JP2008541048A - 自動画像解析 - Google Patents

Abstract

上記のような、自動画像処理が：ａ）生体試料の中の対象のデジタル画像を取得するステップと；ｂ）デジタル画像から関心のある複数の対象を選択するステップと；ｃ）複数の異なる波長における選択した関心のある対象の複数の画像を取得するステップと；ｄ）複数の画像のうちの１を対応するデジタル画像と組み合わせて、組み合わせた画像を作成するステップと；ｅ）組み合わせた画像を解析して生体試料を評価するステップとを有する。
【選択図】図１

Description

本書の主題は、自動画像解析に有用な方法及び器具に関する。

医学的な試料の細胞の画像は、単調であるが医療分析にとって不可欠なツールである。自動化した細胞の画像化が開発されており、より均一な細胞の画像解析のためのニーズに合っている。自動化した細胞画像装置は、スライドガラスでの解析を大きく変えず、疲労の影響を受けにくく、人間と比較してかなりの処理能力を提供できる。

以前にいくつか開発され現在利用可能ないくつかの自動化システムを付加的な人間による解析とともに使用することで、分析する試料の数を増やし、分析する者が経験する疲れを減らしている。自動化した選別機を使用して、人間によるさらなる検査のために各試料、対象を選別できる。このような方法により、機械が人間によって解析すべき各資料の関心のあるこれらの対象をより簡単且つ経済的に識別するように、このような分析の感度を増やすことができる。

しかしながら、自動画像装置は、それに提供される試料及びデータ及びそのプログラミングによって制限される。さらに、コンピュータ処理上の理由のため、画像装置は、解析のために単色の白黒画像を一般に使用しており、試料そのものが、特に細胞学的に染色した試料のための広範囲のスペクトルデータ及び他の情報を提供する。

例えば、パパニコロー（Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ）染色した試料の自動画像解析では、従来の自動化したスクリーニングシステムにおける異常な対象物の分類が、正常な化生細胞及び他の混同物の存在によって複雑となる可能性がある。いくつかの画像システムでは、試料の正常な細胞よりも細胞又は細胞核が「暗く」（光学的により密な）及び／又は大きく現れるため、光学密度に基づいてパパニコロー染色した試料の関心のある細胞を識別するようにしている。染色した試料の化生細胞の細胞質も暗く、その結果縮小した細胞核となるため：細胞質のコントラストにより測定エラーが生じる可能性がある。化生細胞は、スライドガラス上に多数あるのに対し異常細胞は希であるが、それが画像装置に同等に暗く見えるため、自動画像装置は人間による再検査のために異常細胞よりはるかに多い化生細胞を選択してしまう。

本書で開示した一実施例によれば、自動画像処理が：ａ）生体試料の中の対象のデジタル画像を取得するステップと；ｂ）デジタル画像から関心のある複数の対象を選択するステップと；ｃ）複数の異なる波長における関心のある対象の複数の画像を取得するステップと；ｄ）複数の画像のうちの１を対応するデジタル画像と組み合わせて、組み合わせた画像を作成するステップと；ｅ）組み合わせた画像を解析して生体試料を評価するステップとを具える。

本書で開示した別の実施例によれば、自動画像処理が：ａ）生体試料の中の対象のデジタル画像を取得するステップと；ｂ）デジタル画像から少なくとも１の関心のある対象を選択するステップと；ｃ）複数の異なる波長における少なくとも１の関心のある対象の少なくとも１の画像を取得して、多波長の画像のセットを作成するステップと；ｄ）多波長の画像のセットを解析して生体試料を評価するステップとを含む。

本書で開示したさらに別の実施例によれば、自動画像処理に使用するための器具が：ａ）試料に第１のスペクトル領域を出力可能な少なくとも１の光源と；ｂ）第１のスペクトル領域によって照射される際に試料の部分の第１の画像を検出可能な少なくとも１の検出器と；ｃ）第１の条件セットに基づいて第１の画像のサブセットを選択可能な少なくとも１のコンピュータとを有する。２セット以上の画像を制御する場合は、これらの画像を組み合わせて少なくとも１の組み合わせた画像を作成してもよい。そして、少なくとも１のコンピュータが、選択したサブセットの画像のセットを解析してもよく、さらに第１の条件セット又は異なるセットである第２の条件セットに基づいて画像のセットのサブセットを選択することもできる。

