WO2006104201A1 - 細胞画像解析方法、細胞画像解析プログラム、細胞画像解析装置、スクリーニング方法およびスクリーニング装置 - Google Patents

Abstract

　細胞画像を使って行う化合物スクリーニングにおいて、自動化された処理により、細胞に有効な作用を与える化合物を探索し、また、化合物探索を既存の方法より効果的に行う。本発明は、撮影条件の異なる複数の細胞画像を取得する撮影部（５５）と、前記複数の細胞画像に基づいて、細胞の位置と、少なくとも１つの特徴量を抽出し、前記抽出された特徴量をパラメータとして統計的に解析する解析部（８０）と、を具備する装置を提供する。

Description

明 細 書

細胞画像解析方法、細胞画像解析プログラム、細胞画像解析装置、スク リーニング方法およびスクリーニング装置

技術分野

[0001] 本発明は、動植物の細胞画像を画像処理することにより所定のデータ抽出を行う細 胞画像解析方法および細胞画像解析装置に関する。

[0002] また本発明は、生細胞を使ったガン等の病理診断および薬剤スクリーニング等に使 用される細胞画像解析方法、細胞画像解析プログラムおよび細胞画像解析装置に 関するものである。

[0003] さらに本発明は、画像処理を用いたスクリーニング方法およびスクリーニング装置に 関し、特に、顕微鏡により取得された細胞画像に関して、細胞の形態的な変化を比 較するスクリ一ユング方法およびスクリ一ユング装置に関するものである。

背景技術

[0004] バイオテクノロジーや医薬品開発の分野では動植物細胞や微生物などに対する様 々な薬品や薬などの物質の効果や影響、またはこれらの物質に対する動植物細胞 や微生物等の反応を確認する作業が行われる。

[0005] 特に、複数の薬品候補から、もっとも細胞に効果のあるものを探す作業は、細胞べ ースのスクリーニング、或いは、単純に「薬剤スクリーニング」または「細胞スクリーニン グ」と呼ばれる。この薬剤スクリーニングは、通常目視により行われる。例えば、薬剤を 投与した細胞と投与して!/、な 、細胞を顕微鏡で実験者が観察し、視野中の細胞の数 をカウントする。これら細胞の総数や、一視野辺りの平均細胞数を計算し、薬剤の細 胞を殺す効果を測定することができる。

[0006] また、特に、生細胞を使った薬剤スクリーニングにお 、ては、薬剤を投与した後、適 当な刺激を培養細胞に与え、刺激を与えて 、な 、細胞との差異を定量化することに より、薬剤効果を測定する。これら薬剤スクリーニングにおいて、各処理は人間により 行われるのが通常である。

[0007] また、ガン細胞を使った様々な実験系は、多くの場合、対象となるガン細胞を遺伝 子導入などによって性質を変化させた後行われる。このように未知な操作を細胞に対 して行う場合、細胞の基本的な性質が変化してしまう場合が多い。特にガン細胞を対 象とした実験では、ガン細胞としての特徴的な性質が失われる場合が多いので、これ ら細胞がガン細胞としての性質をもって 、るかをはじめに確認しなくてはならな 、。

[0008] 細胞を培養して、一定時間後に培養前と培養後の細胞増殖数の違いによりガン細 胞かどうかを判断することがある。つまり、一定時間後に細胞数が増えているとガンと 判断する。バイオプシーなどにより人体力も採取した組織がガン細胞であるかどうか を診断する、ガンの病理診断もそれにあたる。この細胞数の変化に対しては、一般的 に検査者が手計測て培養前後の細胞数を顕微鏡などで目視観察によりカウントして いる。また、抗ガン剤の薬剤スクリーニングにおいては、例えば、増殖するガン細胞に 対して薬剤を投与し、一定時間経過後にガン細胞の細胞数をカウントすることで増殖 を抑える事ができるかどうかの薬効を測る。この細胞カウントおよび培養前後の細胞 数の比較作業は検査者の手によって行なわれる。

[0009] し力しながら、薬剤スクリーニングの、細胞の観察により薬効を評価する段階は、通 常人間の作業によって実施されるが、大量の薬剤を探索するスクリーニングにおいて は、実験者の負担力 Sかなり大きいため、自動化することが課題となっている。

[0010] 細胞の解析を自動で行う装置としてはフローサイトメーターが知られて 、る。フロー サイトメーターは、細胞を浮遊液中に流すことで単離させ各細胞の生死、大きさ、形 状などを測定する装置である。フローサイトメーターを使うことで薬剤スクリーニングを 自動で行うことも可能である。

[0011] さらに、簡単な画像解析ソフトを備えた細胞解析装置も存在する。この装置では、 目視と同じ手続きで細胞の画像を顕微鏡で取得し、この画像を解析し、自動で薬剤 の効果を測定している。

[0012] 画像解析ソフトを使った装置は、実験者の行う前処理が目視観測を行う場合と同じ なので、実験者の負担が少ないという利点がある。一方現在の装置は、画像解析の 精度が必ずしも高いとは言えず、また解析対象とするパラメータも、細胞の生死数で あるとか、細胞のおおよその大きさであるとか、突起の位置であるとか、簡単な単一パ ラメータとその平均を使った解析を行う程度である。 [0013] 一方、細胞画像情報 (例えば、蛍光発光する細胞）をカメラ等で撮像して画像処理 により細胞の輪郭を抽出する技術などが紹介されている (例えば、特許文献 1参照。 ) 特許文献 1 :特開 2001— 269195号公報

発明の開示

[0014] 細胞を使ったスクリーニングは、細胞を観察し、細胞位置を認識し、さらに各細胞の 特徴量を抽出し、最後にこれらの特徴量を解析することによって、例えば薬効を予測 するなどの作業を行う。細胞の特徴量は、細胞の大きさ、最大半径、突起などの形態 的なものや、各細胞の生死なども含む。

[0015] 画像解析を用いた細胞ベースのスクリーニング技術は、特にフローサイトメーターな ど画像を使わない細胞解析と比較して以下の点で優れた特徴をもつ。

(1) 細胞の形態情報を取得することができ、例えば突起伸張効果など形態情報を 使って効果を予測するスクリーニングを行うことができる。

(2) 解析を行う前処理として実験者が行わなくてはならない作業、つまり、細胞を 単離などの作業を行う必要がなくなり負担を減らすことができる。

(3) 細胞の位置関係がわ力るので、例えば細胞周辺の局所的な細胞密度が与え る化合物の作用への影響などの、細胞間の相互作用を間接的に考慮に入れた解析 を行うことができる。

[0016] そこで、薬剤スクリーニングを効率よく行い、実験者の負担を軽くするためには、細 胞解析を自動化しなければならない。スクリーニング作業の自動化のためには、まず 、細胞認識を自動化することが必要とされる。

[0017] スクリーニングを効率よく行うには、自動化に伴って、細胞の特徴量パラメータを効 率よく選択しなくてはならない。例えば、細胞のサイズを変える効果のある薬品のスク リー-ングを、細胞数変化を指標に行っても有効な薬品を見つけることができない。 しかしながら既存の細胞解析装置では、細胞の特徴量パラメータはあらかじめ固定さ れたものを使っているのが普通である。

[0018] また、それぞれのパラメータの測定に関して、典型的な例と共にその測定精度が公 表され、精度に対する信頼度があらかじめ設定されている。し力しながら、実際の実 験においては、各系によって、実験条件や、細胞の状態、撮影条件など様々な要素 が異なるので、精度も各実験により異なると考えられる。精度が充分高くないことが判 明した場合には、測定の精度を上げるために実験条件の変更などが必要になってく る。例えば、撮影前の細胞に行う前処理を変更するなどがあげられるが、複雑な前処 理が必要な系は効率的なスクリーニングには不向きである。従って、各実験、各条件 に沿って測定に最適なパラメータを見つけることは、正確な薬剤スクリーニングの実 現のための重要な要素である。

[0019] さらに、フローサイトメーターなどの細胞解析方法と比較して著しく異なるのは、細 胞の顕微鏡画像をそのまま解析対象にしている点である。このように、顕微鏡画像を 使うことによって、実験手続きが実験者の直接の目視による観察方法に近ぐ独自の 手順を必要としないという実験上の利点があり、さらに、目視と同じ像を使って解析を 行うため直感的に結果の解釈ができるという利点がある。

[0020] また、薬剤スクリーニングは、分子間などの化合物のみの反応を見る 、わゆる試験 管内での実験 (in vitro)の系と比べて生体内に近いという特徴を持つ。

すなわち、薬剤スクリーニングにおいては、細胞を単離する必要がなぐ複数の細 胞がお互い作用しあっていると思われる状態を観察できるので、より生体内に近い情 報を得ることができる。逆にこのことから、詳細なスクリーニング結果を出すには、細胞 の相互の位置情報を使った解析をする必要があると思われる。

[0021] 上記のように、薬剤スクリーニング技術においては以下のような課題がある。

(1) スクリーニングを効率よく行うために、スクリーニングで行う各処理を自動化し なくてはならない。特に解析部分では、細胞の画像を正しく解析し、細胞の位置を正 確に認識しなければ 、けな 、。

(2) 計測する細胞のパラメータを効率よく選択しなくてはならない。有効なスクリー ニング結果を出すには適切な細胞パラメータの選択が必要である。

(3) スクリーニングのための薬効評価を正しく行うためにパラメータの検証を充分 行わなくてはならない。

[0022] また、検査者が顕微鏡等で観察される、例えば、蛍光発光して!/、る細胞の数を目視 でカウントしてゆく場合には、多大な労力を費やすだけでなくカウントミス等も発生し、 正しい作業を行なうことができないという問題がある。また、創薬分野などでは大量の 検体 (例えば、 1日 1000検体)を使用して解析する必要があり、ミスの増力！]、効率の 低下を招く可能性が高い。

[0023] また、画像処理により細胞の輪郭を抽出する場合、細胞数のカウントのためにはさ らに細胞を認識するなどの処理が必要である。しかし、既存の技術は細胞数のカウン トに用いるまでに至って ヽな 、場合が多 、ため、結局のところ最終的には細胞数を 検査者が目視でカウントしなければならな 、と 、う不都合がある。

[0024] スクリーニングの自動化は、細胞画像を取得する段階と、取得した細胞画像を解析 する段階に分けることができる。細胞画像の解析は、適当な画像処理方法を用いて、 細胞の特徴量を抽出し、異なる条件下の細胞画像での特徴量値を比較することによ つて行われる。

し力しながら、プログラム処理過程でノイズの除去ができな 、場合が多 、などの理 由で、薬剤効果の評価精度が高くな 、場合が多 、と 、う課題がある。

[0025] 細胞形態の特徴量抽出においては、精度良く正確に特徴量を取得することが第一 の課題である。精度とは、第一に取得のための解析段階の精度であり、これは、解析 ソフトウェアのプログラムなどに原因がある場合が多ぐまた、薬効に対する精度という 考えもあり、これは特徴量が薬効をうまく表現していないなどの場合である。本来薬の 効果があるはずなのに、特徴量では効果の差が出ないなどの場合には、精度が低い といえるが、これは実験系の設定の仕方などに依存する精度である。

[0026] 形態特徴量の精度が低くなる原因としては、さらに、細胞画像中に含まれる生細胞 以外の物質による画像ノイズを特徴量に含めてしまうということが第一の原因であり、 特徴量の定義 '選択が適切ではないことが次にあげられる。

[0027] 本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、効率の良いスクリーニング を行うことができ、正確な薬剤の効果測定を行うことが可能な細胞画像解析方法およ び細胞画像解析装置を提供することを目的とする。

[0028] また、本発明は、検査者の負担および検査ミスを低減し、細胞数を正確にカウント することを可能とする細胞画像解析方法、細胞画像解析プログラムおよび細胞画像 解析装置を提供することを目的とする。 [0029] さらに本発明は、適正な形態特徴量を用いてより精度の高い薬剤スクリーニングを 行うことができるスクリーニング方法およびスクリーニング装置を提供することを目的と している。

[0030] 本発明の第 1の態様に係る細胞画像解析方法は、撮影条件の異なる複数の細胞 画像を取得する撮影工程と、前記複数の細胞画像に基づいて、細胞の位置と、少な くとも 1つの特徴量を抽出し、前記抽出された特徴量をパラメータとして統計的に解 析する解析工程と、を有することを特徴とする。

[0031] 前記解析工程において、複数の前記特徴量の相関関係に基づいてパラメータ設 計をし、これらのパラメータを用いて化合物の有効性を評価することとしてもよ!、。

[0032] 前記解析工程において、前記相関関係に基づいて、前記パラメータの重み付けを 変更することとしてもよい。

[0033] 前記解析工程において、前記相関関係と前記測定結果に基づいて、パラメータの 測定精度あるいは測定の信頼性を評価することとしてもょ 、。

[0034] 前記解析工程にお!、て、前記パラメータの測定精度あるいは測定の信頼性の評価 に基づいて、測定系の条件による変化を最も有効に表現するパラメータを選択するこ ととしてもよ 、。

