JP5372137B2 - ラマン散乱を用いた生体組織イメージング - Google Patents
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Description
(1)心筋組織と血管及び/又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料に励起光を照射する工程;
(2)該試料からのラマン散乱光を検出する工程;
(3)該検出されたラマン散乱光を、心筋細胞と赤血球及び/又はコラーゲンに特徴的なラマン散乱スペクトルとを指標として解析し、画像化する工程;
を含む、心筋組織と血管及び/又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料をイメージングする方法。
(1)心筋組織と血管及び/又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料に励起光を照射する工程;
(2)該試料からのラマン散乱光を検出する工程;
(3)該検出されたラマン散乱光を、心筋細胞と赤血球及び/又はコラーゲンに特徴的なラマン散乱スペクトルとを指標として解析し、画像化する工程。
後述する実施例で使用した検体は、次のようにして作成された。心臓全体の検体(n=12)は、100%酸素供給下で全身麻酔の下、若い成体ウィスターラット(体重250−300g、雌)から取り出された。下大静脈から塩化カリウム(0.2mEq)を投与して心筋細胞の収縮を止めた後、心臓からのすべての血管を結紮し、血液で冠状血管を満たして心臓を摘出した。心臓はタイロード溶液(4℃、pH7.4)に静置し摘出後の代謝分解を最小限にした。酸素化型の血液及び脱酸素化型の血液は、各々3匹のラットの左心房及び右心房から得た。
生きたまま調製された損傷のないex-vivo心臓の心外膜下から得られた心筋細胞の細胞質のラマンスペクトルをレーザーラマンコンフォーカル顕微鏡(RAMAN-11; Nanophoton、大阪、日本)を用いて測定した。取り出された心臓を顕微鏡のステージ上の石英基盤の上に置いた後、心筋細胞を確認するために、自家蛍光画像を利用した。自家蛍光は、330〜380nm波長で励起し、420nm波長以上で検出した(図1A)。これにより心筋細胞を同定し、焦点を合わせた後、フィルターを変更しラマンスペクトルを採取した(図1C)。レーザー強度は20mW、照射時間は5秒であった。使用した顕微鏡の構造は、Harada, Y. et al., 2008, Proc. SPIE 、vol. 6853,685308に図示されている。心筋細胞のラマンスペクトルは、いくつかのラマンバンドを含み、主として600, 643, 690, 751, 1003, 1130, 1171, 1307, 1336, 1356, 1396, 1450, 1582, 1657, 2854 及び 2932 cm-1である(図1A)。その中で、751 (ν 15 mode)、1130 (ν 22 mode) 及び 1582 (ν 19 mode) cm-1がヘムタンパク質の中心にあるポルフィリン環から生じた特定の振動モードと考えられる。ヘムタンパク質の中でも、還元型のシトクロムb5及びcのピークが心筋細胞のピークとよく対応する。シトクロムb5及びcは、代表的なヘムタンパク質で電子吸収帯の一つであるβバンドを520〜530nm波長にもつ。ミオグロビンは本実施例の条件下では心筋細胞のスペクトルにほとんど寄与していないと考えられる。なぜなら、光乖離現象によってオキシミオグロビンのラマンスペクトルを得ることが難しいことと、デオキシミオグロビンはスペクトルのパターンに違いがあるからである。
シトクロムのラマンスペクトルは、ヘモグロビンのラマンスペクトルと多くの共通点を有する。ヘモグロビンによる心筋細胞のシトクロムの検出に干渉する可能性を除外するためには、心臓組織中の二つのヘムタンパク質を分別する必要がある。酸素化型及び脱酸素化型赤血球は、それぞれ左心房及び右心房から、ヘパリン入りシリンジに採取した。それぞれ少量を石英基盤上に滴下し、自家蛍光画像で赤血球の形態を確認し、ラマンスペクトルを採取した。図2Aは心筋細胞、酸素化型赤血球及び脱酸素化型赤血球についてのラマンスペクトルを示す。これらの特徴的なラマンバンドは、報告されている532nmの励起光を使った生理学的条件下で得られたスペクトルとよく対応する。