WO2015128946A1 - 分光スペクトル解析方法 - Google Patents

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    • G01N2201/1293—Using chemometrical methods resolving multicomponent spectra

Definitions

  • the present invention relates to a spectral spectrum analysis method.
  • a spectroscopic measurement method has been used as a method for analyzing a component contained in a specimen such as a tissue section (see Non-Patent Documents 1 and 2, for example).
  • the Raman scattered light from each position of the sample is detected, a Raman spectrum is obtained by spectroscopic analysis of the detected Raman scattered light, and a principal component analysis is performed on a set of the obtained Raman spectra to thereby obtain a Raman spectrum at each position of the sample.
  • a scalar value for the component is obtained.
  • the acquired Raman spectrum includes components derived from various noises such as scattered light from the glass slide on which the specimen is placed, autofluorescence of the optical element, and thermal noise of the detector.
  • Principal component analysis is also used effectively in the process of removing components derived from these noises from the acquired Raman spectrum. That is, the higher-order principal components obtained by principal component analysis are regarded as noise-derived components, and the higher-order principal components are removed, and the Raman spectrum is reconstructed from only the lower-order principal components. Yes.
  • Slobodan Sasic 2 people “A comparison of Raman chemicalimages produced by univariate and multivariate data processing-a simulation with an example from pharmaceutical practice”, Analyst, 129, pp. 1001-1007, 2004 Joanne Hutchings 5 others, “The potential for histologicalscreening using a combination of rapid Raman mapping and principal component analysis”, Journal of Biophotonics, vol. 2, no. 1-2, pp. 91-103, 2009
  • the noise removal process is performed based on only the order of the principal component, the following problem occurs. Since the main component derived from weak Raman scattered light appears in a higher order, it is removed together with noise. For example, information on Raman scattered light from a very small amount of molecules in a sample is lost. On the other hand, relatively strong noise such as scattered light from the slide glass appears in the low-order principal components, so that it remains as a part of the Raman spectrum that is reconstructed without being removed, despite being noise. End up. As described above, there is a problem that various noises having different properties cannot be appropriately removed by a single process.
  • the present invention has been made in view of the above-described circumstances, and an object of the present invention is to provide a spectral spectrum analysis method capable of properly removing various noises at once and obtaining an accurate spectral spectrum.
  • the present invention includes a principal component analysis step for calculating a plurality of orders of principal components constituting each of the spectral spectra by performing principal component analysis on a set of spectral spectra measured at each position of the specimen, and the principal component analysis step
  • a principal component image creating step for creating a principal component image for each order with the principal component score of each principal component obtained in step corresponding to the position value, and each principal component created in the principal component image creating step Extracted in the first extraction step of extracting the distribution pattern of the principal component score from the image, the second extraction step of extracting the form of the specimen from the morphological image obtained by photographing the specimen, and the first extraction step
  • the distribution pattern of the principal component score is collated with the form of the sample extracted in the second extraction step, and correlated with the form of the sample.
  • a principal component analysis is performed on a hyper-Raman spectrum, which is a set of spectral spectra of a sample, thereby separating a plurality of principal components constituting the spectral spectrum at each position of the sample.
  • a principal component image is created using the separated principal components.
  • the distribution pattern of the principal component score is extracted from each principal component image
  • the sample form is extracted from the sample form image.
  • a principal component image having a principal component score distribution pattern correlating with the sample form is extracted from the plurality of principal component images. That is, among the plurality of principal components separated in the principal component analysis step, a principal component derived from the sample form and a principal component derived from noise are discriminated.
  • the reconstruction step among the plurality of principal components, a spectral spectrum including only the principal component determined to be derived from the sample form in the matching step is reconstructed. Thereby, various noises can be appropriately removed at a time to obtain an accurate spectral spectrum.
  • the spectral spectrum may be a Raman spectrum or an infrared absorption spectrum. By doing so, it is possible to analyze a specific molecule contained in the specimen.
  • the morphological image may be a phase difference image, a differential interference image, or a bright field image.
  • the spectral spectrum analysis method broadly creates a principal component image by principal component analysis from a set of Raman spectra (hyper Raman spectrum) measured at each position of the specimen A.
