JP6006036B2 - 分光スペクトル解析方法 - Google Patents

Description

本発明は、分光スペクトル解析方法に関するものである。

従来、組織切片のような標本に含まれる成分の分析方法として分光測定方法が用いられている（例えば、非特許文献１および２参照。）。標本の各位置からのラマン散乱光を検出し、検出されたラマン散乱光を分光することによりラマンスペクトルを取得し、取得されたラマンスペクトルの集合を主成分分析することにより、標本の各位置における成分に関するスカラ値が得られる。

取得されたラマンスペクトルには、標本が載置されているスライドガラスからの散乱光や光学素子の自家蛍光、検出器の熱雑音など、種々の雑音に由来する成分が含まれる。これら雑音に由来する成分を取得されたラマンスペクトルから除去する処理においても、主成分分析が有効に用いられている。すなわち、主成分分析により得られた高次の主成分を雑音に由来する成分であるとして高次の主成分を除去し、低次の主成分のみからラマンスペクトルを再構成することが行われている。

Slobodan Sasic 外２名，"A comparison of Raman chemical images produced by univariate and multivariate data processing−a simulation with an example from pharmaceutical practice"，Analyst，129，pp．1001-1007，2004年 Joanne Hutchings 外５名，"The potential for histological screening using a combination of rapid Raman mapping and principal component analysis"，Journal of Biophotonics，vol．2，no．1-2，pp．91-103，2009年

しかしながら、主成分の次数の大小のみを基準にして雑音除去処理を行った場合、次のような問題が生じる。微弱なラマン散乱光に由来する主成分は高次に現れるため、雑音とともに除去されることとなり、例えば、標本中の微量の分子からのラマン散乱光の情報が損なわれてしまう。一方、スライドガラスからの散乱光のように比較的強い雑音は低次の主成分に現れるため、雑音であるにもかかわらず、除去されずに再構成されたラマンスペクトルの一部の成分として残ってしまう。このように、性質の異なる種々の雑音を一度の処理で適切に除去することができないという問題がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、種々の雑音を一度に適切に除去して正確な分光スペクトルを得ることができる分光スペクトル解析方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、標本の各位置において測定された分光スペクトルの集合を主成分分析することにより各前記分光スペクトルを構成する複数の次数の主成分を算出する主成分分析ステップと、該主成分分析ステップにおいて得られた各前記主成分の主成分スコアを対応する前記位置の値とした主成分画像を各次数について作成する主成分画像作成ステップと、該主成分画像作成ステップにおいて作成された各主成分画像から前記主成分スコアの分布パターンの輪郭を抽出する第１の抽出ステップと、前記標本を撮影した形態画像から前記標本の形態の輪郭を抽出する第２の抽出ステップと、前記第１の抽出ステップにおいて抽出された前記主成分スコアの分布パターンの輪郭を前記第２の抽出ステップにおいて抽出された前記標本の形態の輪郭と照合し、該標本の形態の輪郭と相関している前記分布パターンの輪郭を有する主成分画像を抽出する照合ステップと、前記主成分分析ステップにおいて得られた主成分のうち前記照合ステップにおいて抽出された主成分画像の次数と対応する次数の主成分を用いて各前記分光スペクトルを再構成する再構成ステップとを含む分光スペクトル解析方法を提供する。

本発明によれば、主成分分析ステップにおいて、標本の分光スペクトルの集合であるハイパーラマンスペクトルを主成分分析することにより、標本の各位置の分光スペクトルを構成している複数の主成分が分離され、主成分画像作成ステップにおいて、分離された主成分を用いて主成分画像が作成される。そして、第１の抽出ステップにおいて、各主成分画像から主成分スコアの分布パターンが抽出され、一方、第２の抽出ステップにおいて、標本の形態画像から標本の形態が抽出される。

次に、照合ステップにおいて、複数の主成分画像のうち標本の形態と相関する主成分スコアの分布パターンを有する主成分画像が抽出される。すなわち、主成分分析ステップにおいて分離された複数の主成分のうち、標本の形態に由来している主成分と、雑音に由来している主成分とが判別される。再構成ステップにおいては、複数の主成分のうち、照合ステップにおいて標本の形態に由来していると判定された主成分のみを含む分光スペクトルが再構成される。これにより、種々の雑音を一度に適切に除去して正確な分光スペクトルを得ることができる。