本書で開示したさらに別の実施例によれば、自動画像処理に使用するための器具が：ａ）試料に第１のスペクトル領域を出力可能な第１の光源と；ｂ）第１のスペクトル領域によって照射される際に試料の部分の第１の画像を検出可能な第１の検出器と；ｃ）第１の条件セットに基づいて第１の画像のサブセットを選択可能な第１のコンピュータと；ｄ）第１の光源又は異なる光源である第２の光源であって、第１のスペクトル領域とは異なる第２のスペクトル領域を出力可能な第２の光源と；ｅ）第１の検出器又は異なる検出器である第２の検出器であって、第２のスペクトル領域によって照射される際に、選択したサブセットにおける画像の第２の画像を検出可能な第２の検出器と；ｆ）第１のコンピュータ又は異なるコンピュータである第２のコンピュータであって、選択したサブセットの第１及び第２の画像を解析して、さらに第１の条件セット又は異なるセットである第２の条件セットに基づいて第１及び第２の画像のサブセットを選択可能な第２のコンピュータとを有する。

本書で開示したさらに別の実施例によれば、自動画像処理に使用するための器具が：ａ）試料に第１のスペクトル領域を出力可能な第１の光源と；ｂ）第１のスペクトル領域によって照射される際に試料の部分の第１の画像を検出可能な第１の検出器と；ｃ）第１の条件セットに基づいて第１の画像のサブセットを選択可能な第１のコンピュータと；ｄ）第１の光源又は異なる光源である第２の光源であって、第１のスペクトル領域とは異なる第２のスペクトル領域を出力可能な第２の光源と；ｅ）第１の検出器又は異なる検出器である第２の検出器であって、第２のスペクトル領域によって照射される際に、選択したサブセットにおける画像の第２の画像を検出可能な第２の検出器と；ｆ）第１のコンピュータ又は異なるコンピュータである第２のコンピュータであって、選択したサブセットの第２の画像及び前記第１の画像具える組み合わせた画像を作成し、さらに前記第１の条件セット又は異なるセットである第２の条件セットに基づいて組み合わせた画像のサブセットを選択可能な第２のコンピュータとを有する。

自動化した画像処理及び／又は装置は、ここで述べるように、多波長の光を使用して試料に照射し、自動的に又は操作者によって操作可能な画像を得る。また、様々な波長で関連する情報を含む画像を取得して、組み合わせた画像を追加的な解析にかけることができる。さらに、１つの画像に見られる対象を様々な波長の光にかけて、試料に基づいて診断を与える前に、綿密に対象を解析することができる。ある実施例では、白色光をサンプル又は試料に照射して、試料／サンプルと少なくとも１のＴＶカメラ又は他のカメラとの間に少なくとも１のカラーフィルタを配置することによって、関連する情報を取得することができる。また、切り替え可能なカラーフィルターを備えたカメラを使用してもよい。ある実施例では、特定の画像のセットが「関心のある細胞」を具えている場合、システムのオペレータが細胞部位に戻って、追加的な画像を作成又は取り出してもよく、サンプル又は試料についての情報を揃える際に、研究者、コンピュータ又は技術者を支援する。

また、自動画像装置による一連の対象のさらなる研究のためのいくつかの方法、処理及び装置であって、単体で又は組み合わせて使用する方法、処理及び装置が、本書で提供されている。多波長で対象を解析することによって得られる情報の使用を通して、関心のある形態（陽性）を含む細胞又はクラスターを、選択したセットの中の偽情報（ｆａｌｓｅ ａｌａｒｍ）又は陰性細胞と一層区別することができる。また、子宮内膜細胞又は子宮頸管細胞、又はある異常な細胞といった特定の細胞型を、このような調べを通して識別してもよい。

Ｃｙｔｙｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ’ｓ ＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標） Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ｔｈｅ ＴｒｉＰａｔｈ ＦＯＣＡＬＰＯＩＮＴ（商標） Ｐｒｏｆｉｌｅｒ、ｔｈｅ ＣｈｒｏｍａＶｉｓｉｏｎ ＡＣＩＳ（登録商標） Ｓｙｓｔｅｍ、ｔｈｅ ＣｏｍｐｕＣｙｔ ｉＣｙｔｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ ＣＹＴＯＶＩＳＩＯＮ（商標） Ｓｙｓｔｅｍ、及びｔｈｅ Ｖｅｒａｃｅｌ Ｖｅｒａｓｙｓ（商標） Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを含む多くの個々の画像システムが、本出願が出願された時点で市販されている。これらの機器及び装置を改良して、本書に記載されているような追加的な画像処理のステップに組み込むことができることに留意されたい。

最新のＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）画像処理システム（「ＴＩＳ」）は、パパニコロー（Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ）染色処理によって染色してデジタル画像処理した単細胞及びクラスターの双方を含む、スライドガラスの試料の１又はそれ以上の関心のある対象を有する視野を識別する。例えば、ＴＩＳは、所定の試料のスライドガラスの高い積分光学密度を具えた１００個の個別の対象のリスト及び高い平均光学密度を具えた２０個のクラスタのリストを作ることができる。上記のような１００及び２０個以上又は以下の他の値の対象及びクラスタを収集することができる。本書に提供されているような追加的な解析は、識別、適切な選択及びこれらの特定の対象の改善した解析を改善する。このような追加的な解析のレベルは、特定の対象に集中しておりスペクトル解析の使用を含んでいる点でユニークである。

