前の複数クラスデータセットのＰＣＡスコアの描画を示す。 図１９Ｆは、本発明の幾つかの態様に係る、ＥＭＳＣ修正後の複数クラスデータセットのＰＣＡスコアの描画を示す。 図２０Ａは、本発明の幾つかの態様に係る、肺腺ガン、小細胞ガンおよび扁平上皮ガンの平均吸光度スペクトルを示す。 図２０Ｂは、本発明の幾つかの態様に係る、図２０Ａに示された吸光度スペクトルの第二の派生的スペクトルを示す。 図２１Ａは、本発明の幾つかの態様に係る、それぞれ、腺ガン、小細胞ガンおよび扁平上皮ガンの細胞を含む１ｍｍ×１ｍｍの組織領域の４つの継ぎ合わされた微視的Ｒ＆Ｅ染色イメージを示す。図２１Ｂは、本発明の幾つかの態様に係る、図２１Ａに示される組織領域から記録された４つの継ぎ合わされた未処理赤外線イメージの１３５０ｃｍ^−１から９００ｃｍ^−１のスペクトル領域に高速還元ＲＣＡ分析を施すことにより構築された二値化マスクのイメージである。図２１Ｃは、本発明の幾つかの態様に係る、診断に関する細胞材料の領域から記録された散乱修正スペクトルデータの６クラスタＲＣＡイメージである。 図２２は、本発明の幾つかの態様と連動して使用するためのコンピュータシステムの様々な特徴を示す。 図２３は、本発明の幾つかの態様と連動して使用するためのコンピュータシステムを示す。

この特許のファイルは、少なくとも一つの着色された図面を含む。カラー図面を有するこの特許のコピーは、必要な手数料を支払って申請することにより特許商標局により提供される。

別段の定義がなされない限り、本願明細書において用いられるすべての専門的なおよび科学的な用語は、本発明の態様が属する当該技術分野における当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本願明細書に記載されたものと類似または均等な方法および材料は演習またはテストにおいて用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記述する。全ての刊行物、特許出願、特許および本明細書において言及された他の引用文献は参照によりその全てが引用されているものとする。定義を含めて、干渉する場合は、本明細書がコントロールするものとする。加えて、材料、方法および各種の例は、例示的であるだけであり、限定を意図したものではない。

本発明の一態様は、医療診断を提供するためのスペクトルイメージングにより生体試料を分析する方法に関する。生体試料は、外科的方法、生検および培養サンプルによって得られた医学的な試料でもよい。その方法は、生体試料のスペクトル的および視覚的イメージを得ること、および、細胞異常、前ガン細胞およびガン細胞を検出するためにそれらのイメージを登録すること、を含む。生体試料は組織または細胞サンプルを含むことができるが、組織サンプルはいくつかの応用のために好まれるものである。この方法は、これらに限定されるものではないが、炎症、壊死、および細胞自然死を含む非ガン性効果と同様に、これらの限定されるものではないが、リンパ節、甲状腺、胸部、子宮、腎臓、精巣、卵巣、または前立腺のガン、小細胞肺ガン種、非小細胞肺ガン種および黒色腫を含む異常なまたはガン性の、およびその他の障害を識別する。

本発明の幾つかの態様に係る一つの方法は、標準的な組織病理法および他のスペクトル法に内在する診断、予後、予測、および診断的心理療法の偏見および非信頼性を除去、または全般的に減少させるという点で、上述した障壁を克服する。加えて、それは、定量的および再生可能な測定値により生成され、かつ、古典的な組織病理法に対して校正されているアルゴリズムによって分析される組織タイプのスペクトルデータベースへのアクセスを許容する。この方法を介して、例えば、異常なおよびガン性の細胞は、標準組織病理方または他のスペクトル技術を含む関連技術によって識別され得るより先に検出され得る。

本発明の幾つかの態様に係る一つの方法が図３のフローチャートに例示されている。図３に示すように、その方法は、生体切片を得ること３０１、生体切片のスペクトルイメージを得ること３０２、同じ生体切片の視覚イメージを得ること３０３、およびイメージ登録を実行すること３０４、の工程を全般的に含んでいる。登録されたイメージは任意的に訓練の対象とされることがあり３０５、また医療診断が得られることがある３０６。

［生体切片］
図３に示す本発明の方法の例によれば、生体切片を得るステップ３０１は、人間または動物のような個体からの組織または細胞材料の抽出に関連する。組織切片は、これらに限定されるものではないが、コアおよびパンチ生検、並びに切削を含む方法により取得することができる。細胞材料は、これに限定されるものではないが、スワッビング（剥奪）、ウォッシング（洗浄）、および微細針穿刺吸引（ＦＮＡ）を含む方法によって得ることができる。

スペクトルおよび視覚のイメージ獲得の対象とされるべき組織切片は、標準的な組織病理法において用いられる方法に従って、冷凍からまたはパラフィン埋め込み組織ブロックから準備され得る。切片は、スペクトルデータ収集および視覚病理法のために用いられることができるスライド上に載置できる。例えば、その組織は、これに限定されるものではないがフッ化カルシウム（ＣａＦ２）を含む材料を備える赤外線透過顕微鏡スライドの上に、または、市販されている「低放射（low-e）」スライドのような赤外線反射スライド上に載置することができる。載置の後に、パラフィン埋め込みサンプルは、脱パラフィンの対象とすることができる。

［スペクトルイメージ］
本発明の幾つかの態様によれば、図３に示す生体切片のスペクトルイメージを得るステップ３０２は、図３Ａのフローチャートにおいて概説されているように、生体切片からスペクトルデータを得ること３０８、データ前処理を実行すること３１０、多変量解析を実行すること３１２、および生体切片のグレースケールまたは擬似カラーイメージを作成すること３１４、を含むことができる。

［スペクトルデータ］
図３Ａに示したように、生体試料からのスペクトルデータは得ることができる４０１。組織サンプルのような染色されていない生体試料からのスペクトルデータは、サンプルの化学組成のスナップショットを捕えるために得ることができる。そのスペクトルデータは、各ピクセルが大凡細胞核のサイズであるピクセル細目の組織切片から集めることができる。各ピクセルは、それ自身のスペクトルパターンを有しており、サンプルからのスペクトルパターンが比較される際に、それらは、組織の生化学組成の中に小さいが繰り返される相違を示し得る。

スペクトルデータは、これに限定されるものではないが、赤外、ラマン、テラヘルツおよび蛍光性の分光法を含む方法により収集することができる。赤外分光法は、これに限定されるものではないが、減衰全反射法（ＡＴＲ）および減衰全反射法フーリエ変換赤外分光法（ＡＴＲ−ＦＴＩＲ）を含むことができる。一般に、赤外分光法は、ラマン分光法によっても呈されるその指紋感度のために用いることができる。赤外分光法は、ラマン分光法に比して、より大きな組織切片に対して、より扱い易いサイズのデータセットを提供するために用いることができる。さらにまた、赤外分光法データは、完全自動データ収集および解釈によりなじむことができる。加えて、赤外分光法は、様々な組織構造の検出および疾患診断のために必要な感度および選択性を有することができる。

スペクトルデータの輝度軸は、一般に、吸光度、反射率、放射力、散乱輝度または光力についての他の何れかの適切な測定値を表す。波長は、電磁放射の実際の波長、波数、振動数、またはエネルギーと関連することがある。

赤外線データの収集は、現在利用できるフーリエ変換赤外線イメージングマイクロ分光計、量子カスケードまたは非線形光デバイスのような調節可能なレーザを基にしたイメージング機器、或いは異なる技術に基づいた機能的に均等な機器を用いて実行することができる。調節可能なレーザを使用したスペクトルデータの取得は、参照により本明細書に組み込まれる"Tunable Laser-Based Infrared Imaging System and Method of Use Thereof"と題された米国特許出願番号第１３・０８４，２８７に更に記述されている。

本発明の幾つかの態様に係る１つの方法によれば、病理法者または技術者は、染色前の組織について集められたハイパースペクトルデータセットに基づいて、染色組織切片のいかなる部位も選択することができ、かつ、リアルタイムでその組織領域の分光法に基づいた評価を受け取ることができる。スペクトルデータは、選択された未染色の組織サンプルのピクセルの各々について集められ得る。収集されスペクトルの各々は、組織ピクセルの各々の化学組成の指紋を含んでいる。スペクトルデータの獲得については、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／１４６４２５に記述されている。

一般に、スペクトルデータは、nおよびmが、それぞれイメージのxおよびy座標におけるピクセル数であるものとして、N=n・mの個別スペクトルまたはスペクトルベクトル（吸収、放出、反射率その他）を含む構成物であるハイパースペクトルデータセットを含んでいる。各スペクトルは、サンプルの目立ったピクセルと関連しており、１≦x≦nおよび１≦y≦mであるものとして、その座標xおよびyにより位置付けることができる。各ベクトルは、周波数または波数領域において通常は等間隔に設置されるk輝度データポイントを有している。

スペクトルイメージのピクセルサイズは、一般に、細胞より小さな解像度が得られるように、典型的な細胞のサイズより小さく選択されることがある。そのサイズは、赤外光において５μｍから７μｍ程度である光の回折限界によっても決定され得る。このようにして、組織の１ｍｍ^２切片に対して、約１４０^２〜約２００^２の個別ピクセル赤外線スペクトルが集められ得る。スペクトルの「ハイパーキューブ」Ｎピクセルの各々について、そのｘおよびｙ座標、並びにその輝度ベクトル（輝度対波長）が格納される。

［前処理］
スペクトルデータを前処理の形式にならすことは、興味がある細胞材料に関するデータを分離して、交絡したスペクトルの特徴を除去するために有用であることがある。図３Ａを参照して、スペクトルデータ一旦集められると、それは、この種の前処理３１０にさらされ得る。

前処理は、興味ある細胞データを分離するために、サンプルとされた領域の、診断領域を非診断領域から切り離すための二値化マスクを作ることを含むことがある。二値化マスクを作る方法は、その全体が本明細書に参照により組み込まれるＷＯ２００９／１４６４２５に開示されている。

本発明の別の態様では、前処理の方法は、両者間に位相角を調整することによりスペクトルの実部と虚部の分離を最適化する「位相補正」アルゴリズムによる、観察された吸収スペクトルの分散的線形の修正を可能とする。この方法は、計算機的に高速であり、入力データをなんら必要としない修正された位相補正方法に基づく。適当な位相角が実験的に決定され得るＦＴＩＲおよびＮＭＲ分光法（後者の場合、インターフェログラムは、通常「自由誘導減衰（ＦＩＤ）」と呼ばれる）では未処理のインターフェログラムの前処理において位相補正が用いられるが、本発明のこの態様に係る方法は、屈折率の異常分散に基づくＭｉｅ、ＲＭｉｅおよび他の効果のような緩和要素を考慮に入れる点、および遡及的にスペクトルデータに適用され得る点において、従前の位相補正アプローチとは異なっている。

本発明のこの態様の前処理方法は、逆ＦＴ変換によって破損したスペクトルをフーリエ空間に変換する。逆ＦＴは、結果として実および虚インターフェログラムを生み出す。各インターフェログラムの後半は個々にゼロフィリングされ、また、順ＦＴ変換される。このプロセスは、数的ＫＫ変換を経て得られる同じ分散帯域形状を呈する実スペクトル部分と、吸収線形を含む虚部とを生み出す。両者間の正しい補正位相角を伴う上記の実及び虚の部分を再結合することにより、位相が補正され、かつ人為的影響を逃れたスペクトルが得られる。

汚染されたスペクトルを修正するために必要とされる位相が実験的に決定することができず、またスペクトル間で変化することから、位相角は、ユーザによる選択が可能なステップでの−９０°から９０°の間における段階的アプローチを用いて決定される。「最良の」スペクトルは、双方とも位相補正の過程で変化するピーク位置および輝度基準の分析により決定される。幅の広い波状ミー散乱貢献は、このアプローチでは、明示のために明示的に修正されはしないが、それらは、散乱のない背景を呈する第二の派生的スペクトルについて位相補正計算を実行することにより消失する。

