CN106841147A - 用于循环中干细胞在体实时无损检测及归巢动力学研究方法与装置 - Google Patents
用于循环中干细胞在体实时无损检测及归巢动力学研究方法与装置 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于循环中干细胞在体实时无损检测及归巢动力学研究装置及方法，包括：激发光系统(A)、激光聚焦系统(B)、检测平面(C)、检测窗口(D)、照明系统(E)、成像系统(F)、荧光信号检测系统(G)、信号放大系统(H)、数据处理系统(L)；所述的激发光系统(A)通过激光聚焦系统(B)聚焦于血管上构成检测平面(C)，所述的检测平面(C)上设有检测窗口(D)，检测窗口(D)上方设有照明系统(E)，所述的照明系统(E)照射到待测部位时，待测部分在成像系统(F)中成像；所述的荧光信号检测系统(G)采集检测窗口(D)处的信号，并通过信号放大系统(H)输送到数据处理系统(L)，进行数据记录和处理。与现有技术相比，本发明可实现长时间的监测干细胞在动物或人体循环中的动力学变化过程，监测干细胞在循环系统中的归巢动力学。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物学领域，尤其是涉及一种用于循环中干细胞在体实时无损检测及归巢动力学研究方法与装置。
背景技术
自多莉羊诞生以来，干细胞与再生生物医学研究领域不断取得了重大技术突破，各类创新性研究成果连续多年被国际顶级学术期刊《科学》评选为了十大科学进展之一。干细胞基础研究的突破更是引起了人们对干细胞技术实际应用的高度重视，尤其是山中伸弥与约翰·格登因在体细胞反向诱导成干细胞和细胞核重新编程所取得的重大成果而获得2012年度的诺贝尔生理学或医学奖，则进一步提升了干细胞技术及产业化对经济与社会发展的巨大影响力。干细胞技术不仅改造也传统医药医疗产业，而且从研发到产业化形成了新的突破型高技术产业，干细胞产业成为了当前全球最具发展潜力的战略性新兴产业。
1983年，Gallatin等在《自然》杂志上首次报道血源性淋巴细胞能选择性地进入二级淋巴器官，这个过程他们用淋巴细胞“归巢”进行定义。后来“归巢”被逐渐用于形容细胞(特别是白细胞)趋向性迁移并定植到特定靶向组织的过程。近年来，随着干细胞疗法的兴起，这个概念被引申至多种干细胞。许多研究表明，干细胞向损伤或缺血等组织的归巢行为和所涉及的一系列分子与白细胞向炎性组织的归巢机制十分相似。尽管白细胞向炎性组织的归巢机制已经比较清楚，干细胞向损伤或缺血组织的归巢的具体机制至今仍尚不完全明确，缺乏评判归巢效率及治疗效率之间相关性的标准方法，包含输注细胞数量、输注部位、归巢时的间隔时间、评估归巢的方法、归巢效率等。
由于某些干细胞具有能归巢至特殊部位的特性，使其有可能成为特殊的药物载体，靶向定位于特殊组织并发挥治疗效用。而要担载有细胞毒性的治疗药物，就必须得确定药物的担载量和药效释放时间，因此，确定干细胞输注后的循环时间，干细胞在归巢途中发生凋亡情况，研究干细胞循环时间及归巢时间以确定出载药筛选时长。
在检测干细胞归巢及趋向性研究方法上，目前主要的评估手段为放射性核素成像、荧光素酶报告基因系统结合小动物活体成像、近红外荧光成像、核磁共振成像、组织切片结合免疫组化及荧光原位杂交技术。这些检测技术都有各自的优劣点，如成像技术虽然能直观反映出细胞在活体组织内的分布情况，但不能反映在血循环中的细胞变化过程，而传统的流式细胞仪技术，虽然能监测血液中细胞的样本，但属于侵袭的检测，并且受限于血样体积和检测灵敏度，无法实现长时间的监测干细胞在循环中的动力学变化过程。
为了克服现有检测手段的不足，实现对循环中的干细胞进行在体、实时、动态监测，对干细胞在循环中的动力学变化进行定量分析，本发明设计了一种用于循环中干细胞在体实时无损检测及归巢动力学研究方法与装置，该装置利用动物血管或人体的血管中自然流动的血流，作为传统流式细胞仪的液流系统，激光聚焦于血管上构成检测平面，当带有荧光标记或自发荧光的干细胞通过检测窗口时，收到激光的激发后的荧光信号就会被共焦的荧光信号检测器所采集到，再通过信号放大收集到计算机中，进行数据记录和处理。该技术具有非侵入性、高灵敏度、能在不影响受检个体生理状态的情况下进行长时程动态监测循环中受检物质的变化情况。