光の波長を特定する熟慮した方法により、細胞の試料の分類化の改良が可能となり、スペクトル領域全体にわたる試料の走査を含んでおり、その領域の中の特定の波長が試料のパラメータの分類化の改良が可能であるかどうかを判断する。スペクトル領域にわたって試料を規則的又は不規則な間隔で走査し、その後、未修整の画像及び／又は１又はそれ以上の様々な波長の特定の画像と様々な方法で組み合わせてもよい。また、試料の一部分をスペクトル領域にわたって規則的又は不規則な間隔で走査し、特定の波長部分をそれぞれ自動的又はユーザによって精査して、試料の同じ部分の多波長の特定の画像を作成してもよい。

異なる試料の様々なパラメータを解析して、画像処理した試料をより正確に分類する能力に対するそれらの影響を判定してもよい。ある実施例では、細胞核の境界を特定するのが望ましい。細胞核の形状の規則性が、画像処理した細胞の状態に関する重要な手掛かりを提供可能であり、細胞核の形状の不規則性が、悪性になる前の状態を示すことができる。このため、例えば、細胞核と細胞質との間のコントラストを上げることにより細胞核を識別するための能力を改善すると、細胞の状態を自動的に診断する方法が改善される。

ある実施例では、細胞核の画像処理が、核のテクスチャ、その形状、合成した暗さ、平均暗さ、又はそれらの組み合わせの判定を有している。テクスチャは、当技術分野で知られるように、近接する画素と比較した所定の画素の値の解析に関するものである。適切な方法によって、例えば、面積の４π倍で割られた周囲長の二乗を測定することで形状を判定できる。さらに、細胞核を取り囲む細胞質の「リング」を使用してもよい。このようなリング状の細胞質の光学密度を画像からデジタル処理で除去し、細胞核を測定するための能力を増やして、試料の中の異なる細胞の細胞質が互いに重なる状態で視覚化を改善できる。

本実施例は、パパニコロー（Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ）染色処理によって染色した細胞の試料を説明しているが、本書に記載の方法を他の適切及び／又は従来の処理及び／又は材料によって染色した試料とともに使用できることに留意されたい。考えられる染色方法は、ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）及びエオシン（ｅｏｓｉｎ）染色、フォイルゲン（Ｆｅｕｌｇｅｎ）染色、ＤＮＡ染色、化学量論染色、及び対比染色を有する。ある実施例では、方法が、染色しない試料を有するか又は使用してもよい。さらに、このような実施例が、子宮頸部細胞検査から得られる細胞の試料に関する方法の使用を表しているが、何らかの適切な生体試料を本書に記載の方法で同様に使用してもよい。

また、本書で組み合わせが開示される場合、このような組み合わせ要素の各サブコンビネーションが特に開示され、これは主題の範囲内であることに留意されたい。逆に、異なる要素又は要素のグループが開示される場合、それらの組み合わせもまた開示される。また、主題の要素が複数の代替例を有するものとして開示される場合、各代替例が単一又は他の代替例と組み合わせて排除されるこのような主題の例が本書で開示されている；考えられる主題の１以上の要素がこのような除外を有し、このような除外を有する要素の全ての組み合わせが本書で開示されている。

別に定義しない限り、あるいは文脈が明らかに別に示さない限り、本書で使用する全ての技術的及び科学的な用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本書に記載したのと類似又は同等な方法及び材料を、本書に記載した主題の実行又は検査で使用できるが、ここでは好適な方法及び材料を説明する。

前述のように、本書に記載の方法、処理及び／又は器具は、ＴＩＳといった既存の自動画像システムの能力を追加機能と組み合わせて、試料サンプルの「関心のある対象の」特定のサブセットを解析し、正常細胞、異常細胞、疾病に関連する特別な状態、又はそれらの組み合わせの自動認識を与える。

本書に記載のように、ある自動化した画像処理は、：ａ）生体試料の中の対象のデジタル画像を取得するステップと；ｂ）前記デジタル画像から関心のある複数の対象を選択するステップと；ｃ）前記関心のある対象の複数の異なる波長における複数の画像を取得するステップと；ｄ）前記複数の画像のうちの１を対応するデジタル画像と組み合わせて、組み合わせた画像を作成するステップと；ｅ）前記組み合わせた画像を解析して前記生体試料を評価するステップとを具える。

このような考えられる実施例では、試料の中の関心のある対象を特定し、その後、他のスペクトル領域を具える対象に照射することによって、このような対象の追加の画像を所得する。加算、減算及び又は組み合わせた画像の比率といった数学的な手段によって、追加の画像を組み合わせてもよい。２以上の画像を組み合わせてもよい。そして、組み合わせた画像は、本書に記載の条件セットによって分析され、その結果単波長の照射によって得られる結果と比較される。このような方法により、追加の有用な照射の波長を特定できる。複数の波長での追加の画像を、元々の画像を取得する際に同時に取得して、その後、後に使用する可能性のために保存してもよい。あるいは、対象を移動させて、複数の波長での新たな画像を取得してもよい。