本発明の態様によれば、図３Ａに示す前処理３１０は、図３Ｂのフローチャートにおいて概説されているように、スペクトル範囲の選択３１６、スペクトルの第二の派生の計算３１８、データの逆フーリエ変換３２０、インターフェログラムのゼロフィリング処理および順フーリエ変換３２２、並びに結果として生じたスペクトルの実部および虚部の位相補正、を含むことができる。

［スペクトル範囲］
３１６において、ハイパースペクトルデータセットの各スペクトルは、最適なスペクトル範囲（指紋領域）を選択するために前処理される。この範囲は、Ｘ−Ｈ（Ｘは、１２≦の原子番号を有する重原子）変形モードを含む、例えば約８００から約１８００ｃｍ^−１を含むことができる。線形な背景に重畳された典型的なスペクトル例を図６Ａに示す。

［スペクトルの第二の派生］
図３Ｂのフローチャートに示すように、各スペクトルの第二の派生が次に計算される３１８。第二の派生的スペクトルは、輝度対波数の二次微分により、当初のスペクトルベクトルに由来している。第二の派生的スペクトルは、サビツキー・ゴーレイ・スライディングウィンドウアルゴリズムを使用して計算することができ、また、トランケイテッド二次関数によりインターフェログラムを逓倍することによりフーリエ空間において計算することも可能である。

第二の派生的スペクトルは、緩やかに変化するミー散乱背景を含めてベースライン傾斜がないという効果を有することができる。第二の派生的スペクトルは、散乱および非共鳴ミー散乱によるベースライン効果をほとんど完全に欠くことができるが、ＲＭｉｅＳの効果をなお含んでいる。第二の派生的なスペクトルは、サンプルの厚さの変動を補償するため、必要に応じて、ベクトル的に正規化することとしてもよい。第二の派生的スペクトルの一例を図６Ｂに示す。

［逆フーリエ変換］
図３Ｂのフローチャートの３２０に示すように、データセットの各スペクトルは逆フーリエ変換（ＦＴ）に処される。逆ＦＴは、輝度対波数領域から輝度対位相差領域へのスペクトルの転換に関連する。ＦＴルーチンが、２の整数乗の長さを持つスペクトルベクトルについてのみ動作するものであるため、スペクトルは、ＦＴの前に、５１２、１０２４または２０４８（ＮＦＴ）のデータポイント長に補間されまたは切り捨てられる。逆ＦＴは、ＮＦＴ／２ポイントの実（ＲＥ）および虚（ＩＭ）インターフェログラムを生成する。この種のインターフェログラムの実部の一部を図７に示す。

［ゼロフィリングおよび順フーリエ変換］
各スペクトルの実および虚インターフェログラムの後半に続いてゼロフィリングが施される３２２。ゼロフィリングの施されたインターフェログラムは、続いて、それぞれ分散および吸収帯域形状を有する実および虚スペクトル成分を生成するため、順フーリエ変換にかけられる。

［位相補正］
フーリエ変換の結果として生じた実部（Ｒｅ）および虚部（ＩＭ）は、続いて、図３Ｂのフローチャートに示すように位相補正される３２４。これによって、以下の式で示されるような位相シフトの施された実部（ＲＥ’）および虚部（ＩＭ’）が生成される。

但し、φは位相角である。

位相補正のための位相角φが既知ではないため、その位相角は、ユーザの定めた増加幅で−Π／２≦φ≦Π／２の間で変化することができ、また、最も剰余分散線形の少ないスペクトルを選択することができる。図８に示すように、位相補正の後に最も大きい輝度を発生する位相角は破損していないスペクトルであるとみなすことができる。矢によって印付けられ「オリジナルスペクトル」と称されている太い軌跡は、ＲＭｉｅＳ貢献によって汚染されたスペクトルである。薄い軌跡は、様々な位相角を伴う位相補正に応じてスペクトルがどのように変化するのかを示している。第二の太い軌跡は、汚染されていないスペクトルと良好に整合する回復スペクトルである。図８に示すように、最高の修正スペクトルは、約１６５５ｃｍ^−１のか所で最も高いアミドＩ輝度を呈する。このピーク位置はスペクトルが汚染される前のその位置に整合する。

３１８〜３２４において、本発明の幾つかの態様に係る位相補正方法は、吸収および派生のスペクトルの双方について良好に機能する。この方法は、図９Ａに模式的に示すようにベースライン傾斜を模倣する散乱効果によって吸収スペクトルが汚染された場合に、結果として生ずる補正スペクトルを汚染するであろう、スペクトル境界で強く曲げられる効果を、図９Ｂに示すように順ＦＴの虚部が呈するという点において、吸収スペクトルが使われた場合に生ずることのある複雑さでさえも解決する。第二の派生スペクトルの使用は、その派生が背景の傾斜を除去し、これにより人為的影響が皆無なスペクトルが得られることから、この効果を除去することができる。階層的クラスタ分析、或いは他の適切なセグメント化または診断的アルゴリズムによるスペクトルデータセットの次の分析が何れにせよ第二の派生スペクトルに対して実行されるため、第二の派生スペクトルに対して分散補正を行うことは、同様に有効である。第二の派生スペクトルは、スペクトルピークのサインの反転を呈する。このため、最も大きい負の輝度を生じさせる位相角が探索される。この方法による値は、人工的に汚染されたスペクトルから実証することができる。すなわち、反射成分を伴う汚染は常にその輝度を減少させることから、汚染されていない、または「補正された」スペクトルは、１６５０と１６６０ｃｍ^−１の間のアミドＩ帯域において最大の（負の）帯域輝度を有するものとなる。

［例１−位相補正アルゴリズムの実施］
位相補正アルゴリズムの実施の例を図１０および１１に提供する。この例は、人間のリンパ節組織切片から集められたデータセットに基づいている。リンパ節は、図１０Ａにおいて黒色の矢によって示されている、嚢下に確認された乳ガン微小転移巣を有している。この顕微鏡写真は、グレイの矢によって示されている活性リンパ球の領域における細胞質と同様に、ガン領域における明白な細胞核を示している。これらのサンプルの異質性は共に大きなＲＭｉｅＳ効果に貢献する。

この例のリンパ節切片に対して階層的クラスタ分析（ＨＣＡ）によるデータセグメンテーションを最初に実施したところ、図１０Ｂに示すイメージが得られた。ガン組織（濃緑色および黄色）を嚢（赤）およびリンパ球（残りの色）から区別するためには、１０のクラスタが必要であるうえ、これらの組織タイプの特徴は貧弱であった。図１０Ｂにおいて、赤で示された嚢は、複数のスペクトルの分類を含んでおり、それらは１つのクラスタに結合された。

このデータセットをセグメント化することの困難は、図１０Ｃの検査によって評価することができる。この描画図は、各スペクトルにおけるアミドＩ振動帯域の周波数ピークを表している。図の右側のカラースケールは、リンパ節ボディのピークが約１６３０〜１６６５ｃｍ^−１の間に、また嚢については１６３５〜１６６５ｃｍ^−１の間に生ずることを示している。ペプチドおよびタンパク質に対するアミドＩ周波数が第二タンパク質構造に応じて１６５０〜１６６０ｃｍ^−１までの範囲に発生するべきことが広く知られていることから、アミドＩ周波数の広がりはＲＭｉｅＳ効果によって重度に汚染されたデータセットにとっては典型的なことである。図１０Ｄは、位相補正に基づくＲＭｉｅＳ補正後の同一組織切片のイメージを示す。リンパ節のボディ内部において、アミドＩピークの周波数変動は１６５０〜１６５４ｃｍ^−１の範囲に、また、嚢については１６５７〜１６６５ｃｍ^−１の範囲に縮小されている（嚢における繊維連結性タンパク質は、高アミドＩ帯域位置を呈することが知られているタンパク質であるコラーゲンから大部分成っていることが公知である）。

続くＨＣＡからの結果を図１１に示す。図１１Ａにおいてガン組織は赤で示されている。ガン領域の輪郭は、図１１Ｂ（この図は１０Ａと同じである）に示されるＨ＆Ｅに基づく組織病理法とよく一致している。嚢は、嚢は２つの異なる組織クラス（ライトブルーおよび紫）によって表されており、活性化されたＢリンパ球がライトグリーンで示されている。組織球およびＴリンパ球は、ダークグリーン、グレイおよび青の領域で示されている。図１１Ａに表された領域は、視覚による組織病理法によく整合しており、また、本明細書に記述された位相補正方法がスペクトル組織病理法の品質を大幅に改善することを示している。一つの態様において、狭帯域の正規化は、イメージの品質を増強および／または改善するために用いることも可能であり、それはイメージの登録精度についても有用であり得る。狭帯域の正規化では、広帯域スペクトル領域の中で特徴および／または特徴のサブセットを選択することができ、かつ、選択された特徴に重み付けをすることができる。

スペクトル補正についての従前方法に対する本発明の幾つかの態様に係る前処理方法の効果は、その方法が約５０００スペクトル／秒の高速実行時間を提供すること、およびデータセットに関する先験的な情報をなんら必要としないこと、を含んでいる。加えて、位相補正アルゴリズムは、ＳＣＰおよびＳＨＰにおける自動ガン検出および診断のためのスペクトルイメージングおよび「デジタル染色」診断ルーチンに組み込むことができる。更に、位相補正はメージの品質を大きく改善し、その改善はイメージの登録精度に対して、および診断のアライメントおよび境界表現において有用である。

更に、本発明の幾つかの態様に係る前処理方法は、反射成分によって汚染された広域に渡る吸収スペクトルの補正に用いることができる。この種の汚染は、分散反射フーリエ変換分光法（ＤＲＩＦＴＳ）、減衰全反射（ＡＴＲ）、並びにコヒーレント反ストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）において存在することがあるような、複合屈折率または電気感受率の実部と虚部の混合を有意な程度に生じさせる他の形式の分光法のような、帯域形状が分散線形によって歪められるもののような、他のタイプの分光法において頻繁に発生する。

［多変量解析］
図３Ａのフローチャートの３１２において概説しているように、スペクトル差を検出するために前処理スペクトルデータについて多変量解析が実行され得る。特定の多変量解析では、類似性に基づいて複数のスペクトルがグループ化される。グループの数は、与えられた生体サンプルについて要求される分化のレベルに基づいて選択され得る。一般に、グループの数がより大きいほど、スペクトルイメージ内に見られるものが詳細となる。詳細さについての要求が小さい場合は、使用されるグループの数をより少なくすることができる。本発明の態様によれば、ユーザは、スペクトル差の要求レベルを達成するためにグループの数を調整することができる。

例えば、ＨＣＡおよび主成分分析（ＰＣＡ）のような管理されていない方法、これに限定されるものではないが人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮｓ）、階層的人工ニューラルネットワーク（ｈＡＮＮ）、サポートベクターマシン、および／または「ランダムフォレスト」アルゴリズムを含む機械学習アルゴリズムのような管理された方法は、用いることができる。管理されていない方法は、それぞれ、データセットにおける類似または相違に基づいており、セグメント化またはクラスタ化のためのデータセットを除いて何らの情報をも必要とすることなく、これらの基準によりデータセットをセグメント化し、またはクラスタ化する。このようにして、これらの管理されていない方法は、データセットにおける自然な類似または相違（変化）に基づいてイメージを生成する。一方、管理されているアルゴリズムは、例えばガン、筋肉または骨の代表的スペクトルのような基準スペクトルを必要とし、特定の類似基準に基づいて、データセットをこれらの基準スペクトルに分類する。

ＨＣＡ技術は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBird（Bird他、"Spectral detection of micro-metastates in lymph node histo-pathology"、J. Biophoton. 2, No. 1-2, 37-46 (2009)）に記述されている。ＰＣＡは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるWO2009/146425に記述されている。

本発明の幾つかの態様との関係で使用するための管理されている方法の例は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれるP. Lasch他、"Artificial neural networks as supervised techniques for FT-IR microspectroscopic imaging" J. Chemometrics 2006 （以下"Lasch"）, 20, 209-220、M. Miljkovic他、"Label-free imaging of human cells: algorithm for image reconstruction of Raman hyperspectral datasets"（以下"Miljkovic"）, Analyst, 2010, xx, 1-13、およびA. Dupuy他、"Critical Review of Published Microarray Studies for Cancer Outcome and Guideline on Statistical Analysis and Reporting", JNC1, Vol. 99, Issue 2 January 17, 2007（以下"Dupuy"）に記述されている。