上記発明においては、前記分光スペクトルが、ラマンスペクトルまたは赤外吸収スペクトルであってもよい。
このようにすることで、標本に含まれている特定の分子について解析することができる。

また、上記発明においては、前記形態画像が、位相差画像、微分干渉画像または明視野画像であってもよい。
このようにすることで、標本の形態が鮮明に撮影される位相差画像、微分干渉画像または明視野画像を用いることにより、第２の抽出ステップにおいて標本の形態をより正確に抽出することができる。

本発明によれば、種々の雑音を一度に適切に除去して正確な分光スペクトルを得ることができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る分光スペクトル解析方法を示すフローチャートである。 図１の分光スペクトル解析方法の測定対象である標本とスペクトル取得ステップにおいてラマンスペクトルが測定される区画との関係を説明する図である。 （ａ），（ｂ），（ｃ）第１、第２および第３主成分画像と、（ｄ），（ｅ），（ｆ）各主成分画像から抽出された主成分スコアの分布パターンの輪郭とを示す図である。 （ａ）形態画像と（ｂ）該形態画像から抽出された組織の輪郭とを示す図である。

以下に、本発明の一実施形態に係る分光スペクトル解析方法について図面を参照して説明する。
本実施形態に係る分光スペクトル解析方法は、図１に示されるように、大別して、標本Ａの各位置において測定されたラマンスペクトルの集合（ハイパーラマンスペクトル）から主成分分析によって主成分画像を作成し該主成分画像を処理する第１の工程Ｓ１と、標本の形態画像を処理する第２の工程Ｓ２と、主成分画像および形態画像を用いてノイズ除去されたラマンスペクトルを得る第３の工程Ｓ３とを含んでいる。

なお、本実施形態においては、分光スペクトルとしてラマンスペクトルについて説明するが、本実施形態に係る分光スペクトル解析方法には他の分光スペクトル、例えば、赤外吸収スペクトルなども好適に用いることができる。

第１の工程Ｓ１は、顕微鏡によって標本の各位置のラマンスペクトルを測定してハイパースペクトルを取得するスペクトル取得ステップＳ１１と、該スペクトル取得ステップにおいて取得されたハイパースペクトルを主成分分析する主成分分析ステップＳ１２と、主成分分析の結果を用いてｎ枚の主成分画像を作成する主成分画像作成ステップＳ１３と、該主成分画像作成ステップＳ１３において作成された各主成分画像から各主成分スコアの分布パターンを抽出するスコアパターン抽出ステップ（第１の抽出ステップ）Ｓ１４とを含んでいる。

標本は、例えば、スライドガラスの表面に貼付された組織切片である。スペクトル取得ステップＳ１１においては、図２に示されるように、標本Ａの表面を複数の区画Ｒに分割し、各区画Ｒに順番にレーザ光を照射して区画Ｒからのラマン散乱をＣＣＤ検出器で検出し、検出されたラマンスペクトルを分光することにより各区画のラマンスペクトルを取得する。そして、全ての区画Ｒのラマンスペクトルを収集することにより、ハイパーラマンスペクトルを取得する。

主成分分析ステップＳ１２においては、スペクトル取得ステップＳ１１において取得されたハイパーラマンスペクトルを主成分分析することにより１次からｎ次までの主成分を算出する。主成分分析により得られた第１主成分軸Ｖ１、第２主成分軸Ｖ２、第３主成分軸Ｖ３、…、および第ｎ主成分軸Ｖｎを用いて、各区画ＲのラマンスペクトルＶは下式で表わされる。
Ｖ＝Ｃ１×Ｖ１＋Ｃ２×Ｖ２＋Ｃ３×Ｖ３＋…＋Ｃｎ×Ｖｎ
ここで、ラマンスペクトルＶはベクトルとして表わされる。また、Ｃｉ（ｉ＝１，２，３，…，ｎ）は、第ｉ主成分軸Ｖｉと各区画ＲのラマンスペクトルＶとの内積として表わされる第ｉ主成分スコアであり、スカラ値である。

