JP2004053498A - 顕微鏡画像解析装置とその画像解析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、明視野で２次元スライス画像を得ることで物体を３次元的に解析できる顕微鏡画像解析装置とその画像解法析方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明の顕微鏡画像解析装置と顕微鏡画像解析方法は、載置テーブル６の高さ方向の移動に伴ってカメラ部９が２次元の顕微鏡画像の撮影を繰り返し、各高さの顕微鏡画像に対して画像処理部が所定の周波数成分情報を抽出するとともに、変化点抽出手段が高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出し、変化点とその対応する位置情報に基づいて、周波数成分が支配的となる被写体の存在情報を得ることを特徴とする。
【選択図】 図１
【解決手段】本発明の顕微鏡画像解析装置と顕微鏡画像解析方法は、載置テーブル６の高さ方向の移動に伴ってカメラ部９が２次元の顕微鏡画像の撮影を繰り返し、各高さの顕微鏡画像に対して画像処理部が所定の周波数成分情報を抽出するとともに、変化点抽出手段が高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出し、変化点とその対応する位置情報に基づいて、周波数成分が支配的となる被写体の存在情報を得ることを特徴とする。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２次元スライス画像を複数枚撮影することにより細胞のような微小物体を生きたまま観察することができ、更に微小な物体とこの微小物体とを区別することができ、これらの存在情報を抽出可能な顕微鏡画像解析装置、及びその画像解析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近の医療の進歩は目覚しい。ヒトゲノムの解読は一段落し、遺伝子治療も実用化の段階を迎えようとしている。そして、今もっとも多くの期待を寄せられているのが再生医療である。米国のウィスコンシン大学が１９９８年にヒトの幹細胞の作製に成功し、不可能と思われていた再生医療がにわかに現実味を帯びてきている。よく知られているように成長した細胞は、分裂しても皮膚の細胞は皮膚、筋肉の細胞は筋肉にしかなれない。しかし、この幹細胞は様々の細胞に変化し得るもので再生医療の中核となるものである。
【０００３】
ところで、幹細胞には、受精卵から作る胚性幹細胞（ＥＳ細胞）と、体内の組織にある体性幹細胞の２種類がある。胚性幹細胞は多様な組織に成長し得る可能性を秘めていて体性幹細胞より使い易いが、再生医療に用いる場合には拒絶反応や倫理上の問題がある。そこで、骨髄や骨盤等から採取できる体性幹細胞によって再生医療を進められないかに関心が集まり、先端的な研究が進められている。
最近報告されたところでは、皮膚移植のために骨髄の体性幹細胞を皮膚に変えたり、心筋梗塞を起こした心臓に体性幹細胞を移植して新しい血管をつくる等の治療が試験的に行われている。
【０００４】
さて、このような再生医療の進展のためには再生医療を支える周辺技術の進歩が欠かせない。中でも処理対象の細胞を観察する観察装置は最も基本的な技術であり、従来、蛍光顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡が使用されてきた。これらは試料を蛍光色素で染色しその蛍光像を取得し、その蛍光像取得情報をパーソナルコンピュータにより画像処理し、それをモニタに表示するものである。図１１（ａ）は従来の蛍光顕微鏡システムの構成図、図１１（ｂ）は従来の蛍光微分顕微鏡装置の構成図である。図１１（ａ）において、１０１は蛍光顕微鏡、１０２はモニタ、１０３はパーソナルコンピュータ（以下パソコン）、１０４は試料である。
【０００５】
従来の蛍光顕微鏡１０１は、試料１０４を蛍光色素で染色し、その蛍光像が取得されると、その蛍光像取得信号ＳＩＮがパソコン１０３に出力される。蛍光像取得信号ＳＩＮはパソコン１０３内で信号処理されて蛍光像取得データに変換され、当該データはパソコン１０３によりモニタ１０２を駆動する画像表示信号に変換される。これによって、モニタ１０２に試料１０４の蛍光像が表示される。なお、蛍光顕微鏡１０１に代えて、共焦点レーザ顕微鏡を用いるのでもまったく同一である。蛍光色素で染色するのは、染色無しで細胞を観察した場合にはコントラストが低すぎ、細胞の画像の取得などできないためである。しかし、こうした染色方法の多くは細胞を殺してしまう。そこで最近では生きた細胞を観察するために、生体染色用の色素（ＧＰＦ）が開発され、細胞内のイオン濃度動態や、細胞電位の測定を生きた状態の細胞で観察できるようになった。しかし、蛍光像取得信号ＳＩＮをパソコン１０３によって画像処理した場合には、蛍光染色された細胞を人間の感覚としてみたとき、単なる濃淡画像としてしか捉えることしかできなかった。しかも、再生医療においては蛍光染色された細胞を使うことはできない。
【０００６】
そこで、蛍光顕微鏡または共焦点レーザ顕微鏡を改良した蛍光微分顕微鏡装置（特開平７−２４４２３９号公報）が提案された。図１１（ｂ）において、１０５は試料の蛍光像を取得する画像取得手段、１０６は蛍光像を微分処理して蛍光微分データＤＯＵＴを出力する微分演算手段、１０７は蛍光微分データＤＯＵＴに基づいて蛍光画像を表示する表示手段、１０８は試料である。
【０００７】
画像取得手段１０５には、蛍光顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡が用いられる。また、微分演算手段１０６は、試料１０８の蛍光像取得信号ＳＩＮをＡ／Ｄ変換して蛍光像取得データＤＩＮに変換する信号処理部１０６Ａと、蛍光像取得データＤＩＮを平滑化するデータ平滑部１０６Ｂと、平滑化された蛍光像取得データＤＩＮを二次微分して蛍光微分データＤＯＵＴを出力する微分演算部１０６Ｃとから構成されるものである。これにより、この従来の蛍光微分顕微鏡装置は、試料１０８の蛍光微分画像情報を生成し、人間の感覚として細胞内外の微細構造を凹凸として感じる陰影像として観察することができるようになる。しかしこの蛍光微分顕微鏡装置も、蛍光色素で染色しなければ役に立たたないものであった。
【０００８】
また、このほか試料に染色をすることなく、透過光路上の位相差をコントラストまたは凹凸像として検出する位相差顕微鏡も開発されている。この位相差顕微鏡は、細胞内の組織構造に染色することなく、細胞の観察が可能である。しかし、位相差顕微鏡のシステムには、比較的強い透過光が必要であり、強力な照明光源や収束レンズ等の光学系を追加する必要があった。またコントラストや凹凸像は検出できるものの、例えば光軸方向（高さ方向）に何層か細胞等が積み重なったような状態を検出したときには、高さ方向の全情報が重なり、一体どのような組織構造なのか分からないものであった。また、光軸方向の各位置における断層データを得るのは難しいものであった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
以上説明したように、蛍光顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡は、細胞を観察するとき蛍光色素で染色する必要があり、多くは細胞を殺してしまうものであった。生体染色用の色素を用いることができるが、蛍光染色された細胞は再生医療には使えない。すなわち、蛍光顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡は基本的に再生医療には用いることができないものであった。この点、明視野透過顕微鏡なら無処理のまま観察できるが、そのままでは細胞を観察することはできない。
【００１０】
また、蛍光顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡によって得られた画像は、人間の感覚として立体感を感じさせるものでなく、単に濃淡画像にすぎないものであった。
しかも取得されるデータは空間の測定点に１対１で対応しており、試料全体を測定するためには空間全体を走査しなければならなかった。従って蛍光顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡を使って試料を観察するのは、狭い領域に限られ、広範な領域を観察するといったニーズには適していないものであった。しかもそのデータ量は膨大であり、全空間を順次走査する必要から高速測定は難しいものであった。
レーザ光源にピンホールアレイを設け、ピンホールで多点測定を行う技術も提案されているが、高速測定には限界があるものであった。
【００１１】
また、従来の蛍光微分顕微鏡装置は試料の蛍光微分画像情報を生成し、人間の感覚として微細構造を凹凸と感じる陰影像として観察できるようになるが、蛍光顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡を用いるもので、基本的には上述した蛍光顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡と同様の問題を抱えるものであった。蛍光色素で染色しなければ、せっかくの装置も役に立たないし細胞の観察はできない。従って、再生医療には用いることができないものであった。
【００１２】
位相差顕微鏡は、細胞内の組織構造に染色することなく、細胞の観察が可能であるが、強力な照明光源や収束レンズ等の光学系を追加する必要があった。そして光軸方向に何層か細胞が積み重なったような状態を検出する場合、光軸方向で検出情報が混ざって、一体どのような組織構造なのか分からなくなるものであった。また、光軸方向の断層データを得るのは難しく、当然３次元情報を得るのは困難であった。
【００１３】
そこで本発明は、明視野で複数の２次元スライス画像を得ることで物体を３次元的に解析できる顕微鏡画像の画像解法析方法を提供することを目的とする。
【００１４】
また、本発明は、明視野で複数の２次元スライス画像を得ることで物体を３次元的に解析できる顕微鏡画像解析装置を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
以上の課題を解決するために本発明の顕微鏡画像解析装置は、載置テーブルの高さ方向の移動に伴ってカメラ部が２次元の顕微鏡画像の撮影を繰り返し、各高さの顕微鏡画像に対して画像処理部が所定の周波数成分情報を抽出するとともに、変化点抽出手段が高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出し、変化点とその対応する位置情報に基づいて、周波数成分が支配的となる被写体の存在情報を得ることを特徴とする。
【００１６】
これにより、明視野で複数の２次元スライス画像を得ることで物体を３次元的に解析することができる。
【００１７】
また本発明の顕微鏡画像解析方法は、載置テーブルを高さ方向に移動させ、複数の位置でカメラ部により２次元の顕微鏡画像の撮影を行い、各高さの顕微鏡画像に対して所定の周波数成分情報を抽出するとともに、高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出し、変化点とその対応する位置情報に基づいて、周波数成分が支配的となる被写体の存在情報を得ることを特徴とする。
【００１８】
これにより、明視野で複数の２次元スライス画像を得ることで物体を３次元的に解析することができる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の請求項１に記載された発明は、試料を明視野で観察することができる顕微鏡と、該試料を載置して３次元方向に移動可能な載置テーブルと、試料の２次元の顕微鏡画像を撮影することができるカメラ部と、載置テーブルの位置制御とカメラ部の撮像制御を行うことのできる機構制御部とを備え、載置テーブルの高さ方向の移動に伴ってカメラ部が２次元の顕微鏡画像の撮影を複数回繰り返し、各高さの顕微鏡画像に対して画像処理部が所定の周波数成分情報を抽出するとともに、変化点抽出手段が高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出し、解析管理手段が、該変化点とこれと対応した位置情報に基づいて、周波数成分が支配的となる被写体の存在情報を得ることを特徴とする顕微鏡画像解析装置であって、２次元スライス画像から所定の周波数成分情報を抽出するため、この周波数成分が支配的となる被写体の情報を分離することができる。高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出するから、空間内の被写体の存在情報を簡単に取得することができる。周波数成分情報の分離で、細胞のような微小物体、あるいはこれから分岐した極細突起、極小突起を抽出して観察できる。明視野で観察するだけであるから、細胞のような被写体を生きたまま観察することができ、再生医療の生体情報取得に欠かせないものである。変化点と位置情報から輪郭等の３次元データを抽出し、画像作成に供することができる。共焦点レーザ顕微鏡のように狭い領域を観察するのに留まらず、広い領域の分析を行える。また、データ量も共焦点レーザ顕微鏡に比べ少なくて済み、高速化も可能である。
【００２０】
本発明の請求項２に記載された発明は画像処理部にはウェーブレット変換手段が設けられ、低周波成分情報と高周波成分情報に分離することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡画像解析装置であって、ウェーブレット変換によって低周波成分情報と高周波成分情報に分離するため、低周波成分情報と高周波成分情報が同時に得られる。