［グレースケールまたは擬似カラースペクトルイメージ］
多変量解析からの類似グループに分類されたデータには、同じカラーコードが割り当てられ得る。図３Ａのフローチャートの３１４に表したように、分類されたデータは「デジタル的に染色された」グレースケールまたは擬似カラーマップを構成するために用いることができる。従って、この方法は、スペクトルデータに含まれる化学情報にだけ、または主として、基づく生体試料のイメージを提供することができる。

ＨＣＡによる多変量解析後に準備されたスペクトルイメージの一例を図１２Ａおよび１２Ｂに提供する。図１２Ａは、約０．５ｍｍ×１ｍｍを計測する、染色された頸部イメージの切片の視覚的微視的イメージである。扁平上皮の典型的な層が示されている。図１２Ｂは、ＨＣＡによる多変量解析の後、その組織の染色前に構成された擬似赤外線スペクトルイメージである。このイメージは、互いにデータセット内で数学的に関連するスペクトルにより生成され、かつ、スペクトルの類似性だけに基づいており、つまり、コンピュータアルゴリズムには何らの基準スペクトルも提供されていない。図１２Ｂに示すように、ＨＣＡスペクトルイメージは、図１２Ａに示すように標準的な顕微鏡検査法を用いて適切な染色の後（例えば、Ｈ＆Ｅ染色によって）に見ることができる組織構造を再生することができる。加えて、図１２Ｂは、（ａ）におけるケラチンの堆積や（ｂ）における免疫細胞による浸透を含む、図１２Ａにおいては容易に検出することのできない特徴を示している。

ＨＣＡ分析による擬似カラースペクトルイメージの構築は、Birdにおいて述べられている。

ＡＮＮによる分析後に準備されるスペクトルイメージの一例を図１３Ａおよび図１３Ｂに提供する。図１３Ａは、Ｈ＆Ｅ染色腋窩リンパ節切片の一切片の視覚的微視的イメージである。図１３Ｂは、図１３Ａの組織染色の前に集められる赤外線データセットのＡＮＮ分析から生成された赤外線スペクトルイメージである。

［視覚イメージ］
図３に示されるように、３０２において取得された生体切片と同じ視覚的イメージが、３０３によって示されるように獲得され得る。
上述したステップ３０１においてスライドに適用された生体サンプルは、染色されてもよく、または、一またはそれより多くのＨ＆Ｅおよび／またはＩＨＣ染色のような方法で染色されてもよく、かつ、カバースリップ加工されてもよい。視覚イメージの例は、図１２Ａおよび図１３Ａに示す。

組織病理サンプルの視覚イメージは、病理法の研究室で共通に用いられているもののような標準的な視覚顕微鏡を用いて得ることができる。顕微鏡は、デジタル的に顕微鏡の視野を捕える高解像度デジタルカメラと連結することができる。このデジタルリアルタイムイメージは、組織の染色部分の標準的な顕微鏡視に基づき、組織構造、細胞形態学および染色パターンを表す。デジタルイメージは、写真を作成するために、例えばイメージの縫合を経て結合された多数のピクセルタイルを含むことができる。本発明の幾つかの態様によれば、分析のために用いられるデジタルイメージは、写真に縫合結合される個別タイルまたは多数のタイルを含むことができる。このデジタルイメージは、保存されてコンピュータスクリーンに表示されることができる。

［スペクトルおよび視覚のイメージ登録］
本発明の幾つかの態様に係る１つの方法によれば、スペクトルおよび視覚のイメージが一旦獲得されると、染色組織の視覚イメージが、図３のフローチャートの３０４に示すように、デジタル的に染色されたグレースケールまたは擬似カラースペクトルイメージと共に登録され得る。一般に、イメージ登録は、データの異なるセットを１つの座標系に変換または整合させるプロセスである。イメージ登録は第一のイメージを第二のイメージに整合させる空間的な整合または変換を含む。第一のイメージのピクセルと第二のイメージのピクセルはその座標系の同一点に一致する。それらのイメージは、異なるタイプのデータを含むことがあり、また、イメージ登録は異なるタイプのデータの整合または変換を可能とする。一つの態様において、その変換は、スケールド(scaled)リジッドボディ変換を含むことができる。なお、その変換は、サンプルの染色がサンプルを不均一に縮小させてしまった場合、歪ませる工程(warping)を含むことがある点に留意する必要がある。コンピュータシステムで使用できる変換方程式の例は、下記を含んでいる。
u=u0+scale*(x*cos(θ)-y*sin(θ))
v=v0+scale*(x*sin(θ)+y*cos(θ))

但し、(u0, v0)は起点のシフト、θはラジアンで表した回転角、scaleは倍率、(x, y)はＨＣＡイメージにおける座標、(u, v)はＨ＆Ｅ（視覚イメージ）における座標である。

本発明の幾つかの態様によれば、イメージ登録は数多くの方法で実行することができる。例えば、視覚およびスペクトルのイメージのために共通の座標系を確立することとしてもよい。共通の座標系の確立が不可能である、または要求されない場合は、それらのイメージは、一つのイメージを他のイメージに整列させるためにポイントマッピングによって登録することとしてもよい。ポイントマッピングでは、双方のイメージ上で、それらのイメージにおける同じ特徴またはランドマークを識別する制御点が選択される。双方のイメージの空間的マッピングは、制御点の位置に基づいて実行することができる。例えば、少なくとも２つの制御点を用いることができる。イメージを登録するために、可視イメージの制御点は、スペクトルイメージの対応する制御点と相互に関連することができ、かつ一緒に整列配置されることができる。

一つの態様では、スケールドボディ変換の変換パラメータを決定するために少なくとも２つの制御点を用いることができる。変換パラメータは、登録されたイメージ（例えば 重ねあわされたイメージ）内でマッピングされた制御点の間で、エラーを最小化するために選択することとしてもよい。例えば、変換パラメータを決定するために２つの制御点が用いられた際には、変換のための２つの解が計算システムによって生成されることがある。計算システムは、生成された２つの解の１つを、例えば、イメージの方向に基づいて選択することができる。しかしながら、変換パラメータを決定するために３つの制御点が用いられる場合は、計算システムによって変換のための固有の解を生成することができる。このようにして、スケールドボディ変換のパラメータを決定するために、計算システムによって２つを超える制御点が用いられることがある。加えて、制御点の数が増えるに連れて、変換の精度も向上し、および／または改善され得る。

本発明の幾つかの態様に係る１つのバリエーションにおいて、制御点は、生体試料を含むスライド上に照合マークを配置することにより選択されることがある。照合マークは、これに限定されるものではないが、インク、塗料、およびこれに限定されるものではないがポリエチレンを含む材料の一部を含むことができる。照合マークは、いかなる適切な形状またはサイズをも有することができ、それらが視野の中にある限りにおいて、スライドの中心、端または角に置かれ得る。照合マークは、生体試料が準備されている間にスライドに加えられることとしてもよい。これに限定されるものではないが、ポリエチレンのような化学物質および生物学的物質を含む、周知のスペクトルパターンを有する材料が照合マークにおいて用いられた場合、それは、生体試料のスペクトルデータの正確性を検証するための校正マークとしても使用され得る。

本発明の幾つかの態様に係る他のバリエーションにおいて、病理法者のようなユーザは、スペクトルまたは視覚のイメージにおいて制御点を選択することができる。このユーザは、これに限定されるものではないが端および境界を含む視覚およびスペクトルのイメージの目立った特徴についての知識に基づいて制御点を選択することができる。細胞および組織のような生物学的イメージについては、制御点が、イメージ内の生物学的な特徴の何れかから選択される。例えば、この種の生物学的特徴は、これに限定されるものではないが、一群の細胞、細胞の有糸分裂の特徴、細胞のうねまたは巣、歯槽や気管支のようなサンプル空隙、および不規則なサンプル端を含むことができる。スペクトルおよび視覚のイメージにおける制御点のユーザ選択は、個人的なおよび／または特別注文的な使用のための訓練相関を提供するために用いられるリポジトリに保存することができる。このアプローチによれば、主観的に最高である演習を制御点の選択プロセスに組み込むことができる。

本発明の幾つかの態様に係る他のバリエーションでは、制御点を選択するために、スペクトルおよび視覚のイメージにおける目立った特徴の、ソフトウェアに基づく認識が用いられることがある。ソフトウェアは、視覚またはスペクトルのイメージにおける目立った特徴に対応する少なくとも一つの制御点を検出することができる。例えば、特定のクラスタ領域における制御点は、スペクトルイメージにおいて選択することができる。クラスタパターンは、視覚イメージの類似の特徴を識別するために用いることができる。制御点は、スペクトルイメージからのピクセルを視覚イメージからのピクセルにデジタル的に関連付けるために用いることができる。別の態様においては、ソフトウェアは、制御点の選択のために、イメージ内の形態的な（例えば形状の）特徴を用いることができる。その形態的な特徴は、例えば、切片の形状、組織間の空間の形状、および／または、（例えば、ＩＨＣ剤などによる生体試料の染色の結果である）組織内の染色領域の形状に関係することができる。このように、制御点を選択するためには、視覚イメージにおいて発生し、また、スペクトルイメージにも発生する形状を如何なるものであっても用いることができる。

双方のイメージにおける特徴は、移動、回転および拡大縮小により整列配置することができる。移動、回転および拡大縮小は、例えば、特徴選択の選択後にマッピングの関係またはモデルを発展させることにより、自動化または半自動化することもできる。この種の自動プロセスは、例えば、登録の最適化のためにその後に再びサンプリングの対象とされ、移動されることのあるマッピング関係の近似を提供することができる。再サンプリングの技術には、これに限定されるものではないが、最近隣、リニア、および三次の補間法が含まれる。

制御点が一旦整列配置されると、座標P₁(x₁, y₁)を有するスペクトルイメージのピクセルを、座標P₂(x₂, y₂)を有する視覚イメージの対応ピクセルに整合させることができる。この整列プロセスは、スペクトルおよび視覚のイメージ内のピクセルの全てまたは選択された部分に適用することができる。スペクトルおよび視覚のイメージにおける各々のピクセルは、一旦整列配置されると一緒に登録することができる。この登録プロセスにより、スペクトルイメージおよび視覚イメージの各々におけるピクセルは、対応するイメージのピクセルにデジタル的に連結され得る。本発明の幾つかの態様に係る方法によれば、同じ生体サンプルを分光的および視覚的にテストすることができるため、視覚およびスペクトルのイメージを正確に登録することができる。

正しい試料にアクセスしていることを検証するために、スライドには、数値コード、バーコードのような識別マークを加えることができる。基準および識別のマークは、生体試料の視覚イメージを表示するか、或いはそうでなければ保存するコンピュータによって認識され得る。このコンピュータは、イメージ登録に用いられるソフトウェアをも含むことができる。

本発明の一態様に係るイメージ登録の一例を図１４Ａ〜図１４Ｃに例示する。図１４Ａは、小細胞肺ガン組織サンプルの視覚イメージであり、また、図１４ＢはＨＣＡで処理された同じ組織サンプルのスペクトルイメージである。図１４Ｂは、図１４Ａの視覚イメージの右上領域の大部分からのスペクトルデータを含んでいる。図１４Ａの視覚イメージが図１４Ｂのスペクトルイメージに登録された結果を図１４Ｃに示す。図１４Ｃに示すように、図１４Ｂのスペクトルイメージにおいて容易に見ることのできる、複数の点と輪郭１−４を含む囲まれた領域は、図１４Ａの顕微鏡イメージにおいて見ることのできる複数の点および輪郭に密接に対応している。

スペクトルおよび視覚のイメージにおけるピクセルの座標が一旦登録されると、それらはデジタル的に一緒に格納され得る。イメージの全体、またはイメージの一部を格納することができる。例えば、全サンプルのイメージに代えて、診断の領域をデジタル的に格納することができる。これにより、データストレージ要求を著しく低減させることができる。