  • a first step S1 for processing the principal component image, a second step S2 for processing the morphological image of the specimen, and a third step for obtaining a Raman spectrum from which noise is removed using the principal component image and the morphological image S3 is included.
  • Such a spectral spectrum analysis method is implemented by a microscope system including a microscope capable of acquiring a spectral spectrum and a morphological image of a specimen and a control device for analyzing the spectral spectrum and the morphological image acquired by the microscope.
  • the control device is a computer including a CPU (Central Processing Unit) and a storage device, and a program for causing the storage device to execute the first step S1 to the third step is stored.
  • a process from said 1st process S1 to 3rd process S3 is implemented by reading a program from a memory
  • the control device uses the first processing unit, the second processing unit, and the third processing unit as dedicated hardware for executing the processes of the first step S1, the second step S2, and the third step S3, respectively.
  • a processing unit may be provided.
  • a Raman spectrum will be described as a spectral spectrum.
  • other spectral spectrum for example, an infrared absorption spectrum can be suitably used for the spectral spectrum analysis method according to the present embodiment.
  • the first step S1 includes a spectrum acquisition step S11 for acquiring a hyperspectrum by measuring a Raman spectrum at each position of a specimen with a microscope, and a principal component analysis for analyzing the principal component of the hyperspectrum acquired in the spectrum acquisition step S11.
  • Step S12 principal component image creation step S13 for creating n principal component images using the result of the principal component analysis, and each principal component score from each principal component image created in the principal component image creation step S13
  • a score pattern extraction step (first extraction step) S14 for extracting the distribution pattern.
  • Specimen is, for example, a tissue section affixed to the surface of a slide glass.
  • the surface of the sample A is divided into a plurality of sections R, each section R is irradiated with laser light in order, and Raman scattering from the section R is detected by a CCD detector.
  • the Raman spectrum of each section is obtained by dispersing the detected Raman spectrum.
  • a hyper-Raman spectrum is acquired by collecting the Raman spectrum of all the divisions R.
  • the Raman spectrum V of each section R is It is expressed by a formula.
  • V C1 * V1 + C2 * V2 + C3 * V3 + ... + Cn * Vn
  • the Raman spectrum V is represented as a vector.
  • the contour Pi of the score distribution pattern is extracted from the i-th principal component image Xi created in the principal component image creation step S13.
  • edge detection processing is used to extract the contour Pi of the distribution pattern. That is, a function representing a change in score in the i-th principal component image Xi is calculated, a differential coefficient at each position of the calculated function is calculated, and a position where the calculated differential coefficient is larger than a predetermined threshold is defined as a contour Pi.
  • FIGS. 3D, 3E, and 3F show contours P1, P2, and contours of score distribution patterns extracted from the first principal component image X1, the second principal component image X2, and the third principal component image X3, respectively. P3 is shown.
  • the second step S2 includes a morphological image acquisition step S21 for acquiring a morphological image of the specimen A, and a morphological extraction step (second extraction step) S22 for extracting the morphological form of the specimen A from the morphological image.
  • a morphological image acquisition step S21 as shown in FIG. 4A, a morphological image Y obtained by photographing the specimen A using an optical microscope is acquired.
  • a phase difference image, differential interference image, or bright field image in which the tissue B included in the specimen A is clearly photographed is preferable.
  • the outline of the tissue B (for example, blood vessel, fiber tissue, etc.) included in the specimen A from the morphological image Y acquired in the morphological image acquisition step S21.
  • Q is extracted.
  • edge detection processing is used as in the above-described score pattern extraction step S14. That is, a function representing a change in luminance value in the morphological image Y is calculated, a differential coefficient at each position of the calculated function is calculated, and a position where the calculated differential coefficient is greater than a predetermined threshold is extracted as a contour Q To do.
  • the third step S3 is a collation step S31 for collating the contour Pi extracted from the i-th principal component image Xi with the contour Q extracted from the morphological image Y and searching for the contour Pi correlated with the contour Q, and And a reconstruction step S32 for reconstructing the Raman spectrum of each section R based on the degree i of the i-th principal component image Xi having the corresponding contour Pi in the collation step S31.