【００２１】
本発明の請求項３に記載された発明は、解析管理手段が低周波成分情報を解析することにより粗めの被写体の存在情報を得ることを特徴とする請求項２記載の顕微鏡画像解析装置であって、低周波成分情報として粗めの被写体情報が得られ、粗めの被写体は被写体の全体情報を示しているとともに、微細部分はともかく空間内に被写体が存在している存在情報を取得できる。
【００２２】
本発明の請求項４に記載された発明は、解析管理手段が高周波成分情報を解析することにより微細な被写体の存在情報を得ることを特徴とする請求項２または３に記載の微鏡画像解析装置であって、被写体の微細部分の情報だけが高周波成分情報に含まれており、微細部分の情報が抽出できる。
【００２３】
本発明の請求項５に記載された発明は、画像処理部には差分演算手段が設けられ、差分演算手段が２次元の顕微鏡画像の各点における輝度の差分を計算し、該差分によって所定の周波数成分情報を抽出することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡画像解析装置であって、単純な差分計算によって所定の周波数成分情報を抽出できる。
【００２４】
本発明の請求項６に記載された発明は、解析管理手段が、差分によって高周波成分情報を得ることにより、高周波成分が支配的となる被写体の存在情報を得ることを特徴とする請求項５記載の顕微鏡画像解析装置であって、単純な差分計算によって高周波成分が支配的となる微小物体等の被写体の存在情報が得られる。
【００２５】
本発明の請求項７に記載された発明は、２つの被写体の存在情報を比較することにより、解析管理手段がこの２つの被写体の高低を認識することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の顕微鏡画像解析装置であって、２次元スライス画像では２つの被写体、例えば細胞と細胞、細胞と突起等が重なった状態の画像であっても、変化点を抽出して存在情報をえることにより、それぞれが存在する平面の高低を比較することができ、２つの被写体の高低を認識するができる。
【００２６】
本発明の請求項８に記載された発明は、所定高さの平面と被写体が交差する輪郭情報から、解析管理手段が該被写体の３次元情報を得ることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の顕微鏡画像解析装置であって、変化点とその対応する位置情報から所定高さの平面と被写体が交差する輪郭情報が得られるため、輪郭情報を隣接する複数の平面で取得すれば被写体の３次元情報となる。平面の数を増せば詳しい３次元情報も可能となる。
【００２７】
本発明の請求項９に記載された発明は、載置テーブルを高さ方向に移動させ、複数の位置でカメラ部により２次元の顕微鏡画像の撮影を行い、各高さの顕微鏡画像に対して所定の周波数成分情報を抽出するとともに、高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出し、変化点とその対応する位置情報に基づいて、周波数成分が支配的となる被写体の存在情報を得ることを特徴とする顕微鏡画像解析方法であって、２次元スライス画像から所定の周波数成分情報を抽出するため、この周波数成分が支配的となる被写体の情報を分離することができる。高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出するから、空間内の被写体の存在情報を簡単に取得することができる。周波数成分情報の分離で、細胞のような微小物体、あるいはこれから分岐した極細突起、極小突起を抽出して観察できる。明視野で観察するだけであるから、細胞のような被写体を生きたまま観察することができ、再生医療の生体情報取得に欠かせないものである。変化点と位置情報から輪郭等の３次元データを抽出し、画像作成に供することができる。
【００２８】
本発明の請求項１０に記載された発明は、ウェーブレット変換によって、顕微鏡画像の低周波成分情報と高周波成分情報を分離して抽出することを特徴とする請求項９記載の顕微鏡画像解析方法であって、ウェーブレット変換によって低周波成分情報と高周波成分情報に分離するため、低周波成分情報と高周波成分情報が同時に得られる。低周波成分情報として粗めの被写体情報が得られ、粗めの被写体は被写体の全体情報を示しているとともに、微細部分はともかく空間内に被写体が存在している存在情報を取得できる。被写体の微細部分の情報が高周波成分情報に含まれており、微細部分の情報が抽出できる。
【００２９】
本発明の請求項１１に記載された発明は、２次元の顕微鏡画像の各点における輝度の差分を計算し、該差分によって所定の周波数成分情報を抽出することを特徴とする請求項９記載の顕微鏡画像解析方法であって、単純な差分計算によって高周波成分が支配的となる微小物体等の被写体の存在情報が得られる。
【００３０】
本発明の請求項１２に記載された発明は、所定高さの平面と被写体が交差する輪郭情報から、該被写体の３次元情報を得ることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の顕微鏡画像解析方法であって、変化点とその対応する位置情報から所定高さの平面と被写体が交差する輪郭情報が得られるため、輪郭情報を隣接する複数の平面で取得すれば被写体の３次元情報となる。平面の数を増せば詳しい３次元情報も可能となる。
【００３１】
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１における顕微鏡画像解析装置とその画像解析方法について説明する。実施の形態１は血管新生をウェーブレット変換の差分で解析したものである。図１は本発明の実施の形態１における顕微鏡画像解析装置の要部外観図、図２は本発明の実施の形態１における顕微鏡画像解析装置のブロック構成図である。
【００３２】
図１において、１は顕微鏡画像を解析する解析装置本体、２は顕微鏡画像や解析装置本体１で画像処理した画像を表示するＬＣＤ等の表示部、３は顕微鏡画像解析装置に入力を行うマウスやキーボード等の入力装置、３ａは以下説明する顕微鏡４の操作を行うための機構操作入力装置である。
【００３３】
４は細胞等を観察したり撮影する顕微鏡、４ａは観察のための透過光を照射する照明部、５は細胞等の試料を多数収納して観察する透明のプラスチックやガラスから作られたマイクロタイタプレートである。６はマイクロタイタプレート５を載置して３次元的（ｘ軸−ｙ軸−ｚ軸方向）に移送できる載置テーブル、６ａは載置テーブル６をｘ軸方向に移動させることができるｘ軸駆動モータ、６ｂは載置テーブル６をｙ軸方向に移動させることができるｙ軸駆動モータ、６ｃは載置テーブル６をｚ軸方向（高さ方向）に移動させることができるｚ軸駆動モータである。操作用ケーブルを介して入力装置３からの入力や、機構操作入力装置３ａからの入力により、ｘ軸駆動モータ６ａ，ｙ軸駆動モータ６ｂ，ｚ軸駆動モータ６ｃをそれぞれの方向に駆動することができ、各試料内で観察する位置を変更したり、２次元スライス画像（本発明の２次元の顕微鏡画像）を撮るときｚ軸方向に位置を変えることができるし、各試料を別の試料に交換することもできる。
連続して撮影するときは、ｚ軸方向の位置を変化させることができる。
【００３４】
さらに、７は顕微鏡４で観察を行うための接眼レンズ、８は回転可能であって選択した１つのレンズで観察するレボルバ式対物レンズ、９は載置テーブル６の移動に伴って２次元スライス画像を撮影するＣＣＤ等のカメラ部である。マイクロタイタプレート５内の細胞等の試料は、照明部４ａからの光を受けて、透過光がレボルバ式対物レンズ８によって像を結び、そのまま接眼レンズ７から観察できるが、一部が分岐されカメラ部９で同時に撮影できる。得られた画像データはＲＧＢ形式からＹＣｒＣｂ形式のデータに変換されてカメラ用ケーブルを介して解析装置本体１に送られ、画像処理される。
【００３５】
次に実施の形態１の顕微鏡画像解析装置のブロック構成について図２に基づいて説明する。図２において、１１は載置テーブル６の移動制御やカメラ部９の撮像制御、その他の顕微鏡４の操作を制御する機構制御部、１２は載置テーブル６を移動するためＸ軸駆動モータ６ａ，Ｙ軸駆動モータ６ｂ，Ｚ軸駆動モータ６ｃを駆動するテーブル駆動手段、１３は照明部４ａを発光させる照明制御手段、１４はユーザの入力でカメラ部９のフォーカス調整を行ったり、シャッタを切ったりするカメラ制御手段、１４ａはカメラ部９が撮影した画像データをＹＣｒＣｂ形式に変換して記憶部に送信する撮像手段、１５は機構操作入力装置３ａからの入力を機構制御部１１に入力する機構操作入力部である。
【００３６】
続いて、顕微鏡画像解析装置の解析装置本体１の内部構成について説明する。
１６は表示部２を動作させる表示制御手段、１７は入力装置３を動作させる操作入力手段である。また、１８はＲＯＭ（リードオンリメモリ）であり、１８ａはＲＯＭ１８内に設けられた制御プログラムを格納するプログラム格納部、１９は作業領域となったりバッファとなるＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）、２０はフラッシュメモリ等の不揮発メモリ部、２０ａはカメラ部９で撮影された画像データや後述するウェーブレット変換した画像データ等をメモリする画像メモリ部、２１はメモリカードや光ディスク等のメモリ媒体、２１ａはメモリ媒体２１の読出記録を行うメモリ媒体入出力部である。メモリ媒体入出力部２１ａは、外部情報がメモリ媒体２１に格納されてここにセットされたとき、これを駆動してデータを読み出して表示させたり、データを記録するためのものである。これにより内部の不揮発メモリ部２０だけでなく、多数のデータをメモリ媒体２１に格納して保存整理することができる。ＲＯＭ１８、ＲＡＭ１９、不揮発メモリ部２０、メモリ媒体２１は顕微鏡画像解析装置の記憶部を構成する。
【００３７】
次に、２２は顕微鏡画像解析装置の演算と制御を行う制御演算手段である。本実施の形態１においては、制御演算手段２２は中央処理装置（ＣＰＵ）から構成され、プログラム格納部１８ａ等から制御プログラムがロードされて各機能を実行する機能実現手段として構成される。同様に以下説明する解析管理手段２５，変化点抽出手段２６，画像生成手段２７，ウェーブレット変換手段２４，差分演算手段（図示しない），通信管理手段２８等はいずれも、本実施の形態１においてはそれぞれ制御プログラムを中央処理装置ないし専用のプロセッサで実行して各機能を実行する機能実現手段である。これらは顕微鏡画像解析装置の解析装置制御部を構成する。但しこれらはそれぞれ各機能を実行する回路等で構成することもできる。
【００３８】
２３は、画像メモリ部２０ａに格納された画像データのフォーマットを変換して表示部２に表示できるようにしたり、周波数成分を抽出したり、画像データに処理を加える画像処理部である。２４は画像処理部２３に設けられたウェーブレット変換手段であり、画像データの輝度（Ｙ）成分を周波数空間で高周波数成分と低周波数成分とに分解するものである。２５は表示部２に解析入力画面を表示させ、操作入力手段１７からの入力に従って画像処理を行う解析管理手段である。
【００３９】
２６は、ｚ軸方向の所定位置ｚ＝ｚｎの２次元スライス画像から被写体情報、例えば微小物体情報を得るために、輝度（Ｙ）成分をウェーブレット変換し、ｚ＝Ｚｎの平面上の各点（ｘ，ｙ，Ｚｎ）でウェーブレット変換成分Ｐｃｚ（ｘ，ｙ）のｚ軸方向の差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）＝ＰｃＺ（ｎ＋１）（ｘ，ｙ）−ＰｃＺｎ（ｘ，ｙ）を計算し（ｎ＝１〜Ｎ）、これをｚ軸方向にｎ＝１からｎ＝Ｎまで繰り返して、差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）に変化が現われる変化点を求める変化点抽出手段である。変化点は差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）の極大値として検出することができる。すなわち、被写体が存在している空間と不存在の空間の境界では輝度が大きく変化し、差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）にそれが現われるからである。
【００４０】
なお、このとき使用するウェーブレット変換成分Ｐｃｚ（ｘ，ｙ）を用いたのは、ウェーブレット変換を行うことで輝度情報が高周波成分と低周波成分とに分解できるからである。被写体が極小物体の場合高周波成分が支配的となり、粗め（大き目）の微小物体は低周波成分が支配的となる。従って、ウェーブレット変換成分Ｐｃｚ（ｘ，ｙ）としてＬＬ成分をみれば粗めの微小物体が支配的に現われ、ＬＨ成分，ＨＬ成分，ＨＨ成分をみると極小物体が支配的に現われる。これにより極小物体の情報を得るときにはＬＨ成分，ＨＬ成分，ＨＨ成分、粗めの微小物体情報を得るときにはＬＬ成分を処理すれば目的の情報が得られる。そしてウェーブレット変換を多段で使用すれば、ＬＬＬＬ成分，ＬＬＬＨ成分，ＬＬＨＬ成分，ＬＬＨＨ成分，ＬＨ成分，ＨＬ成分，ＨＨ成分が得られ、さらに詳細に３次元情報分析を行うことができる。
【００４１】
