KR20140043128A - 스펙트럼 이미징에 의해 생물학적 표본을 분석하는 방법 - Google Patents

스펙트럼 이미징에 의해 생물학적 표본을 분석하는 방법 Download PDF

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KR20140043128A
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스텐리 에이치. 레미즈위스키
클레이 엠. 톰슨
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시레카 테라노스틱스, 엘엘씨
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Abstract

생물학적 샘플의 시각적 이미지 및 스펙트럼 이미지를 등록하는 방법은 슬라이드 홀더 상의 다수의 레티클의 좌표 위치의 첫 번째 세트와 상기 슬라이드 홀더 상의 다수의 레티클의 좌표 위치의 두 번째 세트를 정렬하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 좌표 위치의 상기 첫 번째 및 두 번째 세트의 정렬에 근거하여 상기 생물학적 샘플의 시각적 이미지와 상기 생물학적 샘플의 스펙트럼 이미지의 등록된 이미지를 생성하는 단계를 더 포함한다.

Description

스펙트럼 이미징에 의해 생물학적 표본을 분석하는 방법{METHOD FOR ANALYZING BIOLOGICAL SPECIMENS BY SPECTRAL IMAGING}
본 발명의 측면들은 의료 진단, 예후 및/또는 예측 분류를 제공하기 위해 스펙트럼 이미징에 의해 생물학적 표본을 분석하는 방법에 관한 것이다. 상기 생물학적 표본은 수술 방법, 생체 검사 및 배양된 샘플에 의해 얻어진 의료 표본을 포함할 수 있다.
본 출원은 2011년 6월 24일에 제출된 미국특허출원 제13/067,777호 "스펙트럼 이미징에 의해 생물학적 표본을 분석하는 방법"의 이익을 주장한다. 본 출원은 2011년 6월 24일에 제출된 PCT/US2011/041884 "스펙트럼 이미징에 의해 생물학적 표본을 분석하는 방법"과 2010년 6월 25일에 제출된 미국임시특허출원 제61/358,606호 "스펙트럼 조직병리학을 통한 병리조직표본의 디지털 착색"과 관련된다. 상기 각각의 출원들은 모두 참조에 의해 본 명세서에 통합된다.
다양한 병리학적 방법들은 비정상 혹은 암 세포를 발견하기 위해 생물학적 표본을 분석할 때 사용된다. 예를 들어, 표준 조직병리학은 현미경을 사용하는 병리학자에 의해 착색된 조직 부분의 시각적 분석을 수반한다. 전형적으로, 조직 부분은 생체 검사에 의해 환자로부터 제거되고, 샘플은 냉동-마이크로톰에 의해 순식간에 냉동되고 분할되거나, 포르말린-고정, 파라핀 내장 그리고 마이크로톰에 의한 분할이 이뤄진다. 상기 조직 부분은 이후 적합한 기질 상에 장착된다. 그 후 파라핀-내장 조직 부분은 탈파라핀화된다. 상기 조직 부분은 예를 들어, 헤모토실린-에오신(H&E) 착색제를 이용하여 착색되고, 커버슬립된다.
상기 조직 샘플은 이후 예를 들어, 10배에서 40배 배율의 고해상도 육안 검사에서 시각적으로 조사된다. 확대된 세포는 병리학자의 기억 내 시각적 데이터베이스와 비교된다. 병리학자에 의해 착색된 조직 부분의 시각적 분석은 비정상 또는 암 세포의 존재를 발견하기 위해 핵과 세포 형태, 조직 구조, 착색 패턴 및 면역 반응 세포의 침윤과 같은 정밀한 특징을 수반한다.
만약 초기 전이 또는 0.2에서 2㎜ 크기보다 작게 측정되는 암 세포의 작은 무리인 미세 전이가 의심될 때, 인접한 조직 부분은 시토케라틴-특정 착색과 같은 면역-조직화학(IHC) 에이전트/카운터 착색제로 착색될 수 있다. 림프절 조직과 같은 정상 조직은 이러한 착색에 반응하지 않기 때문에, 이러한 방법은 조직병리학의 감도를 증가시킨다. 결국, 감염되지 않은 조직과 감염된 조직 사이의 차이는 커질 수 있다.
미세 전이 발견의 주요 방법은 표준 조직병리학이었다. 예를 들어, 작은 크기 및 림프절 조직 내 이상을 구분하는 특징의 부족 때문에 표준 조직병리학에 의한 림프절 내 미세 전이의 발견은 엄청난 작업이다. 만약 림프절이 전이 세포와 상관이 없다면 암의 확산은 억제될 수 있기 때문에, 아직 이러한 미세 전이의 발견은 질병의 확산 단계에 있어 중요하다. 반면, 림프절 내 미세 전이를 발견하지 못해 발생하는 잘못된 음성 진단은 매우 낙관적이라, 더 적극적인 치료가 권장되었어야 한다.
비록 표준 조직병리학이 중증 질병 진단에 있어서 잘 확립되었지만, 그것은 수많은 단점을 갖고 있다. 특히, 이러한 방법에 의한 진단 및 질병의 등급화는 본질적으로 주관적인 병리학자의 기억 내 데이터베이스와 관련한 표본의 비교에 근거하기 때문에, 다른 병리학자에 의한 동일 조직 부분의 독립적인 진단들의 상이함은 일반적이다. 진단의 차이는 특별히 희귀 암의 진단 또는 질병의 초기 단계 시 발생한다. 게다가, 표준 조직병리학은 시간과 비용이 많이 들고, 발견을 위해 사람의 눈에 의존하여 결과가 재생산되기 힘들다. 또한, 작업자의 피로 및 다양한 수준의 병리학자 전문성이 진단에 영향을 줄 수 있다.
게다가, 종양이 미분화된 경우 암 종류를 구분하기 위해 많은 면역조직화학 착색이 필요할 수 있다. 이러한 착색은 다중 평행 세포 블록 상에서 수행될 수 있다. 이 착색 과정은 매우 비쌀 수 있으며, 세포 샘플은 하나의 세포 블록 내 소수의 진단 세포만을 제공할 수 있다.
주로 세포 형태와 조직 구조 특징에 의존하는 표준 조직병리학에 의한 진단의 상이함을 극복하기 위해, 분광법은 세포 및 조직의 생화학적 구성의 스냅샷을 포착하는데 사용되어 왔다. 이는 다양한 상태와 질병에 의해 야기되는 생물학적 표본의 생화학적 구성 내 변화를 발견할 수 있도록 한다. 조직 또는 세포 샘플에 분광법을 사용함으로써, 샘플 일부의 화학적 구성 변화가 발견될 수 있으며, 이는 비정상 또는 암 세포의 존재를 나타낼 수 있다. 분광법의 적외선 세포병리학(세포의 질병 연구) 적용은 "스펙트럼 세포병리학(SCP)"으로 불리고, 적외선 분광법의 조직병리학(조직의 질병 연구) 적용은 "스펙트럼 조직병리학(SHP)"으로 불린다.
개별 요로와 배양 세포 상의 SCP는 B. Bird 외, Vibr. Spectrosc., 48, 10 (2008) 및 M. Romeo 외, Biochim Biophys Acta, 1758, 915 (2006)에서 논의된다. 이미징 데이터 세트 상에 기초하고, 구강 점막 및 자궁경부 세포에 적용된 SCP는 WO 2009/146425에서 논의된다. 구강 점막 세포 내 SCP를 통한 질병 진행의 설명은 K. Papamarkakis 외, Laboratory Investigations, 90, 589 (2010)에서 논의된다. 암 영역 효과를 검출하는 SCP의 감도 및 자궁경부 세포 내 바이러스 감염에 대한 감도의 설명은 K. Papamarkakis 외, Laboratory Investigations, 90, 589, (2010)에서 논의된다.
위계적 군집 분석(HCA)을 통해 간 조직의 SHP를 이용한 조직의 첫 번째 무감독 이미징의 설명은 M. Diem 외, Biopolymers, 57, 282 (2000)에서 논의된다. 림프절 내 전이성 암의 감지는 M. J. Romeo 외, Vibrational Spectrosc, 38, 115 (2005) 및 M, Romeo 외, Vibrational Microspectroscopy of Cells and Tissues, Wiley-Interscience, Hoboken, NJ (2008)에서 논의된다. HCA-파생 데이터에 길들여진 결장 조직 내 암 진단을 위한 신경망의 사용은 P. Lasch 외, J.Chemometrics, 20, 209 (2007)에서 논의된다. 림프절 내 미세 전이 및 개별 전이성 암 세포의 감지는 B. Bird 외, The Analyst, 134, 1067 (2009), B. Bird 외, BMC J. Clin. Pathology, 8, 1 (2008), 및 B. Bird 외, Tech. Cancer Res. Treatment, 10, 135 (2011)에서 논의된다.
분광법은 병리학자에게 질병의 초기 단계를 나타낼 수 있는 생물학적 샘플 내 화학적 구성의 작은 변화에 대한 경각심을 불러일으켰다는 점에서 바람직하다. 반면에, 표준 조직병리학으로부터 뚜렷이 보이는 조직 내 형태학적 변화는 나타나는데 더 긴 시간이 걸리고, 이는 질병의 조기 발견을 더 어렵게 만든다. 게다가, 분광법은 병리학자가 조직이나 세포 물질의 대형 샘플을 점검할 때 동일한 샘플을 시각적으로 조사할 때보다 더 적은 시간이 걸리도록 한다. 나아가, 분광법은 객관적이며, 디지털로 기록되고 저장되며, 재생산 가능하고, 수학적/통계적 분석이 가능한 장치-기반 측정에 의존한다. 따라서, 분광법으로부터 파생된 결과는 표준 조직병리학적 방법들에서 파생된 것보다 더 정확하고 세밀하다.
다양한 기법들이 스펙트럼 데이터를 얻기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 산란 효과를 이용한 시스템의 분자 진동을 평가하는 라만(Raman) 분광법은 세포나 조직 샘플을 분석하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법은 N. Stone 외, Vibrational Spectroscopy for Medical Diagnosis, J.Wiley & Sons (2008), 및 C.Krafft, 외, Vibrational Spectrosc. (2011)에서 설명된다.
1010개의 입사 광자 중 약 1개만 라만 산란을 견딘다는 점에서 라만의 산란 효과는 취약하다고 간주된다. 따라서, 라만 분광법은 강하게 집중된 가시적 또는 근접-IR 레이저 빔을 이용할 때 자극에 가장 효과적이다. 이것은 결국 스펙트럼 정보가 취합되고 있는 점을 규정한다. 현미경 대물렌즈의 개구수와 이용된 레이저의 파장에 따라, 이 점의 사이즈는 약 0.3㎛에서 2㎛정도의 범위에 있을 수 있다. 데이터 세트가 수많은 스펙트럼을 포함하고 긴 데이터 인식 시간을 요구할 수 있기 때문에, 이 작은 점의 사이즈는 대형 조직 부분의 데이터 수집을 배제한다. 결국, 라만 분광법을 사용하는 SHP는 관심의 작은 영역을 선택하기 위해 오퍼레이터를 필요로 한다. 이 방식은 조직의 큰 영역에 대한 비편파적 분석(unbiased analysis)과 같은 스펙트럼 이미징의 장점들을 무효화한다.
뇌, 폐, 구강 점막, 자궁경부 점막, 갑상선, 결장, 피부, 유방, 식도, 전립선 및 림프절 등을 포함하는 조직 내 이상을 발견하기 위해 적외선 분광법을 사용하는 SHP가 또한 이용되어 왔다. 라반 분광법과 같은 적외선 분광법은 분자 진동에 근거하지만 흡수 효과이며, 입사된 적외선 광자의 1%에서 50% 사이는 특정 조건이 충족될 경우 흡수되기 쉽다. 그 결과, 데이터는 라만 분광법과 비교했을 때 적외선 분광법에 의해 완벽한 스펙트럼의 질로 더욱 빠르게 인식될 수 있다. 게다가, 적외선 분광법은 조직 내 작은 구성적 변화를 감지하는데 극도로 민감하다. 결국, 적외선 분광법을 사용하는 SHP는 미세-전이를 쉽게 발견할 수 있기 때문에, 전이될 때까지 빈번히 발견되지 못하는 유방암과 같은 암의 진단, 치료 및 예후에 특히 유리하다. 그것은 또한 소수의 개별 세포들만큼 작은 전이성 암 세포의 소형 군집을 발견할 수 있다. 더 나아가, 적외선 분광기의 사용을 통해 달성되는 공간 해상도는 인간 세포의 사이즈와 비슷하고, 대형 적외선 검출기를 통합한 상업적 기기는 몇 분 안에 수 만개의 픽셀 스펙트럼을 모을 수 있다.
적외선 분광법을 이용하는 SHP의 방법은 Bird 외, "Spectral detection of micro-metastates in lymph node histo-pathology", J. Biophoton. 2, No. 1-2, 37-46 (2009)(이하 "Bird")에서 설명되었다. 이 방법은 림프절 내 미세-전이와 개별 전이성 세포를 정확히 찾아내기 위해 적외선 마이크로-분광법(IRMSP) 및 다변량 분석을 이용한다.
Bird는 700과 4000㎝-1 사이에 1650 스펙트럼 강도 포인트를 각각 갖는 25,600 스펙트럼을 포함하는 원시 초분광 이미징 데이터 세트를 연구하였다. 각각 약 400 MByte를 차지하는 이 데이터 세트가 불려와 사전 처리되었다. 데이터 처리는 900-1800㎝-1의 파상수 범위 제한 및 다른 과정들을 포함한다. "지문" 적외선 스펙트럼 영역은 이후 1700과 1450㎝-1 사이의 "단백질 영역"으로 나뉘고, 단백질 펩티드 결합의 아미드 Ⅰ과 아미드 Ⅱ 진동 결합에 의해 지배된다. 이 영역은 다른 단백질 2차 및 3차 구조에 매우 민감하고, 다른 단백질 함량에 따른 세포 생물학의 특정 현상이 발생하도록 사용될 수 있다. 900에서 1350㎝-1의 낮은 파상수 범위인 "인산 영역"은 DNA 및 RNA와 마찬가지로 인지질 내에서 발견되는 인산디에스터 결합의 몇몇 진동을 포함한다.
Bird에서, 통합된 아미드 Ⅰ 결합의 최소 강도 기준은 조직 범위 없이 픽셀을 제거하기 위해 정해졌다. 이후, 벡터 정규화 및 2차 파생물로의 스펙트럼 벡터 변환이 수행된다. 그 후, 스펙트럼 유사성 및 Ward의 군집화(clustering) 알고리즘을 정의하기 위해 데이터 세트는 유클리디언 거리를 이용하여 개별적으로 위계적 군집 분석(HCA)을 받는다. 픽셀 더스터 자격은 의사-색채(pseudo-color) 스펙트럼 이미지로 변환된다.
Bird의 방법에 따르면, 스펙트럼 분석이 시행될 비착색 인접 조직 부분 상의 해당 영역들을 강조하기 위해, 지표들은 착색된 조직 부분을 가진 슬라이드 상에 놓인다. 그 결과로 스펙트럼 이미지와 시각적 이미지 상의 명확한 특징을 정렬하는 사용자에 의해, 스펙트럼과 시각적 이미지는 상기 스펙트럼 및 시각적 이미지를 물리적으로 덮기 위해 매치된다.
Bird의 방법에 따라, 시각적 관찰과 스펙트럼 데이터 간의 상관관계를 결정하기 위해, 상기 스펙트럼 이미지와 시각적 이미지에 대응하는 부분이 조사된다. 특히, 착색된 시각적 이미지를 덮는 스펙트럼 이미지와 부합하는 부분을 조사할 때, 착색된 시각적 이미지 내에서 병리학자에 의해 관찰된 비정상 또는 암 세포가 관찰될 수 있다. 결국, 의사-색채 스펙트럼 이미지 내 패턴의 윤곽은 착색된 시각적 이미지 내에서 알고 있는 비정상 또는 암 세포와 부합할 수 있다. 착색된 시각적 이미지 내에서 병리학자에 의해 관찰된 잠재적 비정상 또는 암 세포는 의사-색채 스펙트럼 이미지의 정확성을 입증하기 위해 사용될 수 있다.
하지만, Bird의 방법은 스펙트럼 및 시각적 이미지 상의 특정 지표를 시각적으로 매치하기 위해 사용자의 기술에 의존하기 때문에 불명확하다. 이 방법은 종종 애매하다. 게다가, Bird의 방법은 상기 시각적 및 스펙트럼 이미지가 물리적으로 그들을 덮으면서 매치되도록 하지만 두 이미지로부터의 데이터를 서로 연결하지 않는다. 상기 이미지들은 단지 물리적으로 덮이기 때문에, 겹쳐진 이미지들은 향후 분석을 위해 함께 저장되지 않는다.
나아가, 조직의 다른 인접 부분이 스펙트럼 및 시각적 이미징을 받기 때문에, Bird의 덮인 이미지는 동일한 조직 부분을 보여주지 않는다. 시각적 이미지의 형태와 스펙트럼 이미지의 색상 패턴 내에 차이가 존재할 수 있기 때문에, 이는 상기 스펙트럼 및 시각적 이미지의 매치를 어렵게 만든다.
Bird의 덧씌우기 방법에 대한 또 다른 문제는 상기 시각적 이미지가 상기 적외선 스펙트럼 이미지와 같이 동일한 공간 영역에 있지 않다는 것이다. 따라서, Bird의 시각적 이미지와 스펙트럼 이미지의 공간 해상도는 상이하다. 전형적으로, 상기 적외선 이미지의 공간 해상도는 상기 시각적 이미지의 해상도보다 낮다. 해상도 내의 이러한 차이를 설명하기 위해, 해당되는 시각적 점 주변의 영역을 선택하고 한 점이 아닌 그 영역을 진단함으로써, 적외선 영역에서 사용된 데이터는 확장될 수 있다. 상기 시각적 이미지 내의 모든 점에는, 진단 결과가 나오기 위해 입력되어야 하는 점보다 더 큰 적외선 이미지의 영역이 있다. 해상도 차이를 설명하는 이 과정은 Bird에 의해 수행되지 않는다. 대신, Bird는 상기 시각적 이미지 내에서 점을 선택할 때, 그것은 덧씌우기를 통한 상기 스펙트럼 이미지 내 정보의 동일 점이고, 이에 상응하는 진단이 나온다고 추정한다. 상기 이미지들이 시각적으로는 동일할 수 있는 반면, 진단적으로는 동일하지 않다.
진단적으로 매치하기 위해, 사용되는 상기 스펙트럼 이미지는 해당되는 진단 서명을 인식하도록 훈련된 감독 진단 알고리즘으로부터 나와야 한다. 결국, 사용자-선택가능 매치가 아닌 진단적 매치를 생성하기 위해, 상기 스펙트럼 이미지 군집은 생화학적 분류에 따른 알고리즘 분류 체계에 의해 제한될 것이다. 이에 반해, Bird는 진단을 위해 "감독" 착색된 시각적 이미지와 비교할 때 "무감독" HCA 이미지를 사용했다. 군집화를 위해 정해진 규칙과 제한에 근거하여, 상기 HCA 이미지는 아직 진단이 결정되지 않은 공통 스펙트럼 특징의 영역을 식별하고, 암 영역의 윤곽을 나타내도록 경계(기하학적) 연결이 병리학자에 의해 시각적으로 수용될 때까지 수동적으로 계통수(dendrogram)를 절단하는 것을 포함한다. 이 방법은 그저 시각적인 비교만을 제공한다.
형광 데이터 분석에 근거한 다른 방법들이 존재하며, 일반적으로 착색 또는 라벨과 같은 외부 태그의 분포에 근거하거나, 자가-형광으로도 알려진 고유 형광의 변화를 이용한다. 생화학적 구성 및 구성 내 변화를 인식하는데 있어서, 이러한 방법들은 일반적으로 덜 진단적이다. 또한, 이 방법들은 라만과 적외선과 같은 진동 분광법 기술의 지문 감도가 부족하다.
스펙트럼 인식 기술의 일반적인 문제는 생물학적 샘플을 테스트할 때 많은 양의 스펙트럼 데이터가 수집된다는 것이다. 그 결과, 데이터 분석 처리는 계산적으로 복잡해지고 시간이 많이 소요된다. 스펙트럼 데이터는 산란과 베이스라인 인공 산물과 같이 현미경으로 얻어진 세포 및 조직의 적외선 스펙트럼 내에서 빈번히 관찰되는 교락 스펙트럼 특징(confounding spectral features)을 종종 포함한다. 따라서, 해당 세포 물질을 분리하고 교락 스펙트럼 특징을 제거하기 위해, 스펙트럼 데이터를 대상으로 사전-처리하는 것은 도움이 된다.