[0035] 前記解析工程にお!、て、前記選択されたパラメータに基づ 、て、細胞評価に最も 有効な指標となるパラメータを選択することとしてもよい。

[0036] 前記解析工程において、複数の前記特徴量の相関関係に基づいてパラメータ設 計をし、これらのパラメータを用いて化合物の有効性を評価する場合には、各細胞の 位置情報を用いて細胞の特徴量を解析することとしてもょ 、。

[0037] 前記位置情報は、局所的な細胞密度、最近接細胞までの距離、細胞同士が接して

V、る力否かの情報を含んで 、てもよ 、。

[0038] 本発明の第 2の態様に係る細胞画像解析装置は、撮影条件の異なる複数の細胞 画像を取得する撮影部と、前記複数の細胞画像に基づいて、細胞の位置と、少なく とも 1つの特徴量を抽出し、前記抽出された特徴量をパラメータとして統計的に解析 する解析部と、を具備することを特徴とする。

[0039] 前記解析部は、複数の前記特徴量の相関関係に基づいてパラメータ設計をし、こ れらのパラメータを用いて化合物の有効性を評価するものであってもよ 、。

[0040] 前記解析部は、前記相関関係に基づ 、て、前記パラメータの重み付けを変更する ものであってもよい。

[0041] 前記解析部は、前記相関関係と前記測定結果に基づいて、パラメータの測定精度 あるいは測定の信頼性を評価するものであってもよ 、。

[0042] 前記解析部は、前記パラメータの測定精度ある!、は測定の信頼性の評価に基づ 、 て、測定系の条件による変化を最も有効に表現するパラメータを選択するものであつ てもよい。

[0043] 前記解析部は、前記選択されたパラメータに基づいて、細胞評価に最も有効な指 標となるパラメータを選択するものであってもよ 、。

[0044] 前記解析部が複数の前記特徴量の相関関係に基づいてパラメータ設計をし、これ らのパラメータを用いて化合物の有効性を評価するものである場合、前記解析部は、 各細胞の位置情報を用いて細胞の特徴量を解析するものであってもよ 、。

[0045] 前記位置情報は、局所的な細胞密度、最近接細胞までの距離、細胞同士が接して V、る力否かの情報を含んで 、てもよ 、。

[0046] 本発明の第 3の態様に係る細胞画像解析方法は、細胞から発せられる光を所定の 時間間隔をあけて複数の画像として受けとる画像情報入力工程と、該画像情報入力 工程で得られた複数の画像中の輝度値が規定値以上のピクセルの存在割合を算出 する輝度値演算工程と、該輝度値演算工程で得られた複数の画像における規定値 以上の輝度値を有するピクセルの存在割合を比較演算する比較演算工程とを含む。

[0047] また、本発明の第 4の態様に係る細胞画像解析方法は、細胞から発せられる光を 所定の時間間隔をあけて複数の画像として受けとる画像情報入力工程と、該画像情 報入力工程で得られた画像情報に対して画像中に存在する細胞の個数を計数する 個数計数工程と、該個数計数工程で得られた結果を元に複数の画像中の細胞の個 数を比較演算する比較演算工程と含む。

[0048] 上記第 4の態様においては、前記個数計数工程が、細胞核よりも小さい第 1の円と 、細胞核よりも大きい第 2の円と、第 2の円よりも大きい第 3の円とからなる 3重の同心 円と、各画像中の規定値以上の輝度値を有する領域とを対比し、第 1の円内の全て のピクセルが規定値以上の輝度値を有し、第 1の円と第 2の円との間の環状領域に 規定値以上の輝度値を有するピクセルが存在し、かつ、第 2の円と第 3の円との間の 環状領域に規定値以上の輝度値を有するピクセルが存在しないことを条件として、 細胞の存在を認定し、計数することが好ましい。

[0049] また、上記第 3の態様または第 4の態様にぉ 、ては、前記比較演算工程で得られた 演算結果に基づいて細胞の活性または増殖度を判定する判定工程を含むこととして ちょい。

また、前記判定工程にぉ 、て判定された細胞の活性または増殖度に基づ 、て細胞 を分類することとしてもよい。

また、前記判定工程にぉ 、て判定された細胞の活性または増殖度に基づ 、て薬剤 の細胞への影響を定量ィ匕することとしてもょ 、。

[0050] また、本発明の第 5の態様に係る細胞画像解析プログラムは、所定の時間間隔をあ けて細胞カゝら発せられた光を撮影して得られた複数の画像情報に対して、輝度値が 規定値以上のピクセルの存在割合を算出する輝度値演算工程と、該輝度値演算ェ 程で得られた複数の画像における規定値以上の輝度値を有するピクセルの存在割 合を比較演算する比較演算工程とをコンピュータに実行させる。

[0051] また、本発明の第 6の態様に係る細胞画像解析プログラムは、所定の時間間隔をあ けて細胞カゝら発せられた光を撮影して得られた複数の画像情報に対して、画像中に 存在する細胞の個数を計数する個数計数工程と、該個数計数工程で得られた結果 を元に複数の画像中の細胞の個数を比較演算する比較演算工程とをコンピュータに 実行させる。

[0052] 上記第 6の態様においては、前記個数計数工程が、細胞核よりも小さい第 1の円と 、細胞核よりも大きい第 2の円と、第 2の円よりも大きい第 3の円とからなる 3重の同心 円と、各画像中の規定値以上の輝度値を有する領域とを対比し、第 1の円内の全て のピクセルが規定値以上の輝度値を有し、第 1の円と第 2の円との間の環状領域に 規定値以上の輝度値を有するピクセルが存在し、かつ、第 2の円と第 3の円との間の 環状領域に規定値以上の輝度値を有するピクセルが存在しないことを条件として、 細胞の存在を認定し、計数することが好ましい。 [0053] また、本発明の第 7の態様に係る細胞画像解析装置は、細胞から発せられる光を 所定の時間間隔をあけて複数の画像として受けとる画像情報入力部と、該画像情報 入力部で得られた複数の画像中の輝度値が規定値以上のピクセルの存在割合を算 出する輝度値演算部と、該輝度値演算部で得られた複数の画像における規定値以 上の輝度値を有するピクセルの存在割合を比較演算する比較演算部とを含む。

[0054] また、本発明の第 8の態様に係る細胞画像解析装置は、細胞から発せられる光を 所定の時間間隔をあけて複数の画像として受けとる画像情報入力部と、該画像情報 入力部で得られた画像中に存在する細胞の個数を計数する個数計数部と、該個数 計数部で得られた結果を元に複数の画像中の細胞の個数を比較演算する比較演算 部とを備える。

[0055] 本発明の第 9の態様に係るスクリーニング方法においては、顕微鏡により取得した 細胞画像を解析し、細胞画像中の各細胞の形態的な特徴を表す形態特徴量として 、細胞の輪郭の円力ものずれ量をパラメータ化した値を評価し、この評価に基づいて 薬剤スクリーニングを行う。

また、前記第 9の態様においては、前記形態特徴量として、細胞の輪郭の内接円ま たは外接円の少なくともいずれかからのズレ量をパラメータ化した値を評価することと してちよい。

これらにより、細胞の中心部分の大きさや、全体の形の歪み、さらに細胞の空間的 な広がりなどを統一的に把握することができ、細胞の形態変化を効率的に精度良く 表現することができる。

[0056] また、本発明の第 10の態様に係るスクリーニング方法においては、顕微鏡により取 得した複数の細胞画像から構築した 3次元画像を解析し、細胞画像中の各細胞の形 態的な特徴を表す形態特徴量として、細胞の輪郭の球力ものずれ量をパラメ一タイ匕 した値を評価し、この評価に基づ 、て薬剤スクリーニングを行う。

[0057] 上記第 10の態様にぉ 、ては、前記形態特徴量として、細胞の輪郭の内接球または 外接球の少なくともいずれかからのズレ量をパラメータ化した値を評価することとして ちょい。

また、上記第 9の態様または第 10の態様においては、前記形態特徴量に基づいて 、画像中の細胞を生細胞または死細胞のいずれかに判定して評価に使用することが 好ましい。

なお、この判定に際し、細胞は画像取得前に固定されていても良いことは言うまで もない。

さらに、上記第 9の態様または第 10の態様においては、細胞画像中に選択された いずれかの領域に対して解析を行い、パラメータ化した値に基づいて、これら領域を 細胞体、管状構造をもつ細胞の突起、細胞以外の細胞の死骸または気泡に分類す ることが好ましい。

[0058] また、上記分類を行う場合、分類された細胞以外の画像情報を定量ィ匕し、定量化さ れた細胞以外の画像情報を用いて、細胞に対する薬剤スクリーニングの統計結果を 補正することが好ましい。

実際、細胞にダメージを与え、一部の細胞を死滅させるような系では、生きている細 胞あるいは細胞としての形状をある程度保存して 、る死細胞の総数などの量だけで なぐ断片化した細胞の死骸など細胞画像中に存在する細胞以外の画像情報を定 量化し、細胞のみを対象とした画像解析結果の付加情報として用いることで、細胞解 祈の精度があがる。

[0059] さらに、上記のように定量ィ匕された細胞以外の画像情報を用いて、細胞に対する薬 剤スクリーニングの統計結果を補正する場合、細胞の形態の変化を、細胞がダメージ を受けたことに起因すると推定し、薬剤による細胞保護作用を定量ィ匕することとしても よい。

細胞を使った薬剤スクリーニングの対象となる薬剤の種類の主なものとしては、細 胞を保護し細胞のダメージを軽減させるものや、細胞の活性ィ匕をコントロールし、分 裂を抑制したりあるいは成長を促進させたりする作用のある薬剤などがある。

[0060] 細胞はダメージを受け死に至る過程において、一般にその形状は丸くなり、突起な どの外部器官は収縮する。さらに完全に死滅する段階においては、通常の細胞と比 較してかなり小さくなる。

細胞を保護する薬剤の薬効は、一定のダメージに対して細胞の死んだ数と生き残 つている細胞の数の比や、あるいは、さらに詳細な薬効を表現する特徴量として、細 胞の真円度などがある。

[0061] 一方、薬剤のなんらかの効果により活性ィ匕されている細胞は、例えば、外節器官が 増大し成長したり、培養プレート上での細胞自体の運動により形状が丸力 楕円など の複雑な形状へと変化したりする状態が観察される。

[0062] また、上記第 9の態様または第 10の態様においては、細胞の形態の円からの歪み を細胞の運動に起因するものとして解釈し、前記形態特徴量を薬剤の細胞に対する 活性ィ匕を測る指標として用いることとしてもょ 、。

[0063] さらに、神経細胞のスクリーニング方法において、前述のように細胞画像中に選択 されたいずれかの領域に対して解析を行い、パラメータ化した値に基づいて、これら 領域を細胞体、管状構造をもつ細胞の突起、細胞以外の細胞の死骸または気泡に 分類する場合は、分類された管状構造をもつ各細胞の突起の情報を形態特徴量とし て用い、管状構造の総量が細胞が受けたダメージと相関するということを推定し、薬 剤効果の定量ィ匕を行うこととしてもょ 、。

[0064] また、上記第 9の態様または第 10の態様においては、複数の種類によって構成さ れる細胞サンプルを用いることとしてもよ 、。

[0065] さらに、上記複数の種類によって構成される細胞サンプルを用いる場合には、注目 する細胞種および他の細胞種にっ 、て同様な評価を行うこととしてもよ 、。

[0066] また、本発明の第 11の態様に係るスクリーニング装置は、細胞に照明光を照射す る照明部と、細胞力 発せられる光を検出して画像情報を取得する画像情報入力部 と、該画像情報入力部により取得された画像情報において、各細胞の形態的な特徴 を表す形態特徴量をパラメータ化する画像情報処理部と、該画像情報処理部により パラメータ化された形態特徴量を評価し、細胞に対する薬剤スクリーニングを行う評 価部と、該評価部による薬剤スクリーニングの結果を出力表示する出力部とを備える

[0067] 上記第 11の態様にお!、ては、前記評価部が、前記形態特徴量として、円または球 力 の細胞の輪郭のズレ量を用いることが好まし 、。

また、上記第 11の態様においては、前記評価部が、前記形態特徴量に基づいて、 各細胞の生死を判別することが好まし 、。 さらに、上記第 11の態様においては、複数種の細胞サンプルを用い、注目する細 胞種および他の細胞種にっ 、て同様の評価を行うこととしてもよ 、。

[0068] 本発明によれば、細胞集団の解析を詳細に行うことができる。特徴量変化の相関を 調べることで、例えば特定の化合物で引き起こされる細胞変化を定量的に測定、特 徴付けを行うことが可能になり、複数の化合物の効果の比較を効率的に行うことがで きる。