本書に記載のように、考えられる別の自動化した画像処理は：ａ）生体試料の中の対象のデジタル画像を取得するステップと；ｂ）前記デジタル画像から少なくとも１の関心のある複数の対象を選択するステップと；ｃ）前記少なくとも１の関心のある対象の複数の異なる波長における少なくとも１の画像を取得して、多波長の画像のセットを作成するステップと；ｄ）前記多波長の画像のセットを解析して前記生体試料を評価するステップとを具える。

このような追加的な考えられる実施例では、複数の異なる波長で収集した少なくとも１の画像を使用して画像から特徴を抽出する。例えば、青系統の色域の暗さに対する赤系統の色域の暗さの比率は、生体試料から取得される画像を評価する際に有用である。このような考えられる実施例は、生体試料の同じ画像又は画像収集に多くの観点を与えるよう構成される。関連する実施例では、ユーザが４又は５の画像を取得して、様々な画像の細胞核の中の画素のいくつかの加重値が正常に対する異常性を示す結果を与えることを見付ける。このような処理は、生体試料からの画像の「分光的特徴」を与える。

ある実施例では、画像装置が最初に高い積分光学密度の細胞核及び高い平均光学密度クラスターに基づいて特定のサブセットを識別する。異常な試料では、サブセットが異常な対象及びいくつかの「偽情報（ｆａｌｓｅ ａｌａｒｍｓ）」を一般に有する。正常な試料では、サブセットが正常な対象及びいくつかの「偽情報」をも一般に有する。偽情報は、重なった細胞核又は細胞核と細胞質との間の本質的に低いコントラストを具えた正常な対象といった反応／修復型の細胞又は人為的な影響の存在によるものである。

本書に記載したいくつかの実施例では、画像装置が、これらの特定した対象に戻って追加的な解析又は解析を適用し、本当に異常な対象を反応／修復型の変化及び／又は「偽の情報」とより良く区別する。追加的な解析は、スペクトル解析又はマーカーの検出を有することができ、細胞核及び細胞質双方からの測定を含めることができる。

本書に記載のあるいくつかの実施例では、上位２０００対象、上位１０００又はそれ以下の対象、上位５００対象、上位２００対象又は上位１２０対象といった対象の特定のサブセットについて、スペクトル解析を実行する。サブセットとして選ばれる対象の数は、コンピュータのメモリ、コンピュータのスピード、ユーザがさらなる精度でサンプルを評価する必要性といったことの関数である。対象のサブセットが選択され記憶されると、サブセットの上位１２０画像又は対象の解析を適切な基準に基づいて選択できる。つまり、例えば、対象のサブセットは、一つの波長で取り込んだ２０００画像を含んでもよい。別の波長では、１０００画像を収集する。解析中に、それぞれ２０００画像のセット及び１０００画像のセットから１２０画像が抽出される。

他の実施例では、対象のサブセットに戻るのではなく、最初の画像を取得した時点で複数の波長の画像を記憶してもよい。そして、対象を移動させずに関心のある対象のサブセットについて追加の解析を実行してもよい。

多波長の光を使用して単波長又は多波長で取得した白黒画像をデジタル化できる。得られる「カラー」画像を、白黒の単色の画像よりも簡単に評価してもよい。ある実施例では、その後に対象の分類を試みることができる。特定の対象の解析に基づいて、人間によって追加の再検査を要することなしに基準としての試料を特定するための決定を行うことができる。

また、スペクトル情報を使用して特定の型の細胞を識別できる。例えば、クラスターのリストを識別する場合、子宮内膜細胞、又は子宮頸管細胞を識別するのが望ましい。一つの細胞核のリストを識別する場合に、化生又は子宮頸管細胞又は他の特定の細胞型の識別が細胞学者にとって有用である。双方のタイプの識別では、あるレベルの異常性を本書に記載されているスペクトル解析を通して判定できる。このような測定は、細胞核及び細胞質の形態及びスペクトル情報の測定を含めることができる。

また、スペクトル情報は、疾病に関する特定の細胞の変化又は他の細胞の変化を検出することができる。例えば、ＨＰＶ感染により、スペクトルの変化をもたらす細胞の変化を生じる可能性がある。これは、画像装置によって検出可能であり、分子分析を要さずにＨＰＶに感染しているとして試料を特定できる。