特定のピクセル領域をスペクトルまたは視覚のイメージの何れかで視認したユーザは、他方のイメージの対応するピクセル領域に直ちにアクセスすることができる。例えば、病理法者は、マウスをクリックしたり、或いはジョイスティックを制御したりすることにより、スペクトルイメージの如何なる領域をも選択することができ、そのスペクトルイメージに登録される視覚イメージの対応領域を視認することができる。図１４Ｄは、本発明の幾つかの態様に係る、図１４Ｃの登録イメージのためのグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）の一例である。図１４Ｄに示すＧＵＩによれば、病理法者は、視覚、スペクトル、および登録イメージ間を切り換えて、興味のある特定部分を調べることができる。

加えて、病理法者が一つのイメージを移動するかまたは操作するに連れて、彼／彼女は、それが登録されている他方のイメージの対応する部分にもアクセスすることができる。例えば、病理法者がスペクトルイメージの特定部分を拡大する場合、彼／彼女は、倍率の同じレベルで視覚イメージの同じ部分にアクセスすることができる。

視覚顕微鏡システムの動作パラメータは、顕微鏡倍率や倍率の変更などと同様に、計測器に特有のログファイルに格納することもできる。ログファイルは、アルゴリズムの訓練のため、後に注釈記録および対応スペクトルピクセルを選択するためにアクセスを受けることができる。このようにして、病理法者はスペクトルイメージを操作することができ、そして、そのスペクトルイメージとそれに登録されるデジタルイメージは、双方とも後に適切な倍率で表示される。この特徴は、例えば、操作した登録イメージの、事後的視認或いは遠隔視認のための電子的送信のためのデジタル的保管をユーザにとって可能とすることから、有用であり得る。

本発明の幾つかの態様に係る方法の訓練ステップの間に訓練スペクトルを抽出するために、イメージ登録は、組織切片、細胞切片、および／または既知の診断的、予後的および／または予測的使用を有する他の生体サンプルについて用いることができる。訓練ステップの間、染色組織の視覚イメージは、ＨＣＡのような管理されていないスペクトルイメージに登録され得る。イメージ登録は、組織切片に対して診断的、予後的および／または予測的使用をするときにも使われ得る。例えば、組織切片の管理されているスペクトルイメージは、その対応する視覚イメージに登録することができる。このようにして、ユーザは、選択されている登録イメージ内のいかなる位置に基づいても、診断的、予後的および／または予測的使用を得ることができる。

本発明の幾つかの態様に係るイメージ登録は、生体試料を分析する従来の方法に勝る多数の利点を提供する。例えば、それは、分析生体材料の製作時に、生体サンプルの生化学的内容を極めて感度良く反映するスペクトルイメージに依拠することを病理法者にとって可能とする。これにより、それは、微小転移巣を含む小異常、前ガンまたはガン細胞の検出において、関連技術に比して著しく大きな精度を提供する。このため、病理法者は、生体サンプルの視覚イメージについての彼／彼女の主観的観察を彼／彼女のサンプル分析の基礎とする必要がない。このため、例えば、病理法者は、単純にスペクトルイメージを調べることができ、必要に応じて、彼／彼女の所見の検証のために、登録されている視覚イメージの関連部分を容易に参照することができる。

加えて、本発明の幾つかの態様に係るイメージ登録方法は、デジタルデータ、すなわちスペクトルおよび視覚のイメージのピクセルの相関に基づいているため、Birdの従来の方法（Bird他、"Spectral detection of micro-metastates in lymph node histo-pathology", J. Biophoton. 2, No. 1-2, 37-46 (2009)）より高い精度を提供する。Birdは、イメージからの如何なるデジタルデータについても相互に関連付けることがなく、その代わりに、物理的なイメージの重ね合わせによって隣接する組織切片のスペクトルおよび視覚イメージを視覚的にマッチさせるためにユーザのスキルに依存するだけである。このため、本発明の幾つかの態様に係るイメージ登録方法は、異常又はガン性細胞に関して、より正確で、かつ再生可能な診断を提供する。これは、例えば、異常やガンの兆候を検出するのが難しい場面で、疾患の初期段階において正確な診断を提供する点において有効であり得る。

一つの態様においては、スペクトルイメージと視覚イメージとの間で自動的にイメージ登録を生じさせることとしてもよい。計算システムは、例えば、図５Ａ〜図５Ｃに示すように、イメージの特徴に基づいてスペクトルイメージと視覚イメージを自動的に登録することができる。加えて、計算システムは、図４Ａおよび図４Ｂに例示するように、スペクトルイメージと視覚イメージをイメージの特徴から独立した座標に基づいて自動的に登録することができる。

次に図４Ａおよび図４Ｂを参照して、本発明の幾つかの態様に従ってイメージの特徴から独立した座標に基づいてイメージ登録を実行するための自動方法４００の一例を示す。例えば、その方法は、スペクトルイメージと視覚イメージとが、顕微鏡試料台で用いられる試料台プレートのような同一のスライド保持器を用いて捕えられた際に用いることができる。スライド保持器によれば、各顕微鏡内に空間的な精度および精度を伴って生体試料を配置することができる。

その方法は、視覚収集装置内の生体サンプルを有するスライド保持器上の複数の照合マークの座量位置の受領を含むことができる４０２。視覚収集装置は、これに限定されるものではないが、生体サンプルのイメージを捕えることのできる顕微鏡を含むことができる。加えて、スライド保持器は、図４Ｃに示すように、スライド保持器上の座標位置をマーキングする複数の照合マークを含むことができる。

ここで図４Ｃを参照して、例示されているのは本発明の幾つかの態様に係るスライド保持器４２６の一例である。スライド保持器４２６は、生体サンプルを嵌入するためのスロット４２８を含むことができる。生体サンプルは、これに限定されるものではないが、細胞および組織を含むことができる。加えて、スライド保持器４２６は、スライド保持器４２６上の位置をマーキングする複数の照合マーク４３０、４３２および４３４も含むことができる。別の態様においては、複数の照合マークを直接スライドに配置して、スライド保持器に代えてスライド上の位置をマーキングすることができる。照合マーク４３０、４３２および４３４は、座標位置、例えば(x, y)を、各々有することができる。照合マーク４３０、４３２および４３４の各々からの座標は、生体サンプルのデータを取得する間に用いることのできる座標系を定めることができる。なお、一つの実現例では、座標系を決定するために少なくとも２つの照合マークが用いられ得ることに留意する必要がある。例えば、２つの照合マークの座標が用いられた場合は、計算システムによってその座標系に対して２つの解が生成される。計算システムは、生体サンプルの方向に基づいて、生成された２つの解の１つを選択することができる。例えば、計算システムは、生体試料の上下が反転されない、および／またはひっくり返されないとの仮定に基づいてその解を選択することができる。座標系を決定するために３つの照合マークが用いられる場合は、計算システムにより座標系に固有な解決を生成することができる。このようにして、照合マークの数が増えほど、変換の精度も増加および／または改善され得る。

再び図４Ａを参照して、スライド保持器上の照合マークの各々の座標位置は、視覚収集装置から受領することができる。一つの態様においては、視覚収集装置に通じる計算システムが、スライド保持器上の複数の照合マークの座標位置を受領することができる。例えば、視覚収集装置（例えば顕微鏡）は、照合マークが視野に入ってくるまで顕微鏡および／またはスライド保持器を動かし、かつ、その照合マークの座標位置を計算システムに伝送することにより、照合マークの各々をスライド保持器の上に配置するようにプログラムされることができる。別の態様では、ユーザは、照合マークの座標位置を計算システムに入力することができる。例えば、そのユーザは、各照合マークが見えてくるまで顕微鏡および／またはスライド保持器を動かすことができ（また、顕微鏡の内部で、照準器のようなインジケータ同士を整列配置させることができ）、かつ、そのユーザは、顕微鏡に表示された座標を計算システムに入力することができる。このように、スライド保持器上の照合マークの座標位置を捕えて、その座標情報を計算システムに送信するためには、自動化された、或いはそうではない様々な機構が用い得る点に留意することが必要である。

その方法は、視覚イメージ収集装置から生体サンプルの視覚イメージを受領することを含むこともできる４０４。例えば、視覚イメージ収集装置は、視覚イメージ収集装置により捕えられた生体サンプルの視覚イメージを計算システムに伝送することができる。

加えて、その方法は、視覚イメージを有するスライド保持器上の複数の照合マークの座標位置を結びつけること４０６、および視覚イメージ座標位置と視覚イメージを保管すること４０８を含むことができる。一つの態様では、計算システムは、受領した照合マークの座標位置を受領した視覚イメージに結びつけることができ、かつ、その視覚イメージ座標位置および視覚イメージを、例えば、一つのデータリポジトリに格納することができる。一つの態様では、計算システムは、受領した視覚イメージ座標を保管しているファイルを、受領した視覚イメージを保管しているファイルに結び付けることができる。

その方法は、スペクトルイメージ収集装置内の生体サンプルを有するスライド保持器上の複数の照合マークの座量位置を受領することを更に含むことができる４１０。視覚イメージ収集装置において使用された生体試料を有するスライド保持器と同じものが、スペクトルイメージ収集装置においても用いられ得る点に留意する必要がある。計算システムは、スペクトルイメージ収集装置と連通していてもよく、また、スライド保持器上の複数の照合マークの各々の座標位置を、スペクトルイメージ収集装置から直接、および／またはスペクトルイメージ収集装置のユーザを介して、受領することもできる。例えば、スペクトル収集装置は、照合マークが見えてくるまで、スペクトル収集装置および／またはスライド保持器を動かして、その照合マークの座標位置を計算システムに送信することにより、照合マークの各々をスライド保持器上に配置するようにプログラムされることができる。ユーザは、照合マークの座標位置を計算システムに入力することもできる。

加えて、その方法は、スペクトルイメージ収集装置から生体サンプルのスペクトルイメージを受領することを含むことができる４１２。スペクトルイメージ収集装置は、受領した生体サンプルのスペクトルイメージを計算システムに伝送することができる。

その方法は、スペクトルイメージを有するスライド保持器上の複数の照合マークの座標位置を結びつけること４１４、およびスペクトルイメージ座標位置とスペクトルイメージを保管すること４１６をも含むことができる。計算システムは、受領したスペクトルイメージ座標を受領したスペクトルイメージに結び付けることができる。例えば、計算システムは、スペクトルイメージ座標を保存しているファイルに、そのファイルをスペクトルイメージに結び付けるラベルを当てはめてもよい。スペクトルイメージ座標がスペクトルイメージと同一のファイルに保存されてもよい点にも注意すべきである。

その方法は、受領した視覚イメージ座標と受領したスペクトルイメージ座標を整列配置するか、或いは結び付けることを更に含むことができる４１８。計算システムは、視覚イメージとスペクトルイメージとに共通する座標系を生成するために、スペクトルイメージ座標を視覚イメージ座標に自動的にマッピングすることができる。

その方法は、加えて、視覚イメージ座標とスペクトルイメージ座標との整列配置に基づいて受領したスペクトルイメージと受領した視覚イメージを整列配置させる登録イメージを生成することを含むことができる４２０。例えば、計算システムは、視覚イメージ座標とスペクトルイメージ座標との整列配置を用いてスペクトルイメージを視覚イメージ上に重ねて、登録イメージ自動的に生成することができる。このようにして、計算システムは、スペクトルイメージおよび視覚イメージからの特徴から独立した座標を用いて、スペクトルイメージを視覚イメージに自動的に登録することができる。

その方法は、登録イメージを保管することを任意に含むことができる４２２。計算システムは、その計算システムのユーザが登録イメージにアクセスすることができ、および／または登録イメージを変更することができるように、登録イメージをデータリポジトリに格納することができる。

加えて、その方法は、登録イメージを最適化することを任意に含むことができる４２４。例えば、計算システムは、視覚イメージ座標点をスペクトルイメージ座標点に整列配置させ、或いは対応させる最良のリジッドボディ変換を見つけるために、一つ以上の最適化を適用することができる。計算システムは、それらのイメージの整列配置を更に試みることにより登録イメージの精度を改善するために、一つ以上の最適化を用いることができる。