这是一种非侵入式的检测技术，避免了传统流式细胞仪需要频繁采样和样本处理过程，对活体样本检测而言较少干扰样本的生理状态，可以高灵敏度的长时动态检测等优点。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种在体、实时、动态监测，对干细胞在循环中的动力学变化进行定量分析的用于循环中干细胞在体实时无损检测及归巢动力学研究方法与装置。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于循环中干细胞在体实时无损检测及归巢动力学研究装置，其特征在于，包括：激发光系统、激光聚焦系统、检测平面、检测窗口、照明系统、成像系统、荧光信号检测系统、信号放大系统、数据处理系统；所述的激发光系统通过激光聚焦系统聚焦于血管上构成检测平面，所述的检测平面上设有检测窗口，检测窗口上方设有照明系统，所述的照明系统照射到待测部位时，待测部分在成像系统中成像；所述的荧光信号检测系统采集检测窗口处的信号，并通过信号放大系统输送到数据处理系统，进行数据记录和处理。
所述的激发光系统包含多种激光波长，该激光波长在紫外波段和/或可见光波段，不同的激光波段对应不同的荧光染料，激光波长的选择根据不同情况选用不同的染料。
所述的激光聚焦系统是透镜或者其它聚焦器件；用于将激发光系统发出的激光聚焦于检测平面上。
所述的检测窗口用来固定动物或人体的待测血管，动物或人体的待测血管根据实验需要而定。检测窗口包括玻璃板等；检测窗口是用来放置动物或者人体的待测血管，激发光从检测窗口射出，通过检测窗口对待测血管内的干细胞进行照射，玻璃板是检测血管和激光出射口之间的一个隔板，避免血管和激光出射口直接接触。
所述的照明系统与检测平面垂直，照明系统照射到待测动物或人体的待测部位时，待测部分会在成像系统中成像。光学照明系统包括由波长为520-550nm，中心波长为530nm的光电二极管等。
所述的成像系统为成像设备，包括CCD；用来固定待测动物或人体的血管以及实时观测血管内荧光标记的干细胞。
所述的荧光信号检测系统、信号放大系统、数据处理系统为常规市售产品。
一种采用所述的用于循环中干细胞在体实时无损检测及归巢动力学研究装置进行研究的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用动物血管或人体血管中自然流动的血流，作为传统流式细胞仪的液流系统，激发光系统通过激光聚焦系统聚焦于血管上构成检测平面，当带有荧光标记或自发荧光的干细胞通过检测窗口时，受到激光的激发后的荧光信号就会被共焦的荧光信号检测系统所采集到，再通过信号放大系统收集到数据处理系统，进行数据记录和处理，照明系统与检测平面垂直，照明系统照射到待测动物或人体的待测部位时，待测部分会在成像系统中成像，成像系统用来固定待测动物或人体的血管以及实时观测血管内荧光标记的干细胞，实现长时间的监测干细胞在动物或人体循环中的动力学变化过程，监测干细胞在循环系统中的归巢动力学。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、该方法这是一种非侵入式的检测技术，避免了传统流式细胞仪需要频繁采样和样本处理过程，对活体样本检测而言较少干扰样本的生理状态，可以高灵敏度的长时动态检测。
2、该方法可以对循环中的干细胞进行实时监测，能实时监测循环中干细胞数量变化，评估转移进程，评价治疗效果。
3、该方法能有效确定干细胞输注后的循环时间，干细胞在归巢途中发生凋亡情况，方便研究干细胞循环时间及归巢时间。
4、该方法用途广泛：可广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。
附图说明
图1为本发明装置示意图；
图2为在体流式细胞仪(M1，M2，M3：为反射镜；显微镜镜头为0.6A，40倍物镜；DM1、DM 2为双色分光镜；AL1、AL 2、AL 3、AL 4为消色差透镜；CL为柱透镜；MS为机械狭缝；F1、F2为滤光片，PMT为光电倍增管，用来将光信号转换成电信号)；
图3为活体流式细胞仪检测尾静脉注射DiD标记的MSC在皮下瘤小鼠中的循环时间为10天，绝大部分MSC从循环中消失时仍有极少量的DiD阳性信号存在于循环中；
图4为典型的反弹峰出现在40小时；
图5A为在体流式细胞仪检测尾静脉注射DiD标记的MSC在原位瘤小鼠模型中的循环时间为8天，绝大部分MSC从循环中消失时仍有极少量的DiD阳性信号存在于循环中；