２７は変化点抽出手段２６によって検出された変化点情報と画像データ等の情報を使って新しい画像をつくる画像生成手段である。例えば入力装置３からの入力により、変化点間を補完などして所定のｚ＝Ｚｎ平面と交差する所定の大きさの物体の輪郭線データを作ったり、こうしたデータの積み重ねとして立体画像を形成することができる。このデータは解析管理手段２５に渡され、解析管理手段２５は入力があればいつでも画像処理部２３で処理をした後、表示部２に表示させることができる。２８は通信管理手段、２９は通信インタフェースとなる通信入出力部である。通信管理手段２８は解析結果を遠隔地に送信するためのもので、一般的なブラウザやメールソフト、ＦＴＰソフトでもよい。
【００４２】
以上説明したウェーブレット変換の詳細と、血管新生の変化点抽出の詳細について説明する。図３（ａ）は本発明の実施の形態１におけるウェーブレット変換の構成図、図３（ｂ）は（ａ）のウェーブレット変換で処理された分解成分図、図３（ｃ）は（ａ）のウェーブレット変換で処理された分解成分の特徴説明図、図４は（ａ）は本発明の実施の形態１における血管新生時の変化点抽出説明図、図４（ｂ）は（ａ）の変化点抽出で得られる差分の分布図、図５は図４（ａ）のｚ方向断面の分解図である。
【００４３】
図３（ａ）において、３１は水平処理を行う水平方向ローパスフィルタ、３２は同じく水平方向ハイパスフィルタ、３３は垂直処理を行う垂直方向ローパスフィルタ、３４は同じく垂直方向ハイパスフィルタ、３５は同じく垂直方向ローパスフィルタ、３６は同じく垂直方向ハイパスフィルタ、３７〜４２はデータを所定の割合で間引くダウンサンプラである。実施の形態１のウェーブレット変換を行うハールウェーブレット関数（Ｈａａｒ Ｗａｖｅｌｅｔ）はハイパスフィルタの伝達関数Ｈ０（ｚ）が（数１）、ローパスフィルタの伝達関数Ｈ１（ｚ）が（数２）で表される。
【００４４】
【数１】
【００４５】
【数２】
【００４６】
このウェーブレット変換手段２４に原画像（２次元スライス画像の輝度情報）を入力すると、図３（ｂ）に示すように水平処理を行う水平方向ローパスフィルタ３１、水平方向ハイパスフィルタ３２によって、スケーリング関数を作用させたものとなる低周波情報であるＬ成分、ウェーブレットを作用させた高周波情報であるＨ成分とに分解される。これをさらに垂直処理を行う垂直方向ローパスフィルタ３３、垂直方向ハイパスフィルタ３４、垂直方向ローパスフィルタ３５、垂直方向ハイパスフィルタ３６に入力すると、スケーリング関数を作用させたことになる低周波情報のＬＬ成分と、ウェーブレットを作用させた高周波情報であるＬＨ成分，ＨＬ成分，ＨＨ成分とに分解される。
【００４７】
ところで、ウェーブレット変換を通すことにより画像上に特徴的な変化が出現する。例えば、原画像として正方形に破線の対角線を記入したものを入力すると、図３（ｃ）に示すように、ＬＬ成分のところではそのまま粗い構成を示すが、ＬＨ成分，ＨＬ成分のところではそれぞれ水平成分，垂直成分が抽出され、ＨＨ成分のところでは斜め方向の成分で細かい構成のものが出力される。ＬＬ成分，ＨＨ成分の他にＬＨ成分，ＨＬ成分を利用すれば分解された画像からさらに有益な画像を構成できる。またこのウェーブレット変換手段をもう一度、すなわち２段で作用させた場合には、ＬＬＬＬ成分，ＬＬＬＨ成分，ＬＬＨＬ成分，ＬＬＨＨ成分が現われ、ＬＬＬＨ成分，ＬＬＨＬ成分，ＬＬＨＨ成分には中間的な大きさの物体情報の水平，垂直，斜め成分が出力される。この情報を利用すれば詳細な解析が可能になる。
【００４８】
そこで、以下、血管新生時の変化点抽出を行って新生血管の３次元情報を取得する方法について説明する。実施の形態１で解析を行う微細構造は新生血管である。図４（ａ）に示すように、新生血管から微細なヒゲ状の微細新生血管が４本分岐されている。２次元スライス画像は、図１においてフォーカスはそのままにしてｚ軸駆動モータ６ｃを駆動し、載置テーブル５を単位ピッチずつ上下方向に移動させ、移動した各位置で繰り返し撮影を行うことにより入手できる。なお、この上下動作は機構制御部１１が自動的に制御する。このような上下動作を行っては撮影し、図４（ａ）ではｎ＝１〜ＮのＮ枚の２次元スライス画像を得る。ｎ＝１がｚ＝Ｚ１、ｎ＝２がｚ＝Ｚ２、・・・、ｎ＝Ｎがｚ＝ＺＮに対応する。
【００４９】
次に、この２次元スライス画像の解析を行う。Ｎ枚の２次元スライス画像上の点（ｘ，ｙ）に対して、ｎ枚目の画像（ｚ＝Ｚｎ平面）と（ｎ＋１）枚目の画像（ｚ＝Ｚｎ＋１平面）との間の差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）を計算し、これをｎ＝１〜Ｎで繰り返し、点（ｘ，ｙ）におけるｚ軸方向の差分分布を求める。次いで点（ｘ，ｙ）を移動し、差分分布の算出をｘ−ｙ平面全体で行う。このようにして算出した差分分布には、ｚ＝Ｚ１からｚ＝ＺＮまでの空間に存在する物体の境界面の位置で大きな変化が現われ、これを検出することで３次元情報を入手することが可能となる。
【００５０】
そこで図４（ａ）の新生血管のＮ枚の２次元スライス画像から新生血管、とくに微細なヒゲ状の微細新生血管をどのようにして検出すのか、具体的に説明する。図４（ａ）において、点（ｘ１，ｙ１，ｚ）を通るｚ軸と平行なラインｓ１は、（ｘ１，ｙ１，ｚ１）と（ｘ１，ｙ１，ｚ’１）の２点で微細新生血管と交差している。同様に、点（ｘ２，ｙ２，ｚ）を通るｚ軸と平行なラインｓ２は（ｘ２，ｙ２，ｚ２）と（ｘ２，ｙ２，ｚ’２）の間に新生血管が存在している。点（ｘ３，ｙ３，ｚ）を通るｚ軸と平行なラインｓ３は（ｘ３，ｙ３，ｚ３）でヒゲ状の微細新生血管と交差している。そして、このようなラインｓ１〜ｓ３に沿って差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）のプロットすると、各ラインにおけるｚ軸方向の差分分布が得られる。
【００５１】
図４（ｂ）はこの分布を示している。ラインｓ１に沿ってはｚ＝ｚ１近傍で２つの極大値、ｚ＝ｚ’１近傍で２つの極大値が検出される。また、ラインｓ２に沿ってはｚ＝ｚ２とｚ＝ｚ’２でそれぞれ１つずつ極大値が検出され、ラインｓ３に沿ってはｚ＝ｚ３近傍で２つの極大値が検出される。これは点（ｘ１，ｙ１）ではｚ＝ｚ１、ｚ＝ｚ’１近傍で極小の物体が存在していることを示し、点（ｘ２，ｙ２）ではｚ＝ｚ２とｚ＝ｚ’２の間に大きな物体が存在していることを示している。また、点（ｘ３，ｙ３）ではｚ＝ｚ３近傍に極小の物体が存在していることが分かる。これらの極大値のペアが平面上に連なって輪郭を示すことにより、物体が存在していることの境界情報（存在情報）が入手される。言い換えればこの極大値は境界情報の基礎情報ということができる。
【００５２】
実施の形態１においては、原画像にウェーブレット変換を行った画像を使用する。すなわち、Ｎ枚の低周波情報であるＬＬ成分と、高周波情報であるＬＨ成分，ＨＬ成分，ＨＨ成分、とくにＨＨ成分の２次元画像の点（ｘ，ｙ）に対して、ｎ枚目の画像（ｚ＝Ｚｎ平面）と（ｎ＋１）枚目の画像（ｚ＝Ｚｎ＋１平面）との間の差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）をｎ＝１〜Ｎで繰り返して計算し、ウェーブレット変換画像の点（ｘ，ｙ）におけるｚ軸方向の差分分布を求めるものである。これにより、ＬＬ成分の差分分布には、ｚ＝Ｚ１からｚ＝ＺＮまでの各平面における粗めの物体の境界面情報が現われ、ＨＨ成分の差分分布には、ｚ＝Ｚ１からｚ＝ＺＮまでの各平面の微細もしくは微小物体の境界面情報が現われる。
【００５３】
ところで２次元スライス画像には焦点が合っていない物体も撮影されている。
焦点が合っていない場合、輝度が小さく薄い像となっているため、差分も小さく、差分の大きくなるｚ＝Ｚｎ平面付近の物体情報だけを抽出することができる。図５において、（ａ）はｚ＝ｚ１（＝Ｚｍ）に焦点を合わせた２次元スライス画像、（ｂ）はｚ＝ｚ２（＝Ｚｋ）に焦点を合わせた２次元スライス画像、（ｃ）はｚ＝ｚ３（＝Ｚｌ）に焦点を合わせた２次元スライス画像である。但しｎ＝１，２，・・，ｋ，・・，ｌ，・・，ｍ，・・，Ｎである。（ａ）（ｃ）では新生血管と微細なヒゲ状の微細新生血管が１本ずつ濃い像となっており、他のヒゲ状の微細新生血管はやや薄い像となっている。（ｂ）では微細なヒゲ状の微細新生血管はすべて焦点がずれており、薄い像となっている。
【００５４】
このような２次元スライス画像に対してウェーブレット変換手段２４によりウェーブレット変換を行うと、（ｄ）（ｅ）（ｆ）（ｇ）のようなウェーブレット変換画像が得られる。（ｄ）のＬＬ成分では（ａ）の２次元スライス画像とほぼ同じ画像が得られ、ＨＨ成分では（ｘ１，ｙ１，ｚ１）を通るヒゲ状の微細新生血管だけがはっきりと表示される。なお、ＬＬ成分で焦点の合っていない部分の劣化が比較的小さいのは、ダウンサンプラ３７，３９の影響によるものと考えられる。ＨＨ成分では粗めの物体情報や焦点の合っていない部分はぼんやりと表示される。しかし、ヒゲ状の微細新生血管だけは明瞭に抽出される。（ｅ）はｚ＝ｚ’１の２次元スライス画像に対するウェーブレット変換画像であり、ＬＬ成分は（ａ）の２次元スライス画像とほぼ同じであるが、ＨＨ成分は（ｘ１，ｙ１，ｚ’１）を通るヒゲ状の微細新生血管だけがはっきりと写り、他の部分は薄く表示される。（ｆ）のＬＬ成分では（ｂ）の２次元スライス画像とほぼ同じ画像が得られ、ＨＨ成分では（ｘ２，ｙ２，ｚ２）を通るすべてがぼんやりと表示される。（ｇ）のＬＬ成分では（ｃ）の２次元スライス画像とほぼ同じ画像が得られ、ＨＨ成分では（ｘ３，ｙ３，ｚ３）を通るヒゲ状の微細新生血管だけがはっきりと写り、他の部分はぼんやりと表示される。
【００５５】
このように各平面のＬＬ成分、ＨＨ成分に対して、差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）をｚ＝Ｚ１〜ＺＮですべて求め、これを空間全体に広げるから、ＬＬ成分の差分分布には粗め物体の境界面情報が現われ、ＨＨ成分の差分分布には微細もしくは微小物体の境界面情報が現われる。図６は本発明の実施の形態１における顕微鏡画像解析装置で行う画像解析のフローチャート、図７（ａ）は本発明の実施の形態１における微細新生血管の輪郭情報抽出説明図、図７（ｂ）は（ａ）の微細新生血管の輪郭情報の各断面における輪郭図である。
【００５６】
以下、本発明の実施の形態１における顕微鏡画像解析装置で行う画像解析の手順を図６のフローチャートに基づいて説明する。新生血管の場合を想定して説明する。図４（ａ）の新生血管のｚ＝Ｚｎ平面の２次元スライス画像をｎ＝１の画像から取り込む（ｓｔｅｐ１）。この画像をウェーブレット変換し（ｓｔｅｐ２）、差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）を計算する（ｓｔｅｐ３）。その後、ｎ＝１〜Ｎまでのすべての計算が終了したか否かがチェックされ、ｎ＝Ｎの場合はｓｔｅｐ６に進み、ｎ＝Ｎでなければｎ＝ｎ＋１にインクリメントしてｓｔｅｐ１に戻る。
【００５７】
ｓｔｅｐ６では、抽出するように要求されている物体の構造が微細な構造か否かが判断され、微細な構造の場合、ウェーブレット変換画像のＬＨ成分，ＨＬ成分，ＨＨ成分のいずれか、組み合わせ若しくはすべてが選択される（ｓｔｅｐ７）。新生血管ではヒゲ状の微細新生血管を観察する場合に選択される。また、微細な構造というより大まかな構造の新生血管を抽出する場合には、ウェーブレット変換画像のＬＬ成分が選択され（ｓｔｅｐ８）、差分分布から変化点が抽出される（ｓｔｅｐ９）。このとき、例えば差分ΔＨＨｚ（ｘ，ｙ）の差分分布では、焦点の合ったところ以外は輝度が小さく、キャンセルで脱落してヒゲ状の微細新生血管だけの輪郭が浮き彫りになり、差分ΔＬＬｚ（ｘ，ｙ）の差分分布では新生血管の大まかな全体像が抽出される。全体像では微細新生血管はダウンサンプラの作用等もあって薄い像として表示される。
【００５８】
これらを図７（ａ）で説明すると、このｓｔｅｐ９の変化点はｚ＝Ｚｎ平面での差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）が大きく変化する点であり、この変化点を連ねた輪郭ｌｎが微細新生血管とｚ＝Ｚｎ平面の交差する輪郭である。差分分布の極大値で最大値を示す位置が変化点となる。同様に、ｚ＝Ｚｎ＋１平面、Ｚｎ＋２平面、Ｚｎ＋３平面に対して差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）が大きく変化する変化点を連ね、輪郭ｌｎ＋１、ｌｎ＋２、ｌｎ＋３がｚ＝Ｚｎ＋１平面、Ｚｎ＋２平面、Ｚｎ＋３平面と交差したときに境界となる輪郭線が得られる。これを別々の平面上にプロットしたものが図７（ｂ）である。
【００５９】
このようにｓｔｅｐ９で変化点を求めると、これらの解析データが３次元情報として獲得され（ｓｔｅｐ１０）、すべて画像メモリ部２０ａに格納される。また画像データを要求したときには、画像生成手段２７によって補完されて詳細な画像情報として出力されたり、観察したい対象だけに絞って表示することができる。
【００６０】
なお以上の説明では、数百μｍ〜ｍｍオーダの新生血管とこれから伸びたμオーダの微細なヒゲ状の微細新生血管を対象に説明したが、再生医療で扱う他の幹細胞、例えば神経幹細胞においてもまったく同様に扱える。とくに脳神経としてμｍ以下のオーダのニューロンと数μｍ〜十数μｍのグロリア細胞等は、数μｍ離れて分かれて存在しているが、この再生医療を行うため観察するときには、これらの細胞を損なうことがあってはならない。本発明の顕微鏡画像解析装置と顕微鏡画像解析方法によれば、これが簡単に実現でき、コストもかからずそれぞれの大きさの物体に分解して観察が可能になる。さらに、詳細は実施の形態２において説明するが、細胞に菌糸が被さった状態の試料等においてもウェーブレットにより同様に解析でき、菌糸だけを明瞭に抽出することができる。解析方法は上述した通りであるから説明は省略する。図８（ａ）は細胞に菌糸が被さった試料の２次元スライス画像の写真による説明図、図８（ｂ）は（ａ）の２次元スライス画像から菌糸だけを抽出した画像による説明図である。図８（ａ）（ｂ）からも分かるように、２次元スライス画像から極細の菌糸だけを分離し、２次元画像にすることが可能である。さらに３次元情報も抽出でき、必要に応じて立体像も表示できる。