１つの最適化は、同じ座標系にマッピングされた重ね合わせイメージ内のスペクトルイメージと視覚イメージとの間の距離を最小化することを含むことができる。その距離は、全イメージを通じて合計されたグレースケールピクセル毎誤差の計測値であり得る。例えば、その最適化は、下記を含むことができる。
min(p)J=sum D(p, I1, I2)²
D=I2(p)-I1

但し、ｐは、選択点または照合マークに基づく登録のために用いられる同じ縮尺のリジッドボディ変換であり、D (p, ., .)は（ピクセル毎に適用される距離計測値であり、また、I2 (p)は、I1と同じ空間内にpにより変換されたI2イメージである。I1およびI2イメージは、視覚のピクセル値がＨＣＡまたはスペクトルピクセル値と直接比較することができないため、それらのイメージを同じグレースケール空間に入れるために一連の変換をスペクトルおよび視覚のイメージに適用することにより生成することができる。

或いは、別の態様において、計算システムは、登録イメージ内の全ての点の間で登録距離関数を最小化するために最適化を実行することができる。その最適化は、以下の通りにより詳細に定めることができる。

但し、イメージT_ijは視覚イメージに基づいており、I(p)_ijはスケールドリジッドボディ変換p = [u v λ θ]により更に変換され、かつTと同じ座標フレーム内に補間されたスペクトルイメージに基づいている。合計は、イメージ内の全ピクセル(i, j)に渡っている。この最適化がグレースケール距離関数D=I(p)-Tを用いている一方で、他の距離関数が、正規化された勾配磁場のような最適化において用いられ得ることに留意する必要がある。イメージTおよびIは、用いられている特定の距離関数による要求に応じて、補間され、フィルタ処理され、また、視覚およびスペクトルイメージのバージョンを変換する。異なる距離関数は、視覚およびスペクトルイメージについて異なる変換およびフィルタ処理を要求することがある。

他の最適化は、２つのイメージ（例えば視覚イメージとスペクトルイメージ）内で選択された位置対の間の最小二乗誤差の最小化を含む。一つの態様では、計算システムは、２つのイメージ（例えば視覚イメージとスペクトルイメージ）内で選択された位置対の間の最小二乗誤差を最小化するための最適化を実行することができる。例えば、その最適化は下記を含むことができる。

但し、(xi, yi)は視覚イメージ内で選択された基準点であり、(x_ｊ, y_ｊ)は、それらが視覚イメージにマッピングされた後のスペクトルイメージからの基準点であり、また、p=[u v λ θ]は登録パラメータである。

計算システムによって実行される最適化に対して最適化の限度を提供するために、様々な最適化設定が計算システムによって用いられ得る点に留意する必要がある。例えば、最適化の限度は、これに限定されるものではないが、関数評価の最大数、収束許容値、および／または変換パラメータの上下範囲を含むことができる。上下の境界は、最適化が所望の解から過剰に乖離した領域を試みるのを防ぐ点において有効であり得る。

次に図５Ａを参照して、例示されているのは、本発明の幾つかの態様に係るイメージ内の特徴に基づいてイメージ登録を精錬するための方法例５００である。計算システムは、視覚イメージのスペクトルイメージとの重ね合わせが良好に対応しない場合にイメージ登録を精錬することができる。例えば、それらのイメージの重ね合わせは、視覚イメージとスペクトルイメージとの間の整列配置がずれている生体サンプルの特徴を示すことができる。一つの態様において、計算システムは、スペクトルイメージからのイメージ特徴を可能な限り正確に視覚イメージに整列配置するためにイメージ登録精錬方法を自動的に実行することができる。計算システムは、例えば、登録の際に第一のスペクトルイメージレベルがそのスペクトルイメージ内に充分な有益情報を含んでいない場合に、第一のスペクトルイメージレベルと他のスペクトルイメージレベルとの間で切り換えを行い得る点に留意する必要がある。

その方法は、スペクトルイメージを拡大縮小すること５０２、および視覚イメージを拡大縮小すること５０４、を含むことができる。拡大縮小は、興味のある形態的な（例えば形状の）特徴が、各イメージにおいてほぼ同一サイズとなるように実行され得る。その拡大縮小は、スペクトルイメージと視覚イメージとの間に比率に基づくことができる。例えば、視覚イメージは、スペクトルイメージより高い解像度を有することができ、従って、拡大縮小は、解像度の高いイメージを解像度の低いイメージに縮尺合わせするためにそれらのイメージに上下幅を設定することを含むことができる。計算システムが使用することのできる方程式の例は下記を含む。例を拡大縮小している方程式は、以下を含む。
x_H&E=u+λ*(x_HCA*cosθ-y_HCA*sinθ)
y_H&E=v+λ*(y_HCA*sinθ-y_HCA*cosθ)

但し、(u, v)は移動を、λは縮尺因子を、そして、θは回転を表している。拡大縮小は、スペクトルイメージ基準点（例えば、ユーザによって選択された照合マーク座標および／または登録位置）を選択し、また、その選択されたスペクトルイメージ基準点を視覚イメージ基準点（例えば、ユーザによって選択された照合マーク座標および／または座標位置）にマッピングするために適用される。

その方法は、スペクトルイメージを正規化することを任意に含むことができる５０５。一つの態様において、計算システムは、スペクトルイメージのイメージ特徴を改善するために、スペクトルイメージを正規化することができる。例えば、正規化されたスペクトルイメージが視覚イメージと比較されるときに、正規化されたスペクトルイメージの特徴はよりシャープに見えることがあり、イメージの特徴のより正確な表現を提供することが可能となる。

一つの態様において、計算システムは、加重正規化をスペクトルイメージに適用できる。例えば、細胞または組織のピクセルの赤外線吸収スペクトルはタンパク質振動により支配されるため、スペクトルイメージに加重正規化を用いることは有益であることがある。タンパク質が細胞の乾燥質量の６０％超を占めることから、その一方で、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）は細胞の乾燥質量の約２０％以下を占める。従って、（大部分が１７００〜１５００ｃｍ^−１の間、アミドＩおよびＩＩの領域において観察される）タンパク質の振動は、対称（約１０９０ｃｍ^−１）および非対称（約１２３０ｃｍ^−１）リン酸ジエステル伸縮振動において大部分を観察することができる核酸の特徴より、スペクトルにおいて特段に顕著である。核酸振動の帯域の変化はガン疾患の発症と共にしばしば観察されることから、データセット中のスペクトルの低波数スペクトル領域を強調する正規化手順を利用することは有利であることがある。このアプローチは、例えば、スペクトルデータセットの初期区分の階層クラスタ分析（ＨＣＡ）を実行する際に有利であることがある。

一つの態様において、加重正規化は、スペクトルの低波数限度（一般に７７８ｃｍ^−１）に１の値を、また高波数限度（一般に１８００ｃｍ^−１）に０の値を有し、標準のベクトル正規化後にスペクトルベクトルと乗算されるランプ関数（例えば「ランプ方法」）を含むことができる。この関数の積は、タンパク質領域の重要性が抑えられた加重スペクトルベクトルを含むことがある。

別の態様では、加重正規化は領域正規化を含むことができる。領域正規化において、スペクトルＳは、タンパク質と核酸のスペクトルの特徴が異なる領域に入るように（例えば、１８００〜１４８０ｃｍ^−１の領域１と、１４７８〜７７８ｃｍ^−１の領域２）のように、２つ以上（例えば２または３）の領域に分けられる。２つ（またはより多く）の領域は、より多くの重みを低輝度スペクトル領域に加えて、別々に正規化されたベクトルであってもよい。「領域正規化」は、（例えば、１４７８と１４８０ｃｍ^−１の間に）スペクトルの不連続性を生じさせるが、例えば、正常な領域とガン性領域とを区別するためのＨＣＡにおいて要求されるクラスタの数により測定されるように、この方法は、正常な領域とガン性領域とのより良好な区別を結果として生じさせることができる。

計算システムは、登録イメージ精錬の助けとなるよう、スペクトルイメージの特徴を改善するために、スペクトルイメージの加重正規化を実行することもできる。

その方法は、スペクトルイメージおよび視覚イメージに閾値を適用すること５０６、および適用した閾値に基づいて二値化スペクトルイメージおよび二値化視覚イメージを生成すること５０８、を含むこともできる。計算システムは、スペクトルイメージに適用する閾値と視覚イメージに適用する閾値を、自動的に選択することができる。加えて、計算システムは、計算システムのユーザから閾値を受け取ることができる。

次に図５Ｂを参照して、ここには、視覚イメージ５２０ａおよびスペクトルイメージ５２０ｂに対する閾値の選択をユーザに可能ならしめるためのＧＵＩインターフェースを例示する。例えば、ユーザは、閾値をセットするためにスライダを使用することができる。ユーザがスライダを移動させるに連れて、例えば、双方のイメージにおいて組織の色が変化することができ（例えば、白に対して黒、或いは黒に対して白）、また、それらのイメージ内または他の様相の形状の視認性或いは明確性が変化することができる。ユーザは、双方のイメージ内の組織が同じ色／陰（例えば、黒または白）になり、かつイメージ内に多くのノイズを含むことなく各イメージ内に共通する形状が見えるようになったときに、スペクトルイメージおよび視覚イメージの各々のための閾値を選択することができる。スペクトルイメージおよび視覚イメージのための閾値は、同じ数であってもよく、および／または異なる数であってもよい点に留意する必要がある。

再び図５Ａを参照して、計算システムは、選択された閾値を受け取って、その適用された閾値に基づいて二値化スペクトルイメージおよび二値化視覚イメージを生成することができる。例えば、閾値以上の数を有する各ピクセルは白に変換されることができ、一方、閾値を下回る数を有する各ピクセルは黒に変換されることができる。計算システムは、それぞれのイメージごとの閾値を使用してスペクトルイメージおよび視覚イメージの全てのピクセルを黒および白にマッピングすることができる。二値化イメージ（例えば、白黒のイメージ）を生成することにより、生体サンプルの基本構成、生体サンプル内のあらゆる形態的（形状的）特徴、および／または組織内の染色領域の形状（例えば、ＩＨＣ剤などによる生体サンプルの染色の結果）と同様に、組織間の間質腔をハイライト表示することができる。このようにして、スペクトルイメージ内にも発生する視覚イメージ内で生ずることのあるあらゆる形状は、ハイライト表示することができる。

加えて、計算システムは、スペクトルの二値化イメージと、視覚の二値化イメージおよび登録イメージの一方または両方との間の差を表す差分イメージを表示することができる。ここで図５Ｃを参照して、例示されているのは、例示された差分イメージと、差分イメージ内のエラーの最小化における進展を表す点を有するグラフとを有するＧＵＩスクリーンの一例である。差分イメージは、登録イメージの適合精度の視覚的表示を提供する。一つの態様において、差分イメージは、可能な限り黒色であることができる。差分イメージが頻繁に白空間を含んでいる場合、この結果は登録イメージにおけるエラーの存在を示すことができる（例えば、イメージの重ね合わせは、整列配置からずれたイメージ特徴を示している）。反復のプロセスは、差分イメージ内でエラーが最小化される前に反復の最大数が達成されると終了され得る点に留意する必要がある。

再び図５Ａを参照して、計算システムは、二値化されたスペクトルイメージおよび視覚スペクトルイメージの最小エラー値が達成されるか、反復の最大数が達成されるか、何れか早い方が起こるまで、様々な閾値を適用し続けることができる。

その方法は、二値化スペクトルイメージおよび二値化視覚イメージに形態的閉鎖(morphological closure)を適用することを含むこともできる５１０。形態的閉鎖は、それらの二値化イメージに現れることのあるあらゆる小ドットを白領域にならすことによりそれらの二値化イメージからのノイズを除去することができる。例えば、計算システムは、イメージに境界を加え、そのドットを白に変換して白領域に入れ、および／または、それぞれ大きな白または黒の領域内の黒または白ドットを除去することにより、形態的閉鎖を二値化イメージに適用することができる。

