WO2016207986A1 - 検査システム、検査装置、及び検査方法 - Google Patents

検査システム、検査装置、及び検査方法 Download PDF

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WO2016207986A1
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崇秀 横井
白井　正敬
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株式会社日立製作所
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Definitions

  • the present invention relates to a biological sample inspection.
  • the present invention relates to biological tissue analysis including genetic analysis and cell function analysis, disease diagnosis, drug discovery, and the like.
  • Biomarkers such as the type and amount of protein or mRNA, or mutations in genomic genes, are important indicators that characterize individuals and tissues. For example, cell diagnosis by pathologists is the mainstream of diagnosis in cancer diagnosis, but the use of these biomarkers can provide objective indicators and slight changes that could not be detected by conventional image diagnosis, For example, a major feature is that a partial change in a protein molecule or a nucleic acid molecule that cannot be distinguished only by a cell image can be detected.
  • biomarkers are important for determining the effect and determining the dose of a drug specific to a target molecule in recent years, also called genome drug discovery.
  • diagnosis using these biomarkers is important for determining the effect and determining the dose of a drug specific to a target molecule in recent years, also called genome drug discovery.
  • biomarkers as indexes, it is expected that medical costs will be reduced by providing medical care more suitable for individual patients and avoiding useless treatment.
  • High-sensitivity detection of biomarkers is useful for early diagnosis and detection of subtle differences between specimens, and it is important to increase the sensitivity of biomarker detection technology for medical and industrial applications.
  • the tissue or individual is an aggregate of cells having different diversity states and different cell types.
  • blood cells are composed of various cell types such as erythrocytes, lymphocytes, T cells, and T cells that are immune cells have different antigen responsiveness.
  • cancer tissue is a collection of normal cells and cancerous cells, and the state of genomic abnormalities is not uniform and diverse in each cancer cell. It is known that In other words, when a sample is collected from a specimen as an observation target, the sample is an aggregate of cells having diversity, and the cells having the diversity are collected depending on the collection site and time. The configuration and state will change.
  • a method for analyzing gene expression information various techniques such as a quantitative PCR method, a microarray method, or a base sequence analysis using a massively parallel sequencer are used depending on the purpose.
  • various techniques such as a quantitative PCR method, a microarray method, or a base sequence analysis using a massively parallel sequencer are used depending on the purpose.
  • the feature quantity is extracted by comparative analysis of the value of the gene expression level, that is, the average value of the cell population constituting the test object. If the ratio of the target cell type is sufficiently high in the sample to be analyzed, the feature quantity can be extracted even by the conventional method, but if the target cell ratio is low, the validity is poor.
  • the feature quantity derived from a small number of target cells is buried in the feature quantity derived from other cells that occupy the majority, so that highly sensitive detection of biomarkers is performed. Will be difficult. For example, assuming a tumor tissue, it is a common event that the proportion of cancer cells in the tumor tissue is 50% or less. Furthermore, in recent years, knowledge suggesting the existence of cancer stem cells estimated to be a fraction of several percent of the diversity of these cancer cells has been obtained, and biomarkers possessed by such cancer stem cells are detected. It was difficult.
  • single cell analysis technology As a method for solving the above-mentioned problems, research on techniques for extracting features of a small number of cells by individually analyzing individual cells is being promoted. These are technologies that focus on differences in the genome, gene expression, and protein content of individual cells when performing genome analysis, gene expression analysis, and protein analysis of biological tissues composed of many cells. This is called single cell analysis technology. The importance of single cell analysis technology has begun to be recognized as a technology for improving the detection sensitivity of biomarkers by setting the measurement target sample to one cell or a small number of cells.
  • Non-Patent Document 1 For example, almost all mRNA is changed to cDNA, and a cDNA library (cDNA aggregate containing all cDNAs) held on beads is prepared and quantified.
  • a method for use in analysis has been devised. In this technology, it has been shown that it is possible to accurately measure the expression level of multiple genes contained in one cell by repeatedly using a cDNA library to prevent a decrease in the number of molecules of a gene expressed in a small amount due to sample division.
  • a tissue and a specimen are composed of a collection of various cell types, a single cell analysis technique for measuring cells individually is useful for highly sensitive biomarker detection.
  • the detected value is insufficient for grasping the state of the tissue or specimen which is the original purpose. This is because the analysis result of one cell indicates the characteristic amount of the cell, and the analysis result of one cell is used as a direct evaluation index of a tissue that is a group of various cells. It is extremely inappropriate.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems of the prior art, and aims to realize highly accurate biomarker detection while suppressing analysis cost, labor, and analysis time.
  • the feature amounts of a plurality of biological samples are optically acquired from a specimen, and the feature quantities are compared with prior examination information related to the same specimen, Based on the comparison result, an index for determining whether to continue the process of genetic analysis of a biological sample or to recalibrate the sample from the same specimen is calculated.
  • the present invention enables more reliable biomarkers by appropriately selecting test samples and ensuring their validity while reducing analysis costs, analysis time, and labor in single cell analysis or analysis of a small number of cell populations. Detection can be realized.
  • the flowchart which shows the processing content in a single cell analysis test
  • the figure which shows an example of the information stored in a sample conformity reference
  • the figure which shows an example of the information stored in an individual cell reference
  • the figure which shows an example of the information stored in a library reference
  • the block block diagram which shows an example of a structure in a single cell analysis test
  • gene expression analysis using a next-generation sequencer is taken as an example, but the present invention includes cases where other methods such as quantitative PCR and microarray are used as a gene detection method.
  • gene expression analysis is an example of a biomarker derived from an individual cell, and includes cases where the detection target is a nucleic acid molecule or protein such as miRNA or genomic DNA, or a metabolite of a cell.
  • the sample is a sample derived from a specific individual to be examined, and even if the sample is derived from the same individual, if the sample collection location, sample collection time, sample collection method, etc. are different, it is regarded as a different sample.
  • a part of the specimen prepared from the specimen by collecting a part of the specimen by section preparation, laser microdissection method, or the like, or concentrating specific cells by a cell sorter or the like is specifically defined as a test specimen.
  • a sample collected by biopsy is a specimen
  • a paraffin-embedded section used for pathological observation of these specimens is a test sample.
  • This example is one of the major differences from the conventional biomarker detection technique in that it aims to perform more accurate biomarker detection in consideration of the diversity of cells and tissues described above.
  • test samples are derived from the same specimen, different test samples are not strictly the same cell population, and if a highly sensitive biomarker detection technique is used, judgments that take into account the differences between these test samples are particularly important. It becomes important.
  • a pathologist performs microscopic observation of a paraffin-embedded section of a test sample. Biomarker detection is performed on the specimen when the pathologist determines additional analysis of the biomarker by gene analysis or the like from the observation result.
  • test sample used for biomarker detection is a section continuous with the paraffin-embedded section that has been previously observed under a microscope, the position space in the sample is different from the previous observation sample although it is derived from the same specimen. It becomes a test sample.