疾病の存在又は感染による細胞の変化は、多くの場合マーカーの存在によって示される。例えば、抗体は、感染、例えばＨＰＶ又はクラミジアの感染の存在を検出できる。また、核酸プローブ又はアプタマー（ａｐｔａｍｅｒｓ）といった他の分子マーカーを使用して、疾病又は感染の存在を示すことができる。ある実施例では、例えば標準的なパパニコロー染色液といった使用される染色液の中に通常存在しない独自のカラーラベルにプローブを取り付けてもよい。このラベルは、特定の吸収スペクトルを具えてもよく、又は特定の波長の光を照射に使用する場合にのみ蛍光を発してもよい。色の解析及び／又はマーカへの照射は特定の対象について行うことができる。

全体として、このような方法は、スライドの上の対象の次の解析を減らし、完全にスライドでの解析を行う場合に取得できるよりも早い実行が可能となる。また、追加の解析が、関連する特性、例えば細胞核の密度の変化が認識されることにより疑わしいものとしてすでに選択した対象のみに適用されるため、感度又は特異度を増やすことができる。

例えば、ＴＩＳは、高い積分光学密度（ＩＯＤ）で１００個の対象（通常は細胞核）を識別する。本書で提供されている方法を使用するシステムでは、これら１００個の識別した対象のいくつか又は全てのスペクトル解析を行うことができる。スペクトル解析を使用して、これらが陰性細胞の細胞核又は異常細胞の細胞核により似ているスペクトル特性を有する細胞核であるかどうかを表示することができる。このような解析に基づいて、そのスライド（ｓｌｉｄｅ）がおそらく陰性で人間による解析をこれ以上必要としないことを決定することができる。

自動化したスペクトルの画像処理方法の他の実施例は、追加の解析、パパニコロー検査、腺管の洗浄（ｄｕｃｔａｌ ｌａｖａｇｅ）、肺等のための診断、分類、又は細胞の選択のための自動化した解析と；２又はそれ以上の照射する色から取得される画像の組み合わせによる改善した区分解析の改善とを有している。また、自動化した方法は、マルチスペクトルの分離、区分け、及び／又は画像又は関心のある対象の定量化を含むステップを有してもよい。

本書で使用する「色」、「波長」及び「スペクトル領域」といった用語は、狭い帯域幅、例えばレーザ光源によって出力される正確な波長と、例えば広帯域又は多帯域の光源にフィルタを使用することによって出力される多少広い帯域幅の双方を表すことができることに留意されたい。発光ダイオード（ＬＥＤ）の照射により、個別のＬＥＤに応じて狭い幅又は多少広い幅の照射のいずれかを出力できる。

試料とも称する解析するサンプルは、細胞、組織又は体液を含む、直接又は間接的に生命体から取得できる生体材料の元とすることができる。サンプルの非限定的な例は、血液、尿、精液、母乳、唾液、粘液、胸膜液、骨盤液、関節液、腹水、体腔洗浄、眼球ブラッシング、皮膚擦過、口腔スワブ（ｂｕｃｃａｌ ｓｗａｂ）、膣スワブ（ｖａｇｉｎａｌ ｓｗａｂ）、子宮頸部細胞検査、直腸スワブ（ｒｅｃｔａｌ ｓｗａｂ）、吸引物、針生検、例えば手術又は検視解剖によって得られる組織の部分、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外分泌物、呼吸器、腸、及び尿生殖路、涙、唾液、腫瘍、内臓、微生物培養、ウイルス、及び体外での細胞培養構成要素のサンプルを含む。サンプルは、関心のある対象を含むことが分かっている陽性対照サンプルとすることができる。

自動装置によって選択される可能性のある関心のある対象は、検出することが望まれる試料の成分である。対象の非限定的な例は、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、多糖、ムコ多糖体、プロテオグリカン、炭水化物、脂質、脂肪、細胞、細胞型、有機体、ウイルス、構造体、抗原、無機化合物、又はセンサを得ることができる他の分子を含む。

典型的な分子対象は、ＨＰＶ Ｅ２タンパク質、ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７タンパク質、ＨＰＶ Ｌｌカプシドタンパク質、ｐｌ６ＩＮＫ４ａ、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、ｐ５３、ＧＣＤＦＰ−１５、ペニシリン、ＮｕＭＡ、カルボニックアンヒドラーゼ、マトリクス・メタロプロテイナーゼ、核マトリクスタンパク質、フェリチン、オーロラＡ（ａｕｒｏｒａ Ａ）、ペリセントリン、オステオポンチン、ｐｒｏｓｔａｔｉｎ、インスリン様成長因子、線維芽細胞増殖因子、ＢＲＣＡｌ、ＢＲＣＡ２、ｍａｍｍｏｇｌｏｂｉｎ、ＰＳＥ、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ソマトスタチン、シナプトフィジン、クロモグラニン、ｋａｌｌｉｋｒｉｅｎｓ、フィブロネクチン、ＥＧＦＲ、Ｋ−ｒａｓ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、トレポネーマ抗原、ニューロン特異的エノラーゼ、網膜芽細胞腫タンパク、Ｃ型肝炎表面抗原、クラミジア・トラコマチス感染症の外膜タンパク質を含む性感染症マーカー、癌マーカー、及びＨＩＶ ｇｐｌ２０を含む。