  • the contour Pi of the score distribution pattern is compared with the contour Q of the tissue B, and a contour Pi having a shape similar to the contour Q of the tissue B is searched.
  • a function fi (x, y) representing the shape of the contour Pi of the distribution pattern of each score and a function g (x, y) representing the shape of the contour Q of the tissue B are calculated, and each position (x, y) is calculated.
  • the difference between the two functions f (x, y) and gi (x, y) in is squared, and the calculated square value is integrated over all positions (x, y).
  • the horizontal direction of each of the images X1, X2, and X3 is the x axis and the vertical direction is the y axis.
  • the calculated integral value reflects the high correlation between the two functions f (x, y) and gi (x, y).
  • the integral value is equal to or less than a predetermined threshold value
  • the i-th principal component image Xi corresponding to the Pi is selected assuming that the two contours Pi and Q are sufficiently similar.
  • the i-th principal component image Xi whose score distribution pattern is sufficiently correlated with the form of the specimen A in the morphological image Y is extracted.
  • the Raman spectrum of each pixel is reconstructed using the i-th principal component constituting the i-th principal component image Xi extracted in the collation step S31. That is, as described above, the measured raw Raman spectrum V is composed of n main components C1 ⁇ V1, C2 ⁇ V2, C3 ⁇ V3,..., Cn ⁇ Vn. Of these n principal components C1 ⁇ V1, C2 ⁇ V2, C3 ⁇ V3,..., Cn ⁇ Vn, the principal components corresponding to the principal component image not extracted in the collation step S31 are removed.
  • the specimen A by comparing the n principal component images X1, X2, X3,... Xn obtained by principal component analysis of the hyper Raman spectrum with the morphological image Y, the specimen A
  • the principal components that are correlated sufficiently high with the form are extracted.