さらに、画像上での細胞の位置を解析することにより、これら変化に与える細胞間相 互の影響を予測することが可能になり、各細胞の位置関係を考慮に入れない解析と 比較することにより詳細な化合物解析を行うことができる。

[0069] 本発明によれば、検査者の負担および検査ミスを低減し、細胞数を正確にカウント することができると!/、う効果を奏する。

[0070] 本発明によれば、適正な形態特徴量を用いてより精度の高い薬剤スクリーニングを 行うことができるという効果を奏する。

図面の簡単な説明

[0071] [図 1]本発明の第 1の実施形態に係る細胞画像解析装置の概略構成を示すブロック 図である。

[図 2]本発明の第 1の実施形態に係る画像処理の流れを示すフロー図である。

[図 3]複数のパラメータを設定する必要性を説明するための図である。

[図 4]パラメータ間の相関関係を説明するための散布図である。

[図 5]細胞の形状の一例を示す図である。

[図 6]特異な形状を有するような細胞の特徴量における相関関係を示す図である。

[図 7]本発明の第 2の実施形態に係る細胞画像解析装置を示す全体構成図である。

[図 8]図 7の細胞画像解析装置に用いるサンプルプレートの一例を示す斜視図である

[図 9]図 7の細胞画像解析装置により撮影したサンプルプレートの 1つのゥエル内の細 胞の画像例を示す図である。

[図 10]図 9と同一のゥ ル内の細胞を所定時間後に撮影した画像例を示す図である [図 11]図 9および図 10の画像例を本発明の第 2の実施形態に係る細胞画像解析方 法により、それぞれ 2値化処理した画像例とともに示す図である。

[図 12]本発明の第 3の実施形態に係る細胞画像解析方法により撮影したサンプルプ レートの 1つのゥエル内の細胞核の画像例を示す図である。

[図 13]図 12と同一のゥ ル内を所定時間後に撮影した細胞核の画像例を示す図で ある。

[図 14]本発明の第 3の実施形態の細胞画像解析方法による細胞核の特定方法を説 明する図である。

[図 15]本発明の細胞画像解析方法による細胞の増殖度による薬剤の効果を示すグ ラフである。

[図 16]本発明の第 2、第 3の実施形態に係る細胞画像解析方法に共通する部分のフ ローチャートである。

[図 17]本発明の第 2の実施形態に係る細胞画像解析方法のフローチャートである。

[図 18]本発明の第 3の実施形態に係る細胞画像解析方法のフローチャートである。

[図 19]画像解析処理の流れを示すフローチャートである。

[図 20]スクリーニングの手順を示すフローチャートである。

[図 21]従来のスクリーニングにおける特徴量の抽出方法の一例を説明する図である。

[図 22]本発明の第 4の実施形態に係るスクリーニング方法における特徴量の抽出方 法を説明する図である。

[図 23]図 22のスクリーニング方法において、 3次元的な解析を行う場合の特徴量の 抽出方法を説明する図である。

[図 24]本発明の第 4の実施形態に係るスクリーニング装置を示す模式図である。

[図 25]図 24のスクリーニング装置を用いたスクリーニング手順を説明するフローチヤ ートである。

[図 26]図 22のスクリーニング方法において、 3次元的な解析を行う必要がある場合を 説明する図である。

発明を実施するための最良の形態

(第 1の実施形態） 図面を参照して本発明の第 1の実施形態を説明する。図 1を用いて、本発明を実施 するための基本的な構成を説明する。図 1は本発明の第 1の実施形態に係る細胞画 像解析装置の概略構成を示すブロック図であり、本実施形態に係る細胞画像解析装 置の基本構成として走査型共焦点光学顕微鏡を例示している。

[0073] 光源 20として、例えば波長 488nmのアルゴンレーザを用いる。光源 20から出射さ れたレーザ光はコリメートレンズ 22によりビーム直径が拡大されて、平行光束に変換 されてダイクロイツクミラー 25に導かれる。ダイクロイツクミラー 25に導かれたレーザ光 は、ダイクロイツクミラー 25で反射されて、 XYスキャナ 30に入射し、 XYスキャナ 30で XY軸方向に走査される。 XYスキャナ 30を通ったレーザ光は、対物レンズ 35に入射 し、測定対象である培養液中に培養された培養細胞カゝらなる試料 42に集光される。 なお、ダイクロイツクミラー 25は光源 20からのレーザ光の波長の光を反射し、光源 20 力ものレーザ光の波長より長い波長の光を透過させる。また、 XYスキャナ 30として 1 対のガルバノミラーを互いに向力 、合わせたものが通常用いられる。

[0074] 試料 42は、蛍光物質で標識されて、詳細は後述する顕微鏡の試料ステージ 40上 に載置されたマイクロプレート 41上に置かれている。蛍光物質として、例えば、ローダ ミン ·グリーン (RhG)が用いられる。試料 42から発せられる蛍光は、対物レンズ 35を 再び通過し、 XYスキャナ 30を通ってダイクロイツクミラー 25を通過し、ミラー 50で反 射されてレンズ 51に到達する。レンズ 51で蛍光は集光されて、ピンホール 52の開口 部でフォーカスされた後に、光検出器 55で受光される。光検出器 55で受光された蛍 光信号は光電流信号に変換され、画像処理部 80に入力され、詳細は後述する信号 処理、画像解析等の演算が行われてモニタ上に試料の蛍光画像が抽出される。な お、光検出器 55として通常、光電子増倍管（PMT: Photo Multiplier Tube)が用いら れる。或いはアバランシェ 'フォトダイオード (APD)のような高感度半導体検出器を 用いても良い。

[0075] また、図 1では、試料を走査して、試料の画像を抽出する方法について記述してい る力 これに限らず、試料に一様な光を照射し、試料力 発せられる蛍光を CCD (Ch arge Coupled Device)カメフゃ CMOS (Complementary Metal uxide

Semiconductor)イメージセンサ等を用いて試料の画像を取得しても良い。この場合は 、試料を光走査する機構は必要ない。

[0076] 試料 42を収容する容器として、例えば底面が透明に施された 96穴のマイクロプレ ート 41が用いられる。対物レンズ 35の先端とマイクロプレート 41の間は、液浸水で満 たされている。マイクロプレート 41は、試料ステージ 40の上に保持される。試料ステ ージ 40には、試料ステージ 40が直交する 2方向に移動可能なように、 2個のステツピ ングモータ（図示しない）が取り付けられており、それぞれのステッピングモータは試 料ステージコントローラ 45に接続されている。試料ステージコントローラ 45はコンビュ ータ 10に接続されており、試料ステージ 40を保持し、コンピュータ 10からの指令によ り、ステッピングモータを駆動することによって試料ステージ 40を X方向と Y方向に移 動させて、試料 42面を適切な位置に配置する、

また、対物レンズ 35を Z方向に移動させることにより、レーザ光のフォーカス位置を Z軸方向に沿って上下に移動させることができる。

[0077] なお、蛍光物質については、ローダミン'グリーンに限ることなぐ光源の波長を対応 させることができれば、例えば、 TMR (Tetrame- hylrhodamine)、サイファイヴ（Cy5) 、 FITC (Fluorescein— isothiocyanateノ、 TOTu丄、 Acricdne—— urange、 Texas— Re dなどを用いても良い。

[0078] 検出器 55からの出力画像は画像処理部 80に入力して、種々の画像処理が行われ る。画像処理部 80は、細胞中心抽出処理部 81と、中心点吟味処理部 82、細胞境界 抽出処理部 83と、細胞の特徴量抽出処理部 84と、細胞の統計処理部 85とを備えて いる。まず、カメラ 55からの出力画像に基づいて、細胞中心抽出処理部 81は、各画 像の個々の細胞の中心となる点を検出し抽出する。中心点吟味処理部 82、は複数 の画像に対して細胞中心抽出処理部 81で抽出された点を比較することにより、細胞 の中心として不適切な検出結果 (すなわち、誤検出と思われるもの）を除 、た細胞中 心を抽出する。細胞境界抽出処理部 83は、中心点吟味処理部 82で抽出された細 胞中心点を囲むもっとも適切な境界を抽出する。細胞の特徴量抽出処理部 84は、 細胞境界抽出処理部 83の結果に基づいて、個々の細胞の形態的特徴量を抽出す る。細胞の統計処理部 85は、細胞の特徴量抽出処理部 84で抽出された特徴量を解 祈して画像に含まれる細胞の個数を抽出する。 [0079] なお、画像処理部 80を構成するハードウェアとしては、例えば汎用コンピュータ或 いはパーソナルコンピュータ等のようにコンピュータプログラムによって作動する汎用 的な処理装置を用いることができる。また、画像処理部 80は、コンピュータ 10の一部 であっても良い。このような場合には、上記のような処理装置に、画像処理部 80とし て機能させるためのコンピュータプログラム、すなわち細胞中心抽出処理部 81、中心 点吟味処理部 82、細胞境界抽出処理部 83、細胞の特徴量抽出処理部 84、細胞の 統計処理部 85のそれぞれの機能を実現させるためのプログラムをインストールして 細胞画像の処理装置を構成して ヽる。

[0080] 上記のように構成された本発明の第 1の実施形態に係る細胞画像解析装置の動作 を、図 2を参照して説明する。図 2は本発明の第 1の実施形態に係る画像処理の流れ を示すフロー図である。以下、処理の流れに従って、説明する。

[0081] 細胞画像の撮影は、一般に、細胞内のたんぱく質や、細胞内の核の染色、または、 蛍光たんぱく質の使用（このような染色等を「サンプル操作」と称する）により発色した 光を、顕微鏡などで拡大することにより行われることが多い。

この撮影は、以下のような手順で、複数枚の画像を撮影することにより行われる (ス テツプ Sl)。

(1) 細胞試料の準備において、観察の対象となる各種条件下での細胞を準備す る。

(2) 準備した細胞試料に対してのサンプル操作を行う。ここで、複数種類の細胞 が混在して 、る試料にぉ 、ては、染色方法によって特定の種類の細胞のみ発光する ように操作することができる。この性質を使い、観察したい細胞に対して、当該細胞に 応じた特徴的な染色方法ある!/ヽは発光の操作を行う。

(3) サンプル操作後の試料 42を細胞画像解析装置のステージ 40に載置し、その 位置を固定する。

(4) ステージ 40に載置した試料 42の画像 (すなわち、「細胞画像」）をコンビユー タ 10のモニタ上に抽出する。この場合、試料の位置を固定したまま、必要な回数だけ フィルタの変更を行う等の撮影条件の変更を行 ヽ、撮影条件の変更のつど撮影を行

5o (5) マイクロプレート 41を使って細胞の位置を変更し、（4)と同様に、撮影条件を 変更しながら複数の細胞画像を撮影する。

[0082] 上記のようにして細胞画像を撮影したら、各画像にっ ヽて画像上の細胞を認識し、 その中心を細胞中心抽出処理部 81で抽出する。この細胞の認識は、例えば、適当 な輝度値で画像の二値ィ匕を行 ヽ、二値化された画像の境界から細胞を含む領域を 推定する。これにより、細胞を認識して、各細胞の位置を特定し、その中心を抽出す る（ステップ S 2)。

[0083] ステップ S2で抽出された細胞中心が誤検出の可能性があるので、同じ位置で撮影 した複数の細胞画像を比較することにより、当該細胞中心が正しいと判定されたもの を、中心点吟味処理部 82で抽出する (ステップ S3)。

[0084] ステップ S 3で抽出された細胞中心に対応する細胞の境界を細胞境界抽出処理部 83で抽出する (ステップ S4)。本ステップにおいて、境界の抽出は、例えば、ステップ S2と同様に、画像データをニ値ィ匕して、ステップ S3で抽出された細胞中心を含むよ うに境界を抽出すればよい。なお、本ステップにより、細胞が高精度で認識できる。

[0085] 細胞の認識 (各細胞の識別）が終了したら、細胞の特徴量抽出処理部 84による特 徴量の抽出や細胞の統計処理部 85による細胞の総数の抽出を行って、特徴量や総 数を出力する (ステップ S5)。ここで、細胞の特徴量として、細胞境界抽出処理部 83 で抽出された細胞の境界情報をもとに、例えば、細胞の大きさ、最大半径位置、周囲 長、あるいは細胞の明るさ、細胞の明るさの偏り具合、などの複数の細胞の特徴量を 抽出することが考免られる。

[0086] この特徴量を抽出して、比較試験を行うことにより、薬効の評価を行うことができる。

例えば、化合物を投与した細胞と、投与していない細胞とに分け、一定の条件でこれ ら細胞を培養し、これらを比較することにより薬効の評価を行うことができる。具体的 には、