スコアパターン抽出ステップＳ１４においては、主成分画像作成ステップＳ１３において作成された第ｉ主成分画像Ｘｉからスコアの分布パターンの輪郭Ｐｉを抽出する。分布パターンの輪郭Ｐｉの抽出には、例えば、エッジ検出処理が用いられる。すなわち、第ｉ主成分画像Ｘｉ内におけるスコアの変化を表す関数を計算し、算出された関数の各位置における微分係数を計算し、算出された微分係数が所定の閾値よりも大きい位置を輪郭Ｐｉとして抽出する。図３（ｄ），（ｅ），（ｆ）はそれぞれ、第１主成分画像Ｘ１、第２主成分画像Ｘ２、第３主成分画像Ｘ３から抽出されたスコアの分布パターンの輪郭Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３を示している。

第２の工程Ｓ２は、標本Ａの形態画像を取得する形態画像取得ステップＳ２１と、形態画像から標本Ａの形態を抽出する形態抽出ステップ（第２の抽出ステップ）Ｓ２２とを含んでいる。
形態画像取得ステップＳ２１においては、図４（ａ）に示されるように、光学顕微鏡を用いて標本Ａを撮影した形態画像Ｙを取得する。形態画像Ｙとしては、標本Ａに含まれる組織Ｂが鮮明に撮影される位相差画像、微分干渉画像または明視野画像が好ましい。

形態抽出ステップＳ２２においては、形態画像取得ステップＳ２１において取得された形態画像Ｙから、図４（ｂ）に示されるように、標本Ａに含まれる組織Ｂ（例えば、血管、繊維組織など）の輪郭Ｑを抽出する。組織Ｂの輪郭Ｑの抽出には、例えば、上述したスコアパターン抽出ステップＳ１４と同様にエッジ検出処理が用いられる。すなわち、形態画像Ｙ内における輝度値の変化を表す関数を計算し、算出された関数の各位置における微分係数を計算し、算出された微分係数が所定の閾値よりも大きい位置を輪郭Ｑとして抽出する。

第３の工程Ｓ３は、第ｉ主成分画像Ｘｉから抽出された輪郭Ｐｉを形態画像Ｙから抽出された輪郭Ｑと照合して該輪郭Ｑと相関する輪郭Ｐｉを検索する照合ステップＳ３１と、該照合ステップＳ３１において該当した輪郭Ｐｉを有する第ｉ主成分画像Ｘｉの次数ｉに基づいて各区画Ｒのラマンスペクトルを再構成する再構成ステップＳ３２とを含んでいる。

照合ステップＳ３１においては、スコアの分布パターンの輪郭Ｐｉを組織Ｂの輪郭Ｑと比較し、該組織Ｂの輪郭Ｑと形状が類似している輪郭Ｐｉを検索する。例えば、各スコアの分布パターンの輪郭Ｐｉの形状を表す関数ｆｉ（ｘ，ｙ）と組織Ｂの輪郭Ｑの形状を表す関数ｇ（ｘ，ｙ）とを計算し、各位置（ｘ，ｙ）における２つの関数ｆ（ｘ，ｙ），ｇｉ（ｘ，ｙ）の差分を２乗し、算出された２乗値を全ての位置（ｘ，ｙ）にわたって積分する。なお、図３（ｆ）〜（ｄ）において各画像Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３の横方向をｘ軸、縦方向をｙ軸としている。

算出された積分値は、２つの関数ｆ（ｘ，ｙ），ｇｉ（ｘ，ｙ）の相関の高さを反映している。この積分値が所定の閾値以下であった場合、２つの輪郭Ｐｉ，Ｑが十分に類似しているとして当該Ｐｉに対応する第ｉ主成分画像Ｘｉを選択する。これにより、ｎ枚の主成分画像Ｘ１〜Ｘｎのうち、形態画像Ｙ内の標本Ａの形態に対してスコアの分布パターンが十分に高く相関する第ｉ主成分画像Ｘｉが抽出される。

再構成ステップＳ３２においては、照合ステップＳ３１において抽出された第ｉ主成分画像Ｘｉを構成する第ｉ主成分を用いて各画素のラマンスペクトルを再構成する。すなわち、上述したように、測定された生のラマンスペクトルＶはｎ個の主成分Ｃ１×Ｖ１，Ｃ２×Ｖ２，Ｃ３×Ｖ３，…，Ｃｎ×Ｖｎによって構成されている。これらｎ個の主成分Ｃ１×Ｖ１，Ｃ２×Ｖ２，Ｃ３×Ｖ３，…，Ｃｎ×Ｖｎのうち、照合ステップＳ３１において抽出されなかった主成分画像に対応する主成分を除去する。例えば、照合ステップＳ３１において、第１主成分画像、第２主成分画像、第３主成分画像および第７主成分画像が抽出された場合、各区画Ｒの再構成されたラマンスペクトルＶ’は、
Ｖ’＝Ｃ１×Ｖ１＋Ｃ２×Ｖ２＋Ｃ３×Ｖ３＋Ｃ７×Ｖ７
となる。