加えて、その方法は、二値化スペクトルイメージおよび二値化視覚イメージの端部の柔軟化を含むことができる５１２。一つの態様において、計算システムは、それらの二値化メージにおける黒と白の端の間の傾斜をぼやけさせるためにガウスフィルタを使用することができる。例えば、計算システムは、最適化の収束を改善するために、その端をぼやけさせてそれらをより柔らかくするために、その端を横切って平滑化を図ることができる。

その方法は、二値化スペクトルイメージと二値化視覚イメージの間のグレースケール差の最小化を更に含むことができる５１４。例えば、計算システムは、より良好に適合する登録パラメータを得るためにスペクトルイメージと二値化メージとの間のグレースケール差を最小化するために、５０２〜５１２において上述した最適化の一つ以上を適用することができる。最適化のプロセスは、スペクトルイメージおよび視覚イメージにおける構造物が登録イメージにおいて可能な限り近くに整列配置されるまで、繰り返すことができる点に留意する必要がある。

［訓練］
図３のフローチャートにおいて提供される方法のステップ３０５に表しているように、訓練セットを任意で発展させることができる。本発明の幾つかの態様によれば、訓練セットは、数ある中でも特定の疾患または条件と結び付けられているスペクトルデータを含む。訓練セット内のスペクトルデータに対する疾患または条件の結びつきは、病理学的切片において通常発見される形態的特徴に基づくスペクトルパターンに対する古典的な病理法の相関に基づいていてもよい。それらの疾患および条件は、これに限定されるものではないた、細胞異常、炎症、感染症、前ガンおよびガンを含むことができる。

本発明の１つの態様によれば、訓練ステップにおいて、訓練セットは、疾患または条件を含む視覚イメージの領域を識別し、その視覚イメージの領域をその領域に対応するスペクトルデータに関連させ、かつ、そのスペクトルデータと対応する疾患または条件との間の関連を格納することにより発展させることができる、訓練セットは、次いでデータベースなどのリポジトリ内に保存され、その訓練セットに由来する出力を伴う診断アルゴリズムを提供するために、機械学習アルゴリズムでの利用が可能にされ得る。その診断アルゴリズムは、将来の使用のため、データベースなどのリポジトリにおいて保存されることもできる。

例えば、組織切片の視覚イメージは、ＨＣＡにより準備されたものなど、対応する管理されていないスペクトルイメージに登録されることができる。次いで、ユーザは視覚イメージの特性領域を選択することができる。ユーザは、疾患または条件を特定するために、この領域を分類し、および／またはその領域に注釈を付けることができる。対応する登録非管理スペクトルイメージの特性領域に横たわるスペクトルデータは、疾患または条件により、分類され、および／または注釈が付けら得る。

疾患または条件により分類されおよび／または注釈が付けられていたスペクトルデータは、ＡＮＮのような管理された方法を訓練するために用いることのできる訓練セットを提供する。この種の方法は、例えば、Lasch, Miljkovic Dupuyにも記載されている。訓練された管理分析法は、診断アルゴリズムを提供することができる。

疾患または条件の情報は、器具、ユーザによって訓練されたアルゴリズム、或いはそれら両方の組み合せを伴って供給されるアルゴリズムに基づくことができる。例えば、器具と友に供給されるアルゴリズムは、ユーザによって強調されることができる。

本発明の幾つかの態様に係る訓練ステップの効果は、再生可能かつ反復可能な基準によってスペクトルデータを評価する、利用可能なものの中で最高の、大多数の意見に基づく「ゴールドスタンダード」に対して、登録イメージが訓練され得るということである。このようにして、適切な機器評価およびアルゴリズム訓練の後に、本発明の幾つかの態様に係る方法は、通常である、典型的ではない、低級新生物、高級新生物、およびガン性といった視覚的に割り当てられた基準に頼るよりむしろ、世界的に類似の結果を生成することができる。各細胞の結果は、分類整合の確率として適切に拡大縮小された数値的指標または結果全体により表されることができる。このようにして、本発明の幾つかの態様に係る方法は、様々な生物学的構造の検出および疾患診断に必要な感度および特異性を有することができる。

訓練セットの診断限度は、スペクトルデータが疾患または条件により分類されおよび／または注釈が付けられる範囲により制限され得る。上記のように、この訓練セットは、ユーザ自身の関心および習熟度によって大きくすることができる。例えば、ユーザは、Ｈ＆Ｅ染色に対する一つまたは多数のｌＨＣ染色のように、他方に対して一つの染色を好むことがある。加えて、例えば腋窩リンパ節の胸部ガン転移のような特定の条件を認識するためにアルゴリズムを訓練することができる。アルゴリズムは、線ガン対非線ガンのような標準対異常の組織タイプまたは二値化出力を示すために、また、嚢、ＢおよびＴリンパ球のような、遭遇した異なる通常組織タイプを分類しないために訓練されることができる。ＳＨＰにより得られた特定組織タイプの領域または疾患の状態は、組織切片のリアルタイム顕微鏡的表示に重畳された「デジタル染色」として描画することができる。

［診断、予後、予測、セラノスティック］
スペクトルおよび視覚のイメージが一旦登録されると、それらは、図３のフローチャートのステップ３０８において概説されるように、医療診断の実行のために用いられることができる。診断は、これに限定されるものではないが、細胞異常、炎症、感染症、前ガン、ガンおよび巨視的な解剖学的特徴を含む疾患または条件を含むことができる。本発明の幾つかの態様に係る方法において、視覚イメージに登録されている、未知の疾患または条件の生体試料のスペクトルイメージからのスペクトルデータは、上述の通り、訓練された診断アルゴリズムに入力されることができる。生体試料のスペクトルデータは、診断アルゴリズムを準備するために用いられた訓練セットに対する類似性に基づいて、疾患または条件と関連付けられることができる。疾患または条件は、診断として出力されてもよい。

例えば、スペクトルデータおよび視覚イメージは、未知の疾患または条件の生体試料から取得することができる。スペクトルデータは、非管理のスペクトルイメージを準備するために次いで空間的基準データとともに使うことができるＨＣＡのような非管理の方法により分析されることができる。この非管理のスペクトルイメージは、上記のように、視覚イメージに登録されることができる。非管理の方法により分析されたスペクトルデータは、それから訓練された管理アルゴリズムに入力されることができる。例えば、上記の訓練ステップにて説明したように、訓練された管理アルゴリズムはＡＮＮでもよい。訓練された管理アルゴリズムからの出力は、訓練セットに基づく疾患または条件の分類および／または注釈に対応する一つ以上のラベルを含むスペクトルデータでもよい。

ラベルに基づいて診断を引き出すために、ラベル付けされたスペクトルデータは、視覚イメージおよび／または生体試料の非管理のスペクトルイメージに登録されることのある管理スペクトルイメージを準備するために用いることができる。例えば、管理スペクトルイメージがＧＵＩを介して視覚イメージおよび／または非管理スペクトルイメージに登録される際に、ユーザは、視覚イメージまたは非管理スペクトルイメージ内の興味点を選択することができ、また、管理スペクトルイメージ内のその点のラベルに対応する疾患または条件の提供を受けることができる。或いは、ユーザは特定の疾患または条件についての登録イメージを検索するためのソフトウェアプログラムを要求することができ、そのソフトウェアは、特定の疾患または条件がラベル付けされている視覚、非管理スペクトル、および管理スペクトルのイメージのいずれかにおいてその切片をハイライト表示することができる。この効果により、ユーザは診断をリアルタイムに得ることができるようになり、また、ユーザは、分光法的に高い感度で取得したデータにアクセスしつつ、彼／彼女が慣れ親しんでいる視覚イメージを視認することもできるようになる。

診断は、疾患または条件の存在または欠如を示す「である／ではない」式出力のような二値化出力を含むことができる。加えて、診断は、これに限定されるものではないが、疾患または条件への適合の可能性、指標、または相対的組成比のような補助的な報告を含んでも良い。

本発明の方法の幾つかの態様によれば、組織切片の巨視的な構成上の特徴は、必ずしも疾患に関連があるわけではない巨視的な解剖学的特徴を区別するために、スペクトルパターンを介して分析することができる。広範囲デジタル染色法（ＧＤＳ）として知られるこの種の手順は、管理および非管理の多変量方法の組合せを使用することができる。ＧＤＳは、これに限定されるものではないが腺および扁平上皮、内皮、結合組織、骨および脂肪組織を含む解剖学的特徴を分析するために用いることもできる。

ＧＤＳにおいて、管理された診断アルゴリズムは、異なる患者からの所与の疾患の複数のサンプルを含む訓練データセットから構成されることができる。患者からの個々の組織切片は、スペクトルイメージデータの獲得、結果として生じるデータセットの前処理、およびＨＣＡのような非管理アルゴリズムによる分析を用いて、上記の通りに分析されることができる。ＨＣＡイメージは、対応する染色組織に登録されることができ、病理法者によって注釈が付けられ得る。図１５Ａ〜図１５Ｃに示されるこの注釈ステップによれば、組織タイプまたは疾患の段階および状態、或いは他の要求される特徴の典型的兆候に対応するスペクトルの抽出が可能となる。結果として生じる典型的なスペクトルは、それらの注釈付き医療診断と一緒に、ＡＮＮのような、認識するために訓練された特徴を検出するのに特に適している管理されたアルゴリズムを訓練するために、その後用いてもよい。

ＧＤＳ方法によれば、古典的な染色または免疫組織化学的な薬品を使用してサンプルを染色することができる。病理法者が、染色されたサンプルを受け取り、コンピュータ化されたイメージング顕微鏡を用いてそれを検査する際に、スペクトル結果は、視覚顕微鏡を制御しているコンピュータにおいて利用可能であってもよい。病理法者は、サンプル上のあらゆる組織スポットを選択して分光法に基づく診断を受け取ることができる。この診断は、同じスペクトル診断的分類を有する全ての領域を概説する視覚イメージ上に、グレースケールまたは擬似カラーのイメージを被せることができる。

図１５Ａは、Ｈ＆Ｅで染色したリンパ節組織切片の視覚顕微鏡イメージである。図１５Ｂは、嚢およびリンパ節内部のような巨視的解剖学的特徴の広範囲識別の典型的な例を示す。図１５Ｂは、図１５Ａに示される切片の広範囲デジタル染色イメージであり、嚢とリンパ節内部とを区別している。

対応する視覚イメージに登録されるこれらの巨視的解剖学的特徴の領域は、スペクトルパターンデータセット内のより洗練された基準に基づく分析のために選択されることができる。この、診断法の次のレベルは、例えばＳＨＰの結果だけに基づくことがある、または免疫組織化学的（ＩＨＣ）結果を用いて集められたスペクトル情報を含むことがある診断マーカーデジタル染色（ＤＭＤＳ）データベースに基づいてもよい。例えば、異常および／またはガンを表すスペクトルパターンの存在について分析するために上皮組織の切片が選択されることがあり、その際には選択された領域を走査するためにより診断的なデータベースが用いられる。このアプローチの一例が図１５Ｃに示されており、そこでは、ＳＨＰの最大限の区分力が利用され、古典的な組織病理法においては免疫組織化学的な染色の後においてのみ利用可能とされ得るような、（ガン、リンパ球、その他などの）リンパ節内部の組織の特徴の詳細が生成されている。図１５Ｃは、図１５Ａに示す切片のＤＭＤＳイメージであり、嚢、転移性乳ガン、組織球、活性化されたＢリンパ球およびＴリンパ球を区別している。

ＧＤＳおよびＤＭＤＳの関係は、図１６の模式図においてそれぞれダークブルーおよび紫でマークされている水平方向の進行により示される。ＧＤＳおよびＤＭＤＳは共にスペクトルデータに基づいているが、ＩＨＣデータなどの他の情報を含むことができる。実際の診断は、ｈＡＮＮのような、同一にまたは同様に訓練された診断アルゴリズムによっても実行することができる。このようなｈＡＮＮは、組織のために集められたパターンのデータセット内に大きな変化を検出して、巨視的解剖学的特徴のために組織切片を最初に分析することができる（ダークブルーの跡）。続く「診断エレメント」分析は、紫の跡で示されるように、スペクトル情報のサブセットを用いてｈＡＮＮにより実行することができる。例えば、２進数形式の多層アルゴリズムを実行してもよい。ＧＤＳおよびＤＭＤＳは、それぞれの診断に到達するために、巨視的組織データベースおよび診断的組織データベースとして示される異なるデータベースサブ領域を用いることができ、それらの結果は、適切なイメージ登録の後に染色イメージ上に重ねることとしてもよい。