교락 스펙트럼 특징 중 한 유형은 미 산란(Mie scattering)이고, 이는 샘플 형태-의존적 효과이다. 샘플이 불균일하고 샘플에 작용하는 빛의 파장에 가까운 크기의 입자들을 포함하는 경우, 이 효과는 적외선 흡수 또는 반사 측정을 방해한다. 미 산란은 방대하고 기복이 있는 산란 특징에 의해 명시되며, 이 위로 적외선 흡수 특징이 겹쳐진다.
미 산란은 흡수성 및 반사성 선형의 혼합을 중재할 수도 있다. 원칙적으로, 순수한 흡수성 선형은 흡수성의 주파수-의존과 상응하고, 대부분 가우시안, 로렌찌안 또는 이 둘의 혼합이다. 흡수 곡선은 복합 굴절률의 허수부에 해당한다. 반사적 기여는 상기 복합 굴절률의 실수부에 해당하고, 선형 내에서 분산된다. 수치적 KK-변환에 의해 또는 복합 푸리에 변환(FT)의 실수부로서, 분산적 기여는 흡수성 선형으로부터 얻어질 수 있다.
공명 미(RMie) 특징은 흡수성 및 반사성 결합 형태의 혼합으로부터 도출되고, 굴절률이 변칙 분산을 겪기 때문에 흡수성이 최대가 될 때 발생한다(즉, 흡수 밴드의 프로파일 상에서). 미 산란 또는 굴절률에 의존하는 다른 광학 효과들은 반사성 및 흡수성 선형을 혼합할 것이며, 이는 상기 밴드 프로파일의 왜곡과 명백한 주파수 이동을 발생시킨다.
도 1은 SCP와 SHP 모두에서 관찰되는 분산 밴드형에 의한 흡수 패턴의 오염을 보여준다. 도 1의 바닥 자국은 생물학적 조직의 일반 흡수 스펙트럼을 보여주는 반면, 상부 자국은 RMie 효과를 통하여 분산적 요소에 의해 심각하게 오염된 스펙트럼을 보여준다. 상기 스펙트럼 왜곡은 화학적 구성과 관련이 없는 것으로 나타나지만, 샘플의 형태에는 의존한다. 이에 따른 밴드 강도 및 주파수 이동은 밴드 이동의 발생 때문에 비오염과 오염 스펙트럼이 다른 그룹으로 분류되도록 스펙트럼 분석을 악화시킨다. 방대하고 기복이 있는 배경 특징이 도 2에서 보여진다. 세포의 적외선 미세-분광법(IR-MSP) 패턴 상에서 겹쳐졌을 때, 이 특징들은 세포핵과 같은 구형 입자나 구형 세포에 의해 미 산란에 기인한다.
IR-MSP 스펙트럼 상에서 겹쳐진 도 1의 분산성 선형 외관은 M. Romeo, 외, Vibrational Spectroscopy, 38, 129 (2005) (이하 "Romeo 2005") 내의 이론적 분석에 따라 보고되었다. 분산성(반사성) 요소의 중첩으로부터 적외선 스펙트럼의 흡수 특징 상에서 발생하면서, Romeo 2005는 왜곡된 밴드 형태를 구분한다. 이 효과들은 장치 제어 소프트웨어의 부정확한 위상 보정에 기인한다. 특히, FTIR 분광법 내에서 획득한 원시 인터페로그램은 빈번히 "처프(chirped)"되거나 비대칭적이며, FT 전에 대칭화되어야 한다. 이는 더 짧은 인터페로미터 스트로크 상에서 양면의 인터페로그램을 모으고, 대칭적 인터페로그램을 산출하기 위해 위상 보정을 계산함으로써 이뤄진다.
Romeo 2005에서, 이 과정은 적절하게 수행되지 않는다고 추정되었고, 이는 그것이 왜곡된 스펙트럼 특징을 산출하도록 한다. 왜곡된 스펙트럼의 실수부와 허수부 사이의 위상을 계산하고 실수 및 허수부가 보정된 위상으로부터 파워 스펙트럼을 재구성함으로써 왜곡된 스펙트럼 특징을 보정하려는 시도가 이뤄진다. Romeo 2005는 관찰된 적외선 스펙트럼의 각 흡수 밴드에서 굴절률은 변칙 분산을 겪는다는 것도 보고한다. 특정 상황에서, 다양한 양의 분산성 선형은 흡수성 스펙트럼과 함께 겹쳐지거나 혼합될 수 있다.
흡수성 및 반사성 밴드형 사이의 수학적 관계는 Kramers-Kronig(KK) 변환에 의해 제시되었고, 이는 두 가지 물리적 현상과 관련이 있다. 관찰된 스펙트럼 내의 분산성(반사성) 및 흡수성 효과의 혼합은 확인되었고, "위상 보정(PC)"이라 불리는 절차를 통해 상기 효과를 보정하는 방법은 Romeo 2005에서 논의된다. 비록 분산성 및 흡수성 기여의 혼합 원인은 장치 소프트웨어 오작동의 잘못에 기인하지만, 교락 효과의 원칙은 제대로 확인되었다. 하지만 기초 물리학의 불완전한 이해 때문에 상기에 제시된 보정 방법은 올바르게 작용하지 않는다.
P. Bassan 외, Analyst, 134, 1586 (2009) 및 P. Bassan 외, Analyst, 134, 1171 (2009)는 분산성 및 흡수성 효과는 "공명 미 산란(RMieS)" 효과를 통해 혼합할 수 있다고 설명한다. 스펙트럼 왜곡을 보정하는 알고리즘과 방법은 P. Bassan 외, "Resonant Mie Scattering (RMieS) correction of infrared spectra from highly scattering biological samples", Analyst, 135, 268-277 (2010)에서 설명되었다. 이 방법은 A. Kohler 외, Appl. Spectrosc., 59, 707 (2005) 및 A. Kohler 외, Appl. Spectrosc., 62, 259 (2008)에서 보고된 "Extended Multiplicative Signal Correction(EMSC)" 방법의 연장이다.
다중 선형 회귀 모형에 순수 흡수 스펙트럼의 KK-변환을 통해 얻어진 반사성 요소를 포함시킴으로써, 이 방법은 비-공명 미 산란을 적외선 스펙트럼 데이터세트로부터 제거한다. 이 방법은 참조 스펙트럼의 반사성 기여 계산에 사용되는 입력정보 및 EMSC 스케일링의 정규화 기능으로서 원시 데이터세트와 "참조(reference)" 스펙트럼을 이용한다. 참조 스펙트럼이 선험적으로 인식되지 않았기 때문에, Bassan 등은 전체 데이터세트의 평균 스펙트럼 또는 순수 단백질 기질의 스펙트럼과 같은 "인공" 스펙트럼을 "근원" 참조 스펙트럼으로 사용한다. 상기 알고리즘을 통한 최초 패스 후, 부속 패스 내의 모든 스펙트럼을 보정하기 위해 각각의 보정된 스펙트럼은 반복적 방식으로 사용될 수 있다. 결국, 1,000,000 보정 실행을 필요로 하면서, 1000 스펙트럼의 데이터세트는 1000 RMieS-EMSC 보정된 스펙트럼을 생산할 것이고, 각각은 다음 패스를 위해 독립적 새 참조 스펙트럼으로 사용될 것이다. "RMieS-EMSC" 알고리즘으로 불리는 이 알고리즘을 보정된 출력 스펙트럼의 안정적 수준에서 실행하는 것은 여러 패스들(-10) 및 며칠 동안 측정되는 계산 시간을 필요로 한다.
B. Bird, M. Miljkovic 및 M. Diem, "Two step resonant Mie scattering correction of infrared micro-spectral data: human lymph node tissue", J. Biophotonics, 3 (8-9) 597-608 (2010)에서 논의되었듯, RMieS-EMSC 알고리즘은 계산 시간으로 수 시간 또는 수 일을 필요로 하기 때문에, 산란 및 분산형 선형을 스펙트럼으로부터 제거하는 빠른 2단계 방법이 개발되었다. 이 방식은 van Hulst 방정식(H. C. Van De Hulst, Light Scattering by Small Particles, Dover, Mineola, NY, (1981) 참고)을 통해 계산된 미 산란 곡선과 마찬가지로, 순수 흡수 스펙트럼의 KK-변환부터 Extended Multiplicative Signal Correction (EMSC) (A. Kohler 외, Appl.Spectrosc., 62, 259 (2008) 참고)로 알려진 과정을 통한 데이터세트의 모든 스펙트럼까지 얻어진 다중 분산 요소를 맞추고, 이러한 교란 요소들 없이 모든 스펙트럼을 재구성하는 것을 포함한다.
이 알고리즘은 데이터세트로부터 비오염 참조 스펙트럼을 사용함으로써 RMieS-EMSC 알고리즘에서 사용되는 반복적 방식을 피한다. 이 비오염 참조 스펙트럼은 데이터세트의 예비 군집 분석을 수행하고 "비오염" 스펙트럼으로 각 군집 내 최고 아미드 Ⅰ 주파수를 가진 스펙트럼을 선택하면서 발견되었다. 위에서 설명된 바와 같이, RMieS 보정을 위해 압축된 미 곡선을 따라, 상기 스펙트럼은 수치적 KK 변환을 통해 순수 반사성 스펙트럼으로 전환되었고 간섭 스펙트럼으로 사용되었다. 이 방식은 신속하지만, 몇몇의 스펙트럼 분류를 포함하는 데이터세트에서만 작용한다.
하지만 많은 조직 유형을 갖고 있는 스펙트럼 데이터세트의 경우, 비오염 스펙트럼의 추출은 지루해질 수 있다. 게다가, 이러한 상태에서 데이터세트 내의 모든 스펙트럼이 대부분의 적정 간섭 스펙트럼에 맞춰진다고 보장하는 것은 불확실하다. 또한, 이 알고리즘은 보정을 위한 참조 스펙트럼을 필요로 하고, 큰 데이터세트에서 최고의 효과를 발휘한다.
상기 내용에 비추어 볼 때, 스펙트럼 이미징에 의해 향상된 생물학적 표본 분석 방법은 의학적 진단을 제공하기 위해 여전히 필요하다. 나아가, 수정된 위상 보정 방식에 근거하고, 입력 데이터를 필요로 하지 않으며, 계산적으로 빠르고, 또한 현미경으로 얻어진 세포와 조직의 적외선 스펙트럼 내에서 빈번히 관찰되는 다양한 유형의 교락 스펙트럼 기여를 고려하는 향상된 사전-처리 방법이 필요하다.
본 발명은 종래의 의료 진단을 위한 방법들의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 스펙트럼 이미징에 의해 생물학적 표본을 분석하고, 이에 근거하여 의료 진단을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면은 의료 진단을 제공하기 위해 스펙트럼 이미징에 의해 생물학적 표본을 분석하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 생물학적 표본의 스펙트럼 및 시각적 이미지를 획득하는 단계와, 세포 이상, 암 발병 전의 세포 및 암 세포 등의 생물학적 표본의 이상을 발견하기 위해 상기 이미지들을 등록하는 단계를 포함한다. 이 방법은 무엇보다도 표준 조직병리학, 세포학 및 다른 스펙트럼 방법에 내재된 진단 및 예후의 편견과 불신을 제거한다는 점에서 위에 논의된 문제점들을 극복한다.
본 발명의 다른 측면은 미시적으로 획득된 세포 및 조직의 적외선 스펙트럼에서 자주 관찰되는 교락 스펙트럼 기여(confounding spectral contributions)를 상기 스펙트럼 데이터에 위상 보정을 수행함으로써 보정하는 방법에 관한 것이다. 이 위상 보정 방법은 반사 요소에 의해 오염된 다양한 종류의 흡수 스펙트럼을 보정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 측면에 따르면, 스펙트럼 이미징에 의해 생물학적 표본을 분석하는 방법은 상기 생물학적 표본의 스펙트럼 이미지를 획득하는 단계, 상기 생물학적 표본의 시각적 이미지를 획득하는 단계 및 상기 시각적 이미지와 스펙트럼 이미지를 등록하는 단계를 포함한다.
본 발명의 측면에 따른 데이터 저장소를 개발하는 방법은 질병 또는 상태를 표시하는 시각적 이미지의 영역을 식별하는 단계, 상기 시각적 이미지의 영역을 상기 영역에 대응하는 스펙트럼 데이터에 연결하는 단계 및 상기 스펙트럼 데이터와 해당 질병 또는 상태 간의 연결을 저장하는 단계를 포함한다.
본 발명의 측면에 따른 의료 진단을 제공하는 방법은 생물학적 표본에 대한 분광 데이터를 획득하는 단계, 상기 생물학적 표본에 대한 분광 데이터를 질병 또는 상태에 관련된 저장소의 데이터와 비교하는 단계, 상기 저장소의 데이터 및 생물학적 표본에 대한 분광 데이터 간의 상관관계를 결정하는 단계 및 상기 결정과 관련된 진단을 출력하는 단계를 포함한다.
본 발명의 측면에 따른 의료 진단을 제공하는 시스템은 프로세서, 상기 프로세서를 통해 기능하는 사용자 인터페이스 및 상기 프로세서에 의해 접근 가능한 저장소를 포함하며, 생물학적 표본의 분광 데이터가 얻어지고, 상기 생물학적 표본의 분광 데이터는 질병 또는 상태에 관련된 저장소의 데이터와 비교되며, 상기 저장소의 데이터 및 생물학적 표본에 대한 분광 데이터 간의 상관관계가 결정되고, 그리고 상기 결정과 관련된 진단을 출력한다.
본 발명의 측면에 따른 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨터가 의료 진단을 제공하도록 컨트롤 로직을 그 안에 저장시키는 컴퓨터 사용 가능 매체를 포함한다. 상기 컨트롤 로직은 생물학적 표본에 대한 분광 데이터를 획득하기 위한 첫 번째 컴퓨터 가독 프로그램 코드, 상기 생물학적 표본에 대한 분광 데이터를 질병 또는 상태와 관련된 저장소의 데이터와 비교하기 위한 두 번째 컴퓨터 가독 프로그램 코드, 상기 저장소의 데이터 및 생물학적 표본에 대한 분광 데이터 간의 상관관계를 결정하기 위한 세 번째 컴퓨터 가독 프로그램 코드 및 상기 결정과 관련된 진단 및/또는 예후를 출력하기 위한 네 번째 컴퓨터 가독 프로그램 코드를 포함한다.
본 발명은 생물 표본의 스펙트럼 및 시각적 이미지를 획득하는 단계와, 세포 이상, 암 발병 전의 세포 및 암 세포를 발견하기 위해 상기 이미지를 등록하는 단계를 포함하는 의료 진단을 제공하기 위해 스펙트럼 이미징에 의해 생물 표본을 분석하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 표준 조직병리학 및 다른 스펙트럼 방법에 내재된 진단의 편견과 불신을 제거할 수 있는 효과가 있다.
또한, 미시적으로 획득된 세포 및 조직의 적외선 스펙트럼에서 자주 관찰되는 교락 스펙트럼 기여의 보정 방법은 상기 스펙트럼 데이터 상의 위상 보정을 수행하는 단계를 포함하며, 이러한 위상 보정 방법은 반사 요소에 의해 오염된 다양한 유형의 흡수 스펙트럼을 보정할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 SCP 및 SHP 모두에서 전형적으로 관찰되는 분산 밴드 모양에 의한 흡수 패턴의 오염을 나타낸다.
도 2는 구형 입자에 의해 미 산란에 기인하는 세포의 IR-MSP 스펙트럼 상에서 전형적으로 관찰되는 방대하고 기복이 있는 배경 특징을 보여준다.
도 3은 본 발명의 측면에 따른 스펙트럼 이미징에 의해 생물학적 샘플을 분석하는 방법을 나타내는 순서도이다.
도 3A는 본 발명의 측면에 따른 스펙트럼 이미지를 획득하는 방법의 단계를 나타내는 순서도이다.
도 3B는 본 발명의 측면에 따른 스펙트럼 데이터의 사전-처리 방법의 단계를 나타내는 순서도이다.
도 4A 및 4B는 본 발명의 측면에 따른 스펙트럼 이미지와 시각적 이미지의 이미지 등록 수행 방법의 일실시예를 나타내는 순서도이다.
도 4C는 본 발명의 측면에 따른 슬라이드 홀더의 일실시예를 나타낸다.
도 5A는 본 발명의 측면에 따른 이미지 등록 개선 방법의 일실시예를 나타내는 순서도이다.
도 5B는 본 발명의 측면에 따른 한계치 설정을 위한 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) 인터페이스의 일실시예이다.
도 5C는 본 발명의 측면에 따른 최적화 창의 예시를 나타내는 GUI 인터페이스의 일실시예이다.
도 6A는 본 발명의 측면에 따른 선형 배경 상에 겹쳐진 일반적인 스펙트럼을 보여준다.
도 6B는 본 발명의 측면에 따른 2차 파생 스펙트럼의 일실시예를 보여준다.
도 7은 본 발명의 측면에 따른 인터페로그램의 실수부 부분을 보여준다.
도 8은 본 발명의 측면에 따라 위상 보정 후 최대 강도를 생성하는 위상각이 손상되지 않은 스펙트럼으로 간주되는 것을 보여준다.
도 9A는 본 발명의 측면에 따른 베이스라인 경사를 모방하는 분산 효과에 의해 오염되는 흡수 스펙트럼을 보여준다.
도 9B는 본 발명의 측면에 따라 전방 FT의 허수부가 스펙트럼 경계에서 강한 곡선 효과를 보이며, 그 결과 보정된 스펙트럼이 오염되는 것을 보여준다.
도 10A는 본 발명의 측면에 따라 막낭(capsule)에서 유방암 미세-전이가 확인된 림프절을 보여주는 H&E-기반 조직병리학이다.
도 10B는 본 발명의 측면에 따라 도 10A의 림프절 부분에서 수행된 위계적 군집 분석(HCA)에 의한 데이터의 세분화를 보여준다.
도 10C는 본 발명의 측면에 따라 각 스펙트럼 내 아미드 I 진동 밴드의 피크 주파수를 보여주는 도면이다.
도 10D는 본 발명의 측면에 따라 RMieS 보정을 이용한 위상-보정 후 도 10A의 동일한 림프절 부분의 이미지를 보여준다.
도 11A는 본 발명의 측면에 따라 도 10D의 RMieS 보정을 이용한 위상-보정 후 HCA의 결과를 보여준다.
도 11B는 본 발명의 측면에 따른 도 11A의 림프절 부분의 H&E-기반 조직병리학이다.
도 12A는 착색된 자궁경부 이미지 부분의 시각적 현미경 이미지이다.
도 12B는 본 발명의 측면에 따른 조직의 착색 이전에 수집된 적외선 데이터세트의 위계적 군집 분석으로부터 생성된 적외선 스펙트럼 이미지이다.
도 13A는 본 발명의 측면에 따른 H&E-착색 액와부 림프절(axillary lymph node) 부분의 시각적 현미경 이미지이다.
도 13B는 본 발명의 측면에 따른 조직의 착색 이전에 수집된 적외선 데이터세트의 다층 퍼셉트론 네트워크(Multilayer Perceptron Networks) 분석으로부터 생성된 적외선 스펙트럼 이미지이다.
도 14A는 본 발명의 측면에 따른 소세포 폐암 조직의 시각적 이미지이다.
도 14B는 본 발명의 측면에 따른 도 14A에서 보이는 조직의 HCA-기반 스펙트럼 이미지이다.
도 14C는 본 발명의 측면에 따른 도 14A의 시각적 이미지와 도 14B의 스펙트럼 이미지의 등록된 이미지이다.
도 14D는 본 발명의 측면에 따른 도 14C의 등록된 이미지에 대한 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)의 일실시예이다.
도 15A는 본 발명의 측면에 따른 H&E-착색 림프절 조직 부분의 시각적 현미경 이미지이다.
도 15B는 도 15A에서 나타낸 부분의 글로벌 디지털 착색 이미지이며, 본 발명의 측면에 따라 림프절의 막낭과 내부를 구분한다.
도 15C는 도 15A에서 나타낸 부분의 진단 디지털 착색 이미지이며, 본 발명의 측면에 따라 막낭, 전이성 유방암, 조직구, 활성화된 B-림프구와 T-림프구를 구분한다.
도 16은 본 발명의 측면에 따른 글로벌 및 진단 디지털 착색 간 관계의 개략도이다.
도 17A는 본 발명의 측면에 따른 액와부 림프절에서 H&E-착색 조직 부분의 시각적 이미지이다.
도 17B는 본 발명의 측면에 따른 유방암 미세 전이의 SHP-기반 디지털 착색 영역이다.
도 17C는 본 발명의 측면에 따른 B-림프구가 차지하는 SHP-기반 디지털 착색 영역이다.