【００６１】
このように実施の形態１の顕微鏡画像解析装置とその画像解析方法は、２次元スライス画像を撮影することにより、新生血管のような微小物体と、これから伸びた微細なヒゲ状の微細新生血管のような極小物体とを分離して観察することが可能になる。また、分離した極小物体の輪郭を３次元データとして抽出することができ、補完などを施すことによってさらに詳細で明確な画像や３次元データを安価に提供することができる。
【００６２】
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２における顕微鏡画像解析装置とその画像解析方法について説明する。実施の形態２は細胞に菌糸が被さった試料を差分だけで解析したものである。図９（ａ）は本発明の実施の形態２における細胞に菌糸が被さった試料の外観図、図９（ｂ）は本発明の実施の形態２におけるｘ−ｙ平面上の輝度の差分情報の説明図である。なお、実施の形態１と基本的構成に変わりがなく、図１，図２，図８（ａ）（ｂ）を実施の形態２においても参照し、その詳細な説明は実施の形態１に譲って省略する。
【００６３】
図９（ａ）において、５０は細胞、５１は細胞５０を覆った菌糸である。このように２層を形成する試料を顕微鏡で観察した場合、菌糸５１のため細部５０内部はほとんど観察できない。逆に、菌糸５１の観察を行う場合、細胞５０の像の影響を受けて見づらく、菌糸５１同士の重なりがどちらが上でどちらが下か分からないものであった。
【００６４】
そこで、実施の形態２においては、ｚ軸方向にＮ枚撮影した２次元スライス画像から単純に差分をとることによって菌糸５１を抜き出して３次元情報を確保するものである。実施の形態１の顕微鏡画像解析装置と異なっているのは、輝度の周波数空間への写像がウェーブレット変換でなく、２次元スライス画像の各点における輝度の差分計算であり、この差分によって所定の周波数成分情報を抽出する点である。差分計算のピッチによって異なるが、小さなピッチとすることにより高周波成分、大きなピッチにより低周波成分を抽出することができる。実施の形態２においては菌糸５１の情報を抽出するため小ピッチとしている。この差分の計算は画像処理部２３内に設けられた差分演算手段（図示しない）によって行われる。差分演算手段も制御プログラムを中央処理装置で実行して各機能を実行する機能実現手段である。２次元スライス画像の輝度の差分から高周波成分情報を抽出したら、ｚ軸方向に差分をとって変位点を抽出する。この処理結果は図８（ｂ）に示したとおりである。
【００６５】
実施の形態２の輝度の差分ΔＹｉ，ｊ（ｚ）は、図９（ａ）に示すようにｚ＝Ｚｎ平面上の点（ｘｉ，ｙｊ）の輝度Ｙｉ，ｊ（ｚ）を中心に（ｘｉ−１，ｙｊ−１）、（ｘｉ＋１，ｙｊ）、（ｘｉ，ｙｊ＋１）、（ｘｉ＋１，ｙｊ＋１）間で計算される。すなわち、（ｘｉ−１，ｙｊ−１）の輝度Ｙｉ−１，ｊ−１（ｚ）、（ｘｉ＋１，ｙｊ）の輝度Ｙｉ＋１，ｊ（ｚ）、（ｘｉ，ｙｊ＋１）の輝度Ｙｉ，ｊ＋１（ｚ）、（ｘｉ＋１，ｙｊ＋１）の輝度Ｙｉ＋１，ｊ＋１（ｚ）から（数３）のように計算される。但し（数４）の関係がある。
【００６６】
【数３】
【００６７】
【数４】
【００６８】
変化点は、（数３）で示す差分ΔＹｉ，ｊ（ｚ）のｚ軸方向に関しての差分Δｉｊｚ（ｘｉ，ｙｊ）を（数５）に従って計算し、極大値を検出することで求められる。但し、ｎ＝１〜Ｎである。
【００６９】
【数５】
【００７０】
なお、差分ΔＹｉ，ｊ（ｚ）の計算方法は（数３）だけに限られない。実施の形態２は差分計算を行うだけであるから、きわめて単純で原理的であるとともに、ダウンサンプラ３７〜４２がないため、ウェーブレット変換等で発生するデータ量の減少が起こらない。
【００７１】
続いて、本発明の実施の形態２における顕微鏡画像解析装置で行う画像解析の手順を図１０のフローチャートに基づいて説明する。図１０は本発明の実施の形態２における顕微鏡画像解析装置で行う画像解析のフローチャートである。細胞を菌糸が覆った試料を想定して説明する。ｚ＝Ｚｎ平面の２次元スライス画像を取り込む（ｓｔｅｐ１１）。この画像を高周波、低周波のフィルタ画像に変換し（ｓｔｅｐ１２）、差分Δｉｊｚ（ｘｉ，ｙｊ）を計算する（ｓｔｅｐ１３）。その後、ｎ＝１〜Ｎまですべて計算が終了したか否かがチェックされ、ｎ＝Ｎの場合はｓｔｅｐ１６に進み、ｎ＝Ｎでなければｎ＝ｎ＋１にインクリメントしてｓｔｅｐ１１に戻る。
【００７２】
ｓｔｅｐ１６では、高周波画像または低周波画像ので差分分布から変化点が抽出される。菌糸だけを抽出する場合は、高周波画像から菌糸だけが抽出される。
低周波画像であれば細胞だけを観察できる。ｓｔｅｐ１６で変化点を求めると、これらの解析データが３次元情報として獲得され（ｓｔｅｐ１７）、すべて画像メモリ部２０ａに格納される。そして画像データを要求したときには、画像生成手段２７によって補完されて詳細な画像情報として出力されたり、観察したい対象だけに絞って表示することができる。
【００７３】
実施の形態２の顕微鏡画像解析装置は、画像処理部２３の差分演算手段によって高周波成分を抽出しているが、このほかにも他の周波数変換方式である離散コサイン変換（ＤＣＴ）、フーリエ変換、アダマール変換等で行っても同様である。実施の形態２と同様に図１に示す画像処理部２３にこれを実行する手段が置かれる。
【００７４】
このように実施の形態２の顕微鏡画像解析装置とその画像解析方法は、２次元スライス画像を撮影することにより、細胞のような微小物体と、これから伸びた微細な糸状の極細物体とを分離して観察することが可能になる。また、分離した極小物体の輪郭を３次元データとして抽出することができ、補完などを施すことによってさらに詳細で明確な画像や３次元データを安価に提供することができる。
【００７５】
【発明の効果】
本発明の顕微鏡画像解析装置によれば、各高さの顕微鏡画像に対して所定の周波数成分情報を抽出するとともに、変化点抽出手段が高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出し、変化点とその対応する位置情報に基づいて、周波数成分が支配的となる被写体の存在情報を得ることができ、２次元スライス画像から所定の周波数成分情報を抽出するため、この周波数成分が支配的となる被写体の情報を分離することができる。高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出するから、空間内の被写体の存在情報を簡単に取得することができる。周波数成分情報の分離で、細胞のような微小物体、あるいはこれから分岐した極細突起、極小突起を抽出して観察できる。明視野で観察するだけであるから、細胞のような被写体を生きたまま観察することができ、再生医療の生体情報取得に欠かせないものである。変化点と位置情報から輪郭等の３次元データを抽出し、画像作成に供することができる。共焦点レーザ顕微鏡のように狭い領域を観察するのに留まらず、広い領域の分析を行える。また、データ量も共焦点レーザ顕微鏡に比べ少なくて済み、高速化も可能である。
【００７６】
ウェーブレット変換によって低周波成分情報と高周波成分情報に分離するため、低周波成分情報と高周波成分情報が同時に得られる。低周波成分情報を解析することにより粗めの被写体情報が得られ、粗めの被写体は被写体の全体情報を示しているとともに、微細部分はともかく空間内に被写体が存在している存在情報を取得できる。高周波成分情報を解析することにより微細部分の情報が抽出できる。
【００７７】
また、２次元の顕微鏡画像の各点における輝度の差分を計算し、差分によって所定の周波数成分情報を抽出するから、単純な差分計算によって所定の周波数成分情報を抽出できる。単純な差分計算によって高周波成分が支配的となる微小物体等の被写体の存在情報が得られる。
【００７８】
そして２次元スライス画像では２つの被写体、例えば細胞と細胞、細胞と突起等が重なった状態の画像であっても、変化点を抽出して存在情報をえることにより、それぞれが存在する平面の高低を比較することができ、２つの被写体の高低を認識するができる。変化点とその対応する位置情報から所定高さの平面と被写体が交差する輪郭情報が得られるため、輪郭情報を隣接する複数の平面で取得すれば被写体の３次元情報となる。平面の数を増せば詳しい３次元情報も可能となる。
【００７９】
本発明の顕微鏡画像解析方法によれば、各高さの顕微鏡画像に対して所定の周波数成分情報を抽出し、高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出し、変化点とその対応する位置情報に基づいて、周波数成分が支配的となる被写体の存在情報を得るから、周波数成分が支配的となる被写体の情報を分離することができる。高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出するから、空間内の被写体の存在情報を簡単に取得することができる。周波数成分情報の分離で、細胞のような微小物体、あるいはこれから分岐した極細突起、極小突起を抽出して観察できる。明視野で観察するだけであるから、細胞のような被写体を生きたまま観察することができ、再生医療の生体情報取得に欠かせないものである。変化点と位置情報から輪郭等の３次元データを抽出し、画像作成に供することができる。ウェーブレット変換によって低周波成分情報と高周波成分情報に分離するため、低周波成分情報と高周波成分情報が同時に得られる。単純な差分計算によって高周波成分が支配的となる微小物体等の被写体の存在情報が得られる。変化点とその対応する位置情報から所定高さの平面と被写体が交差する輪郭情報が得られるため、輪郭情報を隣接する複数の平面で取得すれば被写体の３次元情報となる。平面の数を増せば詳しい３次元情報も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１における顕微鏡画像解析装置の要部外観図
【図２】本発明の実施の形態１における顕微鏡画像解析装置のブロック構成図
【図３】（ａ）本発明の実施の形態１におけるウェーブレット変換の構成図
（ｂ）（ａ）のウェーブレット変換で処理された分解成分図
（ｃ）（ａ）のウェーブレット変換で処理された分解成分の特徴説明図
【図４】（ａ）本発明の実施の形態１における血管新生時の変化点抽出説明図
（ｂ）（ａ）の変化点抽出で得られる差分の分布図
【図５】図４（ａ）のｚ方向断面の分解図
【図６】本発明の実施の形態１における顕微鏡画像解析装置で行う画像解析のフローチャート
【図７】（ａ）本発明の実施の形態１における微細新生血管の輪郭情報抽出説明図
（ｂ）（ａ）の微細新生血管の輪郭情報の各断面における輪郭図
【図８】（ａ）細胞に菌糸が被さった試料の２次元スライス画像の写真による説明図
（ｂ）（ａ）の２次元スライス画像から菌糸だけを抽出した画像による説明図
【図９】（ａ）本発明の実施の形態２における細胞に菌糸が被さった試料の外観図
（ｂ）本発明の実施の形態２におけるｘ−ｙ平面上の輝度の差分情報の説明図
【図１０】本発明の実施の形態２における顕微鏡画像解析装置で行う画像解析のフローチャート
【図１１】（ａ）従来の蛍光顕微鏡システムの構成図
（ｂ）従来の蛍光微分顕微鏡装置の構成図
【符号の説明】
１ 解析装置本体
２ 表示部
３ 入力装置
３ａ 機構操作入力装置
４ 顕微鏡
４ａ 照明部
５ マイクロタイタプレート
６ 載置テーブル
６ａ ｘ軸駆動モータ
６ｂ ｙ軸駆動モータ
６ｃ ｚ軸駆動モータ
７ 接眼レンズ
８ レボルバ式対物レンズ
９ カメラ部
１１ 機構制御部
１２ テーブル駆動手段
１３ 照明制御手段
１４ カメラ制御手段
１４ａ 撮像手段
１５ 機構操作入力部
１６ 表示制御手段
１７ 操作入力手段
１８ ＲＯＭ
１８ａ プログラム格納部
１９ ＲＡＭ
２０ 不揮発メモリ部
２０ａ 画像メモリ部
２１ メモリ媒体
２１ａ メモリ媒体入出力部
２２ 制御演算手段
２３ 画像処理部
２４ ウェーブレット変換手段
２５ 解析管理手段
２６ 変化点抽出手段
２７ 画像生成手段
２８ 通信管理手段
２９ 通信入出力部
３１ 水平方向ローパスフィルタ
３２ 水平方向ハイパスフィルタ
３３，３５ 垂直方向ローパスフィルタ
３４，３６ 垂直方向ハイパスフィルタ
３７〜４２ ダウンサンプラ
５０ 細胞
５１ 菌糸
１０１ 蛍光顕微鏡
１０２ モニタ
１０３ パーソナルコンピュータ
１０４ 試料
１０５ 画像取得手段
１０６ 微分演算手段
１０７ 表示手段
１０８ 試料
【発明の属する技術分野】
本発明は、２次元スライス画像を複数枚撮影することにより細胞のような微小物体を生きたまま観察することができ、更に微小な物体とこの微小物体とを区別することができ、これらの存在情報を抽出可能な顕微鏡画像解析装置、及びその画像解析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近の医療の進歩は目覚しい。ヒトゲノムの解読は一段落し、遺伝子治療も実用化の段階を迎えようとしている。そして、今もっとも多くの期待を寄せられているのが再生医療である。米国のウィスコンシン大学が１９９８年にヒトの幹細胞の作製に成功し、不可能と思われていた再生医療がにわかに現実味を帯びてきている。よく知られているように成長した細胞は、分裂しても皮膚の細胞は皮膚、筋肉の細胞は筋肉にしかなれない。しかし、この幹細胞は様々の細胞に変化し得るもので再生医療の中核となるものである。