  • Cancer tissue is a collection of normal cells and cancerous cells, and it is known that there is diversity among cancer cells. Furthermore, even within one tumor tissue, the ratio of normal cells to cancer cells varies depending on the tumor site. Therefore, if the purpose is to understand the nature of a cancer tissue in detail, i) prepare samples from multiple sites of the tumor tissue, ii) perform analysis at the single cell level for each sample piece, iii) Although it is required to integrate the analysis results of these tissue pieces, if the sample to be analyzed lacks validity, for example, the region where the cancer cell ratio is extremely low in the tumor tissue, the analysis results Cause incorrect judgment. In other words, considering that cells and tissues are essentially diverse populations, it is extremely important to determine the validity of a test sample in highly sensitive detection of a biomarker using a single cell analysis technique.
  • the system includes a sample conformity reference database 501, an individual cell reference database 502, a library reference database 503, a microscope observation unit 504 for observing cells, a single cell analysis processing unit 505 for preparing individualized cells, A quantitative PCR device 506 that performs quantitative PCR, a DNA sequencer 507 that performs base sequence analysis of the prepared DNA library, and a single cell testing device 200 that can be connected thereto are provided.
  • the single cell inspection apparatus 200 includes a calculation unit 608 and a determination result display unit 609.
  • the calculation unit 608 refers to at least one of the sample matching reference database 501, the individual cell reference database 502, and the library reference database 503, and refers to the referenced reference database and each Calculation processing and determination processing are performed by comparison with the inspection value.
  • the determination result display unit 609 displays the calculation and determination results by the calculation unit 608.
  • the sample conformity standard database 501 includes a reference value based on the result of the precision inspection determination 102 performed in advance using a test sample derived from the same specimen, and the result of the sample conformance determination 201. And the sample conditions determined by the applied biomarker testing technology.
  • the individual cell standard database 502 stores a standard value based on the result of the individual cell evaluation 204 and a sample condition determined by the applied biomarker test technique.
  • the library standard database 503 stores a standard value based on the result of the individual cell evaluation 204 and a sample condition determined by the applied biomarker test technique.
  • sample conformity reference database 501 the individual cell reference database 502, and the library reference database 503 are illustrated as individual databases. However, these databases may be configured in one storage medium.
  • This system realizes sample evaluation / analysis considering tissue and cell diversity, which has been difficult to achieve in the past, and it is also possible to connect a part or a plurality of these devices and databases.
  • This system performs the following processing in order to evaluate the specimen from the result of the highly sensitive biomarker detection analysis in consideration of the diversity of cells and tissues. Furthermore, the process which added or reduced the process as needed is performed.
  • test sample Prior to processing by this system, a test sample is prepared from a specimen in advance (101), and a pathologist or an examiner determines whether or not a detailed inspection is necessary from the inspection result of the test sample (102). A test sample to be tested is prepared (103). Thereafter, the system performs the following processing.
  • the sample suitability determination 201 by the single cell analysis and inspection apparatus 200 will be described. As described above, since the test sample used for the detailed inspection necessity determination 102 and the test sample used for biomarker detection are not the same, the single cell inspection apparatus 200 is used after the detailed inspection determination 102.
  • the sample conformity determination 201 is newly performed on the sample adjusted by the test sample preparation 103.
  • the sample suitability determination 201 the sample adjusted by the test sample preparation 103 used for the biomarker test is observed with, for example, the microscope 504, and the calculation unit 608 uses the sample match reference database 501 for the observation result.
  • the compatibility is confirmed, and an indication of continuation of processing or re-preparation of the test sample is presented on the determination result display unit 609.
  • the result of the detailed inspection determination 102 performed in advance using a test sample derived from the same specimen is an important index. This is because, considering the diversity of living tissues and cells, each test sample is a group of cells with individual individuality. It is reasonable to make comparisons between samples.
  • the sample inspection performed in the sample compatibility determination 201 may be the same method as the previous detailed inspection determination 102, but it is desirable that the method does not interfere with the precise biomarker detection performed later. Therefore, the sample suitability determination is performed by a different method, for example, a phase contrast microscope with less invasiveness to the sample, observation of a Raman image, or detection of a specific antigen by immunostaining.
  • the calculation unit 608 refers to the result of the close test determination 102 derived from the same specimen and the test result of the sample suitability determination 201 corresponding to the determination reference from the sample suitability reference database 501 to continue the test.
  • the readjustment determination in the test sample preparation 103 is performed.
  • the sample suitability reference database 501 stores, as a reference value 2008, criteria for determining pathological suitability such as the number of cancer cells 2001, the ratio of cancer cells 2002, and the progress 2003 in the results of the examination using the first test sample preparation 101. is doing.
  • the sample compatibility standard database 501 also stores test technique compatibility determination standards such as a sample fixing method 2004, a sample storage temperature 2005, and a test sample size 2006 as a reference value 2008. . These are indices for judging the level of the sample required in the cell separation 203, which is the next step, and serve as a standard for the suitability of the test sample to be judged.
  • the calculation unit 608 determines the test sample compatibility by comparing the inspection result 2009 of the second test sample preparation 103 with the reference value 2008, and records the determination result 2007.
  • the pathological compatibility determination criteria of the sample compatibility standard database 501 include the observation results of the test sample of the first test sample preparation 101 used for the fine inspection determination 102 and the second test sample preparation 103 used for the biomarker test.
  • the results (2001 to 2003) of observation performed on the inspection sample using, for example, the microscope 504 are stored in a format that can be compared between the reference value 2008 and the inspection result 2009.
  • the second test sample preparation 103 is subjected to a test that makes it possible to determine the sample suitability, and the result is stored in the test result 2009 of the sample suitability reference database 501, and then two test samples are stored.
  • the comparison result 2007 of the test sample compatibility is stored by comparing the test results.
  • the database 501, 502, and 503, including the sample conformity standard database 501 can improve the judgment criteria in a learning manner.
  • the reference value 2008 may be changed based on the evaluation result in each determination / evaluation (201, 204, 207) of FIG.
  • the test sample prepared in the second test sample preparation 103 is a sample to be used for precise biomarker detection, a desirable sample according to the inspection technique to be performed based on the determination criterion of test method suitability.
  • a state is defined.
  • the sample fixing method 2004, the sample storage temperature 2005, the test sample size 2006, and the like illustrated in FIG. 2 are items that greatly affect the results of the biomarker test. It is important to compare and judge with the index stored in.
  • the test results used to determine the compatibility between test samples, the test sample status defined by the biomarker detection technology, and a part or all of the compatibility determination results made by this system can be compared and browsed.
  • the determination result display unit 609 provides the system user with an index for determining whether to continue processing.
  • the sample suitability determination 201 performed by the single cell analysis / inspection apparatus 200 of the present system is performed by referring to the result of the test sample derived from the same specimen for the suitability determination of the sample to be used for biomarker detection performed as a close test.
  • the test sample conformity criteria is judged, and if the conformance criteria are not met, the sample re-preparation instructions are repeated until the conformance criteria are met, thereby confirming the validity of the prepared sample, that is, the validity of the test results. It is possible to guarantee.