  • the principal components that are not extracted are principal components that have no correlation or a sufficiently low correlation with the form of the specimen A, and are derived from noise such as thermal noise of the CCD detector and scattered light from the slide glass. It is.
  • Raman scattered light equivalent to or weaker than weak noise such as thermal noise is included in higher-order principal components having a small eigenvalue.
  • strong noise such as scattered light from an optical element provided in a slide glass or a microscope is included in a low-order main component having a large eigenvalue.
  • the main component derived from the Raman scattered light of the sample A and the main component derived from noise are discriminated according to the degree of correlation with the form of the sample A. Principal components that correlate sufficiently high remain in the reconstructed Raman spectrum V ′, and principal components that are sufficiently low in correlation with the form of sample A are removed.

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Abstract

本発明の分光スペクトル解析方法は、標本の各位置において測定された分光スペクトルの集合を主成分分析することにより各分光スペクトルを構成する複数の次数の主成分を算出し（Ｓ１２）、各主成分の主成分スコアを対応する位置の値とした主成分画像を各次数について作成し（Ｓ１３）、各主成分画像から主成分スコアの分布パターンを抽出し（Ｓ１４）、標本を撮影した形態画像から標本の形態を抽出し（Ｓ２２）、主成分スコアの分布パターンが標本の形態と相関している主成分画像を抽出し（Ｓ３１）、抽出された主成分画像の次数と対応する次数の主成分を用いて各分光スペクトルを再構成する（Ｓ３２）。

Description

分光スペクトル解析方法
　本発明は、分光スペクトル解析方法に関するものである。
　従来、組織切片のような標本に含まれる成分の分析方法として分光測定方法が用いられている（例えば、非特許文献１および２参照。）。標本の各位置からのラマン散乱光を検出し、検出されたラマン散乱光を分光することによりラマンスペクトルを取得し、取得されたラマンスペクトルの集合を主成分分析することにより、標本の各位置における成分に関するスカラ値が得られる。
　取得されたラマンスペクトルには、標本が載置されているスライドガラスからの散乱光や光学素子の自家蛍光、検出器の熱雑音など、種々の雑音に由来する成分が含まれる。これら雑音に由来する成分を取得されたラマンスペクトルから除去する処理においても、主成分分析が有効に用いられている。すなわち、主成分分析により得られた高次の主成分を雑音に由来する成分であるとして高次の主成分を除去し、低次の主成分のみからラマンスペクトルを再構成することが行われている。
　しかしながら、主成分の次数の大小のみを基準にして雑音除去処理を行った場合、次のような問題が生じる。微弱なラマン散乱光に由来する主成分は高次に現れるため、雑音とともに除去されることとなり、例えば、標本中の微量の分子からのラマン散乱光の情報が損なわれてしまう。一方、スライドガラスからの散乱光のように比較的強い雑音は低次の主成分に現れるため、雑音であるにもかかわらず、除去されずに再構成されたラマンスペクトルの一部の成分として残ってしまう。このように、性質の異なる種々の雑音を一度の処理で適切に除去することができないという問題がある。
　本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、種々の雑音を一度に適切に除去して正確な分光スペクトルを得ることができる分光スペクトル解析方法を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