도 17D는 본 발명의 측면에 따른 조직세포가 차지하는 SHP-기반 디지털 착색 영역이다.
도 18은 본 발명의 측면에 따라 SHP를 통한 개별 암 세포 및 암 세포의 작은 군집의 감지를 설명한다.
도 19A는 본 발명의 측면에 따라 폐 선암(lung adenocarcinoma), 소세포암(small cell carcinoma) 및 편평 상피 세포 암종 세포(squamous cell carcinoma cells)로부터 기록된 세포 스펙트럼으로 구성되는 원시 스펙트럼 데이터 세트를 보여준다.
도 19B는 본 발명의 측면에 따라 폐 선암, 소세포암 및 편평 상피 세포 암종 세포로부터 기록된 세포 스펙트럼으로 구성되는 보정된 스펙트럼 데이터 세트를 보여준다.
도 19C는 본 발명의 측면에 따라 폐 선암, 소세포암 및 편평 상피 세포 암종 세포에 대한 표준 스펙트럼을 보여준다.
도 19D는 도 19C의 스펙트럼으로부터 계산된 KK 변환 스펙트럼을 보여준다.
도 19E는 본 발명의 측면에 따라 EMSC 보정 전 다중 클래스 데이터 세트의 PCA 스코어 도면을 보여준다.
도 19F는 본 발명의 측면에 따라 EMSC 보정 후 다중 클래스 데이터 세트의 PCA 스코어 도면을 보여준다.
도 20A는 본 발명의 측면에 따라 폐 선암, 소세포암 및 편평 상피 암종의 평균 흡광 스펙트럼(mean absorbance spectra)을 보여준다.
도 20B는 본 발명의 측면에 따라 도 20A에 표시된 흡광 스펙트럼의 2차 파생 스펙트럼을 보여준다.
도 21A는 본 발명의 측면에 따라 선암, 소세포암 및 편평 상피 세포 암종 세포를 각각 포함하는 1㎜ x 1㎜ 조직 영역의 4 스티치된 현미경 R&E-착색 이미지를 보여준다.
도 21B는 본 발명의 측면에 따른 도 21A에 나타난 상기 조직 영역으로부터 기록된 4 스티치된 원시 적외선 이미지의 1350㎝-1 - 900㎝-1 스펙트럼 영역에서 빠르게 감소하는 RCA 분석의 수행에 의해 구성된 바이너리 마스크 이미지이다.
도 21C는 본 발명의 측면에 따른 진단 세포 물질의 영역으로부터 기록된 분산 보정 스펙트럼 데이터의 6-군집 RCA 이미지이다.
도 22는 본 발명의 측면과 함께 사용하기 위한 컴퓨터 시스템의 다양한 특징을 보여준다.
도 23은 본 발명의 측면과 함께 사용하기 위한 컴퓨터 시스템을 보여준다.
본 특허의 파일은 하나 이상의 컬러 도면을 포함한다.
컬러 도면을 갖는 본 특허의 사본은 필수 수수료의 요청과 지불에 따라 특허청에 의해 제공될 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 여기에 쓰이는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명의 측면이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 것과 같이 동일한 의미를 갖는다. 비록 여기에 설명된 것들과 비슷하거나 동일한 방법 및 자료는 실습이나 실험에 이용될 수 있지만, 적절한 방법과 자료는 아래에 설명된다. 여기에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 문헌들은 전부가 참고로 인용된다. 분쟁이 발생하는 경우, 정의를 포함한 이 명세서가 조정할 것이다. 또한, 상기 자료, 방법 및 예시는 단지 설명을 도울 뿐, 제한하도록 의도되지 않는다.
본 발명의 한 측면은 스펙트럼 이미징에 의해 의학 진단을 제공하기 위한 생물학적 표본 분석 방법과 관련이 있다. 상기 생물학적 표본은 외과적 방법, 생체 검사 및 배양된 샘플에 의해 획득된 의학적 표본이 될 수 있다. 세포 이상, 전암 세포 및 암 세포를 발견하기 위해 상기 방법은 생물학적 표본의 스펙트럼 및 시각적 이미지를 획득하는 단계와 상기 이미지들을 등록하는 단계를 포함한다. 상기 생물학적 표본은 조직이나 세포 샘플을 포함할 수 있으나, 일부 어플리케이션에서는 조직 샘플이 선호된다. 이 방법은 림프절, 갑상선, 유방, 자궁, 신장, 정소, 난소 또는 전립선 암, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암 및 흑색종 등을 포함하는 비정상 혹은 암 및 다른 이상을 발견할 뿐만 아니라, 염증, 괴사, 세포사멸 등을 포함하는 암이 아닌 증상들도 발견한다.
표준 조직병리학과 다른 스펙트럼 방법에 내재하는 진단, 예후, 예측 및 치료진단(theranostics)의 편향 및 비신뢰성을 제거하거나 대개 감소시킨다는 점에서, 본 발명의 측면에 따른 한 방법은 위에서 논의한 장애들을 극복한다. 게다가, 양적 및 재현 측정에 의해 생성되고, 고전 조직병리학에 대한 교정된 알고리즘에 의해 분석된 조직 유형의 스펙트럼 데이터베이스에 접근할 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법을 통해 비정상 및 암 세포는 표준 조직병리학 또는 다른 스펙트럼 기술을 포함하는 관련 기술에 의해 식별될 수 있는 것보다 앞서 발견될 수 있다.
본 발명의 측면에 따른 방법은 도 3의 순서도에서 설명된다. 도 3에서 보여지듯이, 상기 방법은 일반적으로 생물학적 부분을 획득하는 단계(301), 상기 생물학적 부분의 스펙트럼 이미지를 획득하는 단계(302), 동일한 상기 생물학적 부분의 시각적 이미지를 획득하는 단계(303) 및 이미지 등록을 수행하는 단계(304)를 포함한다. 상기 등록된 이미지는 선택적으로 훈련 받을 수 있으며(305), 의학적 진단이 얻어질 수 있다(306).
생물학적 부분
도 3에서 보여지는 본 발명의 예시 방법에 따르면, 상기 생물학적 부분을 획득하는 단계(301)는 인간 또는 동물과 같은 개체로부터 조직이나 세포 물질의 추출을 의미한다. 조직 부분은 코어 및 펀치 생검(punch biopsy)과 절개 등을 포함하는 방법에 의해 얻어질 수 있다. 세포 물질은 면봉 채취(swabbing)(박락물(exfoliation)), 세정(washing)(세척(lavages)) 및 세침흡인세포검사(fine needle aspiration: FNA) 등을 포함하는 방법에 의해 획득될 수 있다.
스펙트럼 및 시각적 이미지 획득을 받은 조직 부분은 표준 조직병리학에서 사용되는 방법에 따라 냉동 또는 파라핀(paraffin)이 포함된 조직 블록에서 준비될 수 있다. 상기 부분은 스펙트럼 데이터 획득 및 시각적 병리학 모두에 사용될 수 있는 슬라이드 상에 장착될 수 있다. 예를 들어, 상기 조직은 플루오르화 칼슘(CaF2) 등을 포함하는 물질로 구성된 적외선 투명 현미경 슬라이드나 상업적으로 이용 가능한 "low-e" 슬라이드와 같은 적외선 반사 슬라이드 상에 장착될 수 있다. 장착 후, 파라핀-포함 샘플은 탈파라핀화(deparaffinization) 될 수 있다.
스펙트럼 이미지
본 발명의 측면에 따라, 도 3에 보여지는 상기 생물학적 부분의 스펙트럼 이미지를 획득하는 단계(302)는 도 3A의 순서도에 나타난 바와 같이 상기 생물학적 부분으로부터 스펙트럼 데이터를 획득하는 단계(308), 데이터 사전-처리를 수행하는 단계(310), 다변량 분석(multivariate analysis)을 수행하는 단계(312) 및 상기 생물학적 부분의 그레이스케일(grayscale) 또는 의사-색채(pseudo-color) 이미지를 생성하는 단계(314)를 포함할 수 있다.
스펙트럼 데이터
도 3A에 제시된 바와 같이, 상기 생물학적 부분으로부터의 스펙트럼 데이터는 얻어질 수 있다(401). 조직 샘플과 같이 착색되지 않은 생물학적 샘플로부터의 스펙트럼 데이터는 상기 샘플의 화학적 구성의 스냅샷을 캡쳐하기 위해 얻어질 수 있다. 상기 스펙트럼 데이터는 조직 부분으로부터 픽셀 정보로 수집될 수 있으며, 각각의 픽셀은 세포 핵의 크기 정도이다. 각 픽셀은 고유의 스펙트럼 패턴을 가지며, 샘플의 상기 스펙트럼 패턴 비교 시 조직의 생화학적 구성에서 작지만 반복되는 차이를 보일 수 있다.
상기 스펙트럼 데이터는 적외선(infrared), 라만(Raman), 가시(visible), 테라헤르츠(terahertz) 및 형광(fluorescence) 분광법(spectroscopy) 등을 포함하는 방법에 의해 수집될 수 있다. 적외선 분광법은 감쇠 전반사(attenuated total reflectance: ATR) 및 감쇠 전반사 푸리에 변환 적외선 분광법(attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy: ATR-FTIR) 등을 포함한다. 일반적으로, 적외선 분광법은 라만 분광법에 의해서도 나타날 수 있는 지문 감도(fingerprint sensitivity) 때문에 사용될 수 있다. 적외선 분광법은 더 큰 조직 부분과 함께 라만 분광법보다 더 관리 가능한 사이즈의 데이터세트를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 적외선 분광법 데이터는 완전 자동 데이터 수집 및 해석을 더욱 잘 처리할 수 있다. 게다가, 적외선 분광법은 다양한 조직 구조 감지 및 질병의 진단을 위한 필수 감도 및 특수성을 가질 수 있다.
일반적으로 상기 스펙트럼 데이터의 강도 축(intensity axis)은 흡광(absorbance), 반사(reflectance), 방사(emittance), 산란 강도(scattering intensity) 또는 광력(light power)의 다른 적절한 척도를 나타낸다. 파장(wavelength)은 실제 파장, 파상수(wavenumber), 주파수 또는 전자기 방사선의 에너지와 관련이 있을 수 있다.
적외선 데이터의 획득은 현재 사용할 수 있는 푸리에 변환 적외선 이미징 마이크로분광계(microspectrometers), 양자 캐스케이드(quantum cascade)나 비-선형 광학 장치(non-linear optical devices)와 같이 조정 가능한 레이저-기반 이미징 장치 또는 다른 기술을 기반으로 한 동등한 기능의 기타 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 조정 가능한 레이저를 이용한 상기 스펙트럼 데이터의 획득은 미국 특허 출원 번호 13/084,287 제목 "Tunable Laser-Based Infrared Imaging System and Method of Use Thereof"에 추가적으로 설명되며, 이는 참조에 의해 여기에 전체적으로 통합된다.
본 발명의 측면에 따른 하나의 방법에 의하면, 병리학자 또는 기술자는 착색된 조직 부분의 영역을 선택할 수 있으며, 착색 전 상기 조직에 대해 수집된 초분광(hyperspertral) 데이터세트에 따라 실시간으로 상기 조직 영역의 분광-기반 평가를 받을 수 있다. 스펙트럼 데이터는 선택된 비착색 조직 샘플에서 상기 픽셀 각각에 대해 수집될 수 있다. 수집된 각각의 상기 스펙트럼은 각 조직 픽셀의 화학 성분의 지문을 포함한다. 스펙트럼 데이터의 획득은 WO 2009/146425에 설명되며, 이는 참조에 의해 여기에 전체적으로 통합된다.
일반적으로, 상기 스펙트럼 데이터는 초분광 데이터세트를 포함하고, 이는 N = n · m 개별 스펙트럼 또는 스펙트럼 벡터(흡수, 방출, 반사 등)를 포함하는 구조이며, 상기 n 및 m은 각각 이미지의 x와 y 차원에서의 픽셀의 수이다. 각 스펙트럼은 상기 샘플의 고유한 픽셀과 연관되고, 그 좌표 x 및 y에 위치할 수 있으며, 1 < x ≤ n, 1 < y ≤ m 이다. 각각의 벡터는 k 강도 데이터 포인트를 가지며, 이는 보통 주파수 또는 파상수 도메인에 동일하게 이격된다.
상기 스펙트럼 이미지의 픽셀 사이즈는 일반적으로 세포 이하의 해상도를 얻기 위해 전형적인 세포 사이즈보다 더 작게 선택될 수 있다. 상기 사이즈는 빛의 회절 한계(diffraction limit of the light)에 의해 결정될 수도 있으며, 이는 일반적으로 적외선의 약 5㎛ 내지 약 7㎛이다. 따라서, 조직의 1㎟ 부분에 대하여 약 1402 내지 약 2002의 개별 픽셀 적외선 스펙트럼이 수집될 수 있다. 스펙트럼 "하이퍼큐브"의 N 픽셀, 그 x와 y 좌표 및 그 강도 벡터(강도 대 파장) 각각이 저장된다.
사전-처리
상기 스펙트럼 데이터를 사전-처리의 형태로 종속시키는 것은 관심의 상기 세포 물질에 관계된 데이터의 분리와 교락 스펙트럼 특징의 제거에 도움이 될 수 있다. 도 3A를 참조하여, 상기 스펙트럼 데이터가 수집되면 이러한 사전-처리를 받게 될 수 있다(310).
사전-처리는 관심의 상기 세포 데이터를 분리하기 위해 샘플링 구역의 비-진단 영역으로부터 분리 진단하는 이진 마스크(binary mask)의 생성을 포함할 수 있다. 이진 마스크의 생성 방법은 WO 2009/146425에 공개되며, 이는 참조에 의해 여기에 전체적으로 통합된다.
본 발명의 다른 측면에 따른 사전-처리 방법은 그들간의 위상각을 조절하여 스펙트럼의 실수 및 허수부의 분리를 최적화하는 "위상 보정" 알고리즘에 의함으로써 관찰된 흡수 스펙트럼의 분산성 선형의 보정을 허용한다. 계산적으로 빠른 이 방법은 입력 데이터가 요구되지 않는 교정된 위상 보정 방식을 기반으로 한다. 적절한 위상각이 실험적으로 결정될 수 있는 위상 보정은 FTIR 및 NMR 분광법(후자의 경우, 상기 인터페로그램은 보통 "자유 유도 붕괴, FID"로 지칭된다)의 원시 인터페로그램의 사전 처리에 사용되지만, 본 발명의 이러한 측면의 방법은 Mie, RMie 및 굴절률(refractive index)의 변칙 분산(anomalous dispersion)에 기인하는 다른 효과와 같은 완화 요인(mitigating factor)을 고려한다는 점에서 이전의 위상 보정 방식과 다르며, 스펙트럼 데이터세트에 소급하여 적용될 수 있다.
본 발명의 이러한 측면의 사전-처리 방법은 역 FT 변환을 통해 손상된 스펙트럼을 푸리에 공간으로 변환시킨다. 상기 역 FT는 실수 및 허수 인터페로그램에서의 결과이다. 각 상기 인터페로그램의 하반기는 개별적으로 영-충전되고, 전방 FT 변환된다. 이 과정은 수치적 KK 변환을 통해 얻어진 동일한 분산 밴드 모양을 보이는 실수 스펙트럼 부분과 흡수성 선형을 포함하는 허수 부분을 산출한다. 그들 간의 정확한 위상각으로 상기 실수 및 허수 부분을 재결합함으로써, 위상-보정되고 인공 산물(artifact)이 없는 스펙트럼이 획득된다.
오염된 스펙트럼의 보정이 요구되는 상기 위상은 실험적으로 결정할 수 없고 스펙트럼마다 다르기 때문에, 위상각은 사용자 선택 단계에서 -90° 및 90° 사이의 단계적 방식을 이용하여 결정된다. "최적" 스펙트럼은 위상 보정 시 달라지는 피크 위치 및 강도 기준의 분석에 의해 결정된다. 광범위한 기복이 있는 미 산란 기여(Mie scattering contributions)는 이 방식으로 완전히 보정되지 않지만, 그것들은 2차 파생 스펙트럼 상의 위상 보정 계산을 수행함으로써 사라지며, 이는 미-분산 배경을 나타낸다.
본 발명의 측면에 따르면, 도 3A의 사전-처리 단계(310)는 도 3B의 순서도에 나타난 바와 같이, 상기 스펙트럼 범위를 선택하는 단계(316), 상기 스펙트럼의 2차 파생물을 계산하는 단계(318), 상기 데이터의 역 푸리에 변환 단계(320), 상기 인터페로그램의 영-충전 및 전방 푸리에 변환 단계(322) 및 상기 스펙트럼의 실수 및 허수부 결과 위상 보정 단계(324)를 포함할 수 있다.
스펙트럼 범위
316 단계에서, 초분광 데이터세트의 각 스펙트럼은 가장 적절한 스펙트럼 범위(지문 영역)를 선택하기 위해 사전-처리된다. 예를 들어, 이 범위는 약 800 내지 약 1800㎝-1 일 수 있으며, 늘어나는 무거운 원자뿐만 아니라 X-H(X: 원자 번호가 12보다 큰 무거운 원자) 변형 모드(deformation modes)를 포함한다. 선형 배경에 겹친 전형적인 스펙트럼의 예시가 도 6A에 보여진다.
스펙트럼의 2차 파생물
도 3B의 순서도에서 보이는 바와 같이, 각 스펙트럼의 상기 2차 파생물은 이후 계산된다. 2차 파생 스펙트럼은 강도 대 파상수의 2차 미분에 의해 원래의 스펙트럼 벡터로부터 파생된다. 2차 파생 스펙트럼은 Savitzky-Golay sliding window 알고리즘을 이용해 계산될 수 있으며, 적절하게 잘린 2차 함수에 의해 인터페로그램을 곱함으로써 푸리에 공간에서 계산될 수도 있다.
2차 파생 스펙트럼은 베이스라인 경사에 구애받지 않는 이점을 가질 수 있으며, 천천히 변화하는 미 산란 배경을 포함한다. 상기 2차 파생 스펙트럼은 산란 및 비-공진(non-resonant) 미 산란으로 인해 베이스라인 효과가 거의 완전히 결여될 수 있으나, 여전히 RMieS 효과를 포함한다. 원하는 경우 상기 2차 파생 스펙트럼은 샘플 두께의 변화를 보상하기 위해 벡터 정규화(vertor normalize)될 수 있다. 2차 파생 스펙트럼의 예시가 도 6B에 보여진다.
역 푸리에 변환
도 3B 순서도의 320 단계에서 보이듯이, 상기 데이터 세트의 각 스펙트럼은 역 푸리에 변환(FT)된다. 역 FT는 강도 대 파상수 도메인으로부터 강도 대 위상차 도메인으로의 스펙트럼 전환을 의미한다. FT 루틴은 정수의 제곱 길이의 스펙트럼 벡터와만 기능하기 때문에, 스펙트럼은 FT 전 512, 1024 또는 2048 (NFT) 데이터 포인트 길이로 보간되거나 잘린다. 역 FT는 NFT/2 포인트의 실수(RE) 및 허수(IM) 인터페로그램을 산출한다. 이러한 인터페로그램의 실수부 부분이 도 7에 보여진다.
영-충전 및 전방 푸리에 변환
각 스펙트럼에 대한 상기 실수 및 허수 인터페로그램 전부의 하반기는 이후 영-충전된다(322). 이러한 영-충전된 인터페로그램은 이후 각각 분산 및 흡수 밴드 모양으로 실수 및 허수 스펙트럼 요소를 산출하기 위해 전방 푸리에 변환된다.
위상 보정
도 3B의 순서도에서 보이듯이, 푸리에 분석으로 인한 상기 실수(RE) 및 허수(IM) 부분은 이후 위상 보정된다(324). 이는 아래의 공식에 명시된 바와 같이, 위상 이동된 실수(RE') 및 허수(IM')를 산출한다.
Figure pct00001
상기 φ는 위상각이다.
상기 위상 보정을 위한 위상각 φ는 알 수 없기 때문에, 상기 위상각은 사용자 정의 단위에서 -Π/2 < φ < Π/2 로 가변될 수 있고, 최소 잔류 분산성 선형의 스펙트럼이 선택될 수 있다. 위상 보정 후 최대 강도를 생성하는 상기 위상각은 도 8에 보이는 바와 같이, 손상되지 않은 스펙트럼으로 간주될 수 있다. 화살표로 표시되고 "원본 스펙트럼"으로 지칭된 두꺼운 자국은 RMieS 기여에 의해 오염되는 스펙트럼이다. 얇은 자국은 다양한 위상각으로 위상 보정 시 스펙트럼이 어떻게 변하는지를 보여준다. 2번째로 두꺼운 자국은 복구된 스펙트럼이며, 이는 상기 오염되지 않은 스펙트럼과 상당히 매치된다. 도 8에서 나타나는 바와 같이, 상기 최적 보정된 스펙트럼은 약 1655㎝-1에서 가장 높은 아미드 I 강도를 보인다. 이 피크 위치는 상기 스펙트럼이 오염되기 전의 위치와 매치한다.