(1) 細胞を 2つの細胞群に分け、 1つの細胞群に化合物を投与する。もう一方の 細胞群には何も投与しない。

(2) 2つの細胞群を一定期間培養する。

(3) 細胞の数をパラメータとして、細胞群を上記方法で撮影し、解析を行い、 2つ の群の細胞数を比較する。

[0087] 上記のような、評価試験において、例えば培養期間を長くとると、力なりの細胞は死 滅することが考えられる。しかし、化合物を投与した細胞群の生存している細胞の数 力 明らかに、化合物を投与していない細胞群の数よりも多ければ、当該化合物が細 胞を守るなんらかの効果があるということが言及できる。

[0088] 例えば、各細胞の突起の長さをパラメータとしたような場合には、化合物投与後の 突起の長さを計測し、細胞 1個あたりの突起の伸びを比較する。このとき、突起の伸び が化合物を投与した細胞群で有為に大きい場合、当該化合物は細胞の突起を伸張 させる効果があると結論付けることができる。

[0089] このように、本実施形態では、様々な解析により、細胞の特徴量を抽出したり、薬効 の評価を行ったりすることができる。以下、具体的に、本実施形態において、特徴量 などを抽出するための、統計的な解析方法について説明する。

[0090] 細胞サイズの分布を取った場合を例に取ると、理想的な統計分布は、正規分布や ポアソン分布、或いは 2項分布などで与えられる。この場合における分布の特徴は、 平均値、分散などのいくつかの統計量で表現することができる。

[0091] ところが、細胞を使ったィ匕合物スクリーニングの場合は、単一のパラメータの分布も 上記のような良く知られた分布を取るとは限らない。このため、本発明の実施形態で は、上記のような統計量や、更にそれにカ卩えてピークの位置の検出などにより、より詳 細な細胞パラメータの統計解析を行うようにして 、る。

[0092] 特に、ピーク位置を検出し、その特徴力 化合物の効果を予測する方法を例として 以下にあげる。

[0093] 図 3のように、横にパラメータの値、縦に頻度を取った分布図を作成する。なお、図 3において、分布の頻度は規格化されているものとする。また、（a)は化合物を投与し ていない場合、（b)は化合物を投与した場合の分布を示すものとする。この場合にお いて、パラメータを細胞のサイズとすれば、その平均値は、サイズの小さい方のピーク 位置付近にあり、平均値のみでは、その違いを十分表現することができない。すなわ ち、単純平均のみでは（a)と (b)との分布の特徴を充分に識別することができない。ま た、特に、（a)においては、平均値のみでは、 2つのピークを表現できていない。 [0094] しかしながら、図 3の分布図から明らかなように、（b)では、サイズの小さい方に大き V、ピークがあるので、化合物が細胞のサイズが小さ!/、値になるような比率を高くする 効果を持っていることが分かる。つまり、化合物が、サイズの大きい細胞に作用して縮 ませるなどの解釈ができ、さまざまな特徴量に対するパラメータ（以下、「特徴量パラメ ータ」と称する。単に「パラメータ」と称する場合も特に断らない限り、この特徴量パラメ ータを示すものとする）を設定することで、それぞれの化合物の特性にあった解釈を することができる。

[0095] 次に、特徴量パラメータを複数設定した場合において、複数の特徴量パラメータの 相関を検証することにより、化合物の有効性を評価する方法について説明する。なお 、複数の特徴量パラメータの相関を検証することにより次のようなことが分かる。つまり 、各パラメータの測定精度の検証や、実験系にもっとも適したパラメータの選択が可 能になり、この結果、細胞評価にもっとも適したパラメータを選択あるいは設計を行う ことができる。

[0096] パラメータの相関には、通常、正の相関と負の相関があることが知られている。正の 相関は、例えば、詳細は後述する図 4において、サイズが大きくなるにつれて半径が 大きくなるような関係を有する場合を正の相関を有するといい、逆に、サイズが大きく なるにつれて半径が小さくなるような関係を有する場合を負の相関を有するという。

[0097] 図 4を参照して、相関について更に詳しく説明する。図 4は、相関を説明するための 散布図である。図 4において、縦軸をパラメータ xl、横軸をパラメータ x2としている。 ノ メータとしては、例えば、半径やサイズが考えられる力 それらに限らず、細胞の 特徴量を示すものと考えられるものであれば、どのような指標をパラメータとして設定 しても構わない。

[0098] 図 4にお 、て、まず、図 4 (a)、図 4 (b)の 2つの図を比較した場合、一般に、図 4 (a) は相関が強いと判断され、図 4 (b)は弱いと判断される。図 4 (b)の相関が弱いと判断 される分布においては、パラメータ xlのばらつきは少なぐはほぼ一定の値周辺に分 布している。一方、パラメータ x2は、特定の値の周りに分布しているのではなぐほぼ ランダムに分布している。従って、図 4 (b)では、パラメータ xlに対して、ノ ラメータ x2 は関係のない分布をしていると考えられるので、これら 2つのパラメータは相関をもた ないと判断される。図 4 (a)では、パラメータ xl及びパラメータ x2の 2つのパラメータは

、一定の値 (例えば、平均値）の周辺に分布しているため、この場合は、例えば正の 相関を持っていると考えられる。

[0099] なお、図 4 (c)のような負の相関を有する分布も想定でき、このような分布も相関が 強いと判断される。図 4 (c)に示すように、パラメータ xlが小さくなるにつれて、パラメ ータ x2が大きくなつている。

[0100] 上記の例から、相関の強さは、例えば、次のようにして与えられる。相関が強い場合

、横軸の値を固定した場合、縦軸の分布は小さくなる。つまり、縦軸はその値での平 均値周辺に多く分布するという特徴が見られる。

[0101] 例えば、図 4において、パラメータ xlと x2が離散的な値 (iく 1, 2 · · · )を取るとする

。この場合、まずパラメータ x2を固定し、パラメータ x2の値に対応するパラメータ xl の分布を調べて、その平均を取り、この平均力もの差を取る。そして、同様の操作を ノ ラメータ x2の値を変えて行うことにより、 2つのパラメータの相関を見積もることがで きる。

[0102] なお、相関は、式（1)で与えられる。

(l/NO)Sum_{i<N}(l/Misum_{j<Mi}|y(i,j) · avr(y(i)|) 式（ 1)

ここで、 NO :全体のデータ数

i:横軸の値

j :縦軸の値

y (i、 j)：固定された各 i上に分布している値

&^ ^ )）：各1の平均値

上記のような方法により 2つのパラメータ間の相関を定量ィ匕することができる。なお、 ノ ラメータが 2つを越えるような複数のパラメータ群の場合には、 2つずつ相関量を定 量することにより、全体のパラメータの相関を計算することができる。

[0103] 次に、パラメータの絞り込みにっ 、て、説明する。

ノ メータは、一般に、細胞の特徴量をさす。細胞の特徴量とは、上述したサイズや 半径や、更には細胞境界の周囲長等があげられるが、これら特徴量の値を使って、 実験等の系（以下、単に「実験系」と称する）の評価が行われる。 [0104] 例えば、何らかの刺激から細胞を保護する作用のある薬剤を評価する場合を考え る。このときの実験系は、細胞及び一定期間培養する装置と細胞に与える刺激等に よって構成されている。この系を使った薬剤の評価は、例えば、薬剤投与後、刺激を 与えて一定期間が経過した後における、一定範囲内に存在する細胞の平均存在数 などによって行われる。

[0105] 本実施形態では、細胞の特徴量として、細胞数のみを選択しており、その他の特徴 量である、各細胞のサイズ等は直接評価対象として扱わないが、このように、特徴量 による評価は、多くのパラメータを選択して行うのではなぐ少数のパラメータを選択し て（すなわち、絞って)行われることが多い。

[0106] このように、パラメータを絞って評価を行う 1つの理由として、特徴量パラメータの正 確な測定や、見積もり自体が難しい場合が多いこと、また、複数のパラメータを取り扱 うことは一般的に面倒なこと、などがあげられる。

[0107] このため、本発明の第 1の実施形態では、複数のパラメータ力も代表的なパラメータ を絞り込んで選択し、選択したパラメータを実験系に合わせて設計を行うことを特徴と している。この場合、パラメータの有効性を考慮することが重要である。パラメータの 有効性は、パラメータの結果と薬効との相関が強いことを意味している。例えば、上 記の例のように、薬の細胞保護作用と細胞数との間の相関を考慮すると、一般に強 い相関があると考えられる。すなわち、細胞が刺激を受けた後、薬剤を投与しない場 合よりも多く生き残っているなら、投与した薬剤は有効であると判断できる。従って、 薬効を細胞数で判断できると考えられるので、細胞数をパラメータとすることが有効で あるといえる。なお、パラメータの有効性は、上記の「薬の細胞保護作用と細胞数の 関係」のような特定の知識によってのみ判断されるものではない。例えば、数式の形 で与えられた評価関数なども有効なパラメータになりうる。また、相関値を比較するパ ラメータは、他の測定パラメータのことである。

[0108] このことをデータ空間上で考える。細胞の特徴量が n種類 (すなわち、パラメータが n 個）であるものとし、各パラメータの値を xl、 χ2、 · · ·、 xnとする。このとき、パラメータ は n次元データ空間上の点である（xl, x2, · · · , xn)で表現される。

[0109] ここで、例えば、 xlは細胞の平均生存数であり、 x2は細胞の平均サイズ等である。 なお、薬効が、 al = 100、 a2 = 70等と数値ィ匕されているものとする。

[0110] 薬効を表現する「設計されたパラメータ」は、 n次元データ空間上で定義された関数 として、 F (xl、 χ2、 · · ·、 xn)のように書くこと力できる。

[0111] この関数と薬効の相関は、例えば、

(l/N)sum_{i<N}|ai

- Fn(di)|(di=(xl(i)、 x2(i)、 . . ·、 xn(i》）

式 (2)

のように定義される。ここで、 aiは正解となる薬効の測定値 (あらかじめ測定された参 考データ）、 Fn (di)は、 i番目のデータ diを代入した関数 Fnの結果である。なお、式（ 2)では、薬効の測定値と計算した予測値の差の平均を取っているので、相関が高い 場合、この値は、小さくなる。

[0112] 次に、関数を複数個 Fl、 F2、 · · ·、 Fmのようにとっていった場合を考える。ここで、 Fi(i= l、 2、 · · ·、 m)は、それぞれ異なる定義を有する関数であって、例えば、 Fl = xl、 F2=x2のように、単一の変数で表現することもできるし、 F3=x2— x3等のよう に任意の式で表現することもできる。関数 Fiに対して上記の相関を算出することによ つて、関数値 (誤差値)が最も低 、もの (相関が高!、もの)を最も「有効な関数」として 決定する。本明細書では、この「最も有効な関数」を「最も有効なパラメータ」として定 義する。例えば、 Fl =xl、 F2=x2等のように関数を 1パラメータで表現した場合を 考えれば、この表現 (有効なパラメータ）は適切な表現であることがわかる。

[0113] 特に、実際の計算においては、変数の数は少ない方が好ましい。これは、測定、計 算が短時間で済むためである。更に、変数と薬効の関係が単純で直感的に理解しや すいという利点もある。

[0114] 以上のように、本発明の第 1の実施形態では、ノ メータの相関を取り、更に実験 系に沿ってパラメータを絞り込み、或いは、最適なパラメータを使って関数によりモデ ルイ匕を行っている。そして、特にパラメータの有効性を式（2)のように、「結果に対して 最も誤差の小さい値を出す関数」と定義した。なお、関数の具体的な与え方としては 、（1)パラメータの測定精度や信頼性の評価、（2)変化の表現などによって、最適な ノラメータを与えるようにして ヽる。 [0115] パラメータとその相関を使った解析の例として、測定精度の評価 (検証）について説 明する。単純な例として、細胞サイズと細胞の周囲長をパラメータの相関を調べ細胞 サイズが正しく測定されているかを検証する方法を説明する。

[0116] 細胞境界の最大幅として与えられる細胞サイズと細胞の周囲長は、細胞の形態が 球状あるいは、楕円状などの場合には、単純な関係式で与えられることが分力つてい る。よって、例えば細胞とその境界を正しく検出している場合には、 2つのパラメータ は、この関係式に沿った単純な関係を持つことが予想される。

[0117] 図 4のような分布図において、細胞サイズと細胞の周囲長との関係は、比例関係に 近い分布、すなわち散布図上では直線的な分布になることが予想される。

[0118] し力しながら、例えば、画像中に本来の検出対象以外のものが含まれている場合に は、例えば、図 5 (a)のような形状のもの以外に、図 5 (b)のような形態のものを検出す ることも考えられる。この場合、サイズと周囲長の関係は本来予想されるような単純な 関係式から大きく外れる。

[0119] ここで、周囲長を縦軸、半径を横軸にとった場合、このパラメータに関する分布は図 6のようになると予想される。し力しながら、図 5 (b)に示すような特異な形態を持つ細 胞は、例えば、図 6中の黒い星印等の位置に現れる。