対象が細胞又は細胞の成分又は生成物の場合、細胞は、原核細胞、真核細胞又は古細菌（ａｒｃｈｅａ）を含む臓器とすることができる。細胞は、生きていても死んでいてもよい。多細胞生物から取得する場合、細胞は任意の細胞型でよい。細胞は、培養細胞系又は第１の分離株でよく、細胞は、哺乳類、両生類、爬虫類、植物、酵母菌、細菌、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）、スピロヘータ、又は原生動物でよい。細胞は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ニワトリ、ウズラ又はイヌのものでよい。細胞は、正常細胞、突然変異細胞、遺伝子組み換えが行われている細胞、癌細胞等でよい。

本書に記載の自動画像処理方法を実施するための実施例では、装置が多波長の光を試料に照射できる１又はそれ以上の光源を有する。また、この装置は、多波長の照射で試料の画像を取得できる１又はそれ以上の検出器を有する。

また、この装置は、第１の波長で試料から取得した画像から関心のある対象のサブセットを選択可能なコンピュータ又は他の選択手段を有する。この装置は、１又は複数の別々の解析を含む任意の条件セットに基づいてこれらの対象を選択する。平均光学密度、積分光学密度、形状、組織等を含む、このような基準の例が本書に与えられている。この装置は、第２の波長で関心のある特定の対象を画像処理でき、その後これらの追加的な画像を第１の関心のある画像と組み合わせて組み合わせた画像を作成し、さらに追加的な解析を行って最初に実行された基準と同じか又は異なってもよいさらなる基準に基づいて対象の特定のサブセットを選択することができる。

アナログ装置又はデジタル装置によって画像を付け加えるか又は互いに比較することができる。例えば、２つの色（すなわち、２つの異なる波長のＬＥＤから）の照射を同時に行い、アナログ処理で画像を加えることによって２つの画像を合わせてもよい。他の実施例では、画像をデジタル化して追加又は比較してもよい。

以下の実施例は、本書に説明した主題を作製及び使用する方法についての完全な記載を当業者に提供するように説明するが、本発明と見なされる範囲の限定を意図するものではない。使用する数値（例えば、量、温度等）に関する精度を確かめるための取り組みがなされているが、実験的な誤差及び狂いを説明する必要がある。

実施例１ 自動画像処理を改良するための多波長スクリーニング
多波長での試料の画像処理が自動画像装置におけるシーン分割の動作及び／又は特徴抽出動作を高めるかどうかを判定するための実験を実施した。いくつかの異常細胞及び多くの化生細胞が、非常に厚い細胞質により細胞核のコントラストを下げる。さらに、染色システムが、染色した試料の中に多色を形成し、試料の全ての細胞にとって単色の照射が最適ではない可能性がある。例えば、パパニコロー（Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ）染色が、赤、青又は緑色の細胞質を形成し、いくつかのデジタル画像装置とともに使用する単波長が、このような相違する細胞の最適な画像を提供しない可能性がある。このため、コントラスト全体の改善を一つの手段として使用して、解析を改善するための可能性ある方法を評価した。

正常、異常及び化生のパパニコロー染色細胞を含む１１の顕微鏡視野を、白黒ビデオカメラを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡を用いて、５１の異なる波長を使用してデジタル化した。これは、光源と顕微鏡との間にモノクロメータ（ＥＧ＆Ｇモデル５８５−２２）を設置することによって実行された。そして、画像を４５０及び７００ナノメータの間の波長で５ナノメータ毎にデジタル化した。多波長の画像を一旦デジタル化すると、アルゴリズムを調査して２つの画像の組み合わせを加え、細胞核と細胞質との間のコントラストを自動的に判断した。コントラストは、細胞質の中の１０×１０画素ボックス（ｂｏｘ）と比較した細胞核の中の１０×１０画素ボックスのグレーレベルの差として規定した。大部分の画像に対して最適なコントラストを与える５７０ｎｍの単波長を選択した。

他の波長とこのような画像との組み合わせを解析して、５７０ｎｍの画像に対する組み合わせた（２つの画像を加えて２で割った）画像のコントラストの変化を判定した。図１は、５７０ｎｍの画像と組み合わせた５１の全ての波長（ｙ軸）について１１の各対象についてのコントラスト（ｘ軸はｄｉｆｆ３で；ｄｉｆｆ＝二波長の画像についての細胞核と細胞質との間のグレー値（ｇｒｅｙ ｖａｌｕｅｓ）の差から、単波長の画像についての細胞核と細胞質との間のグレー値の差を引いたもの）の純変化の散布図を示す。