【０００３】
ところで、幹細胞には、受精卵から作る胚性幹細胞（ＥＳ細胞）と、体内の組織にある体性幹細胞の２種類がある。胚性幹細胞は多様な組織に成長し得る可能性を秘めていて体性幹細胞より使い易いが、再生医療に用いる場合には拒絶反応や倫理上の問題がある。そこで、骨髄や骨盤等から採取できる体性幹細胞によって再生医療を進められないかに関心が集まり、先端的な研究が進められている。
最近報告されたところでは、皮膚移植のために骨髄の体性幹細胞を皮膚に変えたり、心筋梗塞を起こした心臓に体性幹細胞を移植して新しい血管をつくる等の治療が試験的に行われている。
【０００４】
さて、このような再生医療の進展のためには再生医療を支える周辺技術の進歩が欠かせない。中でも処理対象の細胞を観察する観察装置は最も基本的な技術であり、従来、蛍光顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡が使用されてきた。これらは試料を蛍光色素で染色しその蛍光像を取得し、その蛍光像取得情報をパーソナルコンピュータにより画像処理し、それをモニタに表示するものである。図１１（ａ）は従来の蛍光顕微鏡システムの構成図、図１１（ｂ）は従来の蛍光微分顕微鏡装置の構成図である。図１１（ａ）において、１０１は蛍光顕微鏡、１０２はモニタ、１０３はパーソナルコンピュータ（以下パソコン）、１０４は試料である。
【０００５】
従来の蛍光顕微鏡１０１は、試料１０４を蛍光色素で染色し、その蛍光像が取得されると、その蛍光像取得信号ＳＩＮがパソコン１０３に出力される。蛍光像取得信号ＳＩＮはパソコン１０３内で信号処理されて蛍光像取得データに変換され、当該データはパソコン１０３によりモニタ１０２を駆動する画像表示信号に変換される。これによって、モニタ１０２に試料１０４の蛍光像が表示される。なお、蛍光顕微鏡１０１に代えて、共焦点レーザ顕微鏡を用いるのでもまったく同一である。蛍光色素で染色するのは、染色無しで細胞を観察した場合にはコントラストが低すぎ、細胞の画像の取得などできないためである。しかし、こうした染色方法の多くは細胞を殺してしまう。そこで最近では生きた細胞を観察するために、生体染色用の色素（ＧＰＦ）が開発され、細胞内のイオン濃度動態や、細胞電位の測定を生きた状態の細胞で観察できるようになった。しかし、蛍光像取得信号ＳＩＮをパソコン１０３によって画像処理した場合には、蛍光染色された細胞を人間の感覚としてみたとき、単なる濃淡画像としてしか捉えることしかできなかった。しかも、再生医療においては蛍光染色された細胞を使うことはできない。
【０００６】
そこで、蛍光顕微鏡または共焦点レーザ顕微鏡を改良した蛍光微分顕微鏡装置（特開平７−２４４２３９号公報）が提案された。図１１（ｂ）において、１０５は試料の蛍光像を取得する画像取得手段、１０６は蛍光像を微分処理して蛍光微分データＤＯＵＴを出力する微分演算手段、１０７は蛍光微分データＤＯＵＴに基づいて蛍光画像を表示する表示手段、１０８は試料である。
【０００７】
画像取得手段１０５には、蛍光顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡が用いられる。また、微分演算手段１０６は、試料１０８の蛍光像取得信号ＳＩＮをＡ／Ｄ変換して蛍光像取得データＤＩＮに変換する信号処理部１０６Ａと、蛍光像取得データＤＩＮを平滑化するデータ平滑部１０６Ｂと、平滑化された蛍光像取得データＤＩＮを二次微分して蛍光微分データＤＯＵＴを出力する微分演算部１０６Ｃとから構成されるものである。これにより、この従来の蛍光微分顕微鏡装置は、試料１０８の蛍光微分画像情報を生成し、人間の感覚として細胞内外の微細構造を凹凸として感じる陰影像として観察することができるようになる。しかしこの蛍光微分顕微鏡装置も、蛍光色素で染色しなければ役に立たたないものであった。
【０００８】
また、このほか試料に染色をすることなく、透過光路上の位相差をコントラストまたは凹凸像として検出する位相差顕微鏡も開発されている。この位相差顕微鏡は、細胞内の組織構造に染色することなく、細胞の観察が可能である。しかし、位相差顕微鏡のシステムには、比較的強い透過光が必要であり、強力な照明光源や収束レンズ等の光学系を追加する必要があった。またコントラストや凹凸像は検出できるものの、例えば光軸方向（高さ方向）に何層か細胞等が積み重なったような状態を検出したときには、高さ方向の全情報が重なり、一体どのような組織構造なのか分からないものであった。また、光軸方向の各位置における断層データを得るのは難しいものであった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
以上説明したように、蛍光顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡は、細胞を観察するとき蛍光色素で染色する必要があり、多くは細胞を殺してしまうものであった。生体染色用の色素を用いることができるが、蛍光染色された細胞は再生医療には使えない。すなわち、蛍光顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡は基本的に再生医療には用いることができないものであった。この点、明視野透過顕微鏡なら無処理のまま観察できるが、そのままでは細胞を観察することはできない。
【００１０】
また、蛍光顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡によって得られた画像は、人間の感覚として立体感を感じさせるものでなく、単に濃淡画像にすぎないものであった。
しかも取得されるデータは空間の測定点に１対１で対応しており、試料全体を測定するためには空間全体を走査しなければならなかった。従って蛍光顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡を使って試料を観察するのは、狭い領域に限られ、広範な領域を観察するといったニーズには適していないものであった。しかもそのデータ量は膨大であり、全空間を順次走査する必要から高速測定は難しいものであった。
レーザ光源にピンホールアレイを設け、ピンホールで多点測定を行う技術も提案されているが、高速測定には限界があるものであった。
【００１１】
また、従来の蛍光微分顕微鏡装置は試料の蛍光微分画像情報を生成し、人間の感覚として微細構造を凹凸と感じる陰影像として観察できるようになるが、蛍光顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡を用いるもので、基本的には上述した蛍光顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡と同様の問題を抱えるものであった。蛍光色素で染色しなければ、せっかくの装置も役に立たないし細胞の観察はできない。従って、再生医療には用いることができないものであった。
【００１２】
位相差顕微鏡は、細胞内の組織構造に染色することなく、細胞の観察が可能であるが、強力な照明光源や収束レンズ等の光学系を追加する必要があった。そして光軸方向に何層か細胞が積み重なったような状態を検出する場合、光軸方向で検出情報が混ざって、一体どのような組織構造なのか分からなくなるものであった。また、光軸方向の断層データを得るのは難しく、当然３次元情報を得るのは困難であった。
【００１３】
そこで本発明は、明視野で複数の２次元スライス画像を得ることで物体を３次元的に解析できる顕微鏡画像の画像解法析方法を提供することを目的とする。
【００１４】
また、本発明は、明視野で複数の２次元スライス画像を得ることで物体を３次元的に解析できる顕微鏡画像解析装置を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
以上の課題を解決するために本発明の顕微鏡画像解析装置は、載置テーブルの高さ方向の移動に伴ってカメラ部が２次元の顕微鏡画像の撮影を繰り返し、各高さの顕微鏡画像に対して画像処理部が所定の周波数成分情報を抽出するとともに、変化点抽出手段が高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出し、変化点とその対応する位置情報に基づいて、周波数成分が支配的となる被写体の存在情報を得ることを特徴とする。
【００１６】
これにより、明視野で複数の２次元スライス画像を得ることで物体を３次元的に解析することができる。
【００１７】
また本発明の顕微鏡画像解析方法は、載置テーブルを高さ方向に移動させ、複数の位置でカメラ部により２次元の顕微鏡画像の撮影を行い、各高さの顕微鏡画像に対して所定の周波数成分情報を抽出するとともに、高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出し、変化点とその対応する位置情報に基づいて、周波数成分が支配的となる被写体の存在情報を得ることを特徴とする。
【００１８】
これにより、明視野で複数の２次元スライス画像を得ることで物体を３次元的に解析することができる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の請求項１に記載された発明は、試料を明視野で観察することができる顕微鏡と、該試料を載置して３次元方向に移動可能な載置テーブルと、試料の２次元の顕微鏡画像を撮影することができるカメラ部と、載置テーブルの位置制御とカメラ部の撮像制御を行うことのできる機構制御部とを備え、載置テーブルの高さ方向の移動に伴ってカメラ部が２次元の顕微鏡画像の撮影を複数回繰り返し、各高さの顕微鏡画像に対して画像処理部が所定の周波数成分情報を抽出するとともに、変化点抽出手段が高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出し、解析管理手段が、該変化点とこれと対応した位置情報に基づいて、周波数成分が支配的となる被写体の存在情報を得ることを特徴とする顕微鏡画像解析装置であって、２次元スライス画像から所定の周波数成分情報を抽出するため、この周波数成分が支配的となる被写体の情報を分離することができる。高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出するから、空間内の被写体の存在情報を簡単に取得することができる。周波数成分情報の分離で、細胞のような微小物体、あるいはこれから分岐した極細突起、極小突起を抽出して観察できる。明視野で観察するだけであるから、細胞のような被写体を生きたまま観察することができ、再生医療の生体情報取得に欠かせないものである。変化点と位置情報から輪郭等の３次元データを抽出し、画像作成に供することができる。共焦点レーザ顕微鏡のように狭い領域を観察するのに留まらず、広い領域の分析を行える。また、データ量も共焦点レーザ顕微鏡に比べ少なくて済み、高速化も可能である。
【００２０】
本発明の請求項２に記載された発明は画像処理部にはウェーブレット変換手段が設けられ、低周波成分情報と高周波成分情報に分離することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡画像解析装置であって、ウェーブレット変換によって低周波成分情報と高周波成分情報に分離するため、低周波成分情報と高周波成分情報が同時に得られる。
【００２１】
本発明の請求項３に記載された発明は、解析管理手段が低周波成分情報を解析することにより粗めの被写体の存在情報を得ることを特徴とする請求項２記載の顕微鏡画像解析装置であって、低周波成分情報として粗めの被写体情報が得られ、粗めの被写体は被写体の全体情報を示しているとともに、微細部分はともかく空間内に被写体が存在している存在情報を取得できる。
【００２２】
本発明の請求項４に記載された発明は、解析管理手段が高周波成分情報を解析することにより微細な被写体の存在情報を得ることを特徴とする請求項２または３に記載の微鏡画像解析装置であって、被写体の微細部分の情報だけが高周波成分情報に含まれており、微細部分の情報が抽出できる。
【００２３】
本発明の請求項５に記載された発明は、画像処理部には差分演算手段が設けられ、差分演算手段が２次元の顕微鏡画像の各点における輝度の差分を計算し、該差分によって所定の周波数成分情報を抽出することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡画像解析装置であって、単純な差分計算によって所定の周波数成分情報を抽出できる。
【００２４】
本発明の請求項６に記載された発明は、解析管理手段が、差分によって高周波成分情報を得ることにより、高周波成分が支配的となる被写体の存在情報を得ることを特徴とする請求項５記載の顕微鏡画像解析装置であって、単純な差分計算によって高周波成分が支配的となる微小物体等の被写体の存在情報が得られる。
【００２５】
本発明の請求項７に記載された発明は、２つの被写体の存在情報を比較することにより、解析管理手段がこの２つの被写体の高低を認識することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の顕微鏡画像解析装置であって、２次元スライス画像では２つの被写体、例えば細胞と細胞、細胞と突起等が重なった状態の画像であっても、変化点を抽出して存在情報をえることにより、それぞれが存在する平面の高低を比較することができ、２つの被写体の高低を認識するができる。
【００２６】