  • test sample is prepared from a finite sample, it is assumed that a test sample that satisfies all the conformance criteria cannot be obtained. In such a case, it is also possible to carry out subsequent inspections by compromising one or more fitness indicators. Even in such a case, this system can contribute to improving the accuracy of test result determination by clarifying the conformity reference state of the test sample used for the inspection or the conformity index that deviates from the reference. .
  • the individual cell evaluation 204 by the single cell analysis / inspection apparatus 200 in FIG. 1 will be described.
  • the single cell analysis and inspection apparatus 200 performs an evaluation on the individual cells subjected to the cell separation 203.
  • the cells to be subjected to the individual cell evaluation 204 are those prepared by the cell separation 203 for the test sample whose continuation of processing is determined by the sample compatibility determination 201.
  • the cell separation 203 is a pretreatment for enabling individual examination of cells.
  • the cell separation 203 may be any technique of individualizing cells by simply peeling off the adhesion between cells, or a technique of separating specific cells using a cell sorter, laser microdissection, or the like. Prepared by a technique suitable for biomarker detection.
  • the individual cell evaluation 204 by this system consists of observation of the separated individual cells and evaluation of the observation results, and the observation of the cells is performed by the single cell analysis processing unit 505 or the microscope observation unit 504. It is a process of performing individual cell evaluation on the result of the cell separation process performed by the calculation unit 608.
  • the individual cell reference database 502 stores the result of the inspection using the first test sample preparation 101 and the inspection result of the sample suitability determination 201.
  • the items described for the tumor tissue are illustrated in FIG. 3, these items are examples, and the item names and item contents correspond to the examination performed on the first test sample preparation 101.
  • the sample conformity reference database 501 and the individual cell reference database 502 are described as independent databases. However, these reference databases may be on the same storage medium.
  • the calculation unit 608 evaluates the validity of the sample compatibility determination 201 result with respect to the sample after cell separation, and the subsequent process.
  • the state of the test sample which is essential for analyzing the biomarker detection results of individual cells performed in step (1), is evaluated.
  • Examples of information used as the reference for the individual cell evaluation 204 stored in the individual cell reference database 502 include the number of recovered cells 3001, the cell individualization rate 3002, and the target cell rate 3003. Among these indexes, the cell size 2006 and the like are determination criteria determined by referring to the result of the sample compatibility determination according to the test sample. In addition, as the cell individualization rate 3002 and the target cell rate 3003, determination criteria determined by the inspection technique in individual biomarker detection, for example, “the number of cells with 1000 or more cells and insufficient individualization is 5 The criterion “less than%” is stored in the individual cell criterion database 502.
  • the evaluation results 2010 are stored in a format that can be compared with the reference value 2008 for the reference information such as the number of recovered cells 3001, the cell individualization rate 3002, the target cell rate 3003, and the like.
  • the calculation unit 608 determines suitability by comparing the individual cell evaluation result 2010 with the reference value 2008 for the reference information such as the number of recovered cells 3001, the cell individualization rate 3002, the target cell rate 3003, and the like. Record.
  • the determination result display unit 609 presents the determination result by the calculation unit 608 using the reference information as shown in FIG. In the individual cell evaluation 204, when the criteria such as the number of collected cells 3001, the cell individualization rate 3002, the target cell rate 3003 and the like as shown in FIG. On the other hand, if the determination criteria are not met, the determination result display unit 609 displays information that a sample satisfying the sample suitability determination 201 needs to be re-prepared to the cell separation step 203. This process makes it possible to guarantee the reliability of the entire test by repeatedly performing individual cell evaluation until the individual cell evaluation criteria are satisfied.
  • the present system can contribute to improving the accuracy of determination of the inspection result by clarifying the conformity reference state of the test sample subjected to the inspection.
  • the library evaluation 207 by the single cell analysis inspection apparatus 200 will be described.
  • the test sample determined to be continued in the individual cell evaluation 204 is subjected to biomarker detection pretreatment for individual cells.
  • biomarker detection pretreatment for example, in the case of gene analysis, cell-specific DNA library preparation 206 is performed.
  • the single cell analysis / inspection apparatus 200 performs suitability determination to a level required for the gene analysis 300 for the prepared DNA library.
  • the library reference database 503 stores the result of the test using the first test sample preparation 101, the test result of the sample suitability determination 201, and the test result of the individual cell evaluation 204.
  • FIG. 4 items described for the tumor tissue are illustrated, but these items are examples, and the item names and item contents correspond to the examination performed on the first test sample preparation 101.
  • the library evaluation 207 performed by the single cell analysis / inspection apparatus 200 of this system is based on the criteria determined by the analysis technique used for the gene analysis 300 in addition to the determination criteria in the sample suitability determination 201 and the individual cell evaluation 204 so far.
  • the criteria determined by the analysis technique used for the gene analysis 300 are, for example, a DNA amount 4001, a DNA concentration 4002, and a DNA fragment length 4003.
  • evaluation results 2011 are stored in a format that can be compared with the reference value 2008 for reference information such as DNA amount 4001, DNA concentration 4002, and DNA fragment length 4003.
  • the calculation unit 608 determines compatibility by comparing the individual cell evaluation result 2011 with the reference value 2008 for the reference information such as the DNA amount 4001, the DNA concentration 4002, and the DNA fragment length 4003, and records the determination result 2007. .
  • the determination result display unit 609 presents the determination result by the calculation unit 608 using the reference information as shown in FIG. 4 to the system user.
  • the determination criteria such as the DNA amount 4001, the DNA concentration 4002, and the DNA fragment length 4003 as shown in FIG. 4
  • information recommending that the processing be continued is displayed in the sample evaluation 300 based on the gene analysis 300.
  • the determination criteria are not met, information recommending re-preparation to the cell separation step 203 by the sample satisfying the sample suitability determination 201 is displayed.
  • the library evaluation 207 of this system greatly contributes to guaranteeing inspection reliability, reducing inspection costs and labor, and shortening inspection time.
  • the library evaluation 204 is preferably performed on individual cells. However, the sampling evaluation represented by some cells or the library evaluation 204 using the average of the whole is performed, and the inspection cost or It is also possible to reduce the inspection man-hours.
  • the calculation unit 608 of the single cell analysis test apparatus 200 performs n tests and evaluations thereof.
  • the system may be implemented individually for each sample, and the calculation unit 608 may integrate the test results of the specimen sample accompanied by the reliability index and present the result to the determination result display unit 608 as the test result of the sample.
  • test results of n test samples are integrated in the database for at least a part of the determination result 2007, the reference value 2008, the second test sample test result 2009, the individual cell evaluation result 2010, and the library evaluation result 2011 of FIG. It is good also as a structure shown to the determination result display part 608.
  • Fields of application of this system include medical and pharmaceutical development fields such as cancer tissue observation, blood cell analysis, and evaluation of cultured cells related to regenerative medicine. Then, it becomes possible to provide new biomarker information with higher reliability that was impossible. Further, by continuing the analysis and presenting the re-sample preparation index for the analysis target sample in the course of the analysis, it is possible to prevent a test with poor reliability from being performed and to reduce the test cost.