图5B为在第40小时左右出现反弹峰；
图6为在体流式细胞仪检测尾静脉注射DiD标记的MSC在肺转移癌小鼠模型中的循环时间为7天，无明显的反弹峰。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
如图1所示，一种用于循环中干细胞在体实时无损检测及归巢动力学研究装置，包括：激发光系统A、激光聚焦系统B、检测平面C、检测窗口D、照明系统E、成像系统F、荧光信号检测系统G、信号放大系统H、数据处理系统L；所述的激发光系统A通过激光聚焦系统B聚焦于血管上构成检测平面C，所述的检测平面C上设有检测窗口D，检测窗口D上方设有照明系统E，所述的照明系统E照射到待测部位时，待测部分在成像系统F中成像；所述的荧光信号检测系统G采集检测窗口D处的信号，并通过信号放大系统H输送到数据处理系统L，进行数据记录和处理。
按照以上措施制作了一台样机在体流式细胞仪该样机的，原理如图2所示：其中：
1、激发光系统A：用633nm光纤激光器发出红色激光束对三氟甲磺酸盐染料(DiD)染色的细胞进行激发，激光经过中性密度滤光片NDF控制发射功率后，经双色分光镜DM1反射柱透镜CL，经柱透镜压缩后至机械狭缝MS限制光束大小，截取位于高斯分布中心的激光，形成较为均匀的光束。再经消色差透镜AL1进行消色差后经反射镜M2反射后进入物镜(0.6A，40倍)聚焦系统，在样品聚焦平面(成检测平面C)上生成一个5×72μm的长方形检测窗口D，检测窗口D内聚焦深度为50μm/。
2、成像系统F：光学照明系统E由波长为520-550nm，中心波长为530nm光电二极管LED提供，该波段的光容易被血液吸收，形成对比度强成像较为清晰的图像，同时与638nm的激发波段及664nm波长的发射光均无重叠，相互影响较小。照明光束照射至样本平面后，投射过的部分被物镜(0.6A，40倍)采集，形成平行光被双色分光镜DM3反射经滤光片F1虑光后通过消色差透镜AL2进行消色差处理后至CCD前方的消色差透镜AL2最终聚焦到CCD感光元件上。通过移动三维载物台，使样本在显示区域成清晰的像。激发光路发出的线性光斑覆盖相应成像平面，使其光斑长轴覆盖完血管直径，并垂直于血流方向，当血液流过光斑聚焦平面时能全被光斑平面覆盖并激发，当血流中荧光标记过的细胞流经光斑平面时被有效激发，并发射出相应波长的荧光，通过荧光信号检测系统G搜集信号；
3、荧光信号检测系统G：当荧光标记的样本被特定波长的激光激发后，发出相应波长的荧光，通过同一物镜采集，穿过双色分光镜DM2，经过双色分光镜DM2反射到检测光路，透过带通滤光片F2、消色差透镜AL4及MS后被光电倍增管接收；
4、信号采集及处理：当荧光信号被PMT检测后经微电流放大器(信号放大系统H)放大，再由5千赫兹信号模拟/数字信号转换为数字信号，传入计算机，应用Measure Foundry软件进行观察记录(即数据处理系统L)。
当用另外一种波长的激光(488)激发时，原理类似，此时会用到反射镜M1、M3以及滤光片F3、消色差透AL3。
经过一系列实验验证证明：该方法是一种非侵入式的检测技术，该装置不仅可以用于动物在体的各类干细胞实时检测、归巢动力学研究，能有效确定干细胞输注后的循环时间，干细胞在归巢途中发生凋亡情况，方便研究干细胞循环时间及归巢时间。同时可以对人体循环中的干细胞进行实时监测，能实时监测循环中干细胞数量变化，有效确定干细胞输注后的循环时间，干细胞在归巢途中发生凋亡情况，评估转移进程，评价治疗效果。
下面列举一个荧光染料标记间充质干细胞(MSC)在肿瘤模型体内归巢特性研究的实验进行简单说明：
间充质干细胞(MSC)在肿瘤模型体内归巢特性研究采用Balb/c小鼠为MSC细胞来源，用先天免疫缺陷的Balb/c nude裸鼠构建肿瘤模型。
1、DiD-MSC细胞在皮下瘤小鼠模型中归巢时间
皮下瘤构建成功以后，将DiD标记后的MSC细胞通过尾静脉缓慢注射入小鼠体内，立即放置入到样机的样本平台开始检测。连续监测一个小时的数据，以每十分钟为一次小的节点，最后将所有数据汇总后，统计平均每分钟检测到的DiD信号数目，代表着循环中MSC的细胞数量变化趋势，取了6只模型小鼠为每个时间点的平行样本。结果如图3所示，DiD标记的MSC在皮下瘤小鼠中在循环中数量变化呈一定波动变化趋势，在刚注入循环的2小时内细胞数量平稳维持在4个/分钟，在4-8小时后循环中细胞数量出现上升到12小时出现下降，在第14小时和40小时及60小时出现了比较明显的回升，而10天以后信号逐渐从循环中消失(图3)。图4为典型的在40小时和66小时出现的反弹峰情况，在第十天以后仍然有极少量的红色DiD信号存在于外周血循环中。