[0120] 縦軸及び横軸の平均値とそのばらつきの平均値を計算すると、例えば、このような 特異な形態は、平均から大きくずれた点として検出することができる。このばらつきは 、式（1)と同様の式で定量ィ匕することができる。このようにあら力じめ相関が明確に予 想できるようなパラメータの組の場合には、実際のパラメータ相関を取ることにより、実 験系や測定方法が評価できることがわかる。

[0121] このように、各パラメータの測定値に対する相関を検証することにより、測定自体の 精度を予測することができる。また、このように、例えば、細胞のサイズと細胞の周囲 長の相関を検証すれば、正しくない細胞検出のデータを除くことができるので、全体 の測定結果を正しく補正することができる。すなわち、図 6の例では、黒い星印の測 定点を平均からのばらつき値で除くことができる。

[0122] なお、上記では、測定自体の精度について説明したが、条件による変化についても 同様であって、各パラメータの相関を検証することにより、実験系の条件等による変 化を最も有効に表現するようなパラメータを選択することが可能になる。

[0123] 一般的に細胞画像の解析は、高い精度にあるとはいえない。特に実験系や実験条 件が異なると、誤差が非常に大きくなる。そこで一つの評価系に対しても複数の評価 ノ メータを設定する必要がある。この場合において、化合物の薬効評価を行う場合 に、例えば、突起伸張の効果を評価する系を考える。ここで、突起の検出は完全であ るとは限らないので、各細胞の最大径、周囲長、面積など複数のパラメータの検出を 行う。

[0124] この突起伸張の評価の場合、細胞を正しく認識し、細胞の境界を正しく認識し、細 胞の突起位置を正しく認識し、この突起の長さを正しく認識しなくてはならない。しか し、一般的に、この全ての過程をソフトで自動認識することは難しい。

[0125] そこで、上記本発明の第 1の実施形態のように、検出された複数種類のデータと、 検出された突起の伸張との相関をとり、その相関に応じて重み付けを与えるようにす れば良い。あるいは、最も相関の高いパラメータを参考パラメータとして取り、参考パ ラメータの変化も合わせて基本データとしても良 、。

[0126] 以上のような解析により、細胞の薬効評価にもっとも適したパラメータを選択する、 あるいは重み付けを変えるなどの、パラメータ設計が可能になるので、細胞解析を効 率よく行うことができる。

[0127] 細胞の位置情報を使った解析例を説明する。細胞を長期間生き残らせる効果のあ る化合物を探索するという目的で実験を行う場合を例に取ると、細胞の数をカウント することでィ匕合物の効果を測定することになる。

[0128] ここで、例えば細胞が高密度な領域の方力 あるいは複数の細胞が接している状 態の方が細胞数の比率が多いという場合、細胞間でなんらかの作用が働き、化合物 と作用し、結果細胞がより生き残るという条件を生み出したと解釈することも可能であ る。

[0129] あるいは逆に、細胞間での相互作用の影響を受けて 、な 、反応を調べた!/、と仮定 する。この場合、細胞が接していないもののみを、あるいは最近接細胞が一定以上の 距離である細胞の特徴量のみを取り、その結果を評価するという方法を取ることもで きる。 [0130] このような解析方法は、例えば細胞を 100%単離させる手間よりは、 50%単離させ る手間のほうが圧倒的に少ない場合などに特に有効な評価系を作ることができる。

[0131] 上記のように本発明の第 1の実施形態によれば、処理が自動化されるため、効率の 良いスクリーニングを行うことができる。また、パラメータの選択が効率的になるためス クリーニング結果がより有効になることが期待される。さらに、正確な薬剤の効果測定 を行うことが可能になる。

[0132] 本発明は、上記実施形態の各構成に限ることなぐその他、実施段階ではその要 旨を逸脱しない範囲で種々の変形を実施し得ることが可能である。さらに、上記実施 形態の各構成には、種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構成要件 における適宜な組合せにより種々の発明が抽出され得る。

[0133] また、例えば上記実施形態に示される全構成要件力も幾つ力の構成要件が削除さ れても、発明が解決しょうとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果で 述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明と して抽出され得る。

[0134] (第 2の実施形態）

以下、本発明の第 2の実施形態について、図 7〜図 11,図 15〜図 17を参照して説 明する。

図 7は、本発明の第 2の実施形態に係る細胞画像解析装置の構成を示す図である

[0135] 本実施形態に係る細胞画像解析装置は、図 7に示されるように、サンプルプレート 1 を搭載するステージ 101と、励起光源 102と、該励起光源 102に接続された電源ュ ニット 103と、励起光源 102からの光をオンオフするシャツタユニット 104と、光を平行 光に変換するレンズ 105と、サンプルに入射させる励起光の波長を選択するフィルタ ユニット 106と、励起光を反射してサンプルに入射させ、蛍光を透過するミラーセット 1 07と、励起光を標本に集光する対物レンズ 108と、対物レンズ 108により集光されミ ラーセット 107を透過した蛍光^^光する結像レンズ 109と、結像された蛍光を撮像 する CCDカメラ（画像情報入力部） 110と、シャツタユニット 104、フィルタユニット 106 およびミラーセット 107を制御するユニバーサルコントロールボックス 111と、ステージ 101を制御するステージコントローラ 115と、 CCDカメラ 110により撮像された蛍光を 処理するとともに、ユニバーサルコントロールボックス 111およびステージコントローラ 115を制御するコンピュータ (輝度値演算部、比較演算部、個数計数部） 112とを備 えている。

[0136] サンプルプレート 1としては、図 8に示されるように、例えば、直径 20mm、深さ 15m mのゥ ル laが 15個、 3行 5列に配置されたものが使用される。各ゥ ル laの中に検 查対象となる蛍光色素で染色された細胞が播種されるようになって！/ヽる。本実施形態 で使用する蛍光色素は、例えば、 GFPのような、細胞を生力 たままで蛍光を発する 事ができる色素であり、細胞質に染まるものである。また、サンプルプレート 1にはバ 一コード lbが貼り付けられている。バーコード lbは、不図示のバーコードリーダによ つて読み取られることにより、データベースとの照合が行なわれ、サンプルプレートと データベース内のデータの整合性が保たれるようになって 、る。

[0137] ステージ 101は、サンプルプレート 1を搭載して、電動で水平方向に 2次元的に駆 動し、任意の位置にサンプルプレート 1を位置決めすることができるようになつている。 励起光源 102には、水銀光源等が用いられる。

シャツタユニット 104は、励起光源 102から出射される励起光の光路上に配置され、 開閉可能なシャツタ板 104aを内蔵している。

[0138] フィルタユニット 106は、 2枚の励起フィルタ 106aを内蔵しており、波長の異なる 2種 類の励起光をサンプルに向けて照射することができるようになつている。

ミラーセット 107は、励起光を反射し、蛍光を透過するダイクロイツクミラー 107Aとそ れに取り付けられた励起フィルタ 107Dおよび吸収フィルタ 107Cとにより構成されて いる。

[0139] ミラーセット 107は、必要な励起波長分だけ不図示のミラーホルダに格納されており 、不図示の電動ユニットにより任意に光路入れ替え可能となっている。このミラーセッ ト 107の反射光路上には、対物レンズ 108およびサンプルプレート 1が配置されてい る。また、ミラーセット 107の透過光路上には、結像レンズ 109および CCDカメラ 110 が配置されている。

CCDカメラ 110は、例えば、 12ビットで 1000 X 1000ピクセルの 100万画素カメラ である。

コンピュータ 112には、キーボード 113、モニタ 114およびマウス 116が接続されて いる。

[0140] 以上のように構成された本実施形態に係る細胞画像解析装置を用いた細胞画像 解析方法にっ 、て、抗ガン剤創薬スクリーニングを例に挙げて以下に詳細を述べる 本実施形態に係る細胞画像解析方法のフローチャートを図 16および図 17に示す まず、サンプルプレート 1のゥエル laの 1行目には薬剤候補となる化合物を投与し ないで細胞を植え付け、 2行目には細胞を植え付けると共に薬剤候補となる化合物 Aを投与する。さらに 3行目には細胞を植え付けると共に薬剤候補となる化合物 Bを 投与する。

[0141] そして、サンプルプレート 1をステージ 101にセットし、コンピュータ 112上で不図示 の制御プログラムを起動してサンプルプレート 1のバーコード（ID: 10001)を読み取 り、観察'撮影をスタートさせる。これ〖こより、図 9に示される細胞の画像が取得される 。これを必要なサンプルプレート 1の枚数だけ繰り返す。

[0142] そして、 2時間後に再度サンプルプレート 1をステージ 101にセットし、サンプルプレ ート 1のバーコード（ID : 10001)を読み取り、コンピュータ 112上で不図示の制御プ ログラムを起動して観察 ·撮影をスタートさせる。これにより、図 10に示される細胞の 画像が取得される。これを必要なサンプルプレート 1の枚数だけ繰り返す。

[0143] 撮影が終了したら、検査者は撮影した細胞画像の検証に入る。検査者はコンビュ ータ 112上で細胞画像解析プログラムを起動する。次に検査者はサンプルプレート 1 のバーコード IDを細胞画像解析プログラムに入力し、診断するゥ ル No.を入力す る。ここでは、全ゥエルを指示するものとする。

[0144] そして、解析開始を指示すると、細胞画像解析プログラムは既にコンピュータ 112 のハードディスク内に格納されている撮影時刻の違う 2つの蛍光画像データをバーコ ード IDとゥエル No.から不図示のメモリにロードする。バーコード（ID: 10001)の 1行 目のゥエル最右端を例にとると、メモリにロードされたそれぞれの蛍光画像データは 図 11の 5— Aおよび 5— Cである。

[0145] 細胞画像解析プログラムは、図 11の 5—Aの画像を 5— Bのように、 5— Cの画像を 5— Dのように 2値化する。このときの 2値化レベルは 5— B, 5— D両者に対して同値（ 十進数で 800)である。続いて、 5— B, 5— Dの画像中の白レベル (輝度レベルは十 進数で 4095)になって!/、るピクセルの個数をそれぞれカウントする。

[0146] その結果、例えば、画像 5— Bの白レベルピクセルの個数を 19000個、画像 5— D の白レベルピクセルの個数が 74000個であった場合には、細胞画像解析プログラム はゥエルナンバー 1の細胞の増殖度を（74000Z19000) = 3. 89と比較演算し表示 する。これを必要回数繰り返しゥエル毎に細胞の増殖度を表示する。

[0147] 検査者は、例えば、サンプルプレート 1のゥエル最右端の 1, 2, 3行目の細胞の増 殖度を確認する。例えば、図 15に示されるように、 1行目は 3. 89、 2行目は 1. 85、 3 行目は 1. 12と表示されていれば、薬剤候補となる化合物 Bが細胞増殖作用を抑制 する効果が最も大き 、ことがわかる。

[0148] この作業を全ゥエルに対して行い、最後に行毎にデータを平均化するなどして行別 に増殖度を比較することにより、薬剤候補となる化合物の薬効性を評価することがで きる。

この原理を利用して、ガン細胞の増殖度を検査することにより、ガンの病理検査を 行なうことちできる。

[0149] (第 3の実施形態）

次に、本発明の第 3の実施形態について、図面を参照して以下に説明する。

なお、本実施形態の説明において、上述した第 2の実施形態と構成を共通とする箇 所には、同一の符号を付してその説明を割愛する。

[0150] 本実施形態で使用するサンプルプレート 1は、第 2の実施形態で説明されたものと 同一のものであり、直径が 20mm、深さ 15mmのゥヱル laが 15個、 3行 5列に配列さ れて ヽるものである。この各ゥエル laの中に検査対象となる蛍光色素で染色された細 胞が植えられている。本実施形態で使用する蛍光色素は、例えば、 GFPのような細 胞を生力したままで蛍光を発する事ができる色素であり、細胞核に染まるものである。

[0151] 抗ガン剤薬剤スクリーニングを例に挙げて説明する。 本実施形態に係る細胞画像解析方法のフローチャートを図 16および図 18に示す 検査者はサンプルプレート 1のゥエル laの 1行目には薬剤候補となる化合物を投与 しないで細胞を植え付け、 2行目には細胞を植え付けると共に薬剤候補となる化合物 Aを投与する。さらに 3行目には細胞を植え付けると共に薬剤候補となる化合物 Bを 投与する。

[0152] サンプルの準備ができたら、サンプルプレート 1をステージ 101にセットし、コンビュ ータ 112 (輝度値演算部、比較演算部、個数計数部）上で不図示の制御プログラム を起動してサンプルプレート 1のバーコード (ID : 00001)を読み取り、観察'撮影をス タートさせる。このスタート指示により、ユニバーサルコントロールボックス 111および ステージコントローラ 115が動作を開始し、指定したゥエルの細胞の蛍光画像を撮影 する。