本発明の請求項８に記載された発明は、所定高さの平面と被写体が交差する輪郭情報から、解析管理手段が該被写体の３次元情報を得ることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の顕微鏡画像解析装置であって、変化点とその対応する位置情報から所定高さの平面と被写体が交差する輪郭情報が得られるため、輪郭情報を隣接する複数の平面で取得すれば被写体の３次元情報となる。平面の数を増せば詳しい３次元情報も可能となる。
【００２７】
本発明の請求項９に記載された発明は、載置テーブルを高さ方向に移動させ、複数の位置でカメラ部により２次元の顕微鏡画像の撮影を行い、各高さの顕微鏡画像に対して所定の周波数成分情報を抽出するとともに、高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出し、変化点とその対応する位置情報に基づいて、周波数成分が支配的となる被写体の存在情報を得ることを特徴とする顕微鏡画像解析方法であって、２次元スライス画像から所定の周波数成分情報を抽出するため、この周波数成分が支配的となる被写体の情報を分離することができる。高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出するから、空間内の被写体の存在情報を簡単に取得することができる。周波数成分情報の分離で、細胞のような微小物体、あるいはこれから分岐した極細突起、極小突起を抽出して観察できる。明視野で観察するだけであるから、細胞のような被写体を生きたまま観察することができ、再生医療の生体情報取得に欠かせないものである。変化点と位置情報から輪郭等の３次元データを抽出し、画像作成に供することができる。
【００２８】
本発明の請求項１０に記載された発明は、ウェーブレット変換によって、顕微鏡画像の低周波成分情報と高周波成分情報を分離して抽出することを特徴とする請求項９記載の顕微鏡画像解析方法であって、ウェーブレット変換によって低周波成分情報と高周波成分情報に分離するため、低周波成分情報と高周波成分情報が同時に得られる。低周波成分情報として粗めの被写体情報が得られ、粗めの被写体は被写体の全体情報を示しているとともに、微細部分はともかく空間内に被写体が存在している存在情報を取得できる。被写体の微細部分の情報が高周波成分情報に含まれており、微細部分の情報が抽出できる。
【００２９】
本発明の請求項１１に記載された発明は、２次元の顕微鏡画像の各点における輝度の差分を計算し、該差分によって所定の周波数成分情報を抽出することを特徴とする請求項９記載の顕微鏡画像解析方法であって、単純な差分計算によって高周波成分が支配的となる微小物体等の被写体の存在情報が得られる。
【００３０】
本発明の請求項１２に記載された発明は、所定高さの平面と被写体が交差する輪郭情報から、該被写体の３次元情報を得ることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の顕微鏡画像解析方法であって、変化点とその対応する位置情報から所定高さの平面と被写体が交差する輪郭情報が得られるため、輪郭情報を隣接する複数の平面で取得すれば被写体の３次元情報となる。平面の数を増せば詳しい３次元情報も可能となる。
【００３１】
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１における顕微鏡画像解析装置とその画像解析方法について説明する。実施の形態１は血管新生をウェーブレット変換の差分で解析したものである。図１は本発明の実施の形態１における顕微鏡画像解析装置の要部外観図、図２は本発明の実施の形態１における顕微鏡画像解析装置のブロック構成図である。
【００３２】
図１において、１は顕微鏡画像を解析する解析装置本体、２は顕微鏡画像や解析装置本体１で画像処理した画像を表示するＬＣＤ等の表示部、３は顕微鏡画像解析装置に入力を行うマウスやキーボード等の入力装置、３ａは以下説明する顕微鏡４の操作を行うための機構操作入力装置である。
【００３３】
４は細胞等を観察したり撮影する顕微鏡、４ａは観察のための透過光を照射する照明部、５は細胞等の試料を多数収納して観察する透明のプラスチックやガラスから作られたマイクロタイタプレートである。６はマイクロタイタプレート５を載置して３次元的（ｘ軸−ｙ軸−ｚ軸方向）に移送できる載置テーブル、６ａは載置テーブル６をｘ軸方向に移動させることができるｘ軸駆動モータ、６ｂは載置テーブル６をｙ軸方向に移動させることができるｙ軸駆動モータ、６ｃは載置テーブル６をｚ軸方向（高さ方向）に移動させることができるｚ軸駆動モータである。操作用ケーブルを介して入力装置３からの入力や、機構操作入力装置３ａからの入力により、ｘ軸駆動モータ６ａ，ｙ軸駆動モータ６ｂ，ｚ軸駆動モータ６ｃをそれぞれの方向に駆動することができ、各試料内で観察する位置を変更したり、２次元スライス画像（本発明の２次元の顕微鏡画像）を撮るときｚ軸方向に位置を変えることができるし、各試料を別の試料に交換することもできる。
連続して撮影するときは、ｚ軸方向の位置を変化させることができる。
【００３４】
さらに、７は顕微鏡４で観察を行うための接眼レンズ、８は回転可能であって選択した１つのレンズで観察するレボルバ式対物レンズ、９は載置テーブル６の移動に伴って２次元スライス画像を撮影するＣＣＤ等のカメラ部である。マイクロタイタプレート５内の細胞等の試料は、照明部４ａからの光を受けて、透過光がレボルバ式対物レンズ８によって像を結び、そのまま接眼レンズ７から観察できるが、一部が分岐されカメラ部９で同時に撮影できる。得られた画像データはＲＧＢ形式からＹＣｒＣｂ形式のデータに変換されてカメラ用ケーブルを介して解析装置本体１に送られ、画像処理される。
【００３５】
次に実施の形態１の顕微鏡画像解析装置のブロック構成について図２に基づいて説明する。図２において、１１は載置テーブル６の移動制御やカメラ部９の撮像制御、その他の顕微鏡４の操作を制御する機構制御部、１２は載置テーブル６を移動するためＸ軸駆動モータ６ａ，Ｙ軸駆動モータ６ｂ，Ｚ軸駆動モータ６ｃを駆動するテーブル駆動手段、１３は照明部４ａを発光させる照明制御手段、１４はユーザの入力でカメラ部９のフォーカス調整を行ったり、シャッタを切ったりするカメラ制御手段、１４ａはカメラ部９が撮影した画像データをＹＣｒＣｂ形式に変換して記憶部に送信する撮像手段、１５は機構操作入力装置３ａからの入力を機構制御部１１に入力する機構操作入力部である。
【００３６】
続いて、顕微鏡画像解析装置の解析装置本体１の内部構成について説明する。
１６は表示部２を動作させる表示制御手段、１７は入力装置３を動作させる操作入力手段である。また、１８はＲＯＭ（リードオンリメモリ）であり、１８ａはＲＯＭ１８内に設けられた制御プログラムを格納するプログラム格納部、１９は作業領域となったりバッファとなるＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）、２０はフラッシュメモリ等の不揮発メモリ部、２０ａはカメラ部９で撮影された画像データや後述するウェーブレット変換した画像データ等をメモリする画像メモリ部、２１はメモリカードや光ディスク等のメモリ媒体、２１ａはメモリ媒体２１の読出記録を行うメモリ媒体入出力部である。メモリ媒体入出力部２１ａは、外部情報がメモリ媒体２１に格納されてここにセットされたとき、これを駆動してデータを読み出して表示させたり、データを記録するためのものである。これにより内部の不揮発メモリ部２０だけでなく、多数のデータをメモリ媒体２１に格納して保存整理することができる。ＲＯＭ１８、ＲＡＭ１９、不揮発メモリ部２０、メモリ媒体２１は顕微鏡画像解析装置の記憶部を構成する。
【００３７】
次に、２２は顕微鏡画像解析装置の演算と制御を行う制御演算手段である。本実施の形態１においては、制御演算手段２２は中央処理装置（ＣＰＵ）から構成され、プログラム格納部１８ａ等から制御プログラムがロードされて各機能を実行する機能実現手段として構成される。同様に以下説明する解析管理手段２５，変化点抽出手段２６，画像生成手段２７，ウェーブレット変換手段２４，差分演算手段（図示しない），通信管理手段２８等はいずれも、本実施の形態１においてはそれぞれ制御プログラムを中央処理装置ないし専用のプロセッサで実行して各機能を実行する機能実現手段である。これらは顕微鏡画像解析装置の解析装置制御部を構成する。但しこれらはそれぞれ各機能を実行する回路等で構成することもできる。
【００３８】
２３は、画像メモリ部２０ａに格納された画像データのフォーマットを変換して表示部２に表示できるようにしたり、周波数成分を抽出したり、画像データに処理を加える画像処理部である。２４は画像処理部２３に設けられたウェーブレット変換手段であり、画像データの輝度（Ｙ）成分を周波数空間で高周波数成分と低周波数成分とに分解するものである。２５は表示部２に解析入力画面を表示させ、操作入力手段１７からの入力に従って画像処理を行う解析管理手段である。
【００３９】
２６は、ｚ軸方向の所定位置ｚ＝ｚｎの２次元スライス画像から被写体情報、例えば微小物体情報を得るために、輝度（Ｙ）成分をウェーブレット変換し、ｚ＝Ｚｎの平面上の各点（ｘ，ｙ，Ｚｎ）でウェーブレット変換成分Ｐｃｚ（ｘ，ｙ）のｚ軸方向の差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）＝ＰｃＺ（ｎ＋１）（ｘ，ｙ）−ＰｃＺｎ（ｘ，ｙ）を計算し（ｎ＝１〜Ｎ）、これをｚ軸方向にｎ＝１からｎ＝Ｎまで繰り返して、差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）に変化が現われる変化点を求める変化点抽出手段である。変化点は差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）の極大値として検出することができる。すなわち、被写体が存在している空間と不存在の空間の境界では輝度が大きく変化し、差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）にそれが現われるからである。
【００４０】
なお、このとき使用するウェーブレット変換成分Ｐｃｚ（ｘ，ｙ）を用いたのは、ウェーブレット変換を行うことで輝度情報が高周波成分と低周波成分とに分解できるからである。被写体が極小物体の場合高周波成分が支配的となり、粗め（大き目）の微小物体は低周波成分が支配的となる。従って、ウェーブレット変換成分Ｐｃｚ（ｘ，ｙ）としてＬＬ成分をみれば粗めの微小物体が支配的に現われ、ＬＨ成分，ＨＬ成分，ＨＨ成分をみると極小物体が支配的に現われる。これにより極小物体の情報を得るときにはＬＨ成分，ＨＬ成分，ＨＨ成分、粗めの微小物体情報を得るときにはＬＬ成分を処理すれば目的の情報が得られる。そしてウェーブレット変換を多段で使用すれば、ＬＬＬＬ成分，ＬＬＬＨ成分，ＬＬＨＬ成分，ＬＬＨＨ成分，ＬＨ成分，ＨＬ成分，ＨＨ成分が得られ、さらに詳細に３次元情報分析を行うことができる。
【００４１】
２７は変化点抽出手段２６によって検出された変化点情報と画像データ等の情報を使って新しい画像をつくる画像生成手段である。例えば入力装置３からの入力により、変化点間を補完などして所定のｚ＝Ｚｎ平面と交差する所定の大きさの物体の輪郭線データを作ったり、こうしたデータの積み重ねとして立体画像を形成することができる。このデータは解析管理手段２５に渡され、解析管理手段２５は入力があればいつでも画像処理部２３で処理をした後、表示部２に表示させることができる。２８は通信管理手段、２９は通信インタフェースとなる通信入出力部である。通信管理手段２８は解析結果を遠隔地に送信するためのもので、一般的なブラウザやメールソフト、ＦＴＰソフトでもよい。
【００４２】
以上説明したウェーブレット変換の詳細と、血管新生の変化点抽出の詳細について説明する。図３（ａ）は本発明の実施の形態１におけるウェーブレット変換の構成図、図３（ｂ）は（ａ）のウェーブレット変換で処理された分解成分図、図３（ｃ）は（ａ）のウェーブレット変換で処理された分解成分の特徴説明図、図４は（ａ）は本発明の実施の形態１における血管新生時の変化点抽出説明図、図４（ｂ）は（ａ）の変化点抽出で得られる差分の分布図、図５は図４（ａ）のｚ方向断面の分解図である。
【００４３】
図３（ａ）において、３１は水平処理を行う水平方向ローパスフィルタ、３２は同じく水平方向ハイパスフィルタ、３３は垂直処理を行う垂直方向ローパスフィルタ、３４は同じく垂直方向ハイパスフィルタ、３５は同じく垂直方向ローパスフィルタ、３６は同じく垂直方向ハイパスフィルタ、３７〜４２はデータを所定の割合で間引くダウンサンプラである。実施の形態１のウェーブレット変換を行うハールウェーブレット関数（Ｈａａｒ Ｗａｖｅｌｅｔ）はハイパスフィルタの伝達関数Ｈ０（ｚ）が（数１）、ローパスフィルタの伝達関数Ｈ１（ｚ）が（数２）で表される。
【００４４】
【数１】
【数２】
このウェーブレット変換手段２４に原画像（２次元スライス画像の輝度情報）を入力すると、図３（ｂ）に示すように水平処理を行う水平方向ローパスフィルタ３１、水平方向ハイパスフィルタ３２によって、スケーリング関数を作用させたものとなる低周波情報であるＬ成分、ウェーブレットを作用させた高周波情報であるＨ成分とに分解される。これをさらに垂直処理を行う垂直方向ローパスフィルタ３３、垂直方向ハイパスフィルタ３４、垂直方向ローパスフィルタ３５、垂直方向ハイパスフィルタ３６に入力すると、スケーリング関数を作用させたことになる低周波情報のＬＬ成分と、ウェーブレットを作用させた高周波情報であるＬＨ成分，ＨＬ成分，ＨＨ成分とに分解される。
【００４７】