細胞質の色又は細胞型に拘わらず、全ての対象についての組み合わせた画像のコントラストを改善する（約６００及び６７０の間の）範囲を識別した。これは、多波長の画像を組み合わせてコントラストを改善できることを示している。

実施例２ 困難な試料に対する多波長の画像処理の改善の解析
多波長の画像を使用する可能性を調査するために、パパニコロー染色したスライドからの一連の異常細胞及び正常な化生細胞を、実施例１に基づいて選択した５７０ｎｍ及び６５０ｎｍの２つの波長を使用して、白黒ビデオカメラを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡を用いてデジタル化した。画像全体をデジタル化してクラスタ、組織片、血液等の「無秩序」を可能にした。初めに画像を単波長−多くのパパニコロー検査の画像システムに使用する標準的な緑色照射（５７０ｎｍ）のみを使用して解析した。その後、５７０及び６５０ｎｍの２つの波長の組み合わせを用いて画像を解析した。

そして、細胞核を見付けるために細胞を自動的に分割した。分割のアルゴリズムは、細胞核かもしれないもの（暗い対象）を自動的に見付けることによって行われ、画像のグレーレベルのヒストグラムに基づいた繰り返し方法を使用する。この方法は、対象の現在の輪郭の中の中間調のヒストグラムから、最小及び最大の暗さの値の変化を監視する。多くの他の分割方法を適用して、細胞核、細胞質、又は画像の他の対象を見付けることができる。分割の後に、細胞核の外観を抽出し、形状及び組織の測定に基づいてアーチファクト（ａｒｔｉｆａｃｔｓ）除去がなされる。組み合わせた画像の性能を検査するために、細胞の積分光学密度（「ＩＯＤ」）を使用して細胞の簡単なリストを整理する。このような形態は、スライド上で測定される全ての形態のうちの最も識別力のあるものの一つである。しかしながら、リスト中で異常細胞の間の位置に現れる「大きく／暗い」が正常な「化生」細胞が困難なものにしている。

「面倒な」化生細胞を具える患者の試料について試験を行って、高いＩＯＤを具える４０個の細胞をリストに記録した。単波長のみを使用した場合、化生した細胞核が、悪性度の高い鱗状の上皮内病巣の特性を持つ異常な細胞核のセットのリスト中に、位置２２に１つ、さらには位置３３から４０にもっと現れた。高い積分光学濃度では、多くの異常細胞核が１００個の細胞核のリストの中で見付けられた。

しかしながら、２つの波長を組み合わせた画像を使用して同じ患者の４０個の細胞核の試料から細胞のＩＯＤ値のリストを作成した場合、一つの化生した細胞核のみが位置３７に出現した。ここでは、多くの異常な細胞核がリストの最初の４０の位置に見られた。このように、組み合わせにより、「偽の陽性（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」の細胞核が少なくなるという細胞をランク付け能力が示され、このような非常に困難な問題に対する２色の解析の有効性が示された。

最終的なチェックとして、単波長及び二波長を組み合わせた画像における照合するクラスターのデータと比較することによってクラスターの画像を解析した。データが、白血球細胞のクラスターの「白と黒が入り交じった」外観と（画素濃度があまり変化しない）異常細胞の滑らかなクラスターとの間の、グレーレベルの標準偏差の差における顕著な改善を示した。このような外観は、白血球細胞のクラスターによる「偽情報（ｆａｌｓｅ ａｌａｒｍｓ）」を除去できるため重要である。このような区別が無い場合、画像装置が、同じスライドガラス上にありそうなそれほど多くはない異常なクラスターの代わりに、いくつかの非常に数の多い白血球細胞のクラスターのいくつかを選択して細胞検査技師に示す可能性がある。これらのデータは、コントラストが改善され、画像装置によってより良い区別が可能であることを明らかに示す。二波長の照射により、パパニコロー検査のスライドガラスの細胞の臨床的適用における区分け及び分類の改善が可能である。

以上のように、改良した自動画像解析システムの特定の実施例、使用及び適用方法を開示した。しかしながら、本書の発明の概念から逸脱せずに、上記に加えて多くのさらなる改良が可能であることが当業者にとって明らかである。

図１は、１１個の対象について、単波長（５７０ｎｍ）の画像と比較した二波長（５７０ｎｍ＋２番目の波長）の組み合わせた画像についての、細胞核：細胞質の増分コントラストレベルを示す。円＝正常な中間細胞、ｘ＝正常な化生細胞、点＝異常細胞。

Claims (25)