본 발명의 측면에 따른 316-324 단계의 상기 위상 보정 방법은 흡수 및 파생 스펙트럼 모두에 잘 작용한다. 심지어 이 방식은 만일 도 9A에 개략적으로 보이는 바와 같이 베이스라인 경사를 모방하는 산란 효과에 의해 흡수 스펙트럼이 오염되는 경우에 도 9B에서 보이듯이 상기 전방 FT의 허수 부분이 스펙트럼 경계에서 강한 곡선 효과를 보이고, 이는 그 결과로 보정된 스펙트럼이 오염된다는 점에서 흡수 스펙트럼이 사용될 경우에 발생할 수 있는 문제도 해결한다. 상기 파생물은 경사진 배경을 제거하기 때문에 2차 파생 스펙트럼의 사용은 이러한 효과를 제거할 수 있고, 따라서 인공 산물이 없는 스펙트럼이 획득될 수 있다. 위계적 군집 분석 또는 다른 적절한 분류나 진단 알고리즘에 의한 스펙트럼 데이터-세트의 뒤이은 분석은 어쨌든 2차 파생 스펙트럼 상에서 수행되기 때문에, 마찬가지로 2차 파생 스펙트럼 상의 분산 보정의 수행은 바람직하다. 2차 파생 스펙트럼은 스펙트럼 피크 신호의 반전을 보인다. 따라서, 상기 위상각은 가장 큰 음의 강도의 발생이 추구된다. 이 방식의 값은 인위적으로 오염된 스펙트럼으로부터 보여질 수 있다: 반사 요소로 인한 오염은 항상 그 강도를 감소시킬 수 있기 때문에 오염되지 않거나 "보정된" 상기 스펙트럼은 1650 및 1660㎝- 1사이의 아미드 I 밴드에서 가장 큰 (음의) 밴드 강도를 가진 것이 될 것이다.
예 1 - 위상 보정 알고리즘의 작업
상기 위상 보정 알고리즘 작업의 일실시예는 도 10 및 11에 제공된다. 이 예시는 인간의 림프절 조직 부분으로부터 수집된 데이터세트 상에 근거한다. 도 10A의 검정 화살표에 의해 보이는 상기 림프절은 막낭에서 유방암 미세-전이가 확인된다. 이 미세 사진은 암 영역에서 구별되는 세포 핵뿐만 아니라 활성화된 림프구 지역의 고 세포질을 보여주며, 회색 화살표에 의해 보여진다. 이러한 샘플 이질성은 모두 큰 RMieS 효과에 기여한다.
위계적 군집 분석(HCA)에 의한 데이터 세분화가 이 예시 림프절 부분에서 먼저 수행되었을 때, 도 10B에 보여지는 상기 이미지가 얻어진다. 막낭(적색)과 림프구(나머지 색)로부터 상기 암 조직(어두운 녹색 및 황색)을 구분하기 위해 10 군집(clusters)이 필요하며, 이러한 조직 유형의 구분은 좋지 못하다. 도 10B에서, 붉은색으로 표시된 상기 막낭은 하나 이상의 스펙트럼 클래스를 포함하며, 이는 1 군집으로 결합된다.
이 데이터세트 분류의 어려움은 도 10C의 검사에 의해 측정될 수 있다. 이 도면은 각 스펙트럼의 아미드 I 진동 밴드(amide I vibrational band)의 피크 주파수를 도시한다. 도면 우측의 컬러 스케일은 상기 피크가 림프절 본체의 약 1630과 1665㎝- 1사이, 막낭의 1635와 1665㎝- 1사이에서 발생한 것을 나타낸다. 단백질 2차 구조에 따라 펩티드와 단백질에 대한 상기 아미드 I 주파수가 1650에서 1660㎝-1 영역에서 발생하는 것이 잘 알려져 있기 때문에, 상기 아미드 I 주파수의 확산은 RMieS 효과에 의해 크게 오염된 데이터세트에 대해 일반적이다. 도 10D는 RMieS 보정 기반의 위상-보정 후 동일 조직 부분의 이미지를 보여준다. 상기 림프절 본체 내 아미드 I 피크의 주파수 편차는 1650에서 1654㎝-1의 범위로, 막낭에 대해서는 1657에서 1665㎝-1(막낭의 섬유-연결 단백질(fibro-connective proteins)은 주로 고 아미드 I 밴드 위치를 보이는 것으로 알려진 단백질인 콜라겐으로 구성되는 것이 알려졌다)의 범위로 감소되었다.
이후 HCA의 결과가 도 11에 보여진다. 도 11A에서, 암 조직은 적색으로 표시된다; 도 11B(이 도면은 10A와 동일하다)에 보여지는 상기 암 영역의 윤곽은 H&E-기반 조직병리학과 잘 일치한다. 상기 막낭은 밝은 녹색으로 표시된 활성화된 B-림프구가 있는 두 개의 서로 다른 조직 클래스(밝은 청색 및 보라색)로 나타난다. 조직구(histiocytes) 및 T-림프구는 어두운 녹색, 회색 및 청색 영역으로 보여진다. 도 11A에 도시된 상기 영역은 시각적 조직병리학과 잘 매치하며, 여기 논의된 상기 위상 보정 방법은 스펙트럼 조직병리학 방법의 상당한 품질 향상을 나타낸다. 일측면에서, 협대역 정규화(narrow band normalization)는 상기 이미지의 질을 보강 및/또는 향상시키기 위해 사용될 수도 있으며, 이는 이미지 등록의 정확성에 도움이 될 수 있다. 상기 협대역 정규화는 광대역 스펙트럼 영역 내에서 특징 및/또는 특징 일부를 선택할 수 있으며, 선택된 특징에 가중치를 적용할 수 있다.
종래의 스펙트럼 보정 방법 이상으로 본 발명의 측면에 따른 상기 사전-처리의 이점은 상기 방법이 약 5000스펙트럼/초의 빠른 수행 시간을 제공하는 점과 데이터세트 상의 사전 정보가 요구되지 않는 점을 포함한다. 또한, 상기 위상 보정 알고리즘은 자동 암 감지 및 SCP와 SHP의 진단에 관한 스펙트럼 이미징 및 "디지털 착색" 진단 루틴에 통합될 수 있다. 게다가, 위상 보정은 상기 이미지의 품질을 크게 향상시키며, 이는 이미지 등록의 정확성 및 진단 정렬 그리고 경계 표현에 도움이 된다.
나아가, 본 발명의 측면에 따른 상기 사전-처리 방법은 반사 요소에 의해 오염된 흡수 스펙트럼의 넓은 범위를 보정하는데 사용될 수 있다. 이러한 오염은 다른 유형의 분광법에서 자주 발생하며, 예를 들어, 확산 반사율 푸리에 변환 분광법(DRIFTS), 감쇠 전반사(Attenuated Total Reflection: ATR)와 같이 분산성 선형으로 인해 밴드 모양이 왜곡되는 것들, 또한 가간섭성 반 스토크스 라만 분광법(Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy: CARS)에서 나타날 수도 있는 복합 굴절률의 실수와 허수 부분의 혼합 또는 유전 감수율(dielectric susceptibility)이 상당 정도로 발생하는 다른 형태의 분광법이 있다.
다변량 분석
도 3A의 순서도의 312 단계에서 설명한대로, 다변량 분석은 스펙트럼의 차이를 감지할 수 있도록 상기 사전-처리된 스펙트럼 데이터 상에서 수행될 수 있다. 특정 다변량 분석에서, 스펙트럼은 유사성(similarity)을 기반으로 함께 그룹화된다. 상기 그룹의 수는 주어진 생물학적 샘플에 요구되는 차별화(differentiation)의 수준에 따라 선택될 수 있다. 일반적으로, 상기 그룹의 수가 더 커질수록 상기 스펙트럼 이미지의 세부 사항은 더욱 분명해질 것이다. 적은 세부 사항이 요구되는 경우에는 보다 적은 수의 그룹이 이용될 수 있다. 본 발명의 측면에 따르면, 사용자는 원하는 스펙트럼 차별화의 수준 달성을 위해 그룹의 수를 조정할 수 있다.
예를 들면, HCA 및 주성분 분석(principal component analysis)과 같은 무감독 방법(unsupervised methods), 인공 신경망(artificial neural networks: ANNs), 계층형 인공 신경망(hierarchical artificial neural networks: hANN), 지원 벡터 기계(support vector machines: SVM) 및/또는 "랜덤 포레스트(random forest)" 알고리즘 등을 포함하는 기계 학습 알고리즘(machine learning algorithms)과 같은 감독 방법(supervised methods)이 사용될 수 있다. 무감독 방법은 각각 데이터세트의 유사성 또는 차이에 근거하며, 이러한 기준에 의해 데이터세트를 나누거나 모으는데, 분할(segmentation) 또는 군집화(clustering)에 대한 데이터세트를 제외하고 어떠한 정보도 요구하지 않는다. 따라서, 이러한 무감독 방법은 데이터세트의 자연 유사성 또는 비유사성(차이)에 근거한 이미지를 생성한다. 반면, 감독 알고리즘은 예를 들어 암, 근육 또는 뼈를 나타내는 스펙트럼과 같은 참조 스펙트럼이 필요하며, 이러한 참조 스펙트럼의 특정 유사성 기준에 따라 데이터세트를 분류한다.
HCA 기술은 Bird에 공개되며(Bird 외, "Spectral detection of micro-metastates in lymph node histo-pathology", J.Biophoton. 2, No. 1-2, 37-46 (2009)), 이는 여기에 전체적으로 통합된다. PCA는 WO 2009/146425에 공개되고, 이는 참조에 의해 여기에 전체적으로 통합된다.
본 발명의 측면에 따른 감독 방법 사용의 예시는 P. Lasch 외 "Artificial neural networks as supervised techniques for FT-IR microspectroscopic imaging" J. Chemometrics 2006 (이하 "Lasch"); 20: 209-220, M. Miljkovic 외, "Label-free imaging of human cells: algorithms for image reconstruction of Raman hyperspectral datasets" (이하 "Miljkovic"), Analyst, 2010, xx, 1-13 및 A. Dupuy 외, "Critical Review of Published Microarray Studies for Cancer Outcome and Guidelines on Statistical Analysis and Reporting", JNCI, Vol. 99, Issue 2 | January 17, 2007 (이하 "Dupu")에서 찾을 수 있으며, 이는 각각 참조에 의해 여기에 전체적으로 통합된다.
그레이스케일 또는 의사-색채 스펙트럼 이미지
상기 다변량 분석으로부터 유사하게 그룹화된 데이터는 동일한 컬러 코드로 할당될 수 있다. 도 3A 순서도의 314단계에서 명시된 바와 같이, 상기 그룹화된 데이터는 "디지털 착색" 그레이스케일 또는 의사-색채 맵(pseudo-color maps)의 구축에 사용될 수 있다. 따라서, 이 방법은 전적으로 또는 주로 스펙트럼 데이터에 포함된 화학 정보에 기반하는 생물학적 샘플의 이미지를 제공할 수 있다.
HCA에 의한 다변량 분석 후에 준비된 스펙트럼 이미지의 일실시예는 도 12A 및 12B에 제공된다. 도 12A는 0.5㎜ x 1㎜에 대해 측정된 착색된 자궁경부 이미지 부분의 시각적 현미경 이미지이다. 편평 상피(squamous epithelium)의 전형적인 층이 나타난다. 도 12B는 상기 조직의 착색 전 HCA에 의한 다변량 분석 후 구축된 의사-색채 적외선 스펙트럼 이미지이다. 이 이미지는 상기 데이터세트 내 스펙트럼 간의 수학적 상호 연관(correlating)에 의해 생성되며, 전적으로 스펙트럼 유사성을 기반으로 한다; 참조 스펙트럼은 컴퓨터 알고리즘에 제공되지 않는다. 도 12B에 보여지는 바와 같이, HCA 스펙트럼 이미지는 도 12A에 표시된 것과 같은 표준 현미경 관찰을 이용한 적절한 착색(예를 들어, H&E 착색) 후에 볼 수 있는 상기 조직 구조를 재생할 수 있다. 또한, 도 12B는 도 12A에서 쉽게 감지될 수 없는 특징을 보여주며, 이는 (a)에서의 케라틴 층(deposits of keratin) 및 (b)에의 면역 세포에 의한 침투를 포함한다.
HCA 분석에 의한 의사-색채 스펙트럼 이미지의 구축은 Bird에서 논의된다.
ANN에 의한 분석 후 준비된 스펙트럼 이미지의 일실시예가 도 13A 및 13B에 제공된다. 도 13A는 H&E-착색 액와부 림프절 부분의 시각적 현미경 이미지이다. 도 13B는 도 13A의 상기 조직이 착색되기 이전에 수집된 적외선 데이터세트의 ANN 분석으로부터 생성된 적외선 스펙트럼 이미지이다.
시각적 이미지
도 3의 303 단계에 의해 나타나는 바와 같이, 302 단계에서 얻어지는 동일한 생물학적 부분의 시각적 이미지가 획득될 수 있다. 위에 설명된 301 단계의 슬라이드에 적용되는 상기 생물학적 샘플은 착색되지 않거나 하나 이상의 H&E 및/또는 IHC 착색에 의한 것과 같이 표준 조직병리학에서 이용되는 잘 알려진 적절한 방법에 의해 착색될 수 있고, 커버슬립(coverslip)될 수 있다. 시각적 이미지의 예시가 도 12A 및 13A에 보여진다.
조직병리학적 샘플의 시각적 이미지는 병리학 실험실에서 통상적으로 사용되는 것과 같은 표준 시각적 현미경을 이용해 얻어질 수 있다. 상기 현미경은 현미경의 시야를 디지털 방식으로 캡쳐하는 고해상도 디지털 카메라에 연결될 수 있다. 이러한 실시간 디지털 이미지는 착색된 조직 부분의 표준 현미경 관점을 기반으로 하며, 조직 구조, 세포 형태(cell morphology) 및 착색 패턴을 나타내는 것이다. 예를 들어, 사진의 생성을 위해 상기 디지털 이미지는 이미지 스티칭(stitching)을 통해 결합되는 많은 픽셀 타일을 포함할 수 있다. 본 발명의 측면에 따르면, 분석에 사용되는 상기 디지털 이미지는 사진에 스티치되어 결합되는 개별 타일 또는 여러 타일을 포함할 수 있다. 이 디지털 이미지는 컴퓨터 스크린 상에 저장되고 표시될 수 있다.
스펙트럼 및 시각적 이미지의 등록
본 발명의 측면에 따른 하나의 방법에 의하면, 도 3의 순서도의 304 단계에 나타나는 바와 같이, 상기 스펙트럼 및 시각적 이미지가 획득된 후, 착색된 조직의 상기 시각적 이미지는 디지털 착색된 그레이스케일 또는 의사-색채 스펙트럼 이미지로 등록될 수 있다. 일반적으로, 이미지 등록은 하나의 좌표 시스템에서 상이한 데이터의 세트를 변환 또는 매칭시키는 과정이다. 이미지 등록은 두 번째 이미지와 정렬하도록 첫 번째 이미지를 공간적 매칭 또는 변환시키는 것을 포함한다. 상기 첫 번째 이미지의 픽셀과 상기 두 번째 이미지의 픽셀은 상기 좌표 시스템의 동일한 포인트에 일치할 수 있다. 상기 이미지는 다른 유형의 데이터를 포함할 수 있으며, 이미지 등록은 다른 유형의 데이터를 매칭 또는 변환시키도록 할 수 있다. 일측면에서, 상기 변환은 스케일링된 강체 변환(rigid body transformation)을 포함할 수 있다. 샘플의 착색이 상기 샘플을 불균일하게 수축시키는 경우에 상기 변환은 뒤틀림(warping)을 포함할 수 있다는 것을 주목해야 한다. 컴퓨터 시스템이 사용할 수 있는 변환 방정식의 예시는 다음을 포함한다:
u = u0 + scale * (x * cos(θ) - y * sin(θ))
v = v0 + scale * (x * sin(θ) + y * cos(θ))
(u0, v0)은 원점의 이동이고, θ는 라디안의 회전각이며, scale은 스케일 인자이고, (x,y)는 HCA 이미지의 좌표이며, (u,v)는 H&E(시각적 이미지)의 좌표이다.
본 발명의 측면에 따르면, 이미지 등록은 여러 가지 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 일반적인 좌표 시스템은 상기 시각적 및 스펙트럼 이미지를 위해 설정될 수 있다. 일반적인 좌표 시스템을 설정하는 것이 불가능하거나 원하지 않는 경우, 상기 이미지는 다른 이미지와 정렬하도록 이미지를 가져오기 위한 포인트 매핑에 의해 등록될 수 있다. 포인트 매핑에서, 이미지 내 동일한 특징 또는 랜드마크를 식별하는 양 이미지 상의 컨트롤 포인트가 선택된다. 컨트롤 포인트의 위치에 따라, 두 이미지의 공간적 매핑이 수행될 수 있다. 예를 들어, 두 개 이상의 컨트롤 포인트가 사용될 수 있다. 상기 이미지를 등록하기 위해, 가시 이미지의 상기 컨트롤 포인트는 대응하는 스펙트럼 이미지의 컨트롤 포인트와 연관될 수 있고, 함께 정렬될 수 있다.
어떤 측면에 있어서, 두 개 이상의 컨트롤 포인트는 상기 스케일링된 바디 변환의 변환 파라미터를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 상기 변환 파라미터는 상기 등록된 이미지(예를 들어, 겹쳐진 이미지)의 매핑된 컨트롤 포인트 간의 오류를 최소화하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 두 컨트롤 포인트가 상기 변환 파라미터를 결정하기 위해 사용될 때, 상기 변환을 위한 두 솔루션은 컴퓨팅 시스템에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 상기 컴퓨팅 시스템은 상기 이미지의 방향에 기반하여 생성된 두 솔루션 중 하나를 선택할 수 있다. 하지만, 세 개의 컨트롤 포인트가 상기 변환 파라미터를 결정하기 위해 사용될 때, 상기 환을 위한 특정 솔루션이 상기 컴퓨팅 시스템에 의해 생성될 수 있다. 결국, 스케일링된 바디 변환의 파라미터를 결정하기 위해 두 개 이상의 컨트롤 포인트가 상기 컴퓨팅 시스템에 의해 사용될 수 있다. 게다가, 컨트롤 포인트의 수가 늘어날수록, 상기 변환의 정확도 또한 증가 및/또는 향상할 수 있다.
본 발명의 측면에 따른 하나의 변화에서, 컨트롤 포인트는 상기 생물학적 표본을 포함하는 슬라이드 상에 참조 부호(reference marks)를 배치함으로써 선택될 수 있다. 참조 부호는 잉크, 페인트 및 폴리에틸렌 등을 포함하는 물질의 일부 등을 포함할 수 있다. 상기 참조 부호는 적절한 모양 또는 사이즈를 가질 수 있으며, 그것들이 시야에 있는 한 중앙 부분, 모서리 또는 측면 모퉁이에 위치할 수 있다. 상기 생물학적 표본이 준비되는 동안 상기 참조 부호는 슬라이드에 추가될 수 있다. 만약 폴리에틸렌과 같은 화학 물질과 생물학적 물질 등의 스펙트럼 패턴이 알려진 물질이 참조 부호에 사용된다면, 상기 생물학적 표본의 스펙트럼 데이터의 정확도를 확인하기 위해 그것은 교정 부호(calibration mark)로도 사용될 수 있다.
본 발명의 측면에 따른 다른 변화에서, 병리학자와 같은 사용자는 상기 스펙트럼 및 시각적 이미지의 컨트롤 포인트를 선택할 수 있다. 상기 사용자는 모서리와 경계 등을 포함하는 그들의 시각적 또는 스펙트럼 이미지의 구별 기능에 대한 지식을 바탕으로 컨트롤 포인트를 선택할 수 있다. 세포 및 조직과 같은 생물학적 이미지에 대한 컨트롤 포인트는 상기 이미지의 생물학적 특징으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 이러한 생물학적 특징은 세포 무더기(clumps of cells), 유사 분열 특징(mitotic features), 세포의 코드나 네스트(cords or nests of cells), 폐포(alveolar)와 기관지(bronchi)와 같은 샘플 공극(sample voids) 및 불규칙한 샘플 에지(irregular sample edges) 등을 포함한다. 상기 사용자의 스펙트럼 및 시각적 이미지에서 컨트롤 포인트의 선택은 개인 및/또는 사용자 정의(customized) 사용에 대한 훈련 상관관계를 제공하기 위해 사용되는 저장소에 저장될 수 있다. 이 방식은 주관적인 모범 사례가 컨트롤 포인트 선택 과정에 통합되도록 한다.