ところで、ウェーブレット変換を通すことにより画像上に特徴的な変化が出現する。例えば、原画像として正方形に破線の対角線を記入したものを入力すると、図３（ｃ）に示すように、ＬＬ成分のところではそのまま粗い構成を示すが、ＬＨ成分，ＨＬ成分のところではそれぞれ水平成分，垂直成分が抽出され、ＨＨ成分のところでは斜め方向の成分で細かい構成のものが出力される。ＬＬ成分，ＨＨ成分の他にＬＨ成分，ＨＬ成分を利用すれば分解された画像からさらに有益な画像を構成できる。またこのウェーブレット変換手段をもう一度、すなわち２段で作用させた場合には、ＬＬＬＬ成分，ＬＬＬＨ成分，ＬＬＨＬ成分，ＬＬＨＨ成分が現われ、ＬＬＬＨ成分，ＬＬＨＬ成分，ＬＬＨＨ成分には中間的な大きさの物体情報の水平，垂直，斜め成分が出力される。この情報を利用すれば詳細な解析が可能になる。
【００４８】
そこで、以下、血管新生時の変化点抽出を行って新生血管の３次元情報を取得する方法について説明する。実施の形態１で解析を行う微細構造は新生血管である。図４（ａ）に示すように、新生血管から微細なヒゲ状の微細新生血管が４本分岐されている。２次元スライス画像は、図１においてフォーカスはそのままにしてｚ軸駆動モータ６ｃを駆動し、載置テーブル５を単位ピッチずつ上下方向に移動させ、移動した各位置で繰り返し撮影を行うことにより入手できる。なお、この上下動作は機構制御部１１が自動的に制御する。このような上下動作を行っては撮影し、図４（ａ）ではｎ＝１〜ＮのＮ枚の２次元スライス画像を得る。ｎ＝１がｚ＝Ｚ１、ｎ＝２がｚ＝Ｚ２、・・・、ｎ＝Ｎがｚ＝ＺＮに対応する。
【００４９】
次に、この２次元スライス画像の解析を行う。Ｎ枚の２次元スライス画像上の点（ｘ，ｙ）に対して、ｎ枚目の画像（ｚ＝Ｚｎ平面）と（ｎ＋１）枚目の画像（ｚ＝Ｚｎ＋１平面）との間の差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）を計算し、これをｎ＝１〜Ｎで繰り返し、点（ｘ，ｙ）におけるｚ軸方向の差分分布を求める。次いで点（ｘ，ｙ）を移動し、差分分布の算出をｘ−ｙ平面全体で行う。このようにして算出した差分分布には、ｚ＝Ｚ１からｚ＝ＺＮまでの空間に存在する物体の境界面の位置で大きな変化が現われ、これを検出することで３次元情報を入手することが可能となる。
【００５０】
そこで図４（ａ）の新生血管のＮ枚の２次元スライス画像から新生血管、とくに微細なヒゲ状の微細新生血管をどのようにして検出すのか、具体的に説明する。図４（ａ）において、点（ｘ１，ｙ１，ｚ）を通るｚ軸と平行なラインｓ１は、（ｘ１，ｙ１，ｚ１）と（ｘ１，ｙ１，ｚ’１）の２点で微細新生血管と交差している。同様に、点（ｘ２，ｙ２，ｚ）を通るｚ軸と平行なラインｓ２は（ｘ２，ｙ２，ｚ２）と（ｘ２，ｙ２，ｚ’２）の間に新生血管が存在している。点（ｘ３，ｙ３，ｚ）を通るｚ軸と平行なラインｓ３は（ｘ３，ｙ３，ｚ３）でヒゲ状の微細新生血管と交差している。そして、このようなラインｓ１〜ｓ３に沿って差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）のプロットすると、各ラインにおけるｚ軸方向の差分分布が得られる。
【００５１】
図４（ｂ）はこの分布を示している。ラインｓ１に沿ってはｚ＝ｚ１近傍で２つの極大値、ｚ＝ｚ’１近傍で２つの極大値が検出される。また、ラインｓ２に沿ってはｚ＝ｚ２とｚ＝ｚ’２でそれぞれ１つずつ極大値が検出され、ラインｓ３に沿ってはｚ＝ｚ３近傍で２つの極大値が検出される。これは点（ｘ１，ｙ１）ではｚ＝ｚ１、ｚ＝ｚ’１近傍で極小の物体が存在していることを示し、点（ｘ２，ｙ２）ではｚ＝ｚ２とｚ＝ｚ’２の間に大きな物体が存在していることを示している。また、点（ｘ３，ｙ３）ではｚ＝ｚ３近傍に極小の物体が存在していることが分かる。これらの極大値のペアが平面上に連なって輪郭を示すことにより、物体が存在していることの境界情報（存在情報）が入手される。言い換えればこの極大値は境界情報の基礎情報ということができる。
【００５２】
実施の形態１においては、原画像にウェーブレット変換を行った画像を使用する。すなわち、Ｎ枚の低周波情報であるＬＬ成分と、高周波情報であるＬＨ成分，ＨＬ成分，ＨＨ成分、とくにＨＨ成分の２次元画像の点（ｘ，ｙ）に対して、ｎ枚目の画像（ｚ＝Ｚｎ平面）と（ｎ＋１）枚目の画像（ｚ＝Ｚｎ＋１平面）との間の差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）をｎ＝１〜Ｎで繰り返して計算し、ウェーブレット変換画像の点（ｘ，ｙ）におけるｚ軸方向の差分分布を求めるものである。これにより、ＬＬ成分の差分分布には、ｚ＝Ｚ１からｚ＝ＺＮまでの各平面における粗めの物体の境界面情報が現われ、ＨＨ成分の差分分布には、ｚ＝Ｚ１からｚ＝ＺＮまでの各平面の微細もしくは微小物体の境界面情報が現われる。
【００５３】
ところで２次元スライス画像には焦点が合っていない物体も撮影されている。
焦点が合っていない場合、輝度が小さく薄い像となっているため、差分も小さく、差分の大きくなるｚ＝Ｚｎ平面付近の物体情報だけを抽出することができる。図５において、（ａ）はｚ＝ｚ１（＝Ｚｍ）に焦点を合わせた２次元スライス画像、（ｂ）はｚ＝ｚ２（＝Ｚｋ）に焦点を合わせた２次元スライス画像、（ｃ）はｚ＝ｚ３（＝Ｚｌ）に焦点を合わせた２次元スライス画像である。但しｎ＝１，２，・・，ｋ，・・，ｌ，・・，ｍ，・・，Ｎである。（ａ）（ｃ）では新生血管と微細なヒゲ状の微細新生血管が１本ずつ濃い像となっており、他のヒゲ状の微細新生血管はやや薄い像となっている。（ｂ）では微細なヒゲ状の微細新生血管はすべて焦点がずれており、薄い像となっている。
【００５４】
このような２次元スライス画像に対してウェーブレット変換手段２４によりウェーブレット変換を行うと、（ｄ）（ｅ）（ｆ）（ｇ）のようなウェーブレット変換画像が得られる。（ｄ）のＬＬ成分では（ａ）の２次元スライス画像とほぼ同じ画像が得られ、ＨＨ成分では（ｘ１，ｙ１，ｚ１）を通るヒゲ状の微細新生血管だけがはっきりと表示される。なお、ＬＬ成分で焦点の合っていない部分の劣化が比較的小さいのは、ダウンサンプラ３７，３９の影響によるものと考えられる。ＨＨ成分では粗めの物体情報や焦点の合っていない部分はぼんやりと表示される。しかし、ヒゲ状の微細新生血管だけは明瞭に抽出される。（ｅ）はｚ＝ｚ’１の２次元スライス画像に対するウェーブレット変換画像であり、ＬＬ成分は（ａ）の２次元スライス画像とほぼ同じであるが、ＨＨ成分は（ｘ１，ｙ１，ｚ’１）を通るヒゲ状の微細新生血管だけがはっきりと写り、他の部分は薄く表示される。（ｆ）のＬＬ成分では（ｂ）の２次元スライス画像とほぼ同じ画像が得られ、ＨＨ成分では（ｘ２，ｙ２，ｚ２）を通るすべてがぼんやりと表示される。（ｇ）のＬＬ成分では（ｃ）の２次元スライス画像とほぼ同じ画像が得られ、ＨＨ成分では（ｘ３，ｙ３，ｚ３）を通るヒゲ状の微細新生血管だけがはっきりと写り、他の部分はぼんやりと表示される。
【００５５】
このように各平面のＬＬ成分、ＨＨ成分に対して、差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）をｚ＝Ｚ１〜ＺＮですべて求め、これを空間全体に広げるから、ＬＬ成分の差分分布には粗め物体の境界面情報が現われ、ＨＨ成分の差分分布には微細もしくは微小物体の境界面情報が現われる。図６は本発明の実施の形態１における顕微鏡画像解析装置で行う画像解析のフローチャート、図７（ａ）は本発明の実施の形態１における微細新生血管の輪郭情報抽出説明図、図７（ｂ）は（ａ）の微細新生血管の輪郭情報の各断面における輪郭図である。
【００５６】
以下、本発明の実施の形態１における顕微鏡画像解析装置で行う画像解析の手順を図６のフローチャートに基づいて説明する。新生血管の場合を想定して説明する。図４（ａ）の新生血管のｚ＝Ｚｎ平面の２次元スライス画像をｎ＝１の画像から取り込む（ｓｔｅｐ１）。この画像をウェーブレット変換し（ｓｔｅｐ２）、差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）を計算する（ｓｔｅｐ３）。その後、ｎ＝１〜Ｎまでのすべての計算が終了したか否かがチェックされ、ｎ＝Ｎの場合はｓｔｅｐ６に進み、ｎ＝Ｎでなければｎ＝ｎ＋１にインクリメントしてｓｔｅｐ１に戻る。
【００５７】
ｓｔｅｐ６では、抽出するように要求されている物体の構造が微細な構造か否かが判断され、微細な構造の場合、ウェーブレット変換画像のＬＨ成分，ＨＬ成分，ＨＨ成分のいずれか、組み合わせ若しくはすべてが選択される（ｓｔｅｐ７）。新生血管ではヒゲ状の微細新生血管を観察する場合に選択される。また、微細な構造というより大まかな構造の新生血管を抽出する場合には、ウェーブレット変換画像のＬＬ成分が選択され（ｓｔｅｐ８）、差分分布から変化点が抽出される（ｓｔｅｐ９）。このとき、例えば差分ΔＨＨｚ（ｘ，ｙ）の差分分布では、焦点の合ったところ以外は輝度が小さく、キャンセルで脱落してヒゲ状の微細新生血管だけの輪郭が浮き彫りになり、差分ΔＬＬｚ（ｘ，ｙ）の差分分布では新生血管の大まかな全体像が抽出される。全体像では微細新生血管はダウンサンプラの作用等もあって薄い像として表示される。
【００５８】
これらを図７（ａ）で説明すると、このｓｔｅｐ９の変化点はｚ＝Ｚｎ平面での差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）が大きく変化する点であり、この変化点を連ねた輪郭ｌｎが微細新生血管とｚ＝Ｚｎ平面の交差する輪郭である。差分分布の極大値で最大値を示す位置が変化点となる。同様に、ｚ＝Ｚｎ＋１平面、Ｚｎ＋２平面、Ｚｎ＋３平面に対して差分Δｃｚ（ｘ，ｙ）が大きく変化する変化点を連ね、輪郭ｌｎ＋１、ｌｎ＋２、ｌｎ＋３がｚ＝Ｚｎ＋１平面、Ｚｎ＋２平面、Ｚｎ＋３平面と交差したときに境界となる輪郭線が得られる。これを別々の平面上にプロットしたものが図７（ｂ）である。
【００５９】
このようにｓｔｅｐ９で変化点を求めると、これらの解析データが３次元情報として獲得され（ｓｔｅｐ１０）、すべて画像メモリ部２０ａに格納される。また画像データを要求したときには、画像生成手段２７によって補完されて詳細な画像情報として出力されたり、観察したい対象だけに絞って表示することができる。
【００６０】
なお以上の説明では、数百μｍ〜ｍｍオーダの新生血管とこれから伸びたμオーダの微細なヒゲ状の微細新生血管を対象に説明したが、再生医療で扱う他の幹細胞、例えば神経幹細胞においてもまったく同様に扱える。とくに脳神経としてμｍ以下のオーダのニューロンと数μｍ〜十数μｍのグロリア細胞等は、数μｍ離れて分かれて存在しているが、この再生医療を行うため観察するときには、これらの細胞を損なうことがあってはならない。本発明の顕微鏡画像解析装置と顕微鏡画像解析方法によれば、これが簡単に実現でき、コストもかからずそれぞれの大きさの物体に分解して観察が可能になる。さらに、詳細は実施の形態２において説明するが、細胞に菌糸が被さった状態の試料等においてもウェーブレットにより同様に解析でき、菌糸だけを明瞭に抽出することができる。解析方法は上述した通りであるから説明は省略する。図８（ａ）は細胞に菌糸が被さった試料の２次元スライス画像の写真による説明図、図８（ｂ）は（ａ）の２次元スライス画像から菌糸だけを抽出した画像による説明図である。図８（ａ）（ｂ）からも分かるように、２次元スライス画像から極細の菌糸だけを分離し、２次元画像にすることが可能である。さらに３次元情報も抽出でき、必要に応じて立体像も表示できる。
【００６１】
このように実施の形態１の顕微鏡画像解析装置とその画像解析方法は、２次元スライス画像を撮影することにより、新生血管のような微小物体と、これから伸びた微細なヒゲ状の微細新生血管のような極小物体とを分離して観察することが可能になる。また、分離した極小物体の輪郭を３次元データとして抽出することができ、補完などを施すことによってさらに詳細で明確な画像や３次元データを安価に提供することができる。
【００６２】
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２における顕微鏡画像解析装置とその画像解析方法について説明する。実施の形態２は細胞に菌糸が被さった試料を差分だけで解析したものである。図９（ａ）は本発明の実施の形態２における細胞に菌糸が被さった試料の外観図、図９（ｂ）は本発明の実施の形態２におけるｘ−ｙ平面上の輝度の差分情報の説明図である。なお、実施の形態１と基本的構成に変わりがなく、図１，図２，図８（ａ）（ｂ）を実施の形態２においても参照し、その詳細な説明は実施の形態１に譲って省略する。
【００６３】
図９（ａ）において、５０は細胞、５１は細胞５０を覆った菌糸である。このように２層を形成する試料を顕微鏡で観察した場合、菌糸５１のため細部５０内部はほとんど観察できない。逆に、菌糸５１の観察を行う場合、細胞５０の像の影響を受けて見づらく、菌糸５１同士の重なりがどちらが上でどちらが下か分からないものであった。
【００６４】
そこで、実施の形態２においては、ｚ軸方向にＮ枚撮影した２次元スライス画像から単純に差分をとることによって菌糸５１を抜き出して３次元情報を確保するものである。実施の形態１の顕微鏡画像解析装置と異なっているのは、輝度の周波数空間への写像がウェーブレット変換でなく、２次元スライス画像の各点における輝度の差分計算であり、この差分によって所定の周波数成分情報を抽出する点である。差分計算のピッチによって異なるが、小さなピッチとすることにより高周波成分、大きなピッチにより低周波成分を抽出することができる。実施の形態２においては菌糸５１の情報を抽出するため小ピッチとしている。この差分の計算は画像処理部２３内に設けられた差分演算手段（図示しない）によって行われる。差分演算手段も制御プログラムを中央処理装置で実行して各機能を実行する機能実現手段である。２次元スライス画像の輝度の差分から高周波成分情報を抽出したら、ｚ軸方向に差分をとって変位点を抽出する。この処理結果は図８（ｂ）に示したとおりである。