本発明の幾つかの態様に係る例方法によれば、病理法者は、正確な診断の達成を確実にするために特定の入力を提供することができる。例えば、病理法者は、染色イメージの品質を視覚により点検することができる。加えて、病理法者は、サンプルの倍率または視野を変えるために、選択的な質問を行うことができる。

本発明の幾つかの態様に係る方法は、生体試料を視認し、イメージ登録を実行する病理法者により実行されることができる。或いは、登録イメージが電子的に伝送できるデジタルデータを含んでいるため、その方法は遠隔で実行されることも可能である。

その方法は、以下の非限定的な例により実証することができる。

［例２−リンパ節切片］
図１７は、左上の象限に乳ガン微小転移巣を含む、１ｍｍ×１ｍｍのＨ＆Ｅ染色された腋窩リンパ節切片の視覚イメージを示す。図１７Ｂは、乳ガン微小転移巣のＳＨＰベースのデジタル染色領域である。例えば、カーソルで制御されるマウスをクリックすることによる、微小転移巣の一般的な領域における選択により、図１７Ｂに示すように、ＳＨＰによってガンであると識別された領域が赤でハイライト表示される。図１７Ｃは、Ｂリンパ球で占拠されたＳＨＰベースのデジタル染色領域である。右下角の方を指すことにより、図１７Ｃに示すように、Ｂリンパ球により占拠された領域はライトブルーでマークされている。図１７Ｄは、矢印で示す組織球によって占拠された領域を示すＳＨＰベースのデジタル染色領域である。

ＳＨＰベースのデジタル染色がスペクトルおよび診断を含む訓練された有効なリポジトリまたはデータベースに基づいているため、描画されるデジタル染色は、図１７Ｂの場合における「転移性乳ガン」のような診断的分類に直接関係することができる。その診断解析はＳＨＰにより実行することができるが、そのシステムは、先ず病理法者による補完的または補助的ツールとして使用されることができる。補助的なツールとして、その出力は、例えば、二値的なレポートではなく整合の確率であり得る。図１８は、ＳＨＰで検出したガン細胞の個々および小クラスタを示す。

［例３−肺切片の細針吸引サンプル］
サンプル切片は、肺の中の疑わしい領域の細針吸引物から準備されたホルマリン固定パラフィン埋め込み細胞ブロックから切り出した。細胞ブロックは、従来の先の組織学分析が、肺の腺ガン、小細胞ガン（ＳＣＣ）または扁平上皮ガンを識別する基準に基づいて選択した。試料は、約５μｍの厚さを提供するためにミクロトームを用いて切断し、続いてLow-e顕微鏡スライド（米国、オハイオ、Kevley Technologies）上に載置した。次に、標準プロトコルを使用して切片に脱パラフィン処理を施した。分光データ収集に続いて、組織病理法者による形態的解釈を可能にするために組織切片にヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を施した。

この研究には、ペルキンエルマースペクトル１／スポットライト４００イメージング分光器（米国、コネチカット、シェルトン、ペルキンエルマーコーポレ−ション）を用いた。赤外線マイクロスペクトルイメージは、ノートンビアーアポダイゼーション（Naylor他、J Opt. Soc. Am., A24:3644-3648 (2007)参照）およびフーリエ変換前に、６．２５μｍ×６．２５μｍのピクセル解像度、４ｃｍ^−１のスペクトル解像度、および８のインターフェログラムの共通追加を伴って、トランスフレクション（送信／反射）モードにて１ｍｍ×１ｍｍの組織領域から記録した。適当な背景スペクトルは、単一ビームスペクトルに対する比率化のためサンプル領域の外側で収集した。その結果生じた比率化スペクトルは、次いで吸光度に変換した。１ｍｍ×１ｍｍの赤外線イメージの夫々は１６０×１６０、または２５，６００のスペクトルを含む。

初めに、未処理の赤外線マイクロスペクトルデータセットをインポートし、ＭＡＴＬＡＢ（米国、マサチューセッツ、ナティック、マスワークスR2009aバージョン）で記述されたソフトウェアを用いて処理した。組織が存在しない、またはノイズに対して貧弱な信号しか表示しない領域から登録された全てのスペクトルを除去するために、スペクトル品質テストを実行した。テストを通過した全てのスペクトルを、次にベースラインオフセットで正規化（スペクトルベクトル全体に渡る最小吸光輝度の抽出）し、第二の派生物に変換し（サビツキー・ゴーレイのアルゴリズム(Savitzky他、Anal. Chem,. 36:1627(1964)、13の円滑点参照)）、１３５０ｃｍ^−１〜９００ｃｍ^−１のスペクトル領域に記録された輝度値だけを含むようにカットし、そして、最後にベクトルの正規化で処理した。

処理後のデータセットは、スペクトルの類似性を定めるためにユークリッド距離を用いて実行されるソフトウェアシステムおよびＨＣＡ、並びにクラスタリングのためのワードのアルゴリズム（例えば、Ward, J Am. Stat. Assoc., 58:236(1963)参照）にインポートした。次いで、クラスタを構成するピクセルを描く擬似カラークラスタイメージを組み立て、同じサンプルから得たＨ＆Ｅイメージと直接比較した。計算後のＨＣＡ系統樹を異なるレベルで切断することにより、異なるクラスタ構造を記述する２〜１５のクラスタの間でＨＣＡイメージを組み立てた。これらのクラスタイメージを、次ぎに、Ｈ＆Ｅ染色に基づいて彼らが作成した形態的解釈を最も良好に複製するクラスタ構造を確認した協調関係にある病理法者達に提供した。

下地となっているベースラインシフト、不明な信号輝度変動、ピーク点シフト、またはランバートビアの法則に起因せずまたは従わない一般的な特徴によって汚染された赤外線スペクトルは、登録スペクトルに対するミー散乱および反射寄与物のためのＥＭＳＣのサブ空間モデルバージョンにより修正した（B. Bird, M. MiljkovicおよびM. Diem "Two step resonant Mie scattering correction of infrared micro-spectral data: human lymph node tissue", J. Biphotonics, 3 (8-9) 597-608 (2010)参照）。初めに、各ガンタイプについて１０００の登録スペクトルを、図１９Ａ〜図１９Ｆに表された赤外線イメージから別々のデータセットにプールした。

次に、図１９Ａおよび図１９Ｂに示すように、最も小さな散乱寄与物を伴うスペクトルを求めてこれらのデータセットを調査し、ノイズに対する信号を増大させるために各ガンタイプについて平均を計算し、また、各細胞タイプについてKK変換を計算した。図１９Ａは、肺の腺ガン、小細胞ガンおよび扁平上皮ガンの細胞から記録された細胞スペクトルを含む未処理のスペクトルデータセットを示す。図１９Ｂは、それぞれ、肺の腺ガン、小細胞ガンおよび扁平上皮ガンの細胞から記録された細胞スペクトルを含む修正スペクトルデータセットを示す。図１９Ｃは、肺の腺ガン、小細胞ガンおよび扁平上皮ガンの標準スペクトルを示す。

ヴァンデハルストの近似式（例えば、Brussard他、Rev. Mod. Phys., 34:507(1962)参照）を用いて、半径幅６μｍ〜４０μｍの核球、および１．１から１．５の反射率幅を記述する３４０のミー散乱曲線を計算することにより、ミー散乱寄与物についてのサブ空間モデルを構築した。これらの散乱曲線内に構成される不一致のうち９５％超を記述する最初の主要な１０要素を、データセットの１ステップＥＭＳＣ修正における干渉として、KK変換に加えて次に使用した。ＥＭＳＣの計算は、大凡１０００スペクトルにつき１秒を要した。図１９Ｄは、図１９Ｃのスペクトルから計算されたKK変換後のスペクトルを示す。図１９Ｅは、ＥＭＳＣ修正前の複数クラスデータセットのＰＣＡスコアのプロット線を示す。図１９Ｆは、ＥＭＳＣ修正後の複数クラスデータセットのＰＣＡスコアのプロット線を示す。上記の分析は、１８００ｃｍ^−１〜９００ｃｍ^−１のスペクトル領域に正規化されたベクトルに対して実行した。

図２０Ａは、それぞれ、肺の腺ガン、小細胞ガンおよび扁平上皮ガンの平均吸光度スペクトルを示す。これらは、各細胞タイプの１０００の散乱修正細胞スペクトルから計算した。図２０Ｂは、図２０Ａに示す吸光度スペクトルの第二の派生的なスペクトルを示す。一般に、腺ガンと扁平上皮ガンは、スペクトルの低波数領域において類似したスペクトルプロファイルを有している。しかしながら、扁平上皮ガンは、口腔の扁平上皮ガンから記録されたスペクトルデータについて観察されているように（Papamarkakis他、(2010), Lab. Invest., 90:589-598）、アミドＩ帯域に実質的に低い波数ショルダーを示す。小細胞ガンは、より高い波数に僅かにシフトし、観察されたスペクトルに対する強いリン脂質寄与物を示す非常に強い対象および非対称リン酸帯域を表示する。

サンプル領域の殆どが血液および診断目的以外の組成物で構成されているため、データは、診断目的の組成物だけを含み、かつ散乱寄与物についての修正がなされるように前処理した。加えて、二値化マスクを作成して、最終的にデータを分類するためにＨＣＡを用いた。この結果を図２１Ａ〜図２１Ｃに示す。図２１Ａは、それぞれ、腺ガン、小細胞ガン、および扁平上皮ガンを含む１ｍｍ×１ｍｍ組織領域の４結合顕微鏡Ｒ＆Ｅ染色イメージを示す。図２１Ｂは、図２１Ａに示された組織領域から記録された４つの繋ぎ合わされた未処理赤外線イメージの１３５０ｃｍ^−１〜９００ｃｍ^−１のスペクトル領域に高速還元ＲＣＡ分析を施すことにより構成された二値化マスクイメージである。診断目的の細胞組成物と血液細胞が示されている。図２１Ｃは、診断目的の細胞組成物の領域から記録された散乱修正スペクトルデータの６クラスタＲＣＡイメージである。その分析は、１８００ｃｍ^−１〜９００のｃｍ^−１のスペクトル領域に対して実行した。扁平上皮ガン、線ガン、小細胞ガン、および多様な線に線維増生組織反応の領域が示されている。或いは、これらのプロセスは、ＡＮＮのような管理されたアルゴリズムと置き換えることが可能である。

上記の例に示される結果は、未処理の測定スペクトルデータの分析により、ＳＣＣと非小細胞ガン（ＮＳＣＣ）とを区別できることを示している。本発明の幾つかの態様に係る方法に従って、散乱寄与物、線ガンおよび扁平上皮ガンについて未処理の測定スペクトルを修正した後、しかしながら、ＮＳＣＣの２つのサブタイプは明らかに区別される。このようにして、これらの例は、このスペクトルイメージングの方法が肺ガンの３つの主要なタイプを識別し、かつ正しく分類するために用い得るという強い証拠を提供している。

図２２は、これに限定されるものではないが、イメージ登録および訓練を含む、本発明の幾つかの態様に係る方法と連動して用いるためのコンピュータシステムの一例１００の様々な特徴を示している。図２２に示すように、コンピュータシステム１００は、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、マイクロコンピュータ、電話デバイス、パーソナル携帯情報機器（ＰＤＡ）、またはプロセッサと入力機器を有する他のデバイスのような端末１０２を介して、要求者１０１によって用いられることができる。サーバモジュールは、例えば、ＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、マイクロコンピュータ、或いは、プロセッサとデータ用のリポジトリを有するまたはデータ用のリポジトリにアクセスすることができる他のデバイスを含むことができる。サーバモジュール１０６は、例えば、診断用の疾患ベースのデータにアクセスすることのできるリポジトリと協力することができる。