[0153] 撮影するゥエルは、制御プログラム上で任意に指定することができる。本実施形態 では 15個全てのゥエルを撮影するように設定されて 、る。図 12は検査開始直後に撮 影されたバーコード (ID : 00001)の、 1行目のゥエル最右端の蛍光画像である。蛍光 色素により、細胞の核が発光しているのがわかる。細胞核は、どれも形状はほぼ円形 をしており、核の大きさも一定の範囲に収まっている。細胞はいくつか（このゥエルの 場合は 4つ）の密集した群をなしている。これを 15回繰り返し、全ゥエルの細胞の蛍 光画像を撮影する。

[0154] 撮影画像はサンプルプレート 1のバーコード ID、ゥエル No.と撮影時刻、露光時間 のデータとともにコンピュータ 112のハードディスクに記録される。ハードディスクの代 わりにコンピュータ 112に外付けすることができる半導体メモリ等を使用しても良い。 同時にモニタ 114にも撮景画像やサンプルプレート 1のバーコード ID、ゥエル No.と 撮影時刻、露光時間のデータが表示される。検査者は今撮影が終わったサンプルプ レート 1をステージ 101から取外し、別のサンプルプレート 1をステージ 101にセットし サンプルプレート 1のバーコードを読み取る。そして、必要なゥエルの蛍光画像を撮 影する。

[0155] 一定時間経過後、再び先ほど蛍光画像を撮影したサンプルプレート 1 (ID : 00001 )をステージ 101にセットし、全ゥエルの撮影を行なう。図 13は、 2時間経過後のバー コード（ID : 00001)の、 1行目のゥエル最右端の蛍光画像である。 4つの細胞群のセ ル (細胞核）が増えていることが判る。これを必要な数だけのサンプルプレート 1に対 して行う。撮影が終了したら、検査者は撮影した細胞画像の検証に入る。

[0156] 検査者は、コンピュータ 112上で細胞画像解析プログラムを起動する。次に検査者 はサンプルプレート 1のバーコード IDを細胞画像解析プログラムに入力し、解析する ゥエル No.を入力する。ここでは全ゥエルを指示するものとする。

[0157] そして、解析開始を指示すると、画像解析プログラムは、既にコンピュータ 112のハ ードディスク内に格納されている撮影時刻の違う 2つの蛍光画像データをバーコード I Dとゥエル No.力も不図示のメモリにロードする。続いて、画像解析プログラムはそれ ぞれの画像から核の部分を抽出する。

[0158] 画像解析プログラムは、図 14に示すように半径の違う 3つの同心円（第 3の円 8a、 第 2の円 8b、第 1の円 8c)で画像全体をスキャンしながら、規定の輝度値以上で第 2 の円 8bと第 1の円 8cの間にあり、かつ第 3の円 8aの領域にな!ヽ円形のピクセル群を 核と識別するようになっている。符号 8dが細胞核である。この作業により蛍光画像中 の核の数をカウントする。その結果、図 12の蛍光画像中の核の数が 19個、図 13の 核の数が 74個とカウントされ、画像解析プログラムは（74Z19) = 3. 89と比較演算 し表示する。

[0159] 検査者は、例えば、サンプルプレート 1のゥエル最右端の 1, 2, 3行目の細胞の増 殖度を確認する。その結果、図 15のグラフに示すように、 1行目は 3. 89、 2行目は 1 . 85、 3行目は 1. 12と表示されていれば、薬剤候補となる化合物 Bが細胞増殖作用 を抑制する効果が最も大きいことがわかる。この作業を全ゥエルに対して行い、最後 に行毎にデータを平均化するなどして行別に増殖度を比較することにより、薬剤候補 となる化合物の薬効性を評価することができる。この原理を利用して、ガン細胞 (例え ば乳ガン)の増殖度を検査することで、ガンの病理検査を行なうこともできる。

[0160] (第 4の実施形態）

以下、本発明の第 4の実施形態について、図面を参照して説明する。

本実施形態に係るスクリ一ユング方法および装置の説明を行う前に、細胞の画像 解析方法について説明する。

[0161] (細胞解析概要）

薬剤スクリーニングなどの細胞を観察する実験系で、細胞画像解析を自動化する 方法について考える。

ここでの、画像解析の目的は、画像上の個々の細胞位置を特定し、各細胞の特徴 量を抽出すること、さらにこれら特徴量に対し適切な統計的処理を施すことで、複数 の細胞画像を比較する手段を提供することにある。

[0162] 解析処理の流れを図 19を参照して説明する。まず、対象とする細胞を培養する（S

D o次に染色などの適当な前処理を行い可視化の準備を行う（S2)。なお、必要に 応じて細胞の固定が行われる。これら細胞試料を顕微鏡などの光学系に設定し撮像 を行う（S3)。撮像した細胞画像のデジタルィ匕を行いコンピュータなどに保存する（S4

)。これら画像をコンピュータ上で処理解析する（S5)。

[0163] 次に各処理段階について説明する。

(前処理）

適当な方法で培養された細胞に、撮像のための処理を施す。

撮像のための処理とは、蛍光物質を投与するなどである。これらの処理により細胞 の可視化が行われる。

[0164] (光学系'撮像系'データ保存）

光学系においては、適当な波長の光を細胞に当てることにより観察を行う。このとき 、適当なカメラを光学系に設定し、撮影を行う。撮像系は通常、 CCDなどを使い像を デジタル化し、パソコンなどにデータとして保存しておく。

[0165] 上記の方法で取得した細胞画像は、カラーまたは単色の像である。像は、 1000 X 1000などの上下左右に幅をもったデータとして保存される。像の上の各点には、位 置を表す座標が振り分けられ、各点は、各色の輝度を持つ。

座標（x、 y)の輝度は、例えば、「230」のように表現されデジタルデータとして保存 される。

[0166] (画像解析の概要）

画像解析は、これらのデジタルデータをパソコン上のソフト'プログラムなどで適当な 処理を行!ゝ解析する方法である。

特に、細胞を使った画像解析においては、細胞を認識することが第 1の目的となる 力 細胞の認識は、通常、実験者によって直接行われる。

[0167] 実験の種類によって異なるが、一般的には、顕微鏡画像 (あるいは顕微鏡の視野） を観察しその画像中に「細胞が存在するかどうか」、「細胞が存在する場合、細胞の 位置はどこにあるか」、「画像中に含まれる細胞の数はいくつか」、「画像中の細胞の 種類はいくつあるか」、「特定の種類の細胞はいくつあるか」、「各細胞の大きさはどの 程度あるか」などを認識し、記録し、実験のためのデータを提供する。

[0168] これらデータに対し統計的処理を施し各細胞画像の撮像条件、細胞の培養条件と 関連付け様々な解釈を行うことが可能である。特に、薬剤による形態の違いを検出す ることで、化合物を初めとする薬剤などのスクリーニングを行うことが可能である。

[0169] (化合物スクリーニング）

細胞を使った実験は様々な目的の元に行われる力 ここでは特に細胞をベースに した化合物スクリーニングを例にとって、実験の目的及び流れを簡単に説明する。

[0170] 細胞ベースの化合物スクリーニングは、効果のある薬剤を見つけることを目的とする もので、適当な化合物などをターゲットにする細胞に投与し、これら化合物が細胞に 及ぼす影響を定量ィ匕することにより行われる。

さらに、これらの定量化されたデータは、複数の化合物の場合と比較され、これらい くつかの化合物の中から、細胞に及ぼす影響の大きいもの、効果のあるものを発見 することを目的として行われる。

[0171] (スクリーニングの手順）

サンプルとなる細胞は、図 20に示されるように、まず、通常いくつかのグループ（細 胞群 Gl〜GN)に分類される（S 11)。

例えば、化合物の細胞に及ぼす効果を測定する実験系においては、化合物を加え た細胞群 G1等ものと、そうではない細胞群 GNとに分けられる。

顕微鏡などの適当な光学系を用いて、これら分類されたグループごとに撮像される (S12)。

通常、各グループごとに複数枚の撮像を行い、また各画像には適当な数 (数十程 度）の細胞が含まれている。

[0172] 次に、上記方法で撮像し保存された細胞画像を解析する。

細胞画像の解析により画像中に存在して ヽる細胞の位置、また各細胞の発光量や 大きさ突起の有無など特徴量を抽出する。

細胞の特徴量は、このグループごと、あるいは画像ごとに平均化されあるいは分布 を解析され、グループ間の差異を検出し、化合物を導入された'導入されないなどの グループの条件と比較し検討される（S 13)。

[0173] (課題の詳細）

実際の薬剤スクリーニングにおいては、しかしながら、薬剤効果の評価精度が高く な 、場合が多 、と 、う課題がある。

[0174] (特徴量抽出の定義、選択の間違い例）

この原因として第 1に考えられることは、細胞形態の特徴量抽出処理自体が精度の 低 、解析になって 、るなどである。

[0175] 形態特徴量の精度が低くなる原因としては、細胞の形態の特徴を表す量として、設 定された特徴量の定義 '選択がそもそも適切ではないことがまず挙げられる。

例えば、細胞形態量として、細胞の大きさを抽出する場合を考え、特徴量が適切に 細胞形態に対応して 、な 、例をあげる。

「細胞の大きさ」として、通常、細胞 Aの境界上でもっとも距離の大きい 2点間の距離 Lを大きさとして定義する方法がある。この方法によれば、例えば、図 21にあるような 細胞 Aが特定の方向に伸びて 、る場合、適切に細胞 Aの大きさを表現して 、るとは 言えない。

[0176] 特に、細胞 Aの形状が円に近くない、歪んだものが多い場合、細胞 Aの大きさを正 確に見積もることは難しい。上の例はこのような場合に該当すると考えられる力 この 実験系では、細胞 Aの大きさの定義が細胞の実際の形状と一致せず適切ではな 、と いえる。

[0177] (ノイズ除去方法など処理方法に起因する精度の問題）

細胞画像中に含まれる生細胞以外の物質による画像ノイズを特徴量に含めてしまう ということが、細胞特徴量の測定精度を下げる第 2の原因として挙げられる。このこと を、特に、細胞を保護する作用のある薬剤を探すスクリーニングを例にとって説明す る。

[0178] このようなスクリーニングの例としては、培養細胞に対して、細胞の半分程度が死滅 するような刺激を与える系が考えられる。この培養細胞の系に薬剤投与することによ つて細胞の生存率がどれだけ上がるかによつて細胞の保護作用を評価する方法が 考えられる。ここで、細胞の生存率は、生きている細胞の数を直接比較することによつ て行われる。

この方法で問題になるのは、刺激によって一部死んだ細胞が培養プレートや培養 液中に残って 、る場合があると 、うことである。

[0179] これら細胞の死骸を除去するには、例えば培養細胞を顕微鏡で観察する前に洗浄 するなどの操作が必要である。

実際の実験処理過程においては、このような 1つの処理が付け加わることで時間と コストが増すことになる。このことは大量の薬剤サンプルを解析対象にするような薬剤 スクリーニングにお 、ては好まし 、ことではな 、。

このような事情から、上のようなスクリーニング系では、細胞の画像中に生細胞と細 胞の死骸が混在して 、るとして精度の高 、解析処理方法を考えなくてはならな 、。

[0180] 以上のような課題の解決方法として、本実施形態に係るスクリーニング方法を以下 に説明する。

本実施形態に係るスクリーニング方法においては、まず、細胞 Aの形態を表現する 形態特徴量として、細胞 Aの輪郭形状の円または球力ものずれ量を使用する。

[0181] 細胞 Aは刺激を受けることによって、死滅するが、この過程は細胞 Aの連続した形 態的な変化を生じさせる。一般に刺激を受けて死滅に近づいた細胞 Aは、活性を失 うなどの理由により丸くなる。

[0182] 逆に、活発に活動を行っている細胞 Aの形は、通常、円形または球形を標準として かなりの歪みを生じている。

よって、細胞 Aの形態特徴量として、円または球からのずれ量を採用することにより

、その生死判定、活性度の推定を行うことができると考える。

[0183] 具体的には以下のような方法で形態的特徴量の抽出を行う。 まず、画像処理により細胞 Aの境界を抽出し、さらに、図 22に示されるように、細胞 Aの境界の最大半径の内接円 Cおよび最小半径の外接円 Cを取得する。ここで、

I O

円の半径、円に含まれる領域に対する細胞領域の面積比などを細胞 Aの形態特徴 量とする。

特に細胞が 3次元的に重なっている場合を考える（図 26参照)。この図の中で矢印 をつけた細胞を取り出して解析する場合、細胞の 3次元での解析が必要になる。

[0184] 3次元で立体的に細胞 Aを解析する場合、 3次元の細胞 A像は、撮像系で、プレー トなど対象そのものを上下方向に微小に変化させ、ほぼ連続的に 2次元画像を取得 し、このデータをもとに構成される。

このような場合、図 23に示されるように、細胞 Aの各横断面 A〜Aのうち、細胞 A

1 N

の中心を通る断面に対して上記の方法で解析を行うことにより、ダメージなど上で説 明したパラメータの定量ィ匕を行うことができる。なお、図 23において、符号 C 〜C は