1. 生体試料の中の対象のデジタル画像を取得するステップと、
   前記デジタル画像から関心のある複数の対象を選択するステップと、
   複数の異なる波長における前記関心のある対象の複数の画像を取得するステップと、
   前記複数の画像のうちの１を対応するデジタル画像と組み合わせて、組み合わせた画像を作成するステップと、
   前記組み合わせた画像を解析して前記生体試料を評価するステップと、
   を具えることを特徴とする自動画像処理。
2. 前記関心のある対象が、前記生体試料の他の対象と比較して比較的高い光学密度の対象を含むことを特徴とする請求項１に記載の自動画像処理。
3. 前記デジタル画像を紫外線から赤外線の範囲の少なくとも１の波長から取得することを特徴とする請求項１に記載の自動画像処理。
4. 前記デジタル画像を約６７０ｎｍよりも短い波長のうちの少なくとも１から取得することを特徴とする請求項３に記載の自動画像処理。
5. 前記複数の異なる波長が等間隔に増加することを特徴とする請求項１に記載の自動画像処理。
6. 前記関心のある対象が細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の自動画像処理。
7. 前記処理を使用して正常な試料を判定することを特徴とする請求項１に記載の自動画像処理。
8. 前記処理を使用して感染又は他の疾病を識別することを特徴とする請求項１に記載の自動画像処理。
9. 前記生体試料を評価するステップが、マーカーを検出するステップを有することを特徴とする請求項１に記載の自動画像処理。
10. 前記生体試料を評価するステップが、異常又は感染した細胞の分光的特徴を検出するステップを具えることを特徴とする請求項１に記載の自動画像処理。
11. 生体試料の中の対象のデジタル画像を取得するステップと、
    前記デジタル画像から少なくとも１の関心のある対象を選択するステップと、
    複数の異なる波長における前記少なくとも１の関心のある対象の少なくとも１の画像を取得して、多波長の画像の組を作成するステップと、
    前記多波長の画像の組を解析して前記生体試料を評価するステップと、
    を具えることを特徴とする自動画像処理。
12. 前記少なくとも１の関心のある対象が、前記生体試料の他の対象に対して比較的高い光学密度の対象を含むことを特徴とする請求項１１に記載の自動画像処理。
13. 前記デジタル画像を紫外線から赤外線の範囲の少なくとも１の波長から取得することを特徴とする請求項１１に記載の自動画像処理。
14. 前記デジタル画像を約６７０ｎｍよりも短い波長のうちの少なくとも１から取得することを特徴とする請求項１３に記載の自動画像処理。
15. 前記複数の異なる波長が等間隔に増加することを特徴とする請求項１１に記載の自動画像処理。
16. 前記少なくとも１の関心のある対象が細胞を含むことを特徴とする請求項１１に記載の自動画像処理。
17. 前記処理を使用して前記細胞の核を正確に識別するための向上した能力をもって判定することを特徴とする請求項１１に記載の自動画像処理。
18. 前記処理を使用して前記細胞の核の密度を正確に識別するための向上した能力をもって判定することを特徴とする請求項１７に記載の自動画像処理。
19. 前記生体試料を評価するステップが、マーカーを検出するステップを有することを特徴とする請求項１１に記載の自動画像処理。
20. 前記処理を使用して正常な試料を判定することを特徴とする請求項１１に記載の自動画像処理。
21. 前記処理を使用して感染又は他の疾病を識別することを特徴とする請求項１１に記載の自動画像処理。
22. 前記生体試料を評価するステップが、異常又は感染した細胞の分光的特徴を検出するステップを具えることを特徴とする請求項１１に記載の自動画像処理。
23. 試料に第１のスペクトル領域を出力可能な第１の光源と、
    前記第１のスペクトル領域によって照射される際に前記試料の部分の第１の画像を検出可能な第１の検出器と、
    第１の条件セットに基づいて前記第１の画像のサブセットを選択可能な第１のコンピュータと、
    前記第１の光源又は異なる光源である第２の光源であって、前記第１のスペクトル領域とは異なる第２のスペクトル領域を出力可能な第２の光源と、
    前記第１の検出器又は異なる検出器である第２の検出器であって、前記第２のスペクトル領域によって照射される際に、選択した前記サブセットにおける前記画像の第２の画像を検出可能な第２の検出器と、
    前記第１のコンピュータ又は異なるコンピュータである第２のコンピュータであって、前記選択したサブセットの前記第２の画像及び前記第１の画像を具える組み合わせた画像を作成し、さらに前記第１の条件セット又は異なるセットである第２の条件セットに基づいて前記組み合わせた画像のサブセットを選択可能な第２のコンピュータと、
    を具えることを特徴とする器具。
24. 前記第２のコンピュータが、前記第１のコンピュータ又は異なるコンピュータであり、前記選択したサブセットの前記第１及び第２の画像を解析し、さらに前記第１の条件セット又は異なるセットである第２の条件セットに基づいて前記第１及び第２の画像のサブセットを選択可能であることを特徴とする請求項２３に記載の器具。
25. 前記第１の条件セット又は前記第２の条件セットの少なくとも一方が少なくとも１の波長を具えることを特徴とする請求項２３に記載の器具。

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