　本発明は、標本の各位置において測定された分光スペクトルの集合を主成分分析することにより各前記分光スペクトルを構成する複数の次数の主成分を算出する主成分分析ステップと、該主成分分析ステップにおいて得られた各前記主成分の主成分スコアを対応する前記位置の値とした主成分画像を各次数について作成する主成分画像作成ステップと、該主成分画像作成ステップにおいて作成された各主成分画像から前記主成分スコアの分布パターンを抽出する第１の抽出ステップと、前記標本を撮影した形態画像から前記標本の形態を抽出する第２の抽出ステップと、前記第１の抽出ステップにおいて抽出された前記主成分スコアの分布パターンを前記第２の抽出ステップにおいて抽出された前記標本の形態と照合し、該標本の形態と相関している前記分布パターンを有する主成分画像を抽出する照合ステップと、前記主成分分析ステップにおいて得られた主成分のうち前記照合ステップにおいて抽出された主成分画像の次数と対応する次数の主成分を用いて各前記分光スペクトルを再構成する再構成ステップとを含む分光スペクトル解析方法を提供する。
　本発明によれば、主成分分析ステップにおいて、標本の分光スペクトルの集合であるハイパーラマンスペクトルを主成分分析することにより、標本の各位置の分光スペクトルを構成している複数の主成分が分離され、主成分画像作成ステップにおいて、分離された主成分を用いて主成分画像が作成される。そして、第１の抽出ステップにおいて、各主成分画像から主成分スコアの分布パターンが抽出され、一方、第２の抽出ステップにおいて、標本の形態画像から標本の形態が抽出される。
　次に、照合ステップにおいて、複数の主成分画像のうち標本の形態と相関する主成分スコアの分布パターンを有する主成分画像が抽出される。すなわち、主成分分析ステップにおいて分離された複数の主成分のうち、標本の形態に由来している主成分と、雑音に由来している主成分とが判別される。再構成ステップにおいては、複数の主成分のうち、照合ステップにおいて標本の形態に由来していると判定された主成分のみを含む分光スペクトルが再構成される。これにより、種々の雑音を一度に適切に除去して正確な分光スペクトルを得ることができる。
　上記発明においては、前記分光スペクトルが、ラマンスペクトルまたは赤外吸収スペクトルであってもよい。
　このようにすることで、標本に含まれている特定の分子について解析することができる。
　上記発明においては、前記形態画像が、位相差画像、微分干渉画像または明視野画像であってもよい。
　このようにすることで、標本の形態が鮮明に撮影される位相差画像、微分干渉画像または明視野画像を用いることにより、第２の抽出ステップにおいて標本の形態をより正確に抽出することができる。
　本発明によれば、種々の雑音を一度に適切に除去して正確な分光スペクトルを得ることができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る分光スペクトル解析方法を示すフローチャートである。 図１の分光スペクトル解析方法の測定対象である標本とスペクトル取得ステップにおいてラマンスペクトルが測定される区画との関係を説明する図である。 （ａ），（ｂ），（ｃ）第１、第２および第３主成分画像と、（ｄ），（ｅ），（ｆ）各主成分画像から抽出された主成分スコアの分布パターンの輪郭とを示す図である。 （ａ）形態画像と（ｂ）該形態画像から抽出された組織の輪郭とを示す図である。
　以下に、本発明の一実施形態に係る分光スペクトル解析方法について図面を参照して説明する。
　本実施形態に係る分光スペクトル解析方法は、図１に示されるように、大別して、標本Ａの各位置において測定されたラマンスペクトルの集合（ハイパーラマンスペクトル）から主成分分析によって主成分画像を作成し該主成分画像を処理する第１の工程Ｓ１と、標本の形態画像を処理する第２の工程Ｓ２と、主成分画像および形態画像を用いてノイズ除去されたラマンスペクトルを得る第３の工程Ｓ３とを含んでいる。
　このような分光スペクトル解析方法は、標本の分光スペクトルおよび形態画像を取得可能な顕微鏡と、該顕微鏡によって取得された分光スペクトルおよび形態画像を解析する制御装置とを備える顕微鏡システムによって実施される。例えば、制御装置は、ＣＰＵ（中央処理装置）と記憶装置とを備えるコンピュータであり、記憶装置に、第１の工程Ｓ１から第３の工程までを実行させるためのプログラムが記憶されている。そして、プログラムがＣＰＵにより記憶装置から読み出されて実行されることにより、上記の第１の工程Ｓ１から第３の工程Ｓ３までの処理が実施されるようになっている。あるいは、制御装置は、第１の工程Ｓ１、第２の工程Ｓ２および第３の工程Ｓ３の処理をそれぞれ実行する専用のハードウェアとして、第１の処理部、第２の処理部および第３の処理部を備えていてもよい。
　なお、本実施形態においては、分光スペクトルとしてラマンスペクトルについて説明するが、本実施形態に係る分光スペクトル解析方法には他の分光スペクトル、例えば、赤外吸収スペクトルなども好適に用いることができる。