II IN

細胞 Aの各横断面 A〜Aの内接円を示し、符号 C 〜C は細胞 Aの各横断面 A

I N Ol ON 1

〜Aの外接円を示す。

N

[0185] ここで、細胞 Aの中心を通る断面とは、各細胞 Aの上下方向に異なる位置の断面に ついて得られた各 2次元画像に対して、内接円 C 〜C 力もっとも大きい上下方向

II IN

位置を通過する水平断面であると定義される。

[0186] (円と細胞の特徴）

これらの形態特徴量からは、細胞 Aの中心部分の大きさ、つまり実質的な細胞 Aの 大きさや、上記領域の面積比からは全体の形の歪み、さらに外接円の半径の大きさ 力も細胞 Aの空間的な広がりなどを統一的に把握することができ、細胞 Aの形態変化 を効率的に精度良く表現することができる。

[0187] この方法によって、例えば、図 22のように歪んだ細胞 Aに対してもその実質的な部 分であると考えられる内接円 C内に含まれる中心部分と特定することができ、単純に

I

長さ Lを取った場合と比較して、細胞 Aの活動などを実際により近い値で評価すること ができる。

[0188] また、本実施形態に係るスクリーニング方法によれば、各細胞 Aの生死を判断する ことができる。 さらにこの方法を使うことによって、突起などの特定の細胞器官の検出や、細胞の 死骸や死骸断片、あるいは、気泡などノイズといわれるものなど、様々に分類すること ができる。

[0189] 画像を上記方法から複数の領域に分割し、細胞体に対応した領域、細胞の突起に 対応した領域、ある 、は細胞の死骸など生細胞に含まれな 、領域などに分類する具 体的な方法は、下記の通りである。

[0190] 例えば、細胞体などは楕円に近い形態をとるものが多い。この場合、内接円 Cと外

I

接円 C の半径は、数倍程度におさまることから、判断できる。

o

また、例えば細胞の突起など、一般に管状構造をとる細胞の部分構造が多く見られ るが、この場合、内接円 Cが小さぐ外接円 C は大きいので、これらの半径比率は大

I o

きい。

[0191] また、細胞死の過程で、細胞は突起が徐々に収縮し全体として真円に近づいてい く。よって死んだ細胞あるいは死につつある細胞は上記内接円 Cと外接円 Cとの半

I o 径比率はほぼ 1に近い値をとり、さらに内接円 Cの半径も小さい。

I

以上のような方法により、これら内接円 C、外接円 Cを使って定義した特徴量によ

I o

り、細胞を分類することが可能になる。

[0192] さらにこれらの特徴量は以下のように解釈することによって、直接薬剤の効果を表 す指標として用いることができる。

細胞は刺激によるダメージを受けると、収縮するという特徴があることから、細胞の 形態の円力 の歪みを細胞が受けたダメージとして解釈すれば薬剤の保護作用の 指標として用いることができる。

[0193] また、細胞の運動活性が高 、場合細胞の境界の形状の変化の度合!、が大き!/、と 考えられるので、細胞の形態の円からの歪みを細胞の運動に起因するものとして解 釈した場合、薬剤の細胞に対する活性ィ匕を測る指標として用いることができる。

[0194] 薬剤スクリーニングは様々なカテゴリが考えられる。例えば、細胞を保護する薬剤、 あるいは細胞を活性化させ成長を促進したり分裂を促進させる薬剤などである。 これら薬剤の各カテゴリに対してスクリーニング方法、細胞解析方法は異なる力 い ずれの場合にも本発明の方法を適用することができる。 [0195] 細胞を保護する薬剤の場合、生きて 、る細胞の数と死んだ細胞の数の比率が、薬 効を表現する第一の指標になる。これは、今回の方法により画像中の細胞の生死を 判定し分類し、各細胞の数をカウントし、これらの比を取ることで測定することができる

[0196] 一方、細胞を活性ィ匕させるあるいは、細胞の活性ィ匕を抑える作用のある薬剤の場 合、死ぬ細胞が多い場合そもそも薬剤としては適切ではなく候補力 除外される。こ こで例えば、細胞の活性を表現する指標は、細胞体や細胞核がどれだけ楕円に近 づくかというようなものである。具体的には下記のような処理が考えられる。

[0197] この処理はまず、画像中の領域を細胞と推定される部分領域と細胞以外、細胞の 死骸断片などと推定される領域に分類し、死骸領域が細胞領域と比較して大き ヽ場 合、薬剤候補から除かれ、さらに、細胞領域内で、細胞の中心に存在し大部分を構 成している細胞体とその他突起などの外節領域とに分類し、特に細胞体領域の楕円 度を求め、平均化などの作業で各画像、各実験条件ごとに定量化を行い、それぞれ の薬効を数値化する。

[0198] よって、上記記載のスクリーニング方法は、細胞保護作用のある薬剤の薬効定量や 、細胞活性ィ匕作用のある薬剤の薬効定量など様々な薬剤スクリーニング系に適用す ることがでさる。

[0199] また、本実施形態においては、通常の細胞画像処理では考慮に入れられることの ない、細胞以外の画像情報を使って、特徴量の補正を行う。

[0200] (ノイズ含有画像の処理方法）

前述の細胞にダメージを与える系においては、細胞の一部は死ぬことになる力 こ れら死細胞の死骸は画像中に残って 、る場合が多ぐ系に固有のノイズ発生要因と なって、細胞特徴量解析の精度を下げる原因となっている。

[0201] 通常の解析においては、細胞の死骸などの細胞以外の画像情報は、適当な関数 処理などにより除去されるのが普通である。

[0202] 一方、本実施形態に係るスクリーニング方法においては、これら通常除去される画 像情報を使って特徴量の補正を行う。

例えば、細胞の数をカウントし細胞保護作用の指標とするような前述した系におい ては、細胞の数があら力じめ厳密にコントロールされているとは限らない。そのため、 同一カテゴリ内の、つまり似た条件の、細胞画像を多く観察することによって全体の 細胞数を平均化させ、画像中の細胞数のばらつきを抑えるという方法が取られる。

[0203] し力しながら、細胞スクリーニングにおいてこのような方法で平均化し補正すること は、実験の解析時間を増やすことになるので好まし 、補正方法ではな 、。

本実施形態においては、例えば、細胞の死骸の数で細胞の総数を割ることによつ て、刺激を与える以前の細胞数に対して死滅ある 、は生存して 、る細胞の割合を正 しく見積ちることができる。

[0204] また、このように数に関する補正だけでなぐ例えば、形態の歪みを使って細胞のダ メージを評価する場合、死滅した細胞の総数な 、し死滅した細胞領域の総面積は、 ともに細胞のダメージに対応した特徴量である。

よって、これらを比較、あるいは平均化することにより細胞の受けたダメージ量を補 正し、実際の細胞ダメージにより近 、値を与えることができる。

[0205] 以上のように、細胞以外の画像情報を定量ィ匕し、細胞のみを対象とした画像解析 結果の付加情報として用いて、スクリーニングを行うことにより、細胞解析の精度があ がることが期待できる。

[0206] また、特に神経細胞を使ったスクリーニングを行う場合、通常の細胞に比べ、より特 異な形態をして 、ることから、スクリーニングが難しくなる場合がある。

例えば、神経細胞の管状構造をもつ突起の総延長を形態を表現する特徴量とする 系を考える場合、突起の総延長は細胞によってばらつきが大きい、あるいは、薬剤な どの影響を受けやすい、あるいは細胞体に比べて画像解析的に検出しにくいなどの 特徴があるため、解析処理の結果には大きな誤差が含まれている場合が多いと考え られる。

[0207] このような場合に対して、細胞の死骸などの情報を用いることにより、二つの細胞ダ メージ指標を得ることになり、より適切な値を導き出すことができ、全体としてスクリー ユングの精度が上がると期待できる。

[0208] また、薬剤投与などの適当な処理を施した細胞を観察するこのような実験系におい て、は、薬剤の種類、量などだけでなぐ培養条件も結果を左右する重要な要因にな る場合が多いと考えられる。

細胞は一般的に、相互作用を行っていると考えられ、またこの相互作用は同一の 細胞種間だけにとどまらず、異なる複数細胞種間でも行われて 、ると考えられる。

[0209] ところで、複数細胞種を一緒に培養したサンプルを観察する場合、まず複数の細胞 種を見分ける処理を行う必要がある。

細胞種を分類する方法としては、各細胞の形態の違!、や染色の違!、などの定性的 なものから、あるいは蛍光量などの定量的な違いなど力 判断する方法などが考えら れる。

[0210] これらの処理を行った後、上記、単一の細胞種を対象として行っている解析と同じ 手順で特徴量抽出などを行い、薬剤に対する変化などを定量ィ匕する。

サンプルの細胞を、細胞種などのカテゴリ分類して、各カテゴリの特徴量の変化な どを記録することにより、より詳細にデータの解釈を行うことができ、たとえば有効な薬 剤の探索により効果を発揮すると期待できる。

[0211] また、複数細胞種を培養する際、細胞の混在比率などによって結果が異なることも 予想されるので、これらの情報、混在比率などもあわせて利用する。

また、細胞の比率だけでなぐ各細胞種の薬剤への反応の違いを比較することによ り、たとえばより正確な薬剤の探索を行うことができると期待できる。

[0212] これらの情報の利用方法は、たとえば細胞の死骸を使って補正する方法と同様なも のである。

例えば、細胞群 G1と細胞群 G2の二つの細胞種を含む系で、薬剤投与後一定刺 激を与えることにより、細胞群 G1の 60%が死滅し、細胞群 G2の 10%が死滅したとい う結果を得たとする。この場合、例えば、この薬剤は細胞群 G2を選択的に保護する 役割がある、などと解釈することができる。

一般には、このように、異なる細胞種間の結果を比較することにより、より詳細な解 析を行うことができると期待できる。

[0213] 次に、本発明の第 4の実施形態に係るスクリーニング装置について図 24を参照して 説明する。

図 24に本実施形態に係るスクリーニング装置 61の全体構成を示す。本実施形態 に係るスクリーニング装置 61は、励起光を発生する光源 62を含む照明光学系（照明 部） 63と、観察対象の動植物等の細胞を含む試料 Bを配置したプレート 64を載置す る位置決めステージ 65と、試料 B力 発せられた蛍光を撮像する CCDカメラ (画像情 報入力部） 66を含む受光光学系 67と、 CCDカメラ 66により取得された画像を処理し て形態的特徴量を抽出する画像処理部と、抽出された形態的特徴量を用いて薬剤 スクリーニングを行うスクリーニング部とを備えて 、る。

[0214] 照明光学系 63には、光源 62からの励起光を試料 Bに照射するコンデンサレンズ 6 9が備えられている。

位置決めステージ 65は、試料 Bに焦点を合わせるようにプレート 64を移動させるこ とができるようになって!/、る。

[0215] 受光光学系 67には、特定の波長帯域の蛍光を透過させる光学特性を有するフィル タ 68が備えられている。フィルタ 68は交換可能となっており、透過させる波長帯域に 応じて交換することができるようになって!/、る。

[0216] 画像処理部およびスクリーニング部は、コンピュータ (スクリーニング部、評価部、画 像処理部、画像情報処理部） 70のようにコンピュータプログラムによって作動する汎 用的な処理装置が用いられている。コンピュータ 70には、画像処理部として機能させ るためのコンピュータプログラム、例えば、細胞中心抽出処理、中心点吟味処理、細 胞境界抽出処理、個々の細胞の特徴量抽出処理、細胞の総数抽出処理などの機能 を実現させるものがインストールされている。また、コンピュータ 70には、スクリーニン グ部として機能させるために、本実施形態に係るスクリーニング方法を実施するコン ピュータプログラムもインストールされて 、る。

[0217] 本実施形態に係るスクリ一ユング装置 61を用 、て薬剤スクリ一ユングを行うには、 図 25に示されるように、まず、プレート 64上に細胞サンプル等の試料 Bを用意する。 細胞サンプル準備工程 S21にお ヽては、観察の対象となる各種条件下で試料 Bを 準備する。次いで、染色、発光のためのサンプル操作工程 S 22において、適当な染 色方法、発光させる操作を試料 Bに対して行う。そして、サンプル設置工程 S23にお いては、このようにして準備されたプレート 64を位置決めステージ 65に固定し、位置 決めステージ 65の作動により、観察位置合わせおよび焦点位置合わせ操作を行!ヽ 、光源 62から励起光を細胞サンプル Bに向けて照射する。

[0218] 励起光を照射された試料 Bからは、蛍光が発せられるので、発せられた蛍光を対物 レンズ 71で集め、所定の波長帯域の蛍光のみをフィルタ 68によって選別し、画像撮 像工程 S24において、 CCDカメラ 66によって撮像する。また、必要に応じて、試料 B を固定したままフィルタ 68を交換するなど種々の撮像条件を変更し (S25)で撮像を 行う。あるいは、必要に応じて撮像位置を変更して（S26)撮像を行う。