  • DESCRIPTION OF SYMBOLS 200 ... Single cell analysis inspection apparatus, 201 ... Sample conformity determination, 204 ... Individual cell evaluation, 206 ... Library evaluation, 501 ... Sample conformity reference database, 502 ... Individual cell reference database, 503 ... Library reference database, 504 ... Microscope observation 505 ... Single cell analysis processing unit 506 . Quantitative PCR device 507 ... DNA sequencer 608 ... Calculation unit 609 ... Determination result display unit

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Abstract

検体から複数の生体試料の特徴量を光学的に取得し、特徴量を同一検体に関する事前の検査情報と比較し、比較結果に基づいて、生体試料の遺伝子分析への処理継続か、同一検体からの試料再調整か、の何れを行うかを判定する指標を算出する。これにより単一細胞解析または少数の細胞集団の分析において分析費用、分析時間、労力の抑制を図りながら、検査試料を適切に選択し妥当性を担保することで、より信頼性の高いバイオマーカー検出が実現できる。

Description

検査システム、検査装置、及び検査方法
　本発明は生体試料の検査に関する。特に、遺伝子解析や細胞機能解析等を含む生体組織の解析および病気の診断、創薬などに関するものである。
　タンパク質あるいはmRNAの種類やその量、またはゲノム遺伝子の変異といったバイオマーカーは個体や組織を特徴付ける重要な指標となっている。例えば、がん診断においては病理医による細胞観察が診断の主流であるが、これらのバイオマーカーの活用は客観的な指標を提供できることや従来の画像診断では検出不可能であったわずかな変化、例えば細胞像のみでは判別できないタンパク質分子や核酸分子の部分的変化を検出できること、が大きな特徴である。
　特にゲノム創薬とも呼ばれる近年の標的分子特異的な医薬品の効果判定や用量決定にはこれらバイオマーカーを用いた診断が重要である。これらのバイオマーカーを指標とすることによって、より患者個人に適した医療の提供や無駄な治療の回避による医療費の削減が進められると期待されている。バイオマーカーの高感度検出は早期診断や検体間の微妙な違いの検出に有用であり、医療や産業応用に向けたバイオマーカー検出技術の高感度化は重要である。
　一方、細胞生物学的な視点から個体や組織について考察すると組織や個体は、分化状態や細胞種の構成が異なる多様性を持った細胞の集合体である。例えば、血液細胞は赤血球、リンパ球、T細胞等多様な細胞種から成り、さらには免疫細胞であるT細胞はそれぞれ異なる抗原応答性を有している。また、腫瘍組織を例に取ってみればがん組織は正常な細胞とがん化した細胞の集合であり、個々のがん細胞においてもゲノム異常の状態は一様ではなく多様性が存在していることが知られている。つまり、ある観察対象として検体から試料を採取した際には、それら試料は多様性を持った細胞の集合体であること、また採取を行った部位や時間によってそれらの多様性を持った細胞の構成や状態が変化することとなる。
　遺伝子発現情報の解析手法としては定量PCR法やマイクロアレイ法、または超並列シーケンサを用いた塩基配列解析等、目的に応じて種々の技術が用いられている。ただし、遺伝子検出の技術は異なっても、これら従来法を用いた試料間の比較では試料を構成する細胞の多様性に対する考慮が成されていないことは共通であり、試験対象試料より検出された遺伝子発現量の値、つまりは試験対象を構成する細胞集団の持つ平均値、の比較解析によって特徴量の抽出を行っている。分析する試料中において目的とする細胞種の割合が十分に高い場合には従来法であっても特徴量の抽出が可能であるが、目的とする細胞の割合が低い場合には妥当性に乏しい技術となる。
　より詳しくは、上述の従来法を用いて試料間を比較する場合、少数の目的細胞に由来する特徴量は多数を占める他の細胞由来の特徴量に埋没するために、バイオマーカーの高感度検出は困難となる。例えば、腫瘍組織を想定した場合、腫瘍組織におけるがん細胞の割合が50%以下であることは一般的な事象である。さらに近年、それらがん細胞の多様性の内に数%以下の割合と推定されるがん幹細胞の存在を示唆する知見が得られており、そのようながん幹細胞が有するバイオマーカーを検出することは困難であった。また別の事例として、誘導率が数%～20%であるiPS細胞の分析や評価を想定した場合にも試料の平均値を用いた従来法による分析では存在割合の低いiPS細胞の特徴量を見逃す恐れがある。
　上記の課題を解決する手法として、個々の細胞を個別に解析することで少数の細胞が持つ特徴抽出を行う技術の研究が進められている。これらは、多数の細胞から構成される生体組織のゲノム解析や遺伝子発現解析やタンパク質解析を行うときに、個々の細胞のゲノムや遺伝子発現やタンパク質量の違いに注目して解析する技術であり単一細胞解析技術と称される。単一細胞解析技術は計測対象試料の単位を一細胞もしくは小数の細胞とすることによってバイオマーカーの検出感度を向上させる技術として重要性が認識され始めている。
　このような状況下で、例えば非特許文献１に示されるように、ほぼ全てのmRNAをcDNAに変え、ビーズ上に保持したcDNAライブラリ（全てのcDNAを含んだcDNA集合体）を作製して定量分析に利用する方法が考案されている。本技術ではcDNAライブラリを繰り返し利用することで試料分割による微量発現遺伝子の分子数低下を防ぎ、1細胞中に含まれる複数遺伝子の発現量を正確に計測できることが示されている。
Nature Method vol.6、no.7、503-506 (2009)
　これまで述べてきたように、組織、検体が多様な細胞種の集合で構成されていることから、感度の高いバイオマーカー検出には細胞を個別に計測する単一細胞解析技術が有用である。ただし、いかに精度良く一つの細胞のバイオマーカーを検出したとしても、その検出値は本来の目的である組織や検体の状態把握には不十分である。なぜならば、一つの細胞の分析結果が示すのはその細胞の特徴量を示すものであって、一つの細胞の分析結果を多様な細胞の集団である組織の直接的な評価指標とするのは著しく不適切である。
　そこで、可能な限り多くの細胞について1細胞レベルで分析を行い、それらの分析結果を統合することによって多様性を有する組織の特徴量とすることが望ましい。従来の細胞集団を対象とする分析技術が通常使用する細胞数は10の3乗から6乗個であり、それら細胞集団解析と同等の細胞数となるまで単一細胞解析を繰り返して実行することによって単一細胞解析結果の妥当性を向上させることも考えられるが、単一細胞解析技術は細胞個々について分析を行う技術であるため細胞数の増加は解析費用、労力、解析時間の増大に直結することとなる。
　本発明は、このような従来技術の問題点に鑑み、解析費用、労力、解析時間を抑えつつ、高精度なバイオマーカー検出を実現することを目的とする。
　上述した課題の少なくとも一の課題を解決するための本発明の一態様として、検体から複数の生体試料の特徴量を光学的に取得し、特徴量を同一検体に関する事前の検査情報と比較し、比較結果に基づいて、生体試料の遺伝子分析への処理継続か、同一検体からの試料再調整か、の何れを行うかを判定する指標を算出する構成とした。