このように、本実施形態によれば、ハイパーラマンスペクトルを主成分分析して得られたｎ個の主成分画像Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，…Ｘｎを形態画像Ｙと比較することにより、標本Ａの形態に対して十分に高く相関する主成分を抽出している。抽出されなかった主成分は、標本Ａの形態に対して相関が無いまたは相関が十分に低い主成分であり、ＣＣＤ検出器の熱雑音やスライドガラスからの散乱光などの雑音に由来する主成分である。このような雑音に由来する主成分を生のラマンスペクトルＶを構成するｎ個の主成分Ｃ１×Ｖ１，Ｃ２×Ｖ２，Ｃ３×Ｖ３，…，Ｃｎ×Ｖｎから除去することにより、標本Ａから発せられたラマン散乱光の正確なラマンスペクトルＶ’を得ることができる。

また、熱雑音のような弱い雑音と同等またはそれよりもさらに弱いラマン散乱光は、固有値の小さい高次の主成分に含まれる。一方、スライドガラスや顕微鏡に備えられる光学素子からの散乱光のような強い雑音は固有値の大きい低次の主成分に含まれる。本実施形態によれば、次数に関わらず、標本Ａの形態との相関の程度によって標本Ａのラマン散乱光に由来する主成分と雑音に由来する主成分とを判別し、標本Ａの形態と十分に高く相関する主成分は再構成されたラマンスペクトルＶ’に残され、標本Ａの形態との相関が十分に低い主成分は除去される。すなわち、高次の主成分に現われる微弱なラマン散乱光の情報が雑音とともに損なわれてしまうことがなく、また、低次の主成分に現われる強い雑音も確実に除去される。これにより、種々の雑音を一度の処理で適切に除去することができるという利点がある。

Ｓ１１ スペクトル取得ステップ
Ｓ１２ 主成分分析ステップ
Ｓ１３ 主成分画像作成ステップ
Ｓ１４ スコアパターン抽出ステップ（第１の抽出ステップ）
Ｓ２１ 形態画像取得ステップ
Ｓ２２ 形態抽出ステップ（第２の抽出ステップ）
Ｓ３１ 照合ステップ
Ｓ３２ 再構成ステップ
Ａ 標本
Ｂ 組織
Ｒ 区画
Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３ 主成分画像
Ｙ 形態画像
Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３ 輪郭
Ｑ 輪郭

Claims (3)

1. 標本の各位置において測定された分光スペクトルの集合を主成分分析することにより各前記分光スペクトルを構成する複数の次数の主成分を算出する主成分分析ステップと、
   該主成分分析ステップにおいて得られた各前記主成分の主成分スコアを対応する前記位置の値とした主成分画像を各次数について作成する主成分画像作成ステップと、
   該主成分画像作成ステップにおいて作成された各主成分画像から前記主成分スコアの分布パターンの輪郭を抽出する第１の抽出ステップと、
   前記標本を撮影した形態画像から前記標本の形態の輪郭を抽出する第２の抽出ステップと、
   前記第１の抽出ステップにおいて抽出された前記主成分スコアの分布パターンの輪郭を前記第２の抽出ステップにおいて抽出された前記標本の形態の輪郭と照合し、該標本の形態の輪郭と相関している前記分布パターンの輪郭を有する主成分画像を抽出する照合ステップと、
   前記主成分分析ステップにおいて得られた主成分のうち前記照合ステップにおいて抽出された主成分画像の次数と対応する次数の主成分を用いて各前記分光スペクトルを再構成する再構成ステップとを含む分光スペクトル解析方法。
2. 前記分光スペクトルが、ラマンスペクトルまたは赤外吸収スペクトルである請求項１に記載の分光スペクトル解析方法。
3. 前記形態画像が、位相差画像、微分干渉画像または明視野画像である請求項１または請求項２に記載の分光スペクトル解析方法。

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