特にν4モード(酸素化マーカーバンド、1350-1380 cm-1 レンジ)及びν19とν10モード(1500-1650 cm-1レンジ)に対応したバンドである。これらのラマンバンドは赤血球中のヘモグロビンから生じている。図2Bは心外膜下の心筋細胞とその近傍の小血管の自家蛍光画像である。自家蛍光は、330〜380nm波長で励起し、420nm波長以上で検出した。図2Cは図2Bで示された心外膜下領域から得られたそれぞれの特徴的なラマンバンドでのラマンバンドイメージを示している。心筋細胞を表す1130 (ν22) cm-1とオキシヘモグロビンを表す 1582 (ν19)及び 1637 (ν10) cm-1とは、別々にイメージされ得るが、デオキシヘモグロビン単独でイメージすることは、オキシヘモグロビンの1582 cm-1 でのバンドの裾の部分で邪魔されるため不可能である。オキシ及びデオキシヘモグロビンの両者が1545 cm-1のバンドを指標とすることで画像化される。
通常の組織学的検証方法(図3A-C)と合わせて心筋梗塞領域の凍結融解セクションについてラマン解析を行った。組織学的検証は、ラマン解析用との連続凍結切片におけるヘマトキシリンエオジン染色およびマッソントリクロム染色を用いて行った。これらの染色法により、線維組織で置換された心筋梗塞領域を同定することができた。図3Eは線維性組織(図3Dにアスタリスクで表示されている)から得られた代表的なラマンスペクトルを示している。そのラマンスペクトルはI型コラーゲンのものと非常に一致している。PCAが図3Dで示された領域から得られた19,332(108x179ピクセル)個のラマンスペクトルについて行われ、心筋細胞と線維性組織のそれぞれの特徴的なラマンバンドが得られた。第2主成分スコアイメージ(図3F)は、心筋細胞とそれを取り巻くコラーゲンをはっきりと映し出し、それは連続するヘマトキシリンエオジン染色のイメージ(図3C)とよく合致していた。第2主成分スペクトルにおける正のバンドは、還元型b及びc型シトクロム(751, 1130, 及び 1582 cm-1)及び脂質(2854 cm-1, CH2 伸縮モード)に関連するものである。一方負のバンドはI型コラーゲン(857, 1250, 1687, 及び2945 cm-1)の存在に関連性のあるものである。
Claims (4)
- (A)心筋組織と血管及び/又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料にレーザ光である励起光を照射する手段、(B)前記試料からのラマン散乱光を検出する手段、(C)該検出したラマン散乱光を心筋細胞と赤血球及び/又はコラーゲンに特徴的なラマン散乱スペクトルを指標として画像処理する手段、(D)心筋組織と血管及び/又はコラーゲンリッチ領域を区別して表示する表示手段を備える心筋組織と血管及び/又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料をイメージングするためのイメージング装置であって、前記励起光を照射する手段が400〜600nmの波長を有する励起光を照射する手段であり、前記画像処理する手段が
(i) 心筋細胞をラマンシフト751/cm、1130/cm及び1582/cmからなる群から選ばれる少なくとも1つのピークを指標とし、
(ii) 酸素化赤血球または動脈をラマンシフト1371/cm、1582/cm及び1637/cmからなる群から選ばれる少なくとも1つのピークを指標とし、
(iii) 脱酸素化赤血球又は静脈をラマンシフト1355/cm、1545/cm及び1601/cmからなる群から選ばれる少なくとも1つのピークを指標とし、
(iv) 心筋組織がその機能を失った領域をI型コラーゲンのラマンスペクトルを指標として画像処理する手段である、装置 - 前記血管が動脈と静脈を含み、前記装置が動脈と静脈を区別して表示する表示手段を備える、請求項1に記載の装置。
- 前記コラーゲンリッチ領域が心臓において心筋細胞が脱落して心筋組織がその機能を失った領域を意味し、前記装置が正常な心筋組織と心筋組織がその機能を失った領域を区別して表示する表示手段を備える、請求項1に記載の装置。
- 外科手術時に心臓に対してレーザ光の照射し、心臓からのラマン散乱光を検出し、正常な心筋組織、機能を失った心筋組織領域、静脈及び動脈を表示することができる、請求項1に記載の装置。
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