　第１の工程Ｓ１は、顕微鏡によって標本の各位置のラマンスペクトルを測定してハイパースペクトルを取得するスペクトル取得ステップＳ１１と、該スペクトル取得ステップＳ１１において取得されたハイパースペクトルを主成分分析する主成分分析ステップＳ１２と、主成分分析の結果を用いてｎ枚の主成分画像を作成する主成分画像作成ステップＳ１３と、該主成分画像作成ステップＳ１３において作成された各主成分画像から各主成分スコアの分布パターンを抽出するスコアパターン抽出ステップ（第１の抽出ステップ）Ｓ１４とを含んでいる。
　標本は、例えば、スライドガラスの表面に貼付された組織切片である。スペクトル取得ステップＳ１１においては、図２に示されるように、標本Ａの表面を複数の区画Ｒに分割し、各区画Ｒに順番にレーザ光を照射して区画Ｒからのラマン散乱をＣＣＤ検出器で検出し、検出されたラマンスペクトルを分光することにより各区画のラマンスペクトルを取得する。そして、全ての区画Ｒのラマンスペクトルを収集することにより、ハイパーラマンスペクトルを取得する。
　主成分分析ステップＳ１２においては、スペクトル取得ステップＳ１１において取得されたハイパーラマンスペクトルを主成分分析することにより１次からｎ次までの主成分を算出する。主成分分析により得られた第１主成分軸Ｖ１、第２主成分軸Ｖ２、第３主成分軸Ｖ３、…、および第ｎ主成分軸Ｖｎを用いて、各区画ＲのラマンスペクトルＶは下式で表わされる。
　Ｖ＝Ｃ１×Ｖ１＋Ｃ２×Ｖ２＋Ｃ３×Ｖ３＋…＋Ｃｎ×Ｖｎ
　ここで、ラマンスペクトルＶはベクトルとして表わされる。また、Ｃｉ（ｉ＝１，２，３，…，ｎ）は、第ｉ主成分軸Ｖｉと各区画ＲのラマンスペクトルＶとの内積として表わされる第ｉ主成分スコアであり、スカラ値である。
　スコアパターン抽出ステップＳ１４においては、主成分画像作成ステップＳ１３において作成された第ｉ主成分画像Ｘｉからスコアの分布パターンの輪郭Ｐｉを抽出する。分布パターンの輪郭Ｐｉの抽出には、例えば、エッジ検出処理が用いられる。すなわち、第ｉ主成分画像Ｘｉ内におけるスコアの変化を表す関数を計算し、算出された関数の各位置における微分係数を計算し、算出された微分係数が所定の閾値よりも大きい位置を輪郭Ｐｉとして抽出する。図３（ｄ），（ｅ），（ｆ）はそれぞれ、第１主成分画像Ｘ１、第２主成分画像Ｘ２、第３主成分画像Ｘ３から抽出されたスコアの分布パターンの輪郭Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３を示している。
　第２の工程Ｓ２は、標本Ａの形態画像を取得する形態画像取得ステップＳ２１と、形態画像から標本Ａの形態を抽出する形態抽出ステップ（第２の抽出ステップ）Ｓ２２とを含んでいる。
　形態画像取得ステップＳ２１においては、図４（ａ）に示されるように、光学顕微鏡を用いて標本Ａを撮影した形態画像Ｙを取得する。形態画像Ｙとしては、標本Ａに含まれる組織Ｂが鮮明に撮影される位相差画像、微分干渉画像または明視野画像が好ましい。
　形態抽出ステップＳ２２においては、形態画像取得ステップＳ２１において取得された形態画像Ｙから、図４（ｂ）に示されるように、標本Ａに含まれる組織Ｂ（例えば、血管、繊維組織など）の輪郭Ｑを抽出する。組織Ｂの輪郭Ｑの抽出には、例えば、上述したスコアパターン抽出ステップＳ１４と同様にエッジ検出処理が用いられる。すなわち、形態画像Ｙ内における輝度値の変化を表す関数を計算し、算出された関数の各位置における微分係数を計算し、算出された微分係数が所定の閾値よりも大きい位置を輪郭Ｑとして抽出する。
　第３の工程Ｓ３は、第ｉ主成分画像Ｘｉから抽出された輪郭Ｐｉを形態画像Ｙから抽出された輪郭Ｑと照合して該輪郭Ｑと相関する輪郭Ｐｉを検索する照合ステップＳ３１と、該照合ステップＳ３１において該当した輪郭Ｐｉを有する第ｉ主成分画像Ｘｉの次数ｉに基づいて各区画Ｒのラマンスペクトルを再構成する再構成ステップＳ３２とを含んでいる。
　照合ステップＳ３１においては、スコアの分布パターンの輪郭Ｐｉを組織Ｂの輪郭Ｑと比較し、該組織Ｂの輪郭Ｑと形状が類似している輪郭Ｐｉを検索する。例えば、各スコアの分布パターンの輪郭Ｐｉの形状を表す関数ｆｉ（ｘ，ｙ）と組織Ｂの輪郭Ｑの形状を表す関数ｇ（ｘ，ｙ）とを計算し、各位置（ｘ，ｙ）における２つの関数ｆ（ｘ，ｙ），ｇｉ（ｘ，ｙ）の差分を２乗し、算出された２乗値を全ての位置（ｘ，ｙ）にわたって積分する。なお、図３（ｆ）～（ｄ）において各画像Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３の横方向をｘ軸、縦方向をｙ軸としている。