　本発明により単一細胞解析または少数の細胞集団の分析において分析費用、分析時間、労力の抑制を図りながら、検査試料を適切に選択し妥当性を担保することで、より信頼性の高いバイオマーカー検出が実現できる。
単一細胞解析検査システムにおける処理内容を示すフローチャート。 試料適合基準データベースに格納される情報の一例を示す図。 個別細胞基準データベースに格納される情報の一例を示す図。 ライブラリ基準データベースに格納される情報の一例を示す図。 単一細胞解析検査システムに構成の一例を示すブロック構成図。
　以下、本発明の実施形態の一例について、図面を参照して説明する。ただし、本実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではない。また、本実施例では次世代シーケンサを用いた遺伝子発現解析を例としてあげているが、遺伝子の検出方法として定量PCRやマイクロアレイ等の他の手法を用いた場合も本発明に含まれる。また、同様に遺伝子発現解析も個々の細胞に由来するバイオマーカーの一例であり、検出対象がmiRNAやゲノムDNA等の核酸分子やタンパク質、あるいは細胞の代謝物である場合を含む。
　本実施例において検体とは検査対象である特定個人に由来する試料であり、同一個人に由来しても試料採取箇所、試料採取時期、試料採取方法等が異なる場合は別の試料とみなす。また、切片作製やレーザーマイクロダイセクション法等による試料の一部分の回収や、セルソータ等による特定細胞等の濃縮によって検体より作製された検体の一部分を本実施例では特に試験試料と定義する。例えばバイオプシーによって回収された試料が検体であり、それらの検体を病理観察する際に用いられるパラフィン包埋切片は試験試料となる。
　本実施例は、先に述べた細胞及び組織の多様性を考慮した、より正確なバイオマーカー検出を行うことを目的としていることが従来のバイオマーカー検出技術と大きく異なる点の一つである。すなわち、同一検体に由来する試験試料であっても、異なる試験試料は厳密には同一ではない細胞集団であり、高感度のバイオマーカー検出技術であれば特にそれら試験試料の違いを考慮した判断が重要となる。例えば、がん診断における組織診では病理医により試験試料のパラフィン包埋切片の顕微鏡観察が実施される。その観察結果から病理医が遺伝子解析等によるバイオマーカーの追加分析を判断した際に検体に対するバイオマーカー検出が実施される。この際、バイオマーカー検出に用いられる試験試料は先に顕微鏡観察を行ったパラフィン包埋切片に連続する切片であるため、同一検体由来ではあるものの試料中の位置空間が先の観察試料とは異なる試験試料となる。
　すなわち、本実施例では、異なる試験試料を用いているために、顕微鏡観察を行う試験試料とバイオマーカー検出を行う試験試料ではがん細胞の割合やがん細胞の多様性に違いがある可能性を十分に考慮した単一細胞解析検査システム、単一細胞解析検査装置、単一細胞解析検査方法について説明する。
　バイオマーカー検出の対象とする試料の選定は大きな課題である。組織や細胞の多様性を考慮するならば、組織の採取場所や採取時期が異なる検体は異なる多様性を持つことから、それらの多様性を考慮して適切な試料に対して分析を実行することが重要である。まずは、本実施例のシステム構成例の説明に先立ち、試料選定の重要性をがん組織を例に取って説明する。
　がん組織は正常な細胞とがん化した細胞の集合した組織であり、またがん細胞間にも多様性が存在していることが知られている。さらには一つの腫瘍組織の中においても正常細胞とがん細胞の割合等は腫瘍の部位によって多様となっている。よって、あるがん組織の性質を詳細に把握することを目的とする場合にはi)腫瘍組織の複数の部位から試料を調製し、ii)各試料片について単一細胞レベルで分析を行い、iii）それらの組織片の分析結果を統合する、ことが求められるが、分析対象とした試料が妥当性を欠く場合は、例えば腫瘍組織中でがん細胞割合が極端に低い領域、その分析結果は誤った判定の原因となる。つまり、細胞や組織が本質的に多様な集団であることを考慮すると、単一細胞解析技術を用いたバイオマーカーの高感度検出では、検査試料の妥当性判定が極めて重要となる。
　このような検査試料の妥当性判定の重要性を踏まえ、本実施例における単一細胞解析検査システムの構成例について図５を用いて説明する。本システムは、試料適合基準データベース５０１と、個別細胞基準データベース５０２と、ライブラリ基準データベース５０３と、細胞の観察を行う顕微鏡観察部５０４と、個別化細胞を調製する単一細胞解析処理部５０５と、定量ＰＣＲを行う定量ＰＣＲ装置５０６、作製したDNAライブラリの塩基配列解析を行うＤＮＡシーケンサ５０７と、これらに接続可能な単一細胞検査装置２００を備える。
　また、単一細胞検査装置２００は、演算部６０８と、判定結果表示部６０９を備える。演算部６０８は、図１を用いて後述するように、試料適合基準データベース５０１と、個別細胞基準データベース５０２と、ライブラリ基準データベース５０３の少なくとも何れか一つを参照して、参照した基準データベースと各検査値との比較による演算処理と判定処理を行う。また、判定結果表示部６０９は、演算部６０８による演算及び判定の結果を表示する。
　試料適合基準データベース５０１は、図２で詳述するように、同一検体由来の試験試料を用いて事前に実施した精密検査判定１０２の結果を参照基準とした基準値と、試料適合判定２０１の結果と適用されるバイオマーカー検査技術によって定められる試料の条件を格納している。
　個別細胞基準データベース５０２は、図３で詳述するように、個別細胞評価２０４の結果を参照基準とした基準値と、適用されるバイオマーカー検査技術によって定められる試料の条件を格納している。
　ライブラリ基準データベース５０３は、図４で詳述するように、個別細胞評価２０４の結果を参照基準とした基準値と、適用されるバイオマーカー検査技術によって定められる試料の条件を格納している。
　なお、本実施例では試料適合基準データベース５０１、個別細胞基準データベース５０２、ライブラリ基準データベース５０３を個別のデータベースとして例示しているが、これらのデータベースを一つの記憶媒体中に構成してもよい。
　本システムは従来では達成困難であった組織及び細胞多様性を考慮した検体評価/解析を実現するものであり、これら装置やデータベースの一部あるいは複数を連結したシステムとすることも可能である。
　次に、図1を用いて本システムの処理フローの一例について説明する。本システムは、細胞及び組織の多様性を高度に考慮して高感度バイオマーカー検出解析の結果から検体の評価を行うために以下の処理を行う。さらに、必要に応じて工程の追加または削減を行った処理を行う。
　本システムによる処理に先立って、事前に、検体より試験試料が調製され（１０１）、病理医や検査者等によってそれら試験試料の検査結果より精密検査の要否が判定され（１０２）、精密検査に供試される試験試料が調製される（１０３）。その後、本システムが以下の処理を行う。
　まず、単一細胞解析検査装置２００による試料適合判定２０１について説明する。これまで述べてきたように、精密検査要否判定１０２に用いられた試験試料とバイオマーカー検出に供試される検査試料は同一ではないため、単一細胞検査装置２００は精密検査判定１０２の後の試験試料調整１０３で調整された試料に対して新たに試料適合判定２０１を実施する。試料適合判定２０１では、バイオマーカー検査に供試される試験試料調整１０３で調整された試料に対し例えば顕微鏡５０４等による観察が実施され、その観察結果に対し演算部６０８が試料適合基準データベース５０１を参照して、先に実施した精密検査要否判定１０２の検察結果と照合することによってその適合性を確認し、処理の継続または試験試料の再調製の指標を判定結果表示部６０９に提示する。