[0219] CCDカメラにより取得された蛍光画像情報は、画像処理部に送られ、画像処理ェ 程 S 27が行われる。

画像処理工程 S27においては、まず、各画像の個々の細胞の中心となる点が抽出 される（S271)。また、抽出された中心点が吟味され、細胞の中心点として不適切な ものが除かれた、適切な細胞中心点が抽出される（S272)。続いて、これらの細胞中 心点を囲む最も適切な細胞の境界を抽出する（S273)。そして、得られた細胞境界 を用いて、上述したスクリーニング方法、すなわち、個々の細胞の形態的特徴量の抽 出や細胞の総数を算出を行い（S28)、これに基づいて薬剤スクリーニングを実施す る（S29)。

[0220] このように、本実施形態に係るスクリーニング方法および装置によれば、細胞を使つ た薬剤スクリーニングを高い精度で実現することができるという効果を奏する。

Claims

請求の範囲

[1] 撮影条件の異なる複数の細胞画像を取得する撮影工程と、

前記複数の細胞画像に基づいて、細胞の位置と、少なくとも 1つの特徴量を抽出し

、前記抽出された特徴量をパラメータとして統計的に解析する解析工程と、を有する ことを特徴とする細胞画像解析方法。

[2] 前記解析工程において、複数の前記特徴量の相関関係に基づいてパラメータ設 計をし、これらのパラメータを用いて化合物の有効性を評価することを特徴とする請 求項 1に記載の細胞画像解析方法。

[3] 前記解析工程において、前記相関関係に基づいて、前記パラメータの重み付けを 変更することを特徴とする請求項 2に記載の細胞画像解析方法。

[4] 前記解析工程において、前記相関関係と前記測定結果に基づいて、パラメータの 測定精度あるいは測定の信頼性を評価することを特徴とする請求項 2又は請求項 3 に記載の細胞画像解析方法。

[5] 前記解析工程にぉ 、て、前記パラメータの測定精度あるいは測定の信頼性の評価 に基づいて、測定系の条件による変化を最も有効に表現するパラメータを選択するこ とを特徴とする請求項 4に記載の細胞画像解析方法。

[6] 前記解析工程において、前記選択されたパラメータに基づいて、細胞評価に最も 有効な指標となるパラメータを選択することを特徴とする請求項 5に記載の細胞画像 解析方法。

[7] 前記解析工程にお！ヽて、各細胞の位置情報を用いて細胞の特徴量を解析すること を特徴とする請求項 2に記載の細胞画像解析方法。

[8] 前記位置情報は、局所的な細胞密度、最近接細胞までの距離、細胞同士が接して いるカゝ否かの情報を含むことを特徴とする請求項 7に記載の細胞画像解析方法。

[9] 撮影条件の異なる複数の細胞画像を取得する撮影部と、

前記複数の細胞画像に基づいて、細胞の位置と、少なくとも 1つの特徴量を抽出し

、前記抽出された特徴量をパラメータとして統計的に解析する解析部と、を具備する ことを特徴とする細胞画像解析装置。

[10] 請求項 9に記載の細胞画像解析装置において、前記解析部は、複数の前記特徴 量の相関関係に基づ 、てパラメータ設計をし、これらのパラメータを用 、て化合物の 有効性を評価することを特徴とする細胞画像解析装置。

[11] 請求項 10に記載の細胞画像解析装置において、前記解析部は、前記相関関係に 基づ 、て、前記パラメータの重み付けを変更することを特徴とする細胞画像解析装 置。

[12] 請求項 10又は請求項 11に記載の細胞画像解析装置において、前記解析部は、 前記相関関係と前記測定結果に基づいて、パラメータの測定精度あるいは測定の信 頼性を評価することを特徴とする細胞画像解析装置。

[13] 請求項 12に記載の細胞画像解析装置において、前記解析部は、前記パラメータ の測定精度あるいは測定の信頼性の評価に基づいて、測定系の条件による変化を 最も有効に表現するパラメータを選択することを特徴とする細胞画像解析装置。

[14] 請求項 13に記載の細胞画像解析装置にお 、て、前記解析部は、前記選択された ノ メータに基づいて、細胞評価に最も有効な指標となるパラメータを選択することを 特徴とする細胞画像解析装置。

[15] 請求項 10に記載の細胞画像解析装置にぉ 、て、前記解析部は、各細胞の位置情 報を用いて細胞の特徴量を解析することを特徴とする細胞画像解析装置。

[16] 請求項 15に記載の細胞画像解析装置にぉ 、て、前記位置情報は、局所的な細胞 密度、最近接細胞までの距離、細胞同士が接しているか否かの情報を含むことを特 徴とする細胞画像解析装置。

[17] 細胞力 発せられる光を所定の時間間隔をあけて複数の画像として受けとる画像 情報入力工程と、

該画像情報入力工程で得られた複数の画像中の輝度値が規定値以上のピクセル の存在割合を算出する輝度値演算工程と、

該輝度値演算工程で得られた複数の画像における規定値以上の輝度値を有する ピクセルの存在割合を比較演算する比較演算工程とを含む細胞画像解析方法。

[18] 細胞力 発せられる光を所定の時間間隔をあけて複数の画像として受けとる画像 情報入力工程と、

該画像情報入力工程で得られた画像情報に対して画像中に存在する細胞の個数 を計数する個数計数工程と、

該個数計数工程で得られた結果を元に複数の画像中の細胞の個数を比較演算す る比較演算工程と含む細胞画像解析方法。

[19] 前記個数計数工程が、細胞核よりも小さい第 1の円と、細胞核よりも大きい第 2の円 と、第 2の円よりも大きい第 3の円とからなる 3重の同心円と、各画像中の規定値以上 の輝度値を有する領域とを対比し、第 1の円内の全てのピクセルが規定値以上の輝 度値を有し、第 1の円と第 2の円との間の環状領域に規定値以上の輝度値を有する ピクセルが存在し、かつ、第 2の円と第 3の円との間の環状領域に規定値以上の輝度 値を有するピクセルが存在しないことを条件として、細胞の存在を認定し、計数する 請求項 18に記載の細胞画像解析方法。

[20] 前記比較演算工程で得られた演算結果に基づいて細胞の活性または増殖度を判 定する判定工程を含む請求項 17から請求項 19のいずれかに記載の細胞画像解析 方法。

[21] 前記判定工程にぉ 、て判定された細胞の活性または増殖度に基づ 、て細胞を分 類する請求項 20に記載の細胞画像解析方法。

[22] 前記判定工程にぉ 、て判定された細胞の活性または増殖度に基づ 、て薬剤の細 胞への影響を定量化する請求項 20に記載の細胞画像解析方法。

[23] 前記細胞力も発せられる光が蛍光である請求項 17から請求項 22のいずれかに記 載の細胞画像解析方法。

[24] 所定の時間間隔をあけて細胞から発せられた光を撮影して得られた複数の画像情 報に対して、輝度値が規定値以上のピクセルの存在割合を算出する輝度値演算ェ 程と、該輝度値演算工程で得られた複数の画像における規定値以上の輝度値を有 するピクセルの存在割合を比較演算する比較演算工程とをコンピュータに実行させ る細胞画像解析プログラム。

[25] 所定の時間間隔をあけて細胞から発せられた光を撮影して得られた複数の画像情 報に対して、画像中に存在する細胞の個数を計数する個数計数工程と、該個数計 数工程で得られた結果を元に複数の画像中の細胞の個数を比較演算する比較演算 工程とをコンピュータに実行させる細胞画像解析プログラム。

[26] 前記個数計数工程が、細胞核よりも小さい第 1の円と、細胞核よりも大きい第 2の円 と、第 2の円よりも大きい第 3の円とからなる 3重の同心円と、各画像中の規定値以上 の輝度値を有する領域とを対比し、第 1の円内の全てのピクセルが規定値以上の輝 度値を有し、第 1の円と第 2の円との間の環状領域に規定値以上の輝度値を有する ピクセルが存在し、かつ、第 2の円と第 3の円との間の環状領域に規定値以上の輝度 値を有するピクセルが存在しないことを条件として、細胞の存在を認定し、計数する 請求項 25に記載の細胞画像解析プログラム。

[27] 細胞力 発せられる光を所定の時間間隔をあけて複数の画像として受けとる画像 情報入力部と、

該画像情報入力部で得られた複数の画像中の輝度値が規定値以上のピクセルの 存在割合を算出する輝度値演算部と、

該輝度値演算部で得られた複数の画像における規定値以上の輝度値を有するピ クセルの存在割合を比較演算する比較演算部とを含む細胞画像解析装置。

[28] 細胞力 発せられる光を所定の時間間隔をあけて複数の画像として受けとる画像 情報入力部と、

該画像情報入力部で得られた画像中に存在する細胞の個数を計数する個数計数 部と、

該個数計数部で得られた結果を元に複数の画像中の細胞の個数を比較演算する 比較演算部とを備える細胞画像解析装置。

[29] 顕微鏡により取得した細胞画像を解析し、

細胞画像中の各細胞の形態的な特徴を表す形態特徴量として、細胞の輪郭の円 からのずれ量をパラメータ化した値を評価し、

この評価に基づいて薬剤スクリーニングを行うスクリーニング方法。

[30] 前記形態特徴量として、細胞の輪郭の内接円または外接円の少なくともいずれか 力ものズレ量をパラメータ化した値を評価する請求項 29に記載のスクリーニング方法

[31] 顕微鏡により取得した複数の細胞画像カゝら構築した 3次元画像を解析し、

細胞画像中の各細胞の形態的な特徴を表す形態特徴量として、細胞の輪郭の球 からのずれ量をパラメータ化した値を評価し、

この評価に基づいて薬剤スクリーニングを行うスクリーニング方法。

[32] 前記形態特徴量として、細胞の輪郭の内接球または外接球の少なくとも 、ずれか 力ものズレ量をパラメータ化した値を評価する請求項 31に記載のスクリーニング方法

[33] 前記形態特徴量に基づ!、て、画像中の細胞を生細胞または死細胞の 、ずれかに 判定して評価に使用する請求項 29から請求項 32のいずれかに記載のスクリーニン グ方法。

[34] 細胞画像中に選択された!ヽずれかの領域に対して解析を行 ヽ、

パラメータ化した値に基づいて、これら領域を細胞体、管状構造をもつ細胞の突起 、細胞以外の細胞の死骸または気泡に分類する請求項 29から請求項 33の 、ずれ かに記載のスクリーニング方法。

[35] 分類された細胞以外の画像情報を定量化し、

定量ィ匕された細胞以外の画像情報を用いて、細胞に対する薬剤スクリーニングの 統計結果を補正する請求項 34に記載のスクリ一二ング方法。

[36] 細胞の形態の変化を、細胞がダメージを受けたことに起因すると推定し、薬剤によ る細胞保護作用を定量ィ匕する請求項 35に記載のスクリーニング方法。

[37] 細胞の形態の円力 の歪みを細胞の運動に起因するものとして解釈し、

前記形態特徴量を薬剤の細胞に対する活性ィ匕を測る指標として用いる請求項 29 力も請求項 32のいずれかに記載のスクリーニング方法。

[38] 神経細胞のスクリーニング方法において、

分類された管状構造をもつ各細胞の突起の情報を形態特徴量として用い、 管状構造の総量が細胞が受けたダメージと相関するということを推定し、 薬剤効果の定量ィ匕を行う請求項 34に記載のスクリ一ユング方法。

[39] 複数の種類によって構成される細胞サンプルを用いる請求項 29から請求項 38の いずれかに記載のスクリーニング方法。

[40] 注目する細胞種および他の細胞種につ!、て同様な評価を行う請求項 39に記載の スクリーニング方法。

[41] 細胞に照明光を照射する照明部と、

細胞力 発せられる光を検出して画像情報を取得する画像情報入力部と、 該画像情報入力部により取得された画像情報において、各細胞の形態的な特徴を 表す形態特徴量をパラメータ化する画像情報処理部と、

該画像情報処理部によりパラメータ化された形態特徴量を評価し、細胞に対する薬 剤スクリーニングを行う評価部と、

該評価部による薬剤スクリーニングの結果を出力表示する出力部とを備えるスクリ 一二ング装置。

[42] 前記評価部が、前記形態特徴量として、円または球力 の細胞の輪郭のズレ量を 用 、る請求項 41に記載のスクリ一ユング装置。

[43] 前記評価部が、前記形態特徴量に基づ!、て、各細胞の生死を判別する請求項 41 または請求項 42に記載のスクリーニング装置。

[44] 複数種の細胞サンプルを用い、注目する細胞種および他の細胞種につ!、て同様 の評価を行う請求項 41から請求項 43のいずれかに記載のスクリーニング装置。