본 발명의 측면에 따른 다른 변화에서, 상기 스펙트럼 및 시각적 이미지에서 구별 기능의 소프트웨어-기반 인식은 컨트롤 포인트의 선택을 위해 사용될 수 있다. 상기 소프트웨어는 하나 이상의 시각적 또는 스펙트럼 이미지의 구별 기능과 대응하는 컨트롤 포인트를 발견할 수 있다. 예를 들면, 특정 군집 영역의 컨트롤 포인트는 상기 스펙트럼 이미지에서 선택될 수 있다. 상기 군집 패턴은 상기 시각적 이미지의 유사 특징을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 상기 컨트롤 포인트는 스펙트럼 이미지의 픽셀을 시각적 이미지의 픽셀과 디지털 방식으로 상호 연관시키기 위해 사용될 수 있다. 다른 측면으로는, 상기 컨트롤 포인트를 선택하기 위해 상기 소프트웨어는 상기 이미지의 형태학적(예를 들어, 모양) 특징을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 형태학적 특징은 상기 표본의 모양, 상기 조직 사이 공간의 모양 및/또는 상기 조직 내 착색된 영역의 모양(예를 들어, IHC 에이전트로 생물학적 샘플을 착색한 결과)과 관련이 있을 수 있다. 결국, 상기 시각적 이미지와 상기 스펙트럼 이미지에서도 발생할 수 있는 모든 형태는 상기 컨트롤 포인트를 선택하기 위해 사용될 수 있다.
두 이미지의 상기 특징은 변형, 회전 및 스케일링을 통해 정렬될 수 있다. 예를 들면, 변형, 회전 및 스케일링은 특징 선택을 고른 후 관계나 모델 매핑 개발에 의해 자동화 또는 반자동화될 수도 있다. 이러한 자동화 과정은 예를 들어 최적화 등록을 위해 이후 리샘플링 및 변환될 수 있는 매핑 관계의 근사치(approximation)를 제공할 수 있다. 리샘플링 기술은 최근방(nearest neighbor), 선형(linear) 및 큐빅 보간(cubic interpolation) 등을 포함한다.
상기 컨트롤 포인트가 정렬되면, P1(x1, y1) 좌표를 갖는 상기 스펙트럼 이미지의 픽셀은 P2(x2, y2) 좌표를 갖는 시각적 이미지의 대응 픽셀과 정렬될 수 있다. 이 정렬 과정은 상기 스펙트럼 및 시각적 이미지 내 픽셀의 전체 또는 선택된 부분에 적용될 수 있다. 일단 정렬되면, 각 스펙트럼 및 시각적 이미지 내의 상기 픽셀은 함께 등록될 수 있다. 이러한 등록 과정에 의해, 각 스펙트럼 및 시각적 이미지 내의 상기 픽셀은 대응하는 이미지 내의 픽셀과 디지털 방식으로 연결될 수 있다. 본 발명의 측면에 따른 상기 방법은 동일한 생물학적 샘플이 분광적(spectroscopically)이고 시각적으로 테스트될 수 있도록 하기 때문에, 상기 시각적 및 스펙트럼 이미지는 정확히 등록될 수 있다.
숫자 코드(numerical code), 바 코드(bar code)와 같은 식별 부호(identification mark)는 올바른 표본이 이용되고 있는지 확인하기 위해 상기 슬라이드에 추가될 수 있다. 상기 참조 및 식별 부호는 상기 생물학적 표본의 시각적 이미지를 표시하거나 저장하는 컴퓨터에 의해 인식될 수 있다. 이 컴퓨터는 이미지 등록에 사용하기 위한 소프트웨어를 포함할 수도 있다.
본 발명의 측면에 따른 이미지 등록의 예시는 도 14A-14C에 도시된다. 도 14A는 소세포성 폐암(small cell lung cancer) 조직 샘플의 시각적 이미지이고, 도 14B는 HCA를 받은 동일한 조직 샘플의 스펙트럼 이미지이다. 도 14B는 도 14A의 상기 시각적 이미지의 우측 상부 대부분의 스펙트럼 데이터를 포함한다. 도 14A의 상기 시각적 이미지가 도 14B의 상기 스펙트럼 이미지와 등록되면, 그 결과가 도 14C에 보여진다. 도 14C에 보이는 바와 같이, 도 14B의 스펙트럼 이미지에서 쉽게 보이는 점과 윤곽 1-4를 포함하는 원형 부분은 도 14A의 현미경 이미지에서 보이는 점과 윤곽에 밀접하게 부합한다.
상기 스펙트럼 및 시각적 이미지에서 픽셀의 좌표가 등록되면, 그것들은 함께 디지털 방식으로 저장될 수 있다. 전체 이미지나 부분 이미지가 저장될 수 있다. 예를 들면, 상기 진단 영역은 전체 샘플의 이미지 대신에 디지털 방식으로 저장될 수 있다. 이는 데이터 저장 요건을 크게 감소시킬 수 있다.
상기 스펙트럼 또는 시각적 이미지 중 하나에서 특정 픽셀 영역을 보는 사용자는 즉시 다른 이미지의 대응 픽셀 영역에 접근할 수 있다. 예를 들어, 병리학자는 마우스를 클릭하거나 조이스틱을 조절함으로써 스펙트럼 이미지의 영역을 선택할 수 있고, 상기 스펙트럼 이미지에 등록된 시각적 이미지의 대응 지역을 볼 수 있다. 도 14D는 본 발명의 측면에 따라 도 14C의 등록된 이미지에 대한 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)의 예시이다. 도 14D에 보여지는 상기 GUI는 시각적, 스펙트럼 및 등록된 이미지 사이를 병리학자가 토글(toggle)할 수 있도록 하며, 특정 관심 부분을 검사할 수 있도록 한다.
또한, 병리학자의 이미지 이동 또는 조작으로 그/그녀는 등록된 다른 이미지의 대응 부분에 접근할 수도 있다. 예를 들면, 병리학자가 상기 스펙트럼 이미지의 특정 부분을 확대하는 경우, 그/그녀는 같은 수준의 확대에서 상기 시각적 이미지의 동일 부분에 접근할 수 있다.
시각적 현미경 시스템의 운영 파라미터(operational parameters)뿐만 아니라 현미경 배율, 배율 변화 등은 기구 특정 로그 파일(instrument specific log file)에 저장될 수도 있다. 상기 로그 파일은 알고리즘 훈련에 대한 주석 레코드(annotation records) 및 대응 스펙트럼 픽셀을 선택하기 위해 나중에 이용될 수 있다. 따라서, 병리학자는 상기 스펙트럼 이미지를 조작할 수 있으며, 나중에 그것에 등록된 스펙트럼 이미지 및 디지털 이미지는 모두 적절한 배율로 표시된다. 예를 들어, 이 기능은 사용자가 나중에 보거나 원격 관찰(remote viewing)을 위한 전자 송달(electronic transmittal)을 하기 위해 조작되고 등록된 이미지를 디지털 방식으로 저장할 수 있도록 하기 때문에 유용할 수 있다.
이미지 등록은 본 발명의 측면에 따른 방법의 훈련 단계에서 훈련 스펙트럼을 추출하기 위해 알려진 진단, 예후 및/또는 예측을 갖는 조직 부분, 세포 부분 및/또는 기타 생물학적 샘플에서 사용될 수 있다. 훈련 단계에서, 착색된 조직의 시각적 이미지는 HCA와 같은 무감독 스펙트럼 이미지로 등록될 수 있다. 이미지 등록은 조직 부분의 진단, 예후 및/또는 예측 시에도 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 조직 부분의 감독 스펙트럼 이미지는 그와 대응하는 시각적 이미지에 등록될 수 있다. 따라서, 사용자는 선택된 등록 이미지의 포인트에 따라 진단, 예후 및/또는 예측을 받을 수 있다.
본 발명의 측면에 따른 이미지 등록은 생물학적 샘플 분석의 기존 방법에 비해 많은 이점을 제공한다. 예를 들어, 생물학적 물질을 분석할 때 병리학자가 스펙트럼 이미지에 의존하도록 하며, 이는 생물학적 샘플의 매우 민감한 생화학 내용을 반영한다. 이를테면, 미세 전이 등의 작은 이상, 암 발병 전(pre-cancerous) 또는 암 세포의 감지에 관련 기술보다 상당히 뛰어난 정확도를 제공한다. 따라서, 상기 병리학자는 생물학적 샘플 시각적 이미지의 그/그녀의 주관적인 관찰을 그/그녀의 샘플 분석의 근거로 할 필요가 없다. 예를 들면, 결국 그/그녀의 결과를 확인하기 위해 필요에 따라 상기 병리학자는 단순히 스펙트럼 이미지를 연구할 수 있고, 등록된 시각적 이미지의 관련 부분을 참조할 수 있다.
또한, 본 발명의 측면에 따른 상기 이미지 등록 방법은 디지털 데이터 즉, 상기 스펙트럼 및 시각적 이미지의 픽셀의 상관관계를 기반으로 하기 때문에 Bird(Bird 외, "Spectral detection of micro-metastates in lymph node histo-pathology", J.Biophoton. 2, No. 1-2, 37-46 (2009))의 종래 방법보다 뛰어난 정확도를 제공한다. Bird는 상기 이미지로부터 디지털 데이터가 상호 연관되지 않으며, 그 대신 단지 상기 이미지를 물리적으로 오버레이함으로써 인접 조직 부분의 스펙트럼 및 시각적 이미지를 시각적으로 일치시키는 사용자의 능력에 의존한다. 따라서, 본 발명의 측면에 따른 상기 이미지 등록 방법은 비정상 또는 암 세포에 관한 보다 정확하고 재현 가능한 진단을 제공한다. 예를 들어, 이는 이상 및 암의 표시가 감지되기 힘든 질병의 초기 단계에 정확한 진단을 제공하는데 도움이 될 수 있다.
어떠한 측면에서, 이미지 등록은 스펙트럼 이미지와 시각적 이미지 사이에서 자동으로 발생할 수 있다. 예를 들어, 도 5A-5C에서 보여지듯이, 컴퓨팅 시스템은 스펙트럼 이미지와 시각적 이미지를 상기 이미지들의 특징에 근거하여 자동으로 등록할 수 있다. 또한, 도 4A와 4B에서 보여지듯이, 컴퓨팅 시스템은 스펙트럼 이미지와 시각적 이미지를 이미지 특징과 관계 없는 좌표에 근거하여 자동으로 등록할 수 있다.
이제 도 4A와 4B를 참조하면, 본 발명의 측면에 따라, 여기 설명된 것은 이미지 특징과 관계 없는 좌표에 근거한 이미지 등록의 수행을 위해 자동화된 방법(400)의 일실시예이다. 예를 들어, 상기 스펙트럼 이미지와 시각적 이미지가 현미경 스테이지에서 사용되는 스테이지 플레이트와 같은 동일한 슬라이드 홀더를 사용하여 캡쳐될 때 상기 방법이 사용될 수 있다. 상기 슬라이드 홀더는 생물학적 샘플이 각 현미경에서 공간적으로 정확하고 정밀하게 놓일 수 있도록 한다.
상기 방법은 시각적 수집 장치 내 생물학적 샘플과 함께 슬라이드 홀더 상의 다수의 레티클의 좌표 위치를 수신하는 단계를 포함할 수 있다(402). 상기 시각적 수집 장치는 상기 생물학적 샘플의 이미지 캡쳐가 가능한 현미경 등을 포함할 수 있다. 또한, 도 4C에서 보여지듯이, 상기 슬라이드 홀더는 슬라이드 홀더 상의 좌표위치를 표시하는 다수의 레티클을 포함할 수 있다.
이제 도 4C를 참조하면, 본 발명의 측면에 따라, 여기 설명된 것은 슬라이드 홀더(426)의 일실시예이다. 슬라이드 홀더(426)는 상기 생물학적 샘플이 삽입될 수 있는 슬롯(428)을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 세포와 조직 등을 포함할 수 있다. 또한, 슬라이드 홀더(426)는 상기 슬라이드 홀더(426) 상의 위치를 표시해주는 다수의 레티클(430, 432 및 434)도 포함할 수 있다. 다른 측면으로는, 상기 다수의 레티클은 상기 슬라이드 홀더 대신 슬라이드 상의 위치를 표시하면서 바로 상기 슬라이드에 놓일 수 있다. 레티클(430, 432 및 434)은 (x,y) 좌표와 같이 각각 좌표 위치를 가질 수 있다. 상기 레티클(430, 432 및 434) 각각의 좌표는 상기 생물학적 샘플의 데이터 수집 시 사용될 수 있는 좌표 시스템을 정의할 수 있다. 일실시예에서, 두 개 이상의 레티클이 상기 좌표 시스템을 결정하기 위해 사용될 수 있다는 점에 주목해야 한다. 예를 들어, 두 레티클의 좌표가 사용될 때, 상기 좌표 시스템을 위한 두 솔루션은 상기 컴퓨팅 시스템에 의해 생성될 수 있다. 상기 컴퓨팅 시스템은 생성된 두 솔루션 중 하나를 상기 생물학적 샘플의 방향에 근거하여 선택할 수 있다. 예를 들어, 상기 컴퓨팅 시스템은 상기 생물학적 샘플이 뒤집히고 및/또는 젖혀지지 않는다는 가정 하에 상기 솔루션을 선택할 수 있다. 세 개의 레티클이 상기 좌표 시스템을 결정하기 위해 사용될 때, 상기 좌표 시스템을 위한 특별 솔루션이 상기 컴퓨팅 시스템에 의해 생성될 수 있다. 결국, 레티클의 수가 증가할수록, 상기 변환의 정확도 역시 증가 및/또는 향상할 수 있다.
도 4A로 돌아가서 살펴보면, 상기 슬라이드 홀더 상의 각 레티클의 좌표 위치는 상기 시각적 수집 장치로부터 수신될 수 있다. 어떤 측면으로는, 상기 시각적 수집 장치와 통신하는 컴퓨팅 시스템은 상기 슬라이드 홀더 상의 다수의 레티클의 좌표 위치를 수신할 수 있다. 예를 들어, 상기 레티클이 시야에 들어올 때까지 현미경 및/또는 슬라이드 홀더를 이동시키고 상기 레티클의 좌표 위치를 컴퓨팅 시스템으로 전송함으로써 상기 시각적 수집 장치(예, 현미경)는 각 레티클이 상기 슬라이드 홀더 상에 위치하도록 프로그래밍 될 수 있다. 다른 측면으로, 사용자는 상기 레티클의 좌표 위치를 컴퓨팅 시스템에 입력할 수 있다. 예를 들어, 상기 사용자는 각 레티클이 시야에 들어올 때까지 (그리고 현미경 내에서 십자선과 같은 지표에 정렬되도록) 현미경 및/또는 슬라이드 홀더를 움직일 수 있으며, 상기 사용자는 현미경 상에 보이는 좌표를 컴퓨팅 시스템에 입력할 수 있다. 결국, 자동이든 아니든 다양한 메커니즘이 상기 슬라이드 홀더 상의 레티클의 좌표 위치를 캡쳐하고 상기 컴퓨팅 시스템에 좌표 정보를 보내기 위해 사용될 수 있다는 것에 주목해야 한다.
상기 방법은 시각적 이미지 수집 장치로부터 생물학적 샘플의 시각적 이미지를 수신하는 단계(404)도 포함할 수 있다. 예를 들어, 시각적 이미지 수집 장치는 상기 시각적 이미지 수집 장치에 의해 캡쳐된 생물학적 샘플의 시각적 이미지를 컴퓨팅 시스템에 전송할 수 있다.
또한, 상기 방법은 슬라이드 홀더 상의 다수의 레티클의 좌표 위치와 시각적 이미지를 연결하는 단계(406)와, 시각적 이미지 좌표 위치와 시각적 이미지를 저장하는 단계(408)를 포함할 수 있다. 어떤 측면으로는, 상기 컴퓨팅 시스템이 수신된 레티클의 좌표 위치와 수신된 시각적 이미지를 연결할 수 있고, 시각적 이미지 좌표 위치와 시각적 이미지를 데이터 저장소와 같은 곳에 저장할 수 있다. 어떤 측면으로는, 상기 컴퓨팅 시스템이 수신된 시각적 이미지 좌표를 저장하는 파일과 수신된 시각적 이미지를 저장하는 파일을 연결할 수 있다.
이 방법은 더 나아가 스펙트럼 이미지 수집 장치에서 상기 생물학적 샘플과 함께 슬라이드 홀더 상의 다수의 레티클의 좌표 위치 수신 단계(410)를 포함한다. 시각적 이미지 수집 장치에서 사용된 생물학적 샘플의 동일한 슬라이드 홀더가 스펙트럼 이미지 수집 장치에서도 사용될 수 있다는 것을 주목해야 한다. 상기 스펙트럼 이미지 수집 장치로부터 직접 및/또는 상기 스펙트럼 이미지 수집 장치의 사용자를 통해, 상기 컴퓨팅 시스템은 스펙트럼 이미지 수집 장치와도 통신할 수 있고 슬라이드 홀더 상의 다수의 레티클의 각 좌표 위치를 수신할 수 있다. 예를 들어, 상기 레티클이 시야에 들어올 때까지 스펙트럼 수집 장치 및/또는 슬라이드 홀더를 이동시키고 상기 레티클의 좌표 위치를 컴퓨팅 시스템으로 전송함으로써 상기 스펙트럼 수집 장치는 각 레티클이 슬라이드 홀더 상에 위치하도록 프로그래밍 될 수 있다. 사용자는 상기 레티클의 좌표 위치를 컴퓨팅 시스템에 입력할 수도 있다.
또한, 상기 방법은 스펙트럼 이미지 수집 장치로부터 생물학적 샘플의 스펙트럼 이미지를 수신하는 단계(412)를 포함할 수 있다. 상기 스펙트럼 이미지 수집 장치는 생물학적 샘플의 캡쳐된 스펙트럼 이미지를 컴퓨팅 시스템으로 전송할 수 있다.
상기 방법은 또한 슬라이드 홀더 상의 다수의 레티클의 좌표 위치와 스펙트럼 이미지를 연결하는 단계(414)와 스펙트럼 이미지 좌표 위치와 스펙트럼 이미지를 저장하는 단계(416)를 포함할 수 있다. 상기 컴퓨팅 시스템이 수신된 스펙트럼 이미지 좌표 위치와 수신된 스펙트럼 이미지를 연결할 수 있다. 예를 들어, 상기 컴퓨팅 시스템은 파일과 스펙트럼 이미지를 연결하는 스펙트럼 이미지 좌표를 저장하는 파일에 라벨을 부여할 수 있다. 상기 스펙트럼 이미지 좌표는 스펙트럼 이미지와 같이 동일한 파일에 저장될 수 있다는 것을 주목해야 한다.
상기 방법은 더 나아가 수신된 시각적 이미지 좌표와 수신된 스펙트럼 이미지 좌표의 정렬이나 연결 단계(418)를 포함할 수 있다. 상기 컴퓨팅 시스템은 시각적 이미지와 스펙트럼 이미지 사이의 공통 좌표 시스템을 생성하기 위해 자동으로 스펙트럼 이미지 좌표를 시각적 이미지 좌표에 보여줄 수 있다.
상기 방법은 시각적 이미지 좌표와 스펙트럼 이미지 좌표의 정렬에 근거하여 수신된 스펙트럼 이미지와 수신된 시각적 이미지를 정렬하는 등록된 이미지의 생성 단계(420)를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 컴퓨팅 시스템은 시각적 이미지 좌표와 스펙트럼 이미지 좌표의 정렬을 이용하여 스펙트럼 이미지를 시각적 이미지 상에 오버레이할 수 있고, 등록된 이미지를 자동으로 생성할 수 있다. 결국, 상기 컴퓨팅 시스템은 스펙트럼 이미지와 시각적 이미지의 특징과 관계 없는 좌표들을 사용하여 스펙트럼 이미지를 시각적 이미지에 자동으로 등록할 수 있다.
상기 방법은 등록된 이미지 저장 단계(422)를 선택적으로 포함할 수 있다. 상기 컴퓨팅 시스템은 등록된 이미지를 데이터 저장소에 저장할 수 있어서 컴퓨팅 시스템의 사용자는 등록된 이미지의 접근 및/또는 변경이 가능하다.