2.DiD-MSC细胞在原位瘤小鼠模型中归巢时间
原位肿瘤模型在接种四周以后通过尾静脉注射DiD标记的MSC细胞，经过样机连续检测在不同时间段循环中的DiD信号如图5所示：每分钟MSC细胞数在循环中呈逐渐减少趋势(图5A)，在第四十小时出现了细胞数目的反弹，而每分钟DiD信号数目在第八天后趋近于零。图5B为典型的DiD信号在30-48小时出现反弹峰的情况。
3.DiD-MSC细胞在肺转移癌小鼠模型中归巢时间
肺转移癌在接种四周后，用样机连续监测通过尾静脉注射DiD标记的MSC细胞，测得MSC在循环中清除曲线及循环时间如图6所示，每分钟MSC细胞数在循环中呈逐渐减少趋势(图6)，在循环中第四小时出现了数量增多，两小时后循环中DiD信号数量陡降，并在第七天从循环中清除。
实施例2
所述的激发光系统A包含多种激光波长，该激光波长在紫外波段和/或可见光波段，不同的激光波段对应不同的荧光染料，激光波长的选择根据不同情况选用不同的染料。在本实施例中选用紫外光波长，染料对应选用丹磺酰氯等。
Claims (7)
1.一种用于循环中干细胞在体实时无损检测及归巢动力学研究装置，其特征在于，包括：激发光系统(A)、激光聚焦系统(B)、检测平面(C)、检测窗口(D)、照明系统(E)、成像系统(F)、荧光信号检测系统(G)、信号放大系统(H)、数据处理系统(L)；所述的激发光系统(A)通过激光聚焦系统(B)聚焦于血管上构成检测平面(C)，所述的检测平面(C)上设有检测窗口(D)，检测窗口(D)上方设有照明系统(E)，所述的照明系统(E)照射到待测部位时，待测部分在成像系统(F)中成像；所述的荧光信号检测系统(G)采集检测窗口(D)处的信号，并通过信号放大系统(H)输送到数据处理系统(L)，进行数据记录和处理。
2.根据权利要求1所述的一种用于循环中干细胞在体实时无损检测及归巢动力学研究装置，其特征在于，所述的激发光系统(A)包含多种激光波长，该激光波长在紫外波段和/或可见光波段，不同的激光波段对应不同的荧光染料，激光波长的选择根据不同情况选用不同的染料。
3.根据权利要求1所述的一种用于循环中干细胞在体实时无损检测及归巢动力学研究装置，其特征在于，所述的激光聚焦系统(B)是透镜或者其它聚焦器件；用于将激发光系统(A)发出的激光聚焦于检测平面(C)上。
4.根据权利要求1所述的一种用于循环中干细胞在体实时无损检测及归巢动力学研究装置，其特征在于，所述的检测窗口(D)用来固定动物或人体的待测血管。
5.根据权利要求1所述的一种用于循环中干细胞在体实时无损检测及归巢动力学研究装置，其特征在于，所述的照明系统(E)与检测平面(C)垂直，照明系统(E)照射到待测动物或人体的待测部位时，待测部分会在成像系统(F)中成像。
6.根据权利要求1所述的一种用于循环中干细胞在体实时无损检测及归巢动力学研究装置，其特征在于，所述的成像系统(F)为成像设备，包括CCD；用来固定待测动物或人体的血管以及实时观测血管内荧光标记的干细胞。
7.一种采用如权利要求1～6所述的用于循环中干细胞在体实时无损检测及归巢动力学研究装置进行研究的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用动物血管或人体血管中自然流动的血流，作为传统流式细胞仪的液流系统，激发光系统(A)通过激光聚焦系统(B)聚焦于血管上构成检测平面(C)，当带有荧光标记或自发荧光的干细胞通过检测窗口(D)时，受到激光的激发后的荧光信号就会被共焦的荧光信号检测系统(G)所采集到，再通过信号放大系统(H)收集到数据处理系统(L)，进行数据记录和处理，照明系统(E)与检测平面(C)垂直，照明系统(E)照射到待测动物或人体的待测部位时，待测部分会在成像系统(F)中成像，成像系统(F)用来固定待测动物或人体的血管以及实时观测血管内荧光标记的干细胞，实现长时间的监测干细胞在动物或人体循环中的动力学变化过程，监测干细胞在循环系统中的归巢动力学。
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