　試料適合判定２０１において、同一検体由来の試験試料を用いて事前に実施した精密検査判定１０２の結果は重要な指標である。なぜならば、生体組織および細胞の多様性を考慮するならば試験試料はそれぞれ個別の個性を持った細胞群であるため、試料適合判定に一律な判定基準を設けるのではなく、同一検体由来の試験試料間の比較とすることが合理的である。また、試料適合性判定２０１において実施される試料の検査は先の精密検査判定１０２と同じ手法である場合もあるが、以降に実施する精密なバイオマーカー検出の妨げとならない手法であることが望ましいために、異なる手法、例えば試料に対する侵襲性の少ない位相差顕微鏡やラマン像観察または免疫染色による特定抗原の検出、によって試料適合判定を実施する。二つの判定方法が異なる場合には両方法の観察結果の対応付けを行うための基準が設定され、それら基準は試料適合判定の参照情報として試料適合基準データベース５０１に収められている。より詳しくは、試料適合判定２０１において演算部６０８は試料適合基準データベース５０１より同一検体由来の精密検査判定１０２の結果とその判定基準に対応する試料適合判定２０１の検査結果を参照することによって検査継続または試験試料調整１０３での再調製の判定を実施する。
　図２を用いて、試料適合判定２０１に用いる試料適合基準データベース５０１に格納される情報の一例について説明する。試料適合基準データベース５０１は、基準値２００８として、第一試験試料調製１０１を用いた検査の結果における、がん細胞数２００１、がん細胞割合２００２、進行度２００３といった病理適合性判定の基準を格納している。
　また、試料適合基準データベース５０１は、基準値２００８として、病理適合性判定の基準に加え、試料固定手法２００４、試料保管温度２００５、試験試料サイズ２００６といった試験手法適合性の判定基準も格納している。これらは、次の工程である細胞分離２０３にて要求される試料の水準を判断する指標であり、判断対象の試験試料の適合性の基準となる。
　演算部６０８は、第二試験試料調製１０３の検査結果２００９を基準値２００８と比較することで試験試料適合性の判定を行い、判定結果２００７を記録する。
　ここで、図２には腫瘍組織について記載される項目を例示したが、これらの項目は一例であり、項目名や項目内容は第一試験試料調製１０１に成された検査に対応する病理適合性判定の基準である。試料適合基準データベース５０１の病理適合性判定基準には、精密検査判定１０２に用いられた第一試験試料調製１０１の試験試料の観察結果とバイオマーカー検査に供試される第二試験試料調製１０３の検査試料に対して実施された、例えば顕微鏡５０４等を用いた観察の結果（２００１～２００３）が基準値２００８と検査結果２００９との間で比較可能な形式で格納される。
　先に述べたように第二試験試料調製１０３に対して試料適合判定を可能とする検査が実施され、その結果は試料適合基準データベース５０１の検査結果２００９に格納され、その上で2つの検査試料の検査結果比較によって検査試料の適合性の判定結果２００７が格納される。
　なお、試料適合基準データベース５０１をはじめ、各データベース５０１、５０２、５０３は学習的に判断基準の向上を行うことが可能となる。例えば、図１の各判定・評価（２０１、２０４、２０７）における評価結果に基づいて基準値２００８を変更していく構成としてもよい。　
　また、第二試験試料調製１０３で調製される試験試料は精密なバイオマーカー検出に供試する試料であるため、試験手法適合性の判定基準に基づいて、実施される検査技術に応じた望ましい試料状態が定義される。図２に例示した試料固定手法２００４、試料保管温度２００５、試験試料サイズ２００６等はバイオマーカー検査の結果に大きな影響を与える項目であり、これら検査値に影響する項目の適合性を試料適合基準データベースに格納された指標と比較、判定することが重要である。試験試料間の適合性判定に用いた検査の結果とバイオマーカー検出技術によって定義される試験試料の状態および本システムによって成された適合性判定結果の一部あるいは全体が比較閲覧可能な状態で、判定結果表示部６０９によって本システム使用者に対して処理継続判断の指標として提示される。
　本システムの単一細胞解析検査装置２００が行う試料適合判定２０１は、精密検査として実施するバイオマーカー検出に供試する試料の適合性判定を同一検体に由来する試験試料の結果を参照して実施することによって試験試料の適合基準を判断し、適合基準を満たさない場合は試料再調製の指示を適合基準を満たすまで繰り返すことによって、調製される試料の妥当性、つまりは検査結果の妥当性を保証することを可能とする。
　また、試験試料は有限である検体から調製されるために適合基準のすべてを満たす試験試料が得られない場合も想定される。そのような場合においては、単数または複数の適合指標に妥協して以降の検査を実施することも可能である。本システムは、このような場合においても、検査に供試された試験試料の適合基準状態あるいは基準を逸脱した適合指標を明確にすることによって検査結果の判定精度向上に寄与することを可能とする。
　次に、図１における単一細胞解析検査装置２００による個別細胞評価２０４について説明する。個別細胞評価２０４において、単一細胞解析検査装置２００は細胞分離２０３を行った個別細胞に対する評価を行う。個別細胞評価２０４の対象となる細胞は、試料適合性判定２０１によって処理継続が決定された試験試料に対する細胞分離２０３により調製されたものを対象とする。
　ここで、細胞分離２０３は細胞個々を検査可能とするための前処理である。そのため、細胞分離２０３では単に細胞間の接着を剥離することによる細胞の個別化技術、またはセルソータあるいは、レーザーマイクロダイセクション等による特定細胞の分離技術、のいずれの技術であっても良く、実施するバイオマーカー検出に適した手法により調製される。
　本システムによる個別細胞評価２０４は、分離された個々の細胞の観察とその観察結果の評価からなり、細胞の観察は単一細胞解析処理部５０５が行っても、顕微鏡観察部５０４が行っても良く、演算部６０８により細胞分離工程実施結果について細胞個々の評価を行う処理である。
　図３を用いて、演算部６０８が参照して個別細胞評価２０４に用いる個別細胞基準データベース５０２に格納される検査項目情報の一例について説明する。個別細胞基準データベース５０２には、第一試験試料調製１０１を用いた検査の結果および試料適合判定２０１の検査結果が格納されている。図３では腫瘍組織について記載される項目を例示したがこれらの項目は一例であり、項目名や項目内容は第一試験試料調製１０１に成された検査に対応するものである。なお、本実施例では試料適合基準データベース５０１と個別細胞基準データベース５０２を独立したデータベースとして説明しているが、これらの基準データベースは同一の記憶媒体上にあってもよい。
　本システムの単一細胞解析検査装置２００が行う個別細胞評価２０４は、細胞分離後の試料に対して、演算部６０８により、試料適合性判定２０１結果との妥当性を評価すると同時に、後の工程において実施する個別細胞のバイオマーカー検出結果の分析を行う上で必須である検査試料の状態を評価する。
　個別細胞基準データベース５０２に格納される個別細胞評価２０４の基準となる情報を例示すると、回収細胞数３００１、細胞個別化率３００２、標的細胞率３００３がある。これら指標の内、細胞の大きさ２００６等は試験試料に応じて試料適合性判定の結果を参照して決定される判定基準である。また、細胞個別化率３００２、標的細胞率３００３のように、個別のバイオマーカー検出において検査技術によって決定される判定基準、例えば「細胞数が1000個以上かつ個別化不十分な細胞の割合が5%未満」といった基準が個別細胞基準データベース５０２に格納されている。