또한, 상기 방법은 등록된 이미지 최적화 단계(424)를 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 시각적 이미지 좌표 포인트와 스펙트럼 이미지 좌표 포인트를 정렬 또는 부합시키는 최고의 강체 변형을 찾기 위해 상기 컴퓨팅 시스템은 하나 이상의 최적화 적용이 가능하다. 상기 컴퓨팅 시스템은 등록된 이미지의 정확성을 향상시키기 위해 이미지 정렬까지 시도함으로써 하나 이상의 최적화를 사용할 수 있다.
어떤 최적화는 동일한 좌표 시스템에서 보여지는 오버레이된 이미지 내에서 스펙트럼 이미지와 시각적 이미지 사이의 거리를 최소화시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 거리는 전체 이미지 상에서 합해진 그레이스케일 픽셀-바이-픽셀(pixel-by-pixel) 오류의 측정이 될 수 있다. 예를 들어, 상기 최적화는 다음을 포함할 수 있다:
min(p) J = sum D(p, I1, I2)2
D = I2(p) - I1
p가 선택 포인트나 레티클-기반 등록에 사용된 동일 스케일링된 강체 변형일 때, D(p,.,.)는 거리 측정치이고(픽셀단위로 적용됨), 그리고 I2(p)는 p에 의해 I1과 같은 동일 공간으로 변형된 I2이미지이다. 시각적 픽셀값이 HCA나 스펙트럼 픽셀값에 직접적으로 비교될 수 없기 때문에 I1 및 I2이미지는 이미지들을 동일 그레이스케일 공간으로 넣기 위해 연속된 변환을 스펙트럼 및 시각적 이미지에 적용함으로써 생성될 수 있다.
그 대신에, 다른 측면으로, 상기 컴퓨팅 시스템은 등록된 이미지 내 모든 포인트들 사이의 등록 거리 함수를 최소화하기 위해 최적화를 수행할 수 있다. 상기 최적화는 다음과 같이 더욱 구체적으로 정의될 수 있다:
Figure pct00002
이미지 Tij가 시각적 이미지에 근거할 때, I(p)ij는 스케일링된 강체 변환 p = [u v λ θ]에 의해 더 변환된 스펙트럼 이미지에 근거하고, T와 같은 동일 좌표 프레임으로 보간된다. 이 합계는 이미지의 모든 픽셀 상에 해당한다. 이 최적화가 그레이스케일 거리 함수 D = I(p) - T 를 사용할 때, 정규화된 기울기 장(the normalized gradient field)과 같은 거리 함수들이 최적화에 사용될 수 있다는 것에 주목해야 한다. 이미지 T와 I는 필요에 따라 특정 거리 함수가 사용되도록 시각적 및 스펙트럼 이미지의 보간된, 필터링된 및 전환된 버전이다. 서로 다른 거리 함수들은 시각적 및 스펙트럼 이미지의 서로 다른 전환 및 필터링을 필요로 할 수 있다.
다른 최적화는 두 이미지(예를 들어, 시각적 이미지 및 스펙트럼 이미지)에서 선택된 한 쌍의 포인트 사이에서 최소 제곱 오차의 최소화를 포함할 수 있다. 어떤 측면으로는, 상기 컴퓨팅 시스템이 두 이미지(예를 들어, 시각적 이미지 및 스펙트럼 이미지)에서 선택된 한 쌍의 포인트 사이에서 최소 제곱 오차를 최소화하기 위해 최적화를 수행할 수 있다. 예를 들면, 상기 최적화는 다음을 포함할 수 있다:
Figure pct00003
(xi, yi)가 시각적 이미지에서 선택된 참조 포인트일 때, (xj, yj)은 시각적 이미지에서 보여지는 스펙트럼 이미지의 참조 포인트이고, p = [u v λ θ]은 등록 파라미터이다.
상기 컴퓨팅 시스템에 의해 수행되고 있는 상기 최적화 상에서 최적화 한계를 제공하기 위해 다양한 최적화 설정이 컴퓨팅 시스템에 의해서 가능하다는 점에 주목해야 한다. 예를 들어, 최적화 한계는 변환 파라미터 상에서 함수 산출의 최대 수, 수렴허용오차 및/또는 상·하한치 등을 포함할 수 있다. 상기 상·하한치는 바람직한 솔루션에서 최적화가 극단적으로 벗어나지 않도록 도움을 줄 수 있다.
이제 도 5A를 참조하면, 본 발명의 측면에 따라 여기 설명된 것은 이미지 특징에 근거한 이미지 등록 개선을 위한 방법(500)의 일실시예이다. 시각적 이미지와 스펙트럼 이미지의 오버레이가 잘 상응하지 않을 때 상기 컴퓨팅 시스템은 이미지 등록을 개선할 수 있다. 예를 들어, 이미지들의 오버레이가 상기 시각적 이미지와 스펙트럼 이미지 사이의 정렬에서 벗어난 생물학적 샘플의 특징을 보여줄 수 있다. 어떤 측면으로는, 스펙트럼 이미지와 시각적 이미지의 이미지 특징들을 가능한 한 정교하게 정렬하기 위해 상기 컴퓨팅 시스템이 자동으로 이미지 등록 개선을 위한 방법을 수행할 수 있다. 예를 들어, 등록 발생 시 첫 번째 스펙트럼 이미지 수준이 스펙트럼 이미지의 유용한 정보를 충분히 포함하지 않는다면, 상기 컴퓨팅 시스템은 첫 번째 스펙트럼 이미지 수준과 다른 스펙트럼 이미지 수준을 전환할 수도 있다는 것을 주목해야 한다.
상기 방법은 스펙트럼 이미지의 스케일링 단계(502)와 시각적 이미지의 스케일링 단계(504)를 포함할 수 있다. 관련 형태학적(예를 들어, 모양) 특징이 각 이미지 내에서 거의 동일한 사이즈를 갖기 위해 스케일링이 수행될 수 있다. 스케일링은 상기 스펙트럼 이미지와 시각적 이미지 사이의 비율에 근거할 수 있다. 예를 들어, 상기 시각적 이미지가 스펙트럼 이미지보다 더 높은 해상도를 가질 수 있고, 결국 스케일링은 낮은 해상도의 이미지로 높은 해상도의 이미지를 스케일링하기 위해 이미지 상의 상·하한치 설정을 포함할 수 있다. 상기 컴퓨팅 시스템이 사용할 수 있는 스케일링 방정식 예시는 다음을 포함할 수 있다:
xH &E = u + λ * (xHCA*cosθ - yHCA*sinθ)
yH &E = v + λ * (yHCA*sinθ + yHCA*cosθ)
(u,v)가 변환을 나타낼 때, λ는 스케일 요소를, θ는 회전을 나타낸다. 상기 스케일링은 선택된 스펙트럼 참조 포인트(예를 들어, 레티클 좌표 및/또는 사용자에 의해 선택된 등록 포인트)에 적용될 수 있고, 선택된 스펙트럼 이미지 참조 포인트가 시각적 이미지 참조 포인트(예를 들어, 레티클 좌표 및/또는 사용자에 의해 선택된 등록 포인트)에 보여지는데 적용될 수 있다.
상기 방법은 스펙트럼 이미지의 정규화 단계(505)를 선택적으로 포함할 수 있다. 어떤 측면으로는, 상기 컴퓨팅 시스템은 스펙트럼 이미지의 이미지 특징을 향상시키기 위해 스펙트럼 이미지를 정규화 할 수 있다. 예를 들어, 정규화된 스펙트럼 이미지가 시각적 이미지와 비교될 때, 정규화된 스펙트럼 이미지의 특징들은 더 뚜렷하게 나타날 수 있고, 이미지 특징들의 더 정확한 표현을 제공할 수 있다.
어떤 측면에서, 상기 컴퓨팅 시스템은 스펙트럼 이미지에 중량 정규화(weighted normalization)를 적용할 수 있다. 예를 들어, 세포나 조직 픽셀의 적외선 흡수 스펙트럼이 단백질 진동에 의해 영향을 받기 때문에 스펙트럼 이미지 상에서 중량 정규화를 사용하는 것은 이로울 수 있다. 핵산(DNA와 RNA)이 세포 건조질량의 약 20% 이하를 차지하는 반면, 단백질이 세포 건조질량의 60% 이상을 차지하기 때문이다. 결국, 단백질 진동(주로 1700과 1500㎝-1 사이의 아미드 Ⅰ 및 II 영역에서 관찰됨)은 핵산의 특징보다 스펙트럼 내에서 훨씬 더 강력하며, 이는 대칭(ca. 1090 ㎝-1) 및 비대칭(ca. 1230 ㎝-1) 인산이에스테르 스트레칭 진동(phosphodiester stretching vibrations)에서 주로 관찰될 수 있다. 핵산 진동 밴드의 변화는 암적 질병의 발병과 함께 빈번하게 관찰되기 때문에, 데이터 세트 내 스펙트럼의 저파수 스펙트럼 영역을 강조하는 정규화 절차를 활용하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 스펙트럼 데이터 세트의 초기 분할을 위한 위계적 군집 분석(HCA) 실행 시, 이러한 방식은 유용할 수 있다.
어떤 측면에서, 스펙트럼의 저파수 경계(보통 778 ㎝-1)에 있는 1의 값 및 고파수 경계(보통 1800 ㎝-1)에 있는 0의 값과 함께 표준 벡터 정규화(예, "램프 방법") 후 스펙트럼 벡터가 곱해진 중량 정규화는 램프 함수를 포함할 수 있다. 상기 함수의 결과물은 단백질 영역의 중요성이 줄어드는 가중 스펙트럼 벡터(weighted spectral vector)를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 중량 정규화는 영역 정규화(region normalization)를 포함할 수 있다. 영역 정규화에서, 스펙트럼 S는 다른 영역(예를 들어, 1800 ~ 1480 ㎝-1의 영역 1 및 1478 ~ 778 ㎝-1의 영역 2) 내 단백질 및 핵산 스펙트럼 특징과 같은 두 개 이상(예를 들어, 2 또는 3)의 영역으로 나뉘게 된다. 상기 두 개(또는 그 이상)의 영역은 저강도 스펙트럼 영역에 더 가중하면서 각각 벡터 정규화될 수 있다. 비록 "영역 정규화"는 스펙트럼 내 불연속(예를 들면, 1478과 1480 ㎝-1의 사이)을 발생시킬 수 있지만, 예를 들어 정상과 암 영역의 식별을 위해 HCA에서 필요로 하는 군집의 숫자로 측정되듯이, 이 방법은 정상 및 암 영역을 더 잘 식별할 수 있게 한다.
상기 컴퓨팅 시스템은 등록된 이미지의 개선을 돕도록 스펙트럼 이미지의 특징을 향상시키기 위해 상기 스펙트럼 이미지의 중량 정규화도 수행할 수 있다.
상기 방법은 스펙트럼 이미지와 시각적 이미지에 한계치를 적용하는 단계(506)와 적용된 한계치에 근거하여 바이너리 스펙트럼 이미지와 바이너리 시각적 이미지를 생성하는 단계(508)도 포함한다. 상기 컴퓨팅 시스템은 스펙트럼 이미지에 적용하는 한계치와 시각적 이미지에 적용하는 한계치를 자동으로 선택할 수 있다. 또한, 상기 컴퓨팅 시스템은 컴퓨팅 시스템의 사용자로부터 상기 한계치를 수신할 수 있다.
이제 도 5B를 참조하면, 여기 설명된 것은 사용자가 시각적 이미지(502a)와 스펙트럼 이미지(520b)의 한계치를 선택하도록 하는 GUI 인터페이스 일실시예이다. 예를 들어, 상기 사용자는 한계치 설정을 위해 슬라이더를 사용할 수 있다. 예를 들면, 사용자가 슬라이더를 움직임에 따라, 양쪽 이미지에 있는 조직의 색깔이 변할 수 있고(예를 들어, 검정색이 흰색으로 또는 흰색이 검정색으로), 이미지의 모양이나 다른 양상이 더욱 혹은 덜 가시적이거나 선명하게 될 수 있다. 양쪽 이미지의 조직이 동일한 색/음양(예를 들어, 검정색 또는 흰색)을 갖게 되고 각 이미지의 동일한 모양이 이미지의 노이즈가 많지 않게 보일 수 있을 때, 상기 사용자는 스펙트럼 이미지와 시각적 이미지 각각의 한계치를 선택할 수 있다. 스펙트럼 이미지와 시각적 이미지의 한계치가 동일한 숫자를 갖는지 다른 숫자를 갖는지를 주목해야 한다.
다시 도 5B를 참조하면, 상기 컴퓨팅 시스템은 선택된 한계치를 수신할 수 있고, 적용된 한계치에 근거하여 바이너리 스펙트럼 이미지와 바이너리 시각적 이미지를 생성할 수 있다. 예를 들어, 한계치 이하 수의 각 픽셀이 검은색으로 전환하는 반면, 한계치 이상 수의 각 픽셀은 흰색으로 전환될 수 있다. 상기 컴퓨팅 시스템은 각 이미지의 한계치를 사용하여 스펙트럼 이미지와 시각적 이미지의 모든 픽셀을 검은색과 흰색으로 보여줄 수 있다. 바이너리 이미지(예를 들어, 검은색과 흰색 이미지)를 생성함으로써, 조직 사이의 간극 공간이 강조될 수 있으며, 생물학적 샘플의 기본 구조, 생물학적 샘플의 형태학적 특징(예를 들면, 모양), 및/또는 조직 내 착색된 영역의 모양(예를 들어, IHC 에이전트의 생물학적 샘플 착색의 결과)도 마찬가지이다. 결국, 시각적 이미지와 스펙트럼 이미지에서 발생할 수 있는 어느 모양이든 강조될 수 있다.
게다가, 상기 컴퓨팅 시스템은 스펙트럼 바이너리 이미지와 시각적 바이너리 이미지 및 등록된 이미지 중 하나 혹은 둘 사이의 차이를 설명하는 각기 다른 이미지를 보여줄 수 있다. 이제 도 5C를 참조하면, 여기 설명된 것은 각기 다르게 제시된 이미지와 포인트들이 있는 그래프가 함께 하는 GUI 화면의 일실시예이며, 각기 다른 이미지의 오류를 최소화하는 과정을 보여주고 있다. 서로 다른 이미지는 등록된 이미지의 적당한 정확성의 시각적 지표를 제공한다. 어떤 측면으로는, 서로 다른 이미지가 가능한 한 검은색이 될 수 있다. 만약 서로 다른 이미지가 빈번히 흰색 공간을 포함한다면, 이 결과는 등록된 이미지 내 오류가 존재함을 가리킨다(예를 들면, 이미지의 오버레이는 정렬되지 않은 이미지 특징을 보여준다). 그래프에서 보여지듯이, 임계치 설정 내에서 각기 다른 이미지가 최소 오류(예를 들어, 대부분 검은색 이미지)를 보여주기 전 임계치 설정의 복합적 반복이 발생할 수 있다. 각기 다른 이미지 내 오류가 최소화되기 전 반복의 최대 수치에 도달하면 반복 과정이 종료될 수 있다는 것에 주목해야 한다.
다시 도 5A를 참조하면, 최소 오류값이 바이너리 스펙트럼 이미지와 시각적 스펙트럼 이미지에 도달할 때까지 그리고/또는 반복의 최대 수치에 도달할 때까지, 어느 쪽이 먼저 발생하든지 상기 컴퓨팅 시스템은 다양한 한계치 적용을 지속할 수 있다.
상기 방법은 또한 바이너리 스펙트럼 이미지와 바이너리 시각적 이미지의 형태학적 폐쇄 적용 단계(510)를 포함할 수 있다. 상기 형태학적 폐쇄는 바이너리 이미지에서 나타날 수 있는 작은 점들을 흰색 영역으로 정리(smoothing)함으로써 상기 바이너리 이미지로부터 노이즈를 제거할 수 있다. 예를 들면, 각각 이미지에 경계를 추가하고 점들을 흰색 영역의 흰색으로 전환하며 그리고/또는 검은색이나 흰색의 작은 점들을 흰색이나 검은색의 더 큰 영역 내에서 제거함으로써 상기 컴퓨팅 시스템은 형태학적 폐쇄를 바이너리 이미지에 적용할 수 있다.
또한, 상기 방법은 바이너리 스펙트럼 이미지와 바이너리 시각적 이미지의 모서리를 연화하는 단계(512)를 포함할 수 있다. 어떤 측면으로는, 상기 컴퓨팅 시스템은 바이너리 이미지 내 검은색과 흰색 모서리 사이의 램프를 흐릿하게 하기 위해 가우시안 필터(Gaussian filter)를 적용할 수 있다. 예를 들면, 상기 컴퓨팅 시스템은 최적화 수렴을 증진시키고자 모서리를 흐릿하게 하고 그것들은 더 연화시키면서 상기 모서리를 정리할 수 있다.
상기 방법은 더 나아가 바이너리 스펙트럼 이미지와 바이너리 시각적 이미지 사이의 그레이스케일 차이를 최소화하는 단계(514)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 컴퓨팅 시스템은 스펙트럼 이미지와 바이너리 이미지 사이의 그레이스케일 차이를 최소화하여 더 잘 맞는 등록 파라미터를 얻기 위해, 위의 502-512에서 논의했던 하나 이상의 최적화를 적용할 수 있다. 스펙트럼 이미지와 시각적 이미지의 구조가 등록된 이미지 내에서 최대한 가깝게 정렬될 때까지 상기 최적화 과정이 반복될 수 있다는 것에 주목해야 한다.
훈련
도 3의 순서도에 제공된 방법에서 305 단계에 명시된 바와 같이, 훈련 세트는 선택적으로 개발될 수 있다. 본 발명의 측면에 따르면, 훈련 세트는 다른 것들 사이에 있는 특정 질병 또는 상태와 관련된 스펙트럼 데이터를 포함한다. 상기 훈련 세트의 스펙트럼 데이터와 질병 또는 상태의 연관성은 일반적으로 병리학적 표본에서 발견되는 형태학적 특징에 따라 스펙트럼 패턴에 대한 고전 병리학의 상관관계에 기초할 수 있다. 상기 질병 및 상태는 세포 이상, 염증(inflammation), 감염(infections), 전암(pre-cancer) 및 암 등을 포함한다.
본 발명에 따른 하나의 측면에 따르면, 상기 훈련 단계에서 훈련 세트는 질병 또는 상태를 포함하는 시각적 이미지의 영역 식별, 상기 시각적 이미지의 영역을 상기 영역에 대응하는 스펙트럼 데이터와 상호 연관 및 스펙트럼 데이터와 해당 질병 또는 상태 간의 연관성을 저장함으로써 개발될 수 있다. 상기 훈련 세트는 이후 데이터베이스와 같은 저장소에 보관될 수 있고, 상기 훈련 세트로부터 파생된 출력과 진단 알고리즘을 제공하는 기계 학습 알고리즘(machine learning algorithms)에서 사용 가능하도록 될 수 있다. 상기 진단 알고리즘은 나중의 사용을 위해 데이터베이스와 같은 저장소에 보관될 수도 있다.
예를 들어, 조직 부분의 시각적 이미지는 HCA에 의해 준비된 것과 같이 대응하는 무감독 스펙트럼 이미지로 등록될 수 있다. 그 다음, 사용자는 상기 시각적 이미지의 특징 영역(characteristic region)을 선택할 수 있다. 이 영역은 질병 또는 상태를 명시하기 위해 사용자에 의해 분류되고 및/또는 주석이 달릴 수 있다. 대응하는 등록된 무감독 스펙트럼 이미지 내 특징 영역의 근본이 되는 상기 스펙트럼 데이터는 질병 또는 상태에 대해 분류되거나 및/또는 주석이 달릴 수 있다.
질병 또는 상태에 대해 분류되고 및/또는 주석이 달린 상기 스펙트럼 데이터는 ANN과 같은 감독 분석 방법이 훈련을 위해 사용될 수 있는 훈련 세트를 제공한다. 예를 들어, 이러한 방법은 Lasch, Miljkovic, Dupuy에서도 설명된다. 상기 훈련된 감독 분석 방법은 진단 알고리즘을 제공할 수 있다.
질병 또는 상태 정보는 기구에 의해 제공되는 알고리즘, 사용자에 의해 훈련된 알고리즘 또는 이들의 조합에 근거한다. 예를 들면, 기구에 의해 제공된 알고리즘은 상기 사용자에 의해 향상될 수 있다.
본 발명의 측면에 따른 훈련 단계의 이점은 상기 등록된 이미지가 합의-기반 "최적 기준"의 최고로 가능한 훈련을 받을 수 있다는 것이며, 이는 재현 가능하고 반복적인 기준에 의해 스펙트럼 데이터를 평가한다. 따라서, 적절한 기구 검증 및 알고리즘 훈련 후에 본 발명의 측면에 따른 방법은 정상, 비정형(atypical), 낮은 등급의 종양, 높은 등급의 종양 및 암과 같이 시각적으로 할당된 기준에 의존하는 것보다 세상적으로 유사한 결과를 생산할 수 있다. 각 세포에 대한 결과는 적절히 조절된 숫자 색인 또는 분류 매치 가능성으로서의 전체 결과에 의해 나타내어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 측면에 따른 방법은 다양한 생물학적 구조 및 질병 진단의 감지에 대한 민감도 및 특이성을 가질 수 있다.