　算出された積分値は、２つの関数ｆ（ｘ，ｙ），ｇｉ（ｘ，ｙ）の相関の高さを反映している。この積分値が所定の閾値以下であった場合、２つの輪郭Ｐｉ，Ｑが十分に類似しているとして当該Ｐｉに対応する第ｉ主成分画像Ｘｉを選択する。これにより、ｎ枚の主成分画像Ｘ１～Ｘｎのうち、形態画像Ｙ内の標本Ａの形態に対してスコアの分布パターンが十分に高く相関する第ｉ主成分画像Ｘｉが抽出される。
　再構成ステップＳ３２においては、照合ステップＳ３１において抽出された第ｉ主成分画像Ｘｉを構成する第ｉ主成分を用いて各画素のラマンスペクトルを再構成する。すなわち、上述したように、測定された生のラマンスペクトルＶはｎ個の主成分Ｃ１×Ｖ１，Ｃ２×Ｖ２，Ｃ３×Ｖ３，…，Ｃｎ×Ｖｎによって構成されている。これらｎ個の主成分Ｃ１×Ｖ１，Ｃ２×Ｖ２，Ｃ３×Ｖ３，…，Ｃｎ×Ｖｎのうち、照合ステップＳ３１において抽出されなかった主成分画像に対応する主成分を除去する。例えば、照合ステップＳ３１において、第１主成分画像、第２主成分画像、第３主成分画像および第７主成分画像が抽出された場合、各区画Ｒの再構成されたラマンスペクトルＶ’は、
　Ｖ’＝Ｃ１×Ｖ１＋Ｃ２×Ｖ２＋Ｃ３×Ｖ３＋Ｃ７×Ｖ７
となる。
　このように、本実施形態によれば、ハイパーラマンスペクトルを主成分分析して得られたｎ個の主成分画像Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，…Ｘｎを形態画像Ｙと比較することにより、標本Ａの形態に対して十分に高く相関する主成分を抽出している。抽出されなかった主成分は、標本Ａの形態に対して相関が無いまたは相関が十分に低い主成分であり、ＣＣＤ検出器の熱雑音やスライドガラスからの散乱光などの雑音に由来する主成分である。このような雑音に由来する主成分を、生のラマンスペクトルＶを構成するｎ個の主成分Ｃ１×Ｖ１，Ｃ２×Ｖ２，Ｃ３×Ｖ３，…，Ｃｎ×Ｖｎから除去することにより、標本Ａから発せられたラマン散乱光の正確なラマンスペクトルＶ’を得ることができる。
　また、熱雑音のような弱い雑音と同等またはそれよりもさらに弱いラマン散乱光は、固有値の小さい高次の主成分に含まれる。一方、スライドガラスや顕微鏡に備えられる光学素子からの散乱光のような強い雑音は固有値の大きい低次の主成分に含まれる。本実施形態によれば、次数に関わらず、標本Ａの形態との相関の程度によって標本Ａのラマン散乱光に由来する主成分と雑音に由来する主成分とを判別し、標本Ａの形態と十分に高く相関する主成分は再構成されたラマンスペクトルＶ’に残され、標本Ａの形態との相関が十分に低い主成分は除去される。すなわち、高次の主成分に現われる微弱なラマン散乱光の情報が雑音とともに損なわれてしまうことがなく、また、低次の主成分に現われる強い雑音も確実に除去される。これにより、種々の雑音を一度の処理で適切に除去することができるという利点がある。
Ｓ１１　スペクトル取得ステップ
Ｓ１２　主成分分析ステップ
Ｓ１３　主成分画像作成ステップ
Ｓ１４　スコアパターン抽出ステップ（第１の抽出ステップ）
Ｓ２１　形態画像取得ステップ
Ｓ２２　形態抽出ステップ（第２の抽出ステップ）
Ｓ３１　照合ステップ
Ｓ３２　再構成ステップ
Ａ　標本
Ｂ　組織
Ｒ　区画
Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３　主成分画像
Ｙ　形態画像
Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３　輪郭
Ｑ　輪郭

Claims (3)

  1. 　標本の各位置において測定された分光スペクトルの集合を主成分分析することにより各前記分光スペクトルを構成する複数の次数の主成分を算出する主成分分析ステップと、
    　該主成分分析ステップにおいて得られた各前記主成分の主成分スコアを対応する前記位置の値とした主成分画像を各次数について作成する主成分画像作成ステップと、
    　該主成分画像作成ステップにおいて作成された各主成分画像から前記主成分スコアの分布パターンを抽出する第１の抽出ステップと、
    　前記標本を撮影した形態画像から前記標本の形態を抽出する第２の抽出ステップと、
    　前記第１の抽出ステップにおいて抽出された前記主成分スコアの分布パターンを前記第２の抽出ステップにおいて抽出された前記標本の形態と照合し、該標本の形態と相関している前記分布パターンを有する主成分画像を抽出する照合ステップと、
    　前記主成分分析ステップにおいて得られた主成分のうち前記照合ステップにおいて抽出された主成分画像の次数と対応する次数の主成分を用いて各前記分光スペクトルを再構成する再構成ステップとを含む分光スペクトル解析方法。
  2. 　前記分光スペクトルが、ラマンスペクトルまたは赤外吸収スペクトルである請求項１に記載の分光スペクトル解析方法。
  3. 　前記形態画像が、位相差画像、微分干渉画像または明視野画像である請求項１または請求項２に記載の分光スペクトル解析方法。
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