診断に関する情報が、例えばインターネットのような、例えばネットワーク１１０を介して分析者１０１とサーバモジュール１０６との間で伝播され得る。通信は、例えば、有線、ワイヤレス、または光ファイバーリンクなどの継手１１１、１１３を介して行うことができる。

本発明の幾つかの態様は、ハードウェア、ソフトウェアまたはそれらの組み合わせを用いて実現することができ、また、一つ以上のコンピュータシステムまたは他の処理システムにおいて実現することができる。１つの変形では、本発明の幾つかの態様は、本願明細書に記載した機能を実行することのできる一つ以上のコンピュータシステムに向けられている。この種のコンピュータシステム２００の例を図２３に示す。

コンピュータシステム２００は、プロセッサ２０４のようなプロセッサを一つ以上備えている。プロセッサ２０４は、通信インフラ２０６（例えば、通信バス、クロスオーバーバーまたはネットワーク）に接続されている。様々なソフトウェアの態様が、この例示的なコンピュータシステムに関して記述されている。この説明を読めば、他のコンピュータシステムおよび／またはアーキテクチャを用いて本発明の態様をどのようにして実現するべきかが当業者にとって明らかになる。

コンピュータシステム２００は、ディスプレイユニット２３０に表示するために、通信インフラ２０８から（または図示しないフレームバッファから）、グラフィクス、テキストおよび他のデータを先送りするディスプレイインターフェース２０２を備えることができる。コンピュータシステム２００は、主メモリ２０８は、好ましくはランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）をも含み、また、第二メモリ２１０をも含むことがある。第二メモリ２１０は、フロッピーディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブなどであり、例えば、ハードディスクドライブ２１２および／またはリムーバブルストレージドライブ２１４を含むことができる。リムーバブルストレージドライブ２１４は、周知の手法によってリムーバブルストレージユニット２１８からの読み込みおよび／またはそこへの書き込みを行う。リムーバブルストレージユニット２１８は、リムーバブルストレージドライブ２１４に読み書きされるフロッピーディスク、磁気テープ、光ディスク、その他である。明らかなことであるが、リムーバブルストレージユニット２１８は、内部にコンピュータソフトウェアおよび／またはデータを格納したコンピュータ利用可能な記憶媒体を含む。

他の変形では、二次メモリ２１０は、コンピュータプログラムまたは他の指令のコンピュータシステム２００へのロードを可能にするための他の類似の装置を含むことができる。この種のデバイスは、例えば、リムーバブルストレージユニット２２２およびインターフェース２２０を含むことができる。この種の例には、（ビデオゲーム装置で見られるような）プログラムカートリッジおよびカートリッジインターフェース、（消去可能プログラム可能リードオンリメモリ（ＥＰＲＯＭ）、またはプログラム可能リードオンリメモリ（ＰＲＯＭ）のような）リムーバブルメモリーチップおよび付属ソケット、およびリムーバブルストレージユニット２２２からコンピュータシステム２００へのソフトウェアおよびデータの移送を可能とする他のリムーバブルストレージユニット２２２およびインターフェース２２０を含めることができる。

コンピュータシステム２００は、通信インターフェース２２４を含むこともできる。通信インターフェース２２４は、コンピュータシステム２００と外部装置との間でのソフトウェアおよびデータの移送を可能とする。通信用インターフェース２２４の例には、モデム、（イーサネットカードのような）ネットワークインターフェース、通信ポート、パーソナルコンピュータメモリカード国際協会（ＰＣＭＣＩＡ）スロットおよびカード、その他を含めることができる。通信インターフェース２２４を介して移送されるソフトウェアおよびデータは、電子、電磁、光、および通信インターフェース２２４が受け取れる他の信号であり得る信号２２８の形式をとる。これらの信号２２８は、通信通路（例えばチャネル）を介して通信インターフェース２２４に２２８を提供される。この通路２２６は信号２２８を伝送し、かつワイヤーまたはケーブル、光ファイバ、電話線、セルラーリンク、ラジオ周波数（ＲＦ）リンク、および／または他の通信チャネルを用いて実現することができる。この文書において、「コンピュータプログラム媒体」および「コンピュータ使用可能な媒体」の用語は、一般的に、リムーバブルストレージドライブ２１４、ハードディスクドライブ２１２にインストールされたハードディスク、および信号２２８を称するために用いられている。これらのコンピュータプログラム製品は、コンピュータシステム２００にソフトウェアを提供する。本発明の幾つかの態様は、この種のコンピュータプログラム製品に向けられている。

（コンピュータ制御ロジックとも称される）コンピュータプログラムは、主メモリ２０８および／または二次メモリ２１０に格納される。コンピュータプログラムは、通信インターフェース２２４を介して受信されることもある。この種のコンピュータプログラムは、本願明細書において説明されているように、実行される際に、コンピュータシステム２００に本発明の幾つかの態様に係る特徴を実行させることができる。特に、コンピュータプログラムは実行される際に、プロセッサ２０４にこの種の特徴を実行させることができる。従って、この種のコンピュータプログラムは、コンピュータシステム２００のコントローラである。

本発明の幾つかの態様がソフトウェアを用いて実現される変形において、そのソフトウェアは、リムーバブルストレージドライブ２１４、ハードディスク２１２または通信インターフェース２２４を用いて、コンピュータプログラム製品に格納されることができ、かつコンピュータシステム２００にロードされることができる。その制御ロジック（ソフトウェア）は、プロセッサ２０４により実行される際に、本願明細書に記載したような機能をプロセッサ２０４に実行させる。他のバリエーションにおいて、本発明の幾つかの態様は、例えば、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣｓ）のようなハードウェア要素を用いて、主としてハードウェア内で実現される。本願明細書に記載された機能を実行するためのハードウェア状態の装置の実現は、当業者にとっては明らかである。

さらにもう一つの変形では、本発明の幾つかの態様は、ハードウェアとソフトウェアの双方の組み合わせを用いて実現される。

Claims (9)

1. 生体サンプルのスペクトルイメージと生体サンプルの視覚イメージとを受け取るステップと、
   前記スペクトルイメージと前記視覚イメージをスケーリングし、当該スケーリングは前記スペクトルイメージと前記視覚イメージとの間の比に基づくステップと、
   スケーリングされたスペクトルイメージに第一閾値を、また、スケーリングされた視覚イメージに第二閾値を適用するステップと、
   前記スペクトルイメージのイメージ特徴を改善するために前記スペクトルイメージに加重正規化を適用するステップと、
   前記第一閾値に基づいて二値化スペクトルイメージを生成するステップと、
   前記第二閾値に基づいて二値化視覚イメージを生成するステップと、
   前記二値化スペクトルイメージと前記二値化視覚イメージとを用いて前記スペクトルイメージの特徴を前記視覚イメージの特徴に整列配置するステップと、
   登録イメージの精錬のためのフィードバックを提供する選択されたメトリックに関連して前記登録イメージに一つ以上の最適化を適用することにより、前記スペクトルイメージの特徴と前記視覚イメージの特徴の整列配置に基づいて、前記スペクトルイメージと前記視覚イメージのイメージ登録を精錬し、前記スペクトルイメージと前記視覚イメージの前記イメージ登録は、座標の第一セットと座標の第二セットを結合させることにより生成された共通座標系に基づいているステップと、
   前記イメージ登録の正確さを表す差分イメージを表示するステップと、を備え、
   前記差分イメージが前記イメージ登録のエラーを表す際に、異なる閾値を選択し、当該異なる閾値に基づいて前記二値化スペクトルイメージ及び前記二値化視覚イメージをアップデートするイメージ登録精錬方法。
2. 前記スペクトルイメージの特徴と前記視覚イメージの特徴の整列配置は、前記スペクトルイメージと前記視覚イメージの前記イメージ登録を改善する請求項１に記載の方法。
3. 前記二値化スペクトルイメージ及び前記二値化視覚イメージに形態的閉鎖を適用するステップを更に備える請求項１に記載の方法。
4. 前記二値化スペクトルイメージと前記二値化視覚イメージの端に柔軟化を施すステップを更に備える請求項１に記載の方法。
5. 前記二値化スペクトルイメージと前記二値化視覚イメージの間のグレースケール差を最小化するステップを更に備える請求項１に記載の方法。
6. 前記メトリックはイメージを基礎とする情報により生成される請求項１に記載の方法。
7. 好ましい登録エリアを繰り返し決定するステップを更に備える請求項１に記載の方法。
8. プロセッサと、
   前記プロセッサを介して機能するユーザインターフェースと、
   前記プロセッサによりアクセス可能なリポジトリと、を備え、
   生体サンプルのスペクトルイメージと生体サンプルの視覚イメージとが受け取られ、
   前記スペクトルイメージと前記視覚イメージが、前記スペクトルイメージと前記視覚イメージとの間の比に基づいてスケーリングされ、
   前記スペクトルイメージのイメージ特徴を改善するために前記スペクトルイメージに加重正規化が適用され、
   スケーリングされたスペクトルイメージに第一閾値が、また、スケーリングされた視覚イメージに第二閾値が適用され、
   前記第一閾値に基づいて二値化スペクトルイメージが生成され、
   前記第二閾値に基づいて二値化視覚イメージが生成され、
   前記二値化スペクトルイメージと前記二値化視覚イメージとを用いて前記スペクトルイメージの特徴が前記視覚イメージの特徴に整列配置され、
   登録イメージの精錬のためのフィードバックを提供する選択されたメトリックに関連して前記登録イメージに一つ以上の最適化を適用することにより、前記スペクトルイメージの特徴と前記視覚イメージの特徴の整列配置に基づいて、前記スペクトルイメージと前記視覚イメージのイメージ登録が精錬され、前記スペクトルイメージと前記視覚イメージの前記イメージ登録は、座標の第一セットと座標の第二セットを結合させることにより生成された共通座標系に基づいており、
   前記イメージ登録の正確さを表す差分イメージが表示され、
   前記差分イメージが前記イメージ登録のエラーを表す際に、異なる閾値が選択され、当該異なる閾値に基づいて前記二値化スペクトルイメージ及び前記二値化視覚イメージがアップデートされるイメージ登録精錬システム。
9. コンピュータに登録イメージを精錬させる制御ロジックを内部に格納したコンピュータ利用可能な媒体を備える非一時的コンピュータプログラム製品であって、前記制御ロジックは、
   コンピュータに、生体サンプルのスペクトルイメージと生体サンプルの視覚イメージとを受け取らせる一組のコードと、
   コンピュータに、前記スペクトルイメージと前記視覚イメージとの間の比に基づいて前記スペクトルイメージと前記視覚イメージをスケーリングさせる一組のコードと、
   前記スペクトルイメージのイメージ特徴を改善するために、コンピュータに、前記スペクトルイメージに加重正規化を適用させる一組のコードと、
   コンピュータに、スケーリングされたスペクトルイメージに第一閾値を、また、スケーリングされた視覚イメージに第二閾値を適用させる一組のコードと、
   コンピュータに、前記第一閾値に基づいて二値化スペクトルイメージを生成させる一組のコードと、
   コンピュータに、前記第二閾値に基づいて二値化視覚イメージを生成させる一組のコードと、
   コンピュータに、前記二値化スペクトルイメージと前記二値化視覚イメージとを用いて前記スペクトルイメージの特徴を前記視覚イメージの特徴に整列配置させる一組のコードと、
   コンピュータに、登録イメージの精錬のためのフィードバックを提供する選択されたメトリックに関連して前記登録イメージに一つ以上の最適化を適用することにより、前記スペクトルイメージの特徴と前記視覚イメージの特徴の整列配置に基づいて、前記スペクトルイメージと前記視覚イメージのイメージ登録を精錬させる一組のコードであり、前記スペクトルイメージと前記視覚イメージの前記イメージ登録は、座標の第一セットと座標の第二セットを結合させることにより生成された共通座標系に基づいているものと、
   コンピュータに、前記イメージ登録の正確さを表す差分イメージを表示させる一組のコードと、を備え、
   前記差分イメージが前記イメージ登録のエラーを表す際に、異なる閾値を選択し、当該異なる閾値に基づいて前記二値化スペクトルイメージ及び前記二値化視覚イメージをアップデートする非一時的コンピュータプログラム製品。

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