　個別細胞基準データベース５０２では、回収細胞数３００１、細胞個別化率３００２、標的細胞率３００３等の基準情報について評価結果２０１０が基準値２００８との間で比較可能な形式で格納される。演算部６０８は、回収細胞数３００１、細胞個別化率３００２、標的細胞率３００３等の基準情報について、個別細胞評価結果２０１０を基準値２００８と比較することで適合性の判定を行い、判定結果２００７を記録する。
　判定結果表示部６０９は、図３に示したような基準情報を用いた演算部６０８による判定結果を、本システム使用者に対して提示する。個別細胞評価２０４において図３に示すような回収細胞数３００１、細胞個別化率３００２、標的細胞率３００３等の判定基準を満たす場合には処理継続を勧める情報を表示する。一方、判定基準に適合しない場合には、試料適合判定２０１を満たした試料による細胞分離工程２０３への再調製が必要であるという情報を判定結果表示部６０９から表示する。当該処理により、個別細胞評価基準を満たすまで繰り返して個別細胞評価を実施することによって検査全体の信頼性保証を行うことを可能とする。
　また、試料適合判定２０１と同様に、個別細胞基準データベース５０２に格納された適合基準のすべてを満たす試験試料が得られない場合も想定される。そのような場合においては、単数または複数の適合指標を選択して以降の検査を実施することも可能である。本システムは、このような場合においても、検査に供試された試験試料の適合基準状態を明確にすることによって検査結果の判定精度向上に寄与することを可能とする。
　次に、単一細胞解析検査装置２００によるライブラリ評価２０７について説明する。個別細胞評価２０４で継続が判定された試験試料は個々の細胞についてバイオマーカー検出の前処理が実施される。例えば、遺伝子分析であれば細胞個別のDNAライブラリ作製２０６が実施される。単一細胞解析検査装置２００は、ライブラリ評価２０７において、作製されたDNAライブラリについての遺伝子分析３００に求められる水準への適合性判定を実施する。
　図４を用いて、ライブラリ評価２０７に用いるライブラリ基準データベース５０３に格納される検査項目情報の一例について説明する。ライブラリ基準データベース５０３は、第一試験試料調製１０１を用いた検査の結果および試料適合判定２０１の検査結果、個別細胞評価２０４の検査結果を格納する。図４では腫瘍組織について記載される項目を例示するが、これらの項目は一例であり、項目名や項目内容は第一試験試料調製１０１に成された検査に対応するものである。
　本システムの単一細胞解析検査装置２００が行うライブラリ評価２０７は、これまでの試料適合判定２０１、個別細胞評価２０４における判定基準に加え、遺伝子分析３００に用いられる分析技術によって定められる基準を判定基準とする。遺伝子分析３００に用いられる分析技術によって定められる基準は、例えばDNA量４００１、DNA濃度４００２、DNA断片長４００３が判定基準である。
　これらDANライブラリの評価指標は単一細胞解析処理部５０５または定量PCR装置５０６を用いて取得され、判定結果表示部６０９はその検査結果を判定指標と合わせて本システム使用者に提示する。
　ライブラリ基準データベース５０３では、DNA量４００１、DNA濃度４００２、DNA断片長４００３等の基準情報について評価結果２０１１が基準値２００８との間で比較可能な形式で格納される。演算部６０８は、DNA量４００１、DNA濃度４００２、DNA断片長４００３等の基準情報について、個別細胞評価結果２０１１を基準値２００８と比較することで適合性の判定を行い、判定結果２００７を記録する。
　判定結果表示部６０９は、図４に示したような基準情報を用いた演算部６０８による判定結果を、本システム使用者に対して提示する。ライブラリ評価２０７において図４に示すようなDNA量４００１、DNA濃度４００２、DNA断片長４００３等の判定基準を満たす場合には遺伝子解析３００に基づく検体評価３００へと処理継続を勧める情報を表示する。一方、判定基準に適合しない場合には試料適合判定２０１を満たした試料による細胞分離工程２０３への再調製を勧める情報を表示する。
　本システムのライブラリ評価２０７は、上述した個別細胞評価２０４と同様に、検査の信頼性保証、検査費用や検査労力の低減、検査時間の短縮に大きく貢献する。個別細胞の検査においてライブラリ評価２０４は個々の細胞に対して実施されることが望ましいが、一部の細胞を代表とした抜き取り検査あるいは全体の平均を用いたライブラリ評価２０４を実施して検査コストや検査工数の低減を図ることも可能である。
　これまで図１から図4を用いてひとつの試験試料を用いた検査について説明を行った。上述したように、個別細胞のバイオマーカー検出結果に、精密検査判定１０２、試料適合判定２０１、個別細胞評価２０４、ライブラリ評価２０６を考慮した分析を行うことによって従来技術では達成困難であった組織及び細胞多様性を考慮した検体評価４００が実現する。
　しかし、多様性を内包する組織の詳細を知るには複数の試験試料を検査対象とすることが望ましく、本システムは個々の試験試料に適用された後、それらの評価結果を統合して提示することも可能である。個々の試験試料に対して実施される適合性判定や個別細胞評価はこれまで述べてきたとおりであるが、単一細胞解析検査装置２００の演算部６０８がそれらの検査や評価がn個の試験試料それぞれについて個別に実施し、演算部６０８がそれら信頼性の指標が付随した検体試料の検査結果を統合して検体の検査結果として判定結果表示部６０８に提示するシステムとしてもよい。例えば、図４の判定結果２００７、基準値２００８、第二試験試料検査結果２００９、個別細胞評価結果２０１０、ライブラリ評価結果２０１１の少なくとも一部についてn個の試験試料の検査結果をデータベース中で統合して判定結果表示部６０８に提示する構成としてもよい。
　本システムの適用分野はがん組織の観察や血中細胞の分析、再生医療に関連する培養細胞の評価等、医療や医薬品開発分野が含まれており、これらの重要な分野に対して従来技術では不可能であったあらたなバイオマーカー情報をより高い信頼性を持って提供することが可能となる。また、分析対象試料に対し分析の継続、および再試料調製の指標の提示が分析の進行過程で行われることにより、信頼性に乏しい検査の実施が防止され検査コストの低減が達成される。
　以上、本実施例で示したように単一細胞解析に向けて調製された個別細胞の評価を遺伝子分析等の個別バイオマーカー検出に先立って実行することは、検査の信頼性保証において極めて重要であるとともに、検査費用、検査労力、検査時間の短縮に大きく貢献する。なぜならば、個々の細胞に対する遺伝子解析や免疫分析によるバイオマーカー検出の実行は、従来の細胞集団に対する検査技術と比較してより多くの検査費用、検査労力、検査時間を要するためである。本実施例のように、最も多くの費用、労力、時間が発生する工程の前段階において同一検体の検査結果から定められる試験試料の妥当性とバイオマーカー検査に用いる試料としての妥当性を判断することによって、効率的な検査の実行が可能となる。
２００…単一細胞解析検査装置、２０１…試料適合判定、２０４…個別細胞評価、２０６…ライブラリ評価、５０１…試料適合基準データベース、５０２…個別細胞基準データベース、５０３…ライブラリ基準データベース、５０４…顕微鏡観察部、５０５…単一細胞解析処理部、５０６…定量ＰＣＲ装置、５０７…ＤＮＡシーケンサ、６０８…演算部、６０９…判定結果表示部

Claims (11)

  1. 　検体に関する事前の検査情報を格納するデータベースと、
    　前記検体から抽出された複数の生体試料の特徴量を光学的に抽出する顕微鏡観察部と、
    　前記特徴量と前記検査情報とを比較して、前記比較結果に基づいて、前記生体試料の遺伝子分析への処理継続か、前記検体からの試料再調整か、の何れを行うかを判定する指標を提示する検査装置と、を備える、
    　ことを特徴とする検査システム。
  2. 　請求項１に記載の検査システムであって、