훈련 세트의 진단 한계는 상기 스펙트럼 데이터가 질병이나 상태에 대해 분류되고 및/또는 주석이 달리는 범위에 의해 제한될 수 있다. 위에서 나타난 바와 같이, 이 훈련 세트는 상기 사용자 자신의 관심 및 전문 지식에 의해 증대될 수 있다. 예를 들면, 사용자는 H&E 착색 위에 하나 이상의 IHC 착색과 같이 다른 것에 착색된 것을 선호할 수 있다. 또한, 알고리즘은 예를 들어 액와부 림프절의 유방암 전이와 같은 특정 상태를 인식하기 위해 훈련될 수 있다. 상기 알고리즘은 오직 선암 대 비선암과 같은 정상 대 비정상 조직 유형 또는 바이너리 출력를 표시하도록, 막낭, B- 및 T-림프구와 같은 상이한 정상 조직 유형의 발생을 분류하지 않도록 훈련될 수 있다. SHP에 의해 얻어진 특별한 조직 유형 또는 질병 상태의 영역은 상기 조직 부분의 실시간 미세 표시에 겹친 "디지털 착색"으로 표현될 수 있다.
진단, 예후, 예측, 치료진단
도 3의 순서도에서 306 단계에 설명된 바와 같이, 상기 스펙트럼 및 시각적 이미지가 등록되면, 그것들은 의료 진단의 형성을 위해 이용될 수 있다. 상기 진단은 세포 이상, 염증, 감염, 전암, 암 및 총 해부학적 특징(gross anatomical features) 등을 포함하는 질병이나 상태를 포함할 수 있다. 본 발명의 측면에 따른 방법에서, 그 시각적 이미지로 등록된 알려지지 않은 질병 또는 상태의 생물학적 표본 스펙트럼 이미지의 스펙트럼 데이터는 위에서 설명된 바와 같이, 훈련된 진단 알고리즘에 입력될 수 있다. 진단 알고리즘의 준비에 사용된 훈련 세트에 유사성을 바탕으로, 상기 생물학적 표본의 스펙트럼 데이터는 질병 또는 상태에 상호 연관될 수 있다. 상기 질병 또는 상태는 진단으로서 출력될 수 있다.
예를 들어, 스펙트럼 데이터 및 시각적 이미지는 알려지지 않은 질병 또는 상태의 생물학적 표본으로부터 얻어질 수 있다. 상기 스펙트럼 데이터는 HCA와 같은 무감독 방법에 의해 분석될 수 있으며, 이는 이후 무감독 스펙트럼 이미지를 준비하기 위해 공간적 참조 데이터(spatial reference data)와 함께 사용될 수 있다. 이 무감독 스펙트럼 이미지는 위에서 논의된 바와 같이, 상기 시각적 이미지에 등록될 수 있다. 무감독 방법에 의해 분석된 상기 스펙트럼 데이터는 이후 훈련된 감독 알고리즘으로 입력될 수 있다. 예를 들면, 상기 훈련된 감독 알고리즘은 위의 훈련 단계에서 설명된 바와 같이, ANN일 수 있다. 상기 훈련된 감독 알고리즘으로부터의 출력은 훈련 세트를 기반으로 한 질병 또는 상태의 분류 및/또는 주석에 해당하는 하나 이상의 라벨(labels)을 포함하는 스펙트럼 데이터일 수 있다.
상기 라벨에 따라 진단을 추출하기 위해, 라벨링된 스펙트럼 데이터는 시각적 이미지 및/또는 생물학적 표본의 무감독 스펙트럼 이미지에 등록될 수 있는 감독 스펙트럼 이미지를 준비하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, GUI를 통해 상기 감독 스펙트럼 이미지가 시각적 이미지 및/또는 무감독 스펙트럼 이미지에 등록될 때, 사용자는 상기 시각적 이미지 또는 무감독 스펙트럼 이미지의 관심 포인트를 선택할 수 있고, 상기 감독 스펙트럼 이미지의 포인트에서 상기 라벨에 대응하는 질병 또는 상태를 제공받을 수 있다. 대안으로, 사용자는 특정 질병이나 상태에 대한 등록된 이미지를 검색하는 소프트웨어 프로그램을 요청할 수 있고, 상기 소프트웨어는 특정 질병이나 상태가 라벨링된 시각적, 무감독 스펙트럼 및 감독 스펙트럼 이미지의 부분을 강조할 수 있다. 이는 매우 민감하고 미세적으로 얻어진 데이터에 접근하는 동안 바람직하게 사용자가 실시간으로 진단을 얻을 수 있도록 하며, 또한 상기 사용자가 그/그녀가 익숙한 시각적 이미지를 볼 수 있도록 한다.
상기 진단은 "그렇다/그렇지 않다" 유형의 출력과 같은 바이너리 출력을 포함할 수 있으며, 이는 질병이나 상태의 존재 또는 결핍을 나타낸다. 또한, 상기 진단은 질병이나 상태의 매치 확률과 같은 부가적 보고(adjunctive report), 색인(index) 또는 관련 구성 비율(relative composition ratio) 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 측면에 따르면, 조직 부분의 총 건축 특징(gross architectural features)은 필연적으로 질병에 관련이 없는 총 해부학적 특징(gross anatomical features)을 구별하기 위해 스펙트럼 패턴을 통해 분석될 수 있다. 글로벌 디지털 착색(global digital staining: GDS)으로 알려진 이러한 과정은 감독 및 무감독 다변량 방법(multivariate methods)의 조합을 이용할 수 있다. GDS는 선상 및 편평 상피(glandular and squamous epithelium), 내피(endothelium), 결합 조직(connective tissue), 뼈(bone) 및 지방 조직(fatty tissue) 등을 포함하는 해부학적 특징을 분석하기 위해 사용될 수 있다.
GDS에서, 감독 진단 알고리즘은 다른 환자로부터 주어진 질병의 여러 샘플을 포함하는 훈련 데이터세트로부터 구축될 수 있다. 환자의 각 개별 조직 부분은 위에서 설명한 바와 같이 스펙트럼 이미지 데이터 획득, 결과 데이터세트의 사전-처리 및 HCA와 같은 무감독 알고리즘에 의한 해석을 이용하여 분석될 수 있다. 상기 HCA 이미지는 대응하는 착색된 조직에 등록될 수 있으며, 병리학자에 의해 주석이 달릴 수 있다. 도 15A-C에 나타나는 이 주석 단계는 조직 유형 또는 질병 단계와 상태 또는 다른 원하는 특징의 전형적인 징후에 해당하는 스펙트럼을 추출하도록 한다. 주석이 달린 의료 진단과 함께 그 결과로 생긴 전형적인 스펙트럼은 ANN과 같은 감독 알고리즘을 훈련시키는데 사용될 수 있으며, 이는 인식하도록 훈련된 특징을 감지하는데 특히 적합하다.
GDS 방법에 따르면, 상기 샘플은 고전 착색제(classical stains) 또는 면역-조직 화학의 물질(immune-histochemical agents)을 사용하여 착색될 수 있다. 상기 병리학자가 착색된 샘플을 받고 전산화된 이미징 현미경을 이용하여 검사하는 경우, 상기 스펙트럼 결과는 시각적 현미경을 제어하는 컴퓨터에서 사용될 수 있다. 상기 병리학자는 샘플 상의 조직점을 선택할 수 있고, 분광-기반 진단을 받을 수 있다. 이 진단은 동일한 스펙트럼 진단 분류를 갖는 모든 영역을 나타내는 상기 시각적 이미지에 그레이스케일 또는 의사-색채 이미지를 오버레이할 수 있다.
도 15A는 H&E-착색된 림프절 조직 부분의 시각적 현미경 이미지이다. 도 15B는 림프절의 막낭 및 내부와 같은 총 해부학적 특징의 글로벌 식별(global discrimination)의 전형적인 예시를 나타낸다. 도 15B는 도 15A에서 보이는 부분의 글로벌 디지털 착색 이미지이며, 림프절의 막낭과 내부를 구별한다.
해당 시각적 이미지에 등록된 총 해부학적 특징 영역은 상기 스펙트럼 패턴 데이터세트의 더욱 정교한 기준에 따른 분석을 위해 선택될 수 있다. 이 진단의 다음 수준은 예를 들어, 오직 SHP 결과에 기초할 수 있는 진단 표시 디지털 착색(diagnostic marker digital staining: DMDS) 데이터베이스를 기반으로 할 수 있거나, 면역-조직 화학(IHC)의 결과를 이용하여 수집될 수 있는 스펙트럼 정보를 포함할 수 있다. 예를 들어, 선택된 지역을 스캔하기 위해 더 많은 진단 데이터베이스를 사용함으로써 상피 조직 부분은 비정상 및/또는 암을 나타내는 스펙트럼 패턴의 존재에 대한 분석을 위해 선택될 수 있다. 이러한 방식의 예시가 도 15C에 개략적으로 보여지며, 이는 고전 조직병리학에서 면역-조직 화학 착색 후에만 이용될 수 있는 것과 같이 SHP의 전체 차별적 능력(full discriminatory power)을 활용하고, 림프절 내부 조직 특징의 세부사항(암, 림프구 등)을 산출한다. 도 15C는 도 15A에 보여지는 부분의 DMDS 이미지이며, 막낭, 전이성 유방암(metastatic breast cancer), 조직구, 활성화된 B-림프구 및 T림프구를 구별한다.
GDS와 DMDS 간의 관계는 도 16의 개략도에 각각 어두운 청색 및 보라색으로 표시된 수평 진행에 의해 보여진다. GDS 및 DMDS 모두는 스펙트럼 데이터를 기반으로 하지만 IHC 데이터와 같은 다른 정보를 포함할 수 있다. 실제 진단은 동일하거나 hANN과 같이 유사 훈련된 진단 알고리즘에 의해 수행될 수도 있다. 이러한 hANN은 먼저 상기 조직(어두운 청색 트랙)에 대해 수집된 패턴의 데이터세트에 큰 변화를 감지하는 총 해부학적 특징에 대한 조직 부분을 분석할 수 있다. 이후 "진단 요소" 분석은 보라색 트랙에 표시된 스펙트럼 정보의 일부를 사용하여 hANN에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 바이너리 형식의 다층 알고리즘이 구현될 수 있다. 각각의 진단에 도달하기 위해 GDS 및 DMDS 모두는 도 16에 총 조직 데이터베이스 및 진단 조직 데이터베이스로 보여진 상이한 데이터베이스 세부 항목을 사용할 수 있고, 그 결과는 적정 이미지 등록 후 상기 착색된 이미지에 겹쳐질 수 있다.
본 발명의 측면에 따른 방법의 일실시예에 따르면, 병리학자는 정확한 진단이 달성되도록 하기 위해 특정 입력을 제공할 수 있다. 예를 들면, 상기 병리학자는 착색된 이미지의 품질을 시각적으로 체크할 수 있다. 또한, 상기 병리학자는 샘플의 배율 또는 시야를 변경하기 위해 선택적 질문(selective interrogation)을 수행할 수 있다.
본 발명의 측면에 따른 방법은 병리학자가 상기 생물학적 표본을 보고 이미지 등록을 실시함으로써 수행될 수 있다. 또는, 상기 등록된 이미지가 전자적으로 전송될 수 있는 디지털 데이터를 포함하고 있기 때문에 상기 방법은 원격으로 수행될 수 있다.
방법은 다음의 제한되지 않는 실시예에 의해 보여질 수 있다.
예 2 - 림프절 부분
도 17은 1㎜ x 1㎜로 측정된 H&E-착색된 액와부 림프절 부분의 시각적 이미지를 보여주며, 좌측 사분면(left quadrant) 상단에 유방암 미세 전이를 포함한다. 도 17B는 유방암 미세 전이의 SHP-기반 디지털 착색된 영역이다. 예를 들어, 미세 전이의 일반적인 지역에서 마우스에 제어되는 커서(cursor)를 이용해 클릭하여 선택함으로써, SHP에 의해 암으로 확인된 영역은 도 17B에 보여지듯이 적색으로 강조된다. 도 17C는 B-림프구가 차지하는 SHP-기반 디지털 착색된 영역이다. 우측 하단 모서리를 향해 포인팅함으로써, B-림프구가 차지한 영역은 도 17C에 보여지듯이 밝은 청색으로 표시된다. 도 17D는 조직세포가 차지한 영역을 보이는 SHP-기반 디지털 착색된 영역이며, 이는 화살표에 의해 식별된다.
상기 SHP-기반 디지털 착색이 스펙트럼과 진단을 포함하는 훈련되고 검증된 저장소 또는 데이터베이스를 기반으로 하기 때문에, 주어진 상기 디지털 착색은 도 17B의 "전이성 유방암"의 경우와 같이 진단 카테고리(diagnostic category)에 직접적으로 연관될 수 있다. SHP에 의해 진단 분석이 수행될 수 있지만, 상기 시스템은 먼저 병리학자에 의해 보완 또는 보조 수단으로 사용될 수 있다. 부가적 도구로서, 예를 들어 상기 출력은 바이너리 보고(binary report)가 아닌 매치 확률(match probability)일 수 있다. 도 18은 SHP와 개별적이고 작은 군집의 암 세포의 감지를 보여준다.
예 3 - 폐 부분의 미세 바늘 흡인( fine needle aspirate ) 샘플
샘플 부분은 폐에 위치한 의심스러운 집단의 미세 바늘 흡인으로 준비된 포르말린 고정 파라핀 내장(formalin fixed paraffin embedded) 세포 블록으로부터 절단된다. 세포 블록은 이전의 조직학적(histological) 분석이 선암, 소세포암(SCC) 또는 폐편평상피암(squamous cell carcinoma of the lung)을 식별한 기준을 기반으로 하여 선택된다. 표본은 약 5㎛의 두께로 제공하기 위해 마이크로톰(microtome)을 이용하여 절단되고, 이후 low-e 현미경 슬라이드(Kevley Technologies, Ohio, USA)에 장착된다. 부분은 이후 표준 프로토콜을 이용하여 탈파라핀화된다. 분광 데이터 수집 이후, 상기 조직 부분은 조직병리학자에 의해 형태학적 해석이 가능하도록 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin: H&E) 착색된다.
Perkin Elmer Spectrum 1 / Spotlight 400 Imaging Spectrometer (Perkin Elmer Corp, Shelton, CT, USA)는 이 연구에 쓰인다. 적외선 마이크로-스펙트럼 이미지는 노턴-비어 아포디제이션(Norton-Beer apodization) (see, e.g., Naylor, et al. J Opt. Soc. Am., A24:3644-3648(2007)) 및 푸리에 변환 이전에 반투과 (전송/반사) 모드(transflection mode)에서 1㎜ x 1㎜ 조직 지역으로부터 6.25㎛ x 6.25㎛의 픽셀 해상도(pixel resolution), 4㎝-1의 스펙트럼 해상도 및 8 인터페로그램의 공동 부가로 기록된다. 적절한 배경 스펙트럼은 단일 빔 스펙트럼에 대한 비율로 상기 샘플 영역 외부에 수집된다. 그 결과 비율 스펙트럼(ratioed spectra)은 이후 흡광도(absorbance)로 변환된다. 각 1㎜ x 1㎜의 적외선 이미지는 160 x 160 또는 25,600 스펙트럼을 포함한다.
처음에, 원시 적외선 마이크로-스펙트럼 데이터 세트는 매트랩(Matlab) (version R2009a, Mathworks, Natick, MA, USA)으로 작성된 소프트웨어를 사용하여 불려지고, 처리된다. 스펙트럼 품질 테스트는 조직이 존재하지 않는 지역으로부터 기록되거나 잡음에 대해 열악한 신호가 표시된 모든 스펙트럼을 제거하기 위해 수행된다. 상기 테스트를 통과한 모든 스펙트럼은 이후 베이스라인 오프-셋 정규화(baseline off-set normalize) (전체 스펙트럼 벡터에서 최소한의 흡광 강도의 삭감)되고, 2차 파생물로 변환되며(Savitzy-Golay algorithm (see. e.g., Savitzky, et al. Anal. Chem., 36:1627 (1964)), 13 smoothing points), 1350㎝-1 - 900㎝-1 스펙트럼 영역에서 기록된 강도 값만을 포함하도록 절단되고, 마지막으로 벡터 정규화(vertor normalize)된다.
처리된 데이터 세트는 소프트웨어 시스템 및 스펙트럼 유사성의 정의를 위해 유클리디언 거리(Euclidean distance)를 사용하여 수행되는 HCA, 그리고 군집화를 위한 Ward's 알고리즘(see. e.g., Ward, J Am. Stat. Assoc., 58:236 (1963))으로 불려진다. 픽셀 군집 멤버십(membership)을 설명하는 의사-색채 군집 이미지는 이후 동일한 샘플로부터 캡쳐된 H&E 이미지와 직접적으로 결집되고 비교된다. 다른 군집화 구조를 설명하는 2 및 15 군집 간의 HCA 이미지는 다른 수준에서 계산된 HCA 계통수(dendrogram)를 자름으로써 모이게 된다. 이러한 군집 이미지는 이후 H&E-착색된 조직의 형성으로 형태학적 해석이 잘 복제된 군집화 구조를 확인하는 협력 병리학자에게 제공된다.
적외선 스펙트럼은 기본 베이스 라인 이동, 원인 불명의 신호 강도 변화, 피크 위치 이동 또는 기록된 스펙트럼에 미 산란 및 반사 기여에 대한 EMSC의 하위-공간 모델 버전에 의해 보정되는 람베르트비어 법칙(LambertBeer law) (see B. Bird, M. Miljkovic and M. Diem, "Two step resonant Mie scattering correction of infrared micro-spectral data: human lymph node tissue", J. Biophotonics, 3 (8-9) 597-608 (2010))으로부터 발생하지 않거나 순종하는 일반적인 특징에 의해 오염된다. 처음에, 각 암 유형에 대한 1000 기록된 스펙트럼은 도 19A-19F에서 나타나는 상기 적외선 이미지로부터 별도의 데이터 세트로 모인다.
이러한 데이터 세트는 이후 도 19A 및 도 19B에 보여지는 바와 같이, 최소 산란 기여(minimal scattering contributions)와 스펙트럼에 대해 검색되며, 잡음 대비 신호의 증가를 위해 각 암 유형에 대한 평균이 계산되고, 각 세포 유형에 대해 KK 변환이 계산된다. 도 19A는 폐 선암, 소세포암 및 편평 상피 세포 암종 세포로부터 기록된 세포 스펙트럼으로 구성된 원시 스펙트럼 데이터 세트를 보여준다. 도 19B는 폐 선암, 소세포암 및 편평 상피 세포 암종 세포 각각으로부터 기록된 세포 스펙트럼으로 구성된 보정된 스펙트럼 데이터 세트를 보여준다. 도 19C는 폐 선암, 소세포암 및 편평상피암(squamous cell carcinoma)에 대한 표준 스펙트럼을 보여준다.
미 산란 기여에 대한 하위 공간 모델(sub space model)은 반 데 헐스트(Van de Hulst) 근사 공식(see, e.g., Brussard, et al., Rev. Mod. Phys., 34:507 (1962))을 사용하여 6㎛ - 40㎛의 핵 영역 반경 범위 및 1.1 - 1.5의 굴절률 범위를 형성하는 340 미 산란 곡선의 계산으로 구축된다. 이러한 산란 곡선으로 구성된 분산의 95% 이상을 설명하는 처음 10 주성분은 데이터 세트의 1단계 EMSC 보정의 간섭과 같이 각 암 유형에 대한 상기 KK 변환에 부가적으로 사용된다. 상기 EMSC 계산은 1000 스펙트럼 당 대략 1초가 소요된다. 도 19D는 도 19C의 스펙트럼으로부터 계산된 KK 변환 스펙트럼을 보여준다. 도 19E는 EMSC 보정 전 다중 클래스 데이터 세트의 PCA 스코어 도면을 보여준다. 도 19F는 EMSC 보정 후 다중 클래스 데이터 세트의 PCA 스코어 도면을 보여준다. 상기 분석은 1800㎝-1 - 900㎝-1 스펙트럼 영역에서 정규화된 벡터 상에서 수행된다.