【００６５】
実施の形態２の輝度の差分ΔＹｉ，ｊ（ｚ）は、図９（ａ）に示すようにｚ＝Ｚｎ平面上の点（ｘｉ，ｙｊ）の輝度Ｙｉ，ｊ（ｚ）を中心に（ｘｉ−１，ｙｊ−１）、（ｘｉ＋１，ｙｊ）、（ｘｉ，ｙｊ＋１）、（ｘｉ＋１，ｙｊ＋１）間で計算される。すなわち、（ｘｉ−１，ｙｊ−１）の輝度Ｙｉ−１，ｊ−１（ｚ）、（ｘｉ＋１，ｙｊ）の輝度Ｙｉ＋１，ｊ（ｚ）、（ｘｉ，ｙｊ＋１）の輝度Ｙｉ，ｊ＋１（ｚ）、（ｘｉ＋１，ｙｊ＋１）の輝度Ｙｉ＋１，ｊ＋１（ｚ）から（数３）のように計算される。但し（数４）の関係がある。
【００６６】
【数３】
【数４】
変化点は、（数３）で示す差分ΔＹｉ，ｊ（ｚ）のｚ軸方向に関しての差分Δｉｊｚ（ｘｉ，ｙｊ）を（数５）に従って計算し、極大値を検出することで求められる。但し、ｎ＝１〜Ｎである。
【００６９】
【数５】
なお、差分ΔＹｉ，ｊ（ｚ）の計算方法は（数３）だけに限られない。実施の形態２は差分計算を行うだけであるから、きわめて単純で原理的であるとともに、ダウンサンプラ３７〜４２がないため、ウェーブレット変換等で発生するデータ量の減少が起こらない。
【００７１】
続いて、本発明の実施の形態２における顕微鏡画像解析装置で行う画像解析の手順を図１０のフローチャートに基づいて説明する。図１０は本発明の実施の形態２における顕微鏡画像解析装置で行う画像解析のフローチャートである。細胞を菌糸が覆った試料を想定して説明する。ｚ＝Ｚｎ平面の２次元スライス画像を取り込む（ｓｔｅｐ１１）。この画像を高周波、低周波のフィルタ画像に変換し（ｓｔｅｐ１２）、差分Δｉｊｚ（ｘｉ，ｙｊ）を計算する（ｓｔｅｐ１３）。その後、ｎ＝１〜Ｎまですべて計算が終了したか否かがチェックされ、ｎ＝Ｎの場合はｓｔｅｐ１６に進み、ｎ＝Ｎでなければｎ＝ｎ＋１にインクリメントしてｓｔｅｐ１１に戻る。
【００７２】
ｓｔｅｐ１６では、高周波画像または低周波画像ので差分分布から変化点が抽出される。菌糸だけを抽出する場合は、高周波画像から菌糸だけが抽出される。
低周波画像であれば細胞だけを観察できる。ｓｔｅｐ１６で変化点を求めると、これらの解析データが３次元情報として獲得され（ｓｔｅｐ１７）、すべて画像メモリ部２０ａに格納される。そして画像データを要求したときには、画像生成手段２７によって補完されて詳細な画像情報として出力されたり、観察したい対象だけに絞って表示することができる。
【００７３】
実施の形態２の顕微鏡画像解析装置は、画像処理部２３の差分演算手段によって高周波成分を抽出しているが、このほかにも他の周波数変換方式である離散コサイン変換（ＤＣＴ）、フーリエ変換、アダマール変換等で行っても同様である。実施の形態２と同様に図１に示す画像処理部２３にこれを実行する手段が置かれる。
【００７４】
このように実施の形態２の顕微鏡画像解析装置とその画像解析方法は、２次元スライス画像を撮影することにより、細胞のような微小物体と、これから伸びた微細な糸状の極細物体とを分離して観察することが可能になる。また、分離した極小物体の輪郭を３次元データとして抽出することができ、補完などを施すことによってさらに詳細で明確な画像や３次元データを安価に提供することができる。
【００７５】
【発明の効果】
本発明の顕微鏡画像解析装置によれば、各高さの顕微鏡画像に対して所定の周波数成分情報を抽出するとともに、変化点抽出手段が高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出し、変化点とその対応する位置情報に基づいて、周波数成分が支配的となる被写体の存在情報を得ることができ、２次元スライス画像から所定の周波数成分情報を抽出するため、この周波数成分が支配的となる被写体の情報を分離することができる。高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出するから、空間内の被写体の存在情報を簡単に取得することができる。周波数成分情報の分離で、細胞のような微小物体、あるいはこれから分岐した極細突起、極小突起を抽出して観察できる。明視野で観察するだけであるから、細胞のような被写体を生きたまま観察することができ、再生医療の生体情報取得に欠かせないものである。変化点と位置情報から輪郭等の３次元データを抽出し、画像作成に供することができる。共焦点レーザ顕微鏡のように狭い領域を観察するのに留まらず、広い領域の分析を行える。また、データ量も共焦点レーザ顕微鏡に比べ少なくて済み、高速化も可能である。
【００７６】
ウェーブレット変換によって低周波成分情報と高周波成分情報に分離するため、低周波成分情報と高周波成分情報が同時に得られる。低周波成分情報を解析することにより粗めの被写体情報が得られ、粗めの被写体は被写体の全体情報を示しているとともに、微細部分はともかく空間内に被写体が存在している存在情報を取得できる。高周波成分情報を解析することにより微細部分の情報が抽出できる。
【００７７】
また、２次元の顕微鏡画像の各点における輝度の差分を計算し、差分によって所定の周波数成分情報を抽出するから、単純な差分計算によって所定の周波数成分情報を抽出できる。単純な差分計算によって高周波成分が支配的となる微小物体等の被写体の存在情報が得られる。
【００７８】
そして２次元スライス画像では２つの被写体、例えば細胞と細胞、細胞と突起等が重なった状態の画像であっても、変化点を抽出して存在情報をえることにより、それぞれが存在する平面の高低を比較することができ、２つの被写体の高低を認識するができる。変化点とその対応する位置情報から所定高さの平面と被写体が交差する輪郭情報が得られるため、輪郭情報を隣接する複数の平面で取得すれば被写体の３次元情報となる。平面の数を増せば詳しい３次元情報も可能となる。
【００７９】
本発明の顕微鏡画像解析方法によれば、各高さの顕微鏡画像に対して所定の周波数成分情報を抽出し、高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出し、変化点とその対応する位置情報に基づいて、周波数成分が支配的となる被写体の存在情報を得るから、周波数成分が支配的となる被写体の情報を分離することができる。高さ方向に周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出するから、空間内の被写体の存在情報を簡単に取得することができる。周波数成分情報の分離で、細胞のような微小物体、あるいはこれから分岐した極細突起、極小突起を抽出して観察できる。明視野で観察するだけであるから、細胞のような被写体を生きたまま観察することができ、再生医療の生体情報取得に欠かせないものである。変化点と位置情報から輪郭等の３次元データを抽出し、画像作成に供することができる。ウェーブレット変換によって低周波成分情報と高周波成分情報に分離するため、低周波成分情報と高周波成分情報が同時に得られる。単純な差分計算によって高周波成分が支配的となる微小物体等の被写体の存在情報が得られる。変化点とその対応する位置情報から所定高さの平面と被写体が交差する輪郭情報が得られるため、輪郭情報を隣接する複数の平面で取得すれば被写体の３次元情報となる。平面の数を増せば詳しい３次元情報も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１における顕微鏡画像解析装置の要部外観図
【図２】本発明の実施の形態１における顕微鏡画像解析装置のブロック構成図
【図３】（ａ）本発明の実施の形態１におけるウェーブレット変換の構成図
（ｂ）（ａ）のウェーブレット変換で処理された分解成分図
（ｃ）（ａ）のウェーブレット変換で処理された分解成分の特徴説明図
【図４】（ａ）本発明の実施の形態１における血管新生時の変化点抽出説明図
（ｂ）（ａ）の変化点抽出で得られる差分の分布図
【図５】図４（ａ）のｚ方向断面の分解図
【図６】本発明の実施の形態１における顕微鏡画像解析装置で行う画像解析のフローチャート
【図７】（ａ）本発明の実施の形態１における微細新生血管の輪郭情報抽出説明図
（ｂ）（ａ）の微細新生血管の輪郭情報の各断面における輪郭図
【図８】（ａ）細胞に菌糸が被さった試料の２次元スライス画像の写真による説明図
（ｂ）（ａ）の２次元スライス画像から菌糸だけを抽出した画像による説明図
【図９】（ａ）本発明の実施の形態２における細胞に菌糸が被さった試料の外観図
（ｂ）本発明の実施の形態２におけるｘ−ｙ平面上の輝度の差分情報の説明図
【図１０】本発明の実施の形態２における顕微鏡画像解析装置で行う画像解析のフローチャート
【図１１】（ａ）従来の蛍光顕微鏡システムの構成図
（ｂ）従来の蛍光微分顕微鏡装置の構成図
【符号の説明】
１ 解析装置本体
２ 表示部
３ 入力装置
３ａ 機構操作入力装置
４ 顕微鏡
４ａ 照明部
５ マイクロタイタプレート
６ 載置テーブル
６ａ ｘ軸駆動モータ
６ｂ ｙ軸駆動モータ
６ｃ ｚ軸駆動モータ
７ 接眼レンズ
８ レボルバ式対物レンズ
９ カメラ部
１１ 機構制御部
１２ テーブル駆動手段
１３ 照明制御手段
１４ カメラ制御手段
１４ａ 撮像手段
１５ 機構操作入力部
１６ 表示制御手段
１７ 操作入力手段
１８ ＲＯＭ
１８ａ プログラム格納部
１９ ＲＡＭ
２０ 不揮発メモリ部
２０ａ 画像メモリ部
２１ メモリ媒体
２１ａ メモリ媒体入出力部
２２ 制御演算手段
２３ 画像処理部
２４ ウェーブレット変換手段
２５ 解析管理手段
２６ 変化点抽出手段
２７ 画像生成手段
２８ 通信管理手段
２９ 通信入出力部
３１ 水平方向ローパスフィルタ
３２ 水平方向ハイパスフィルタ
３３，３５ 垂直方向ローパスフィルタ
３４，３６ 垂直方向ハイパスフィルタ
３７〜４２ ダウンサンプラ
５０ 細胞
５１ 菌糸
１０１ 蛍光顕微鏡
１０２ モニタ
１０３ パーソナルコンピュータ
１０４ 試料
１０５ 画像取得手段
１０６ 微分演算手段
１０７ 表示手段
１０８ 試料
Claims (12)
- 試料を明視野で観察することができる顕微鏡と、該試料を載置して３次元方向に移動可能な載置テーブルと、前記試料の２次元の顕微鏡画像を撮影することができるカメラ部と、前記載置テーブルの位置制御と前記カメラ部の撮像制御を行うことのできる機構制御部とを備え、
前記載置テーブルの高さ方向の移動に伴って前記カメラ部が２次元の顕微鏡画像の撮影を複数回繰り返し、
各高さの顕微鏡画像に対して画像処理部が所定の周波数成分情報を抽出するとともに、変化点抽出手段が高さ方向に前記周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出し、
解析管理手段が、該変化点とこれと対応した位置情報に基づいて、前記周波数成分が支配的となる被写体の存在情報を得ることを特徴とする顕微鏡画像解析装置。 - 前記画像処理部にはウェーブレット変換手段が設けられ、低周波成分情報と高周波成分情報に分解することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡画像解析装置。
- 前記解析管理手段が前記低周波成分情報を解析することにより粗めの被写体の存在情報を得ることを特徴とする請求項２記載の顕微鏡画像解析装置。
- 前記解析管理手段が前記高周波成分情報を解析することにより微細な被写体の存在情報を得ることを特徴とする請求項２または３に記載の微鏡画像解析装置。
- 前記画像処理部には差分演算手段が設けられ、前記差分演算手段が２次元の顕微鏡画像の各点における輝度の差分を計算し、該差分によって所定の周波数成分情報を抽出することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡画像解析装置。
- 前記解析管理手段が、前記差分によって高周波成分情報を得ることにより、高周波成分が支配的となる被写体の存在情報を得ることを特徴とする請求項５記載の顕微鏡画像解析装置。
- ２つの被写体の存在情報を比較することにより、前記解析管理手段がこの２つの被写体の高低を認識することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の顕微鏡画像解析装置。
- 所定高さの平面と被写体が交差する輪郭情報から、前記解析管理手段が該被写体の３次元情報を得ることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の顕微鏡画像解析装置。
- 載置テーブルを高さ方向に移動させ、複数の位置でカメラ部により２次元の顕微鏡画像の撮影を行い、
各高さの顕微鏡画像に対して所定の周波数成分情報を抽出するとともに、高さ方向に前記周波数成分情報の差分計算を行って変化点を抽出し、
前記変化点とその対応する位置情報に基づいて、前記周波数成分が支配的となる被写体の存在情報を得ることを特徴とする顕微鏡画像解析方法。 - ウェーブレット変換によって、顕微鏡画像の低周波成分情報と高周波成分情報を分離して抽出することを特徴とする請求項９記載の顕微鏡画像解析方法。
- ２次元の顕微鏡画像の各点における輝度の差分を計算し、該差分によって所定の周波数成分情報を抽出することを特徴とする請求項９記載の顕微鏡画像解析方法。
- 所定高さの平面と被写体が交差する輪郭情報から、該被写体の３次元情報を得ることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の顕微鏡画像解析方法。
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