    　前記データベースは、前記検査情報として、前記検体に関する病理判定情報を格納する、ことを特徴とする検査システム。
  3. 　請求項２に記載の検査システムであって、
    　前記データベースは、前記検査情報として、前記検体に関するがん細胞数、がん細胞割合、がん進行度のうちの少なくとも何れか一つの病理判定情報を格納する、ことを特徴とする検査システム。
  4. 　請求項１に記載の検査システムであって、
    　前記データベースは、前記検査情報として、前記検体に関する試料固定手法、試料保管温度、試験試料サイズのうちの少なくとも何れか一つの試験手法情報を格納する、ことを特徴とする検査システム。
  5. 　請求項１に記載の検査システムであって、
    　前記検査装置が判定する前記生体試料の遺伝子分析への処理には、細胞分離工程と個別ＤＮＡライブラリ作成工程とが含まれる、ことを特徴とする検査システム。
  6. 　請求項５に記載の検査システムであって、
    　前記検査装置は、前記細胞分離が行われた際に、分離された個別細胞について、前記データベースに格納される情報との比較に基づいて個別ＤＮＡライブラリ作成か、個別細胞の再調整か、の何れを行うかを判定する指標を提示する、ことを特徴とする検査システム。
  7. 　請求項６に記載の検査システムであって、
    　前記データベースは、前記個別細胞の評価情報として、回収細胞数、細胞個別化率、標的細胞率のうちの少なくとも何れか一つを格納する、ことを特徴とする検査システム。
  8. 　請求項５に記載の検査システムであって、
    　前記検査装置は、前記個別ＤＮＡライブラリ作成が行われた際に、作成された個別ＤＮＡライブラリについて、前記データベースに格納される情報との比較に基づいて遺伝子分析か、検体試料の再調整か、の何れを行うかを判定する指標を提示する、ことを特徴とする検査システム。
  9. 　請求項８に記載の検査システムであって、
    　前記データベースは、前記個別ＤＮＡライブラリの評価情報として、DNA量、DNA濃度、DNA断片長のうちの少なくとも何れか一つを格納する、ことを特徴とする検査システム。
  10. 　検体から光学的に抽出された複数の生体試料の特徴量と、前記検体に関する事前の検査情報と、を比較して、前記比較結果に基づいて、前記生体試料の遺伝子分析への処理継続か、前記検体からの試料再調整か、の何れを行うかを判定する指標を算出する演算部と、
    　前記指標をユーザに提示する表示部と、を備える、
    　ことを特徴とする検査装置。
  11. 　検体から複数の生体試料の特徴量を光学的に取得し、
    　前記特徴量を前記検体に関する事前の検査情報と比較し、
    　前記比較結果に基づいて、前記生体試料の遺伝子分析への処理継続か、前記検体からの試料再調整か、の何れを行うかを判定する、
    ことを特徴とする検査方法。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9192981B2 (en) 2013-03-11 2015-11-24 Ati Properties, Inc. Thermomechanical processing of high strength non-magnetic corrosion resistant material
TW201832113A (zh) * 2017-02-01 2018-09-01 美商歐瑞３恩公司 用於基因物質儲備之自動化監測及補充的系統及方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006104201A1 (ja) * 2005-03-29 2006-10-05 Olympus Corporation 細胞画像解析方法、細胞画像解析プログラム、細胞画像解析装置、スクリーニング方法およびスクリーニング装置
JP2007505630A (ja) * 2003-09-19 2007-03-15 アビアラデックス，インコーポレイティド 乳がん治療転帰の予測
WO2008029468A1 (fr) * 2006-09-07 2008-03-13 Neat Co., Ltd. Procédé et appareil pour microéchantillonnage multipoint
JP2008541018A (ja) * 2005-04-28 2008-11-20 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 光干渉測定法により解剖学的構造に関連する情報を評価するためのシステム、方法及びソフトウエア装置
JP2012509061A (ja) * 2008-11-17 2012-04-19 ベラサイト インコーポレイテッド 疾患診断のための分子プロファイリングの方法および組成物

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100753616B1 (ko) * 2001-07-18 2007-08-29 아사히비루 가부시키가이샤 미생물의 검사 장치 및 검사 방법
MX2014006884A (es) * 2011-12-09 2015-06-02 Gerd Marienfeld Aparato, sistema y metodo para identificar celulas tumorales circulantes.
TWI493171B (zh) * 2013-06-27 2015-07-21 Univ China Medical System and method for analyzing tissue cells by using hyperspectral image
GB2537875A (en) * 2015-04-29 2016-11-02 Imp Innovations Ltd Infrared imaging of biological material

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007505630A (ja) * 2003-09-19 2007-03-15 アビアラデックス，インコーポレイティド 乳がん治療転帰の予測
WO2006104201A1 (ja) * 2005-03-29 2006-10-05 Olympus Corporation 細胞画像解析方法、細胞画像解析プログラム、細胞画像解析装置、スクリーニング方法およびスクリーニング装置
JP2008541018A (ja) * 2005-04-28 2008-11-20 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 光干渉測定法により解剖学的構造に関連する情報を評価するためのシステム、方法及びソフトウエア装置
WO2008029468A1 (fr) * 2006-09-07 2008-03-13 Neat Co., Ltd. Procédé et appareil pour microéchantillonnage multipoint
JP2012509061A (ja) * 2008-11-17 2012-04-19 ベラサイト インコーポレイテッド 疾患診断のための分子プロファイリングの方法および組成物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIGUSA OKUBO ET AL.: "2. Microdissection", PATHOLOGY AND CLINICAL MEDICINE, vol. 22, 2004, XP009504659 *
See also references of EP3315594A4 *

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