도 20A는 폐 선암, 소세포암 및 편평 상피 암종(squamous carcinoma) 각각의 평균 흡광 스펙트럼을 보여준다. 이는 각 세포 유형의 1000 소량 보정된 세포 스펙트럼으로부터 계산된다. 도 20B는 도 20A에 표시된 흡광 스펙트럼의 2차 파생 스펙트럼을 보여준다. 일반적으로, 선암 및 편평상피암은 상기 스펙트럼의 낮은 파상수 영역에서 유사한 스펙트럼 윤곽(profiles)을 갖는다. 그러나, 상기 편평상피암은 아미드 I 밴드에 대해 대체로 낮은 파상수 숄더(wavenumber shoulder)를 보이며, 이는 구강(oral cavity)의 편평상피암으로부터 기록된 스펙트럼 데이터에 관찰된다(Papamarkakis, et al. (2010), Lab. Invest., 90:589-598). 상기 소세포암은 높은 파상수로 약간 이동되는 매우 강한 대칭 및 비대칭의 인산염(phosphate) 밴드를 표시하며, 관찰된 스펙트럼에 인지질(phospholipids)의 강한 기여를 나타낸다.
상기 샘플 지역의 대부분은 혈액과 비-진단 물질로 구성되어 있기 때문에, 상기 데이터는 진단 물질만을 포함하고, 산란 기여를 보정하기 위해 사전-처리된다. 또한, HCA는 바이너리 마스크를 생성하고, 최종적으로 상기 데이터를 분류하기 위해 사용된다. 이 결과가 도 21A-21C에 보여진다. 도 21A는 선암, 소세포암 및 편평 상피 세포 암종 세포 각각을 포함하는 1㎜ x 1㎜ 조직 영역의 4 스티치된 현미경 R&E-착색된 이미지를 보여준다. 도 21B는 도 21A에 표시된 상기 조직 영역으로부터 기록된 4 스티치된 원시 적외선 이미지의 1350㎝-1 - 900㎝-1 스펙트럼 영역에서 빠르게 감소하는 RCA 분석의 수행에 의해 만들어진 바이너리 마스크 이미지이다. 진단 세포 물질 및 혈액 세포의 영역이 보여진다. 도 21C는 진단 세포 물질의 영역으로부터 기록된 소량 수정된 스펙트럼 데이터의 6-군집 RCA 이미지이다. 상기 분석은 1800㎝-1 - 900㎝-1 스펙트럼 영역 상에서 수행된다. 편평상피암, 선암, 소세포암 및 다양한 결합조직형성 조직 반응(diverse desmoplastic tissue response)의 영역이 보여진다. 대안으로, 이러한 처리는 ANN과 같은 감독 알고리즘으로 대체될 수 있다.
위의 예시에서 제시된 결과는 원시 측정된 스펙트럼 데이터의 분석이 SCC 및 비-소세포암(non-small cell carcinoma: NSCC)의 차별화를 가능하도록 하는 것을 보인다. 상기 원시 측정된 스펙트럼이 산란 기여에 대해 보정된 후, 본 발명의 측면에 의한 방법에 따른 선암 및 편평상피암인 NSCC의 두 하위 유형은 명확하게 구분된다. 따라서, 이러한 예시들은 이 스펙트럼 이미징 방법이 폐암의 세 가지 주요 유형을 식별하고 정확하게 분류하기 위해 사용될 수 있다는 강력한 증거를 제공한다.
도 22는 본 발명의 측면에 따른 이미지 등록 및 훈련 등의 방법과 함께 사용할 수 있는 컴퓨터 시스템(100) 일실시예의 다양한 특징을 보여준다. 도 22에서 보여지듯이, 상기 컴퓨터 시스템(100)은 개인용 컴퓨터(personal computer: PC), 미니컴퓨터(minicomputer), 메인프레임 컴퓨터(mainframe computer), 마이크로컴퓨터(microcomputer), 전화 기기(telephone device), PDA(personal digital assistant) 또는 프로세서와 입력 기능을 갖는 다른 장치와 같은 터미널(102)을 통해 요청자(101)에 의해 사용될 수 있다. 서버 모듈은 예를 들어 PC, 미니컴퓨터, 메인프레임 컴퓨터, 마이크로컴퓨터 또는 데이터의 프로세서와 저장소를 갖거나 데이터 저장소에 접근할 수 있는 다른 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 서버 모듈(106)은 진단에 사용하기 위해 질병 기반 데이터의 접근 가능한 저장소와 연결될 수 있다.
예를 들어, 인터넷과 같은 네트워크(110)를 통해 진단과 관련된 정보는 분석가(101) 및 상기 서버 모듈(106) 사이에 전송될 수 있다. 예를 들어, 유선(wired), 무선(wireless) 또는 광섬유 링크(fiberoptic links)와 같은 연결(111, 113)을 통해 통신이 이루어질 수 있다.
본 발명은 하드웨어, 소프트웨어 또는 이들의 조합을 이용하여 구현될 수 있으며, 하나 이상의 컴퓨터 시스템 또는 다른 처리 시스템에 구현될 수 있다. 하나의 변화에서, 본 발명의 측면은 여기 설명된 기능을 수행할 수 있는 하나 이상의 컴퓨터 시스템을 알려준다. 이러한 컴퓨터 시스템(200)의 일실시예가 도 23에 보여진다.
컴퓨터 시스템(200)은 프로세서(204)와 같은 하나 이상의 처리장치를 포함한다. 상기 프로세서(204)는 통신 인프라(예를 들어, 통신 버스, 크로스-오버 바 또는 네트워크)(206)와 연결된다. 다양한 소프트웨어 측면이 이 모범적인 컴퓨터 시스템의 관점에서 설명된다. 이 설명을 읽은 후에는, 다른 컴퓨터 시스템 및/또는 아키텍처(architectures)를 사용하여 본 발명의 측면을 구현하는 방법이 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백해질 것이다.
컴퓨터 시스템(200)은 상기 디스플레이 유닛(230) 상에 표시하기 위해 그래픽, 텍스트 및 통신 인프라(206)(또는 도시되지 않은 프레임 버퍼(frame buffer))의 다른 데이터를 전달하는 디스플레이 인터페이스(202)를 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템(200)은 또한 메인 메모리(208), 바람직하게는 램(random access memory: RAM)을 포함하며, 2차 메모리(secondary memory)(210)도 포함할 수 있다. 상기 2차 메모리(210)는 예를 들어 플로피 디스크 드라이브(floppy disk drive), 자기 테이프 드라이브(magnetic tape drive), 광 디스크 드라이브(optical disk drive) 등으로 대표되는 하드 디스크 드라이브(212) 및/또는 이동식 저장 드라이브(removable storage drive)(214)를 포함할 수 있다. 상기 이동식 저장 드라이브(214)는 잘 알려진 방법으로 이동식 저장 유닛(218)으로부터 읽거나 및/또는 이동식 저장 유닛(218)에 기록한다. 이동식 저장 유닛(218)은 플로피 디스크, 자기 테이프, 광 디스크 등을 나타내며, 이는 이동식 저장 드라이브(214)로부터 읽히고 이동식 저장 드라이브(214)에 기록된다. 알 수 있는 바와 같이, 상기 이동식 저장 유닛(218)은 그 안에 저장된 컴퓨터 소프트웨어 및/또는 데이터를 갖는 컴퓨터 사용 가능한 저장 매체를 포함한다.
대안적 변화에서, 2차 메모리(210)는 컴퓨터 시스템(200)에 로드되는 컴퓨터 프로그램 또는 다른 명령을 허용하도록 다른 유사 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어 이러한 장치는 이동식 저장 유닛(222) 및 인터페이스(220)를 포함할 수 있다. 이러한 예시는 프로그램 카트리지 및 카트리지 인터페이스(비디오 게임 장치에서 발견되는 것과 같은), 이동식 메모리 칩(이피롬(EPROM) 또는 피롬(PROM)) 및 관련 소켓, 그리고 다른 이동식 저장 유닛(222) 및 인터페이스(220)를 포함할 수 있으며, 이는 소프트웨어와 데이터가 이동식 저장 유닛(222)으로부터 컴퓨터 시스템(200)으로 전송될 수 있도록 한다.
컴퓨터 시스템(200)은 통신 인터페이스(224)도 포함할 수 있다. 통신 인터페이스(224)는 컴퓨터 시스템(200)과 외부 장치 사이에서 소프트웨어 및 데이터가 전송될 수 있도록 한다. 통신 인터페이스(224)의 예시는 모뎀, 네트워크 인터페이스(이더넷 카드(Ethernet card)와 같은), 통신 포트, 국제 개인용 컴퓨터 메모리 카드 협회(Personal Computer Memory Card International Association: PCMCIA) 슬롯과 카드 등을 포함할 수 있다. 통신 인터페이스(224)를 통해 전송되는 소프트웨어와 데이터는 신호(228)의 형태이며, 이는 전자, 전자기, 광 또는 통신 인터페이스(224)에 의해 수신될 수 있는 다른 신호일 수 있다. 이러한 신호(228)는 통신 경로(226)(예를 들어, 채널)를 통해 통신 인터페이스(224)에 제공된다. 이 경로(226)는 신호(228)를 전달하며, 전선 또는 케이블, 광 섬유, 전화선, 무선 링크, 무선 주파수(RF) 링크 및/또는 다른 통신 채널을 이용하여 구현될 수 있다. 본 문서에서, 용어 "컴퓨터 프로그램 매체" 및 "컴퓨터 사용 가능 매체"는 이동식 저장 드라이브(214), 하드 디스크 드라이브에 설치된 하드 디스크(212) 및 신호(228)와 같은 미디어의 일반적인 참조에 사용된다. 이러한 컴퓨터 프로그램 제품은 상기 컴퓨터 시스템(200)에 소프트웨어를 제공한다. 본 발명의 측면은 이러한 컴퓨터 프로그램 제품을 알려준다.
컴퓨터 프로그램(컴퓨터 컨트롤 로직으로도 지칭된)은 메인 메모리(208) 및/또는 2차 메모리(210)에 저장된다. 컴퓨터 프로그램은 또한 통신 인터페이스(224)를 통해 수신될 수 있다. 여기 논의된 바와 같이 실행 시, 이러한 컴퓨터 프로그램은 상기 컴퓨터 시스템(200)이 본 발명의 측면에 따른 기능을 수행할 수 있도록 한다. 특히, 실행 시 상기 컴퓨터 프로그램은 프로세서(204)가 그러한 기능을 수행할 수 있도록 한다. 따라서, 이러한 컴퓨터 프로그램은 상기 컴퓨터 시스템(200)의 컨트롤러를 나타낸다.
본 발명의 측면이 소프트웨어를 사용하여 다양하게 구현되면서, 상기 소프트웨어는 이동식 저장 드라이브(214), 하드 드라이브(212) 또는 통신 인터페이스(224)의 사용으로 컴퓨터 프로그램 제품에 저장될 수 있고, 컴퓨터 시스템(200)에 로드될 수 있다. 상기 프로세서(204)에 의해 실행될 때, 상기 컨트롤 로직(소프트웨어)은 여기에 설명된 바와 같이 프로세서(204)가 기능을 수행하도록 한다. 예를 들어, 또 다른 변화의 본 발명의 측면은 주문형 집적 회로(application specific integrated circuits: ASICs)와 같은 하드웨어 요소를 이용하여 주로 하드웨어에서 구현된다. 여기 설명된 기능을 수행하기 위한 하드웨어 상태 기계(hardware state machine)의 구현은 관련 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.
또 다른 변형에서, 본 발명의 측면은 하드웨어 및 소프트웨어 모두의 조합을 이용하여 구현된다.

Claims (17)

  1. 생물학적 샘플과 함께 슬라이드 홀더 상의 다수의 레티클(reticle)의 좌표 위치의 첫 번째 세트를 수신하는 단계;
    상기 생물학적 샘플의 시각적 이미지를 수신하는 단계;
    상기 생물학적 샘플과 함께 상기 슬라이드 홀더 상의 다수의 상기 레티클의 좌표 위치의 두 번째 세트를 수신하는 단계;
    상기 생물학적 샘플의 스펙트럼 이미지를 수신하는 단계;
    좌표의 상기 첫 번째 세트와 좌표의 상기 두 번째 세트를 정렬하는 단계; 및
    좌표의 상기 첫 번째 세트와 좌표의 상기 두 번째 세트의 정렬에 근거하여 상기 스펙트럼 이미지와 상기 시각적 이미지의 등록된 이미지를 생성하는 단계; 를 포함하는 생물학적 샘플의 시각적 이미지와 스펙트럼 이미지를 등록하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 등록된 이미지를 생성하는 단계는 이미지 좌표의 상기 첫 번째 세트와 이미지 좌표의 상기 두 번째 세트의 정렬에 근거하여 자동으로 발생하는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플의 시각적 이미지와 스펙트럼 이미지를 등록하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    좌표의 상기 첫 번째 세트와 좌표의 상기 두 번째 세트는 상기 등록된 이미지를 위한 공통의 좌표계를 생성하는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플의 시각적 이미지와 스펙트럼 이미지를 등록하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    좌표의 상기 첫 번째 세트는 상기 시각적 이미지 내 이미지 특성과는 독립적인 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플의 시각적 이미지와 스펙트럼 이미지를 등록하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    좌표의 상기 두 번째 세트는 상기 스펙트럼 이미지 내 이미지 특성과는 독립적인 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플의 시각적 이미지와 스펙트럼 이미지를 등록하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 등록된 이미지의 최적화를 수행하는 단계를 더 포함하는 생물학적 샘플의 시각적 이미지와 스펙트럼 이미지를 등록하는 방법.
  7. 프로세서;
    상기 프로세서를 통해 작동하는 사용자 인터페이스; 및
    상기 프로세서에 의해 접근 가능한 저장소(repository); 를 포함하되,
    생물학적 샘플과 함께 슬라이드 홀더 상의 다수의 레티클의 좌표 위치의 첫 번째 세트를 수신하고,
    상기 생물학적 샘플의 시각적 이미지를 수신하며,
    상기 생물학적 샘플과 함께 상기 슬라이드 홀더 상의 다수의 상기 레티클의 좌표 위치의 두 번째 세트를 수신하고,
    상기 생물학적 샘플의 스펙트럼 이미지를 수신하며,
    좌표의 상기 첫 번째 세트와 좌표의 상기 두 번째 세트가 정렬되고,
    좌표의 상기 첫 번째 세트와 좌표의 상기 두 번째 세트의 정렬에 근거하여 상기 스펙트럼 이미지와 상기 시각적 이미지의 등록된 이미지를 생성하는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플의 시각적 이미지와 스펙트럼 이미지를 등록하는 시스템.
  8. 컴퓨터가 생물학적 샘플의 시각적 이미지와 스펙트럼 이미지를 등록하도록 제어 논리를 저장시키는 컴퓨터 사용 가능 매체를 포함하되, 상기 제어 논리는,
    컴퓨터가 생물학적 샘플과 함께 슬라이드 홀더 상의 다수의 레티클의 좌표 위치의 첫 번째 세트를 수신하도록 하는 코트 세트;
    상기 컴퓨터가 상기 생물학적 샘플의 시각적 이미지를 수신하도록 하는 코드 세트;
    상기 컴퓨터가 상기 생물학적 샘플과 함께 상기 슬라이드 홀더 상의 다수의 상기 레티클의 좌표 위치의 두 번째 세트를 수신하도록 하는 코드 세트;
    상기 컴퓨터가 상기 생물학적 샘플의 스펙트럼 이미지를 수신하도록 하는 코드 집합;
    상기 컴퓨터가 좌표의 상기 첫 번째 세트와 좌표의 상기 두 번째 세트를 정렬하도록 하는 코드 세트; 및
    상기 컴퓨터가 좌표의 상기 첫 번째 세트와 좌표의 상기 두 번째 세트의 정렬에 근거하여 상기 스펙트럼 이미지와 상기 시각적 이미지의 등록된 이미지를 생성하도록 하는 코드 세트; 를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품.
  9. 생물학적 샘플의 스펙트럼 이미지와 상기 생물학적 샘플의 시각적 이미지를 수신하는 단계;
    상기 스펙트럼 이미지에 첫 번째 한계치(threshold value)를, 상기 시각적 이미지에 두 번째 한계치를 적용하는 단계;
    상기 첫 번째 한계치에 근거하여 바이너리 스펙트럼 이미지를 생성하는 단계;
    상기 두 번째 한계치에 근거하여 바이너리 시각적 이미지를 생성하는 단계;
    상기 바이너리 스펙트럼 이미지와 상기 바이너리 시각적 이미지를 이용하여 상기 스펙트럼 이미지의 생물학적 특성과 상기 시각적 이미지의 생물학적 특성을 정렬하는 단계; 및
    상기 스펙트럼 이미지의 생물학적 특성과 상기 시각적 이미지의 생물학적 특성의 정렬에 근거하여 상기 스펙트럼 이미지와 상기 시각적 이미지의 이미지 등록을 개선하는 단계; 를 포함하는 이미지 등록 개선 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 스펙트럼 이미지 특성과 상기 시각적 이미지 특성의 정렬이 상기 스펙트럼 이미지와 상기 시각적 이미지의 이미지 등록을 향상시키는 것을 특징으로 하는 이미지 등록 개선 방법.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 스펙트럼 이미지의 이미지 특성을 향상시키기 위해 상기 스펙트럼 이미지에 가중 정규화(weighted normalization)를 적용하는 단계를 더 포함하는 이미지 등록 개선 방법.
  12. 제 9항에 있어서,
    상기 바이너리 스펙트럼 이미지와 상기 바이너리 시각적 이미지에 형태학적 폐쇄(morphological closure)를 적용하는 단계를 더 포함하는 이미지 등록 개선 방법.
  13. 제 9항에 있어서,
    상기 바이너리 스펙트럼 이미지와 상기 바이너리 시각적 이미지 내 가장자리를 연화(softening)하는 단계를 더 포함하는 이미지 등록 개선 방법.
  14. 제 9항에 있어서,
    상기 바이너리 스펙트럼 이미지와 상기 바이너리 시각적 이미지 사이의 그레이스케일(grayscale) 차이를 최소화하는 단계를 더 포함하는 이미지 등록 개선 방법.
  15. 제 9항에 있어서,
    상기 시각적 이미지의 스케일링 단계; 및
    상기 스펙트럼 이미지의 스케일링 단계; 를 더 포함하는 이미지 등록 개선 방법.
  16. 프로세서;
    상기 프로세서를 통해 작동하는 사용자 인터페이스; 및
    상기 프로세서에 의해 접근 가능한 저장소(repository); 를 포함하되,
    생물학적 샘플의 스펙트럼 이미지와 상기 생물학적 샘플의 시각적 이미지를 수신하고,
    상기 스펙트럼 이미지에 첫 번째 한계치가 적용되며, 상기 시각적 이미지에 두 번째 한계치가 적용되고,
    상기 첫 번째 한계치에 근거하여 바이너리 스펙트럼 이미지가 생성되며,
    상기 두 번째 한계치에 근거하여 바이너리 시각적 이미지가 생성되고,
    상기 바이너리 스펙트럼 이미지와 상기 바이너리 시각적 이미지를 이용하여 상기 스펙트럼 이미지의 생물학적 특성과 상기 시각적 이미지의 생물학적 특성이 정렬되며,
    상기 스펙트럼 이미지의 생물학적 특성과 상기 시각적 이미지의 생물학적 특성의 정렬에 근거하여 상기 스펙트럼 이미지와 상기 시각적 이미지의 이미지 등록이 개선되는 것을 특징으로 하는 이미지 등록 개선 시스템.
  17. 컴퓨터가 등록된 이미지를 개선하도록 제어 논리를 저장시키는 컴퓨터 사용 가능 매체를 포함하되, 상기 제어 논리는,
    생물학적 샘플의 스펙트럼 이미지와 상기 생물학적 샘플의 시각적 이미지를 컴퓨터가 수신하도록 하는 코드 세트;
    상기 컴퓨터가 첫 번째 한계치를 상기 스펙트럼 이미지에, 두 번째 한계치를 상기 시각적 이미지에 적용하도록 하는 코드 세트;
    상기 컴퓨터가 상기 첫 번째 한계치에 근거하여 바이너리 스펙트럼 이미지를 생성하도록 하는 코드 세트;
    상기 컴퓨터가 상기 두 번째 한계치에 근거하여 바이너리 시각적 이미지를 생성하도록 하는 코드 세트;
    상기 컴퓨터가 상기 바이너리 스펙트럼 이미지와 상기 바이너리 시각적 이미지를 이용하여 상기 스펙트럼 이미지의 생물학적 특성과 상기 시각적 이미지의 생물학적 특성을 정렬하도록 하는 코드 세트; 및
    상기 컴퓨터가 상기 스펙트럼 이미지의 생물학적 특성과 상기 시각적 이미지의 생물학적 특성의 정렬에 근거하여 상기 스펙트럼 이미지와 상기 시각적 이미지의 이미지 등록을 개선하도록 하는 코드 세트; 를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품.
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