CN102096914B

CN102096914B - 一种生物荧光图像中自体荧光干扰的去除方法

Info

Publication number: CN102096914B
Application number: CN201110028943A
Authority: CN
Inventors: 田捷; 薛贞文; 杨鑫; 秦承虎
Original assignee: Institute of Automation of Chinese Academy of Science
Current assignee: Institute of Automation of Chinese Academy of Science
Priority date: 2011-01-26
Filing date: 2011-01-26
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2031-01-26
Also published as: CN102096914A

Abstract

本发明涉及一种生物荧光图像中自体荧光干扰的去除方法，该方法包括以下步骤：获取不同波长的激发荧光图像一和激发荧光图像二；将激发荧光图像一和激发荧光图像二按照相同方式划分成多个尺寸相等的块，在激发荧光图像一和激发荧光图像二中对应位置的两个块构成测试小组；将每个测试小组的激发荧光图像一和激发荧光图像二中像素和的比值大于阈值的测试小组作为种子小组；使用自适应的聚类分析方法，按距离度量将各种子小组组合为多个荧光小区；以每个荧光小区作为种子点，在激发荧光图像一中采用种子漫水法筛选出有用荧光信号。本方法能够有效地筛选出多个有用荧光区域并同时去除自体荧光的干扰，在激发荧光分子成像领域有重要的应用价值。

Description

一种生物荧光图像中自体荧光干扰的去除方法

技术领域

本发明涉及到一种激发荧光分子影像的预处理方法研究，特别设计到一种自适应的荧光图像中自体荧光干扰的去除方法。

背景技术

分子影像是应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究。而激发荧光成像(Fluorescence MolecularImaging)是近年来发展起来的一种重要的分子影像模态，能够实现新型的分子、基因表达的分析检测技术，并且越来越得到人们的重视。

自体荧光是生物体的一些内源性物质在没有荧光探针标记的情况下，经激发后产生的荧光，将对目标荧光信号的检测产生干扰，严重时甚至淹没有用的荧光信号。

现有减少自体荧光干扰的方法中，最常见的是通过获取两幅不同波长的图像，其中第一幅含较多的有用荧光信号和较少的自体荧光信号，第一幅含有较多的自体荧光干扰信号和较少的有用荧光信号。最后将第一幅图像减去第二幅图像得到校正后的结果。该方法虽然能去掉大部分自体荧光，但同时使得有用荧光信号也被衰减，从而使得信噪比降低。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明的目的是通过对激发荧光分子影像的预处理方法研究，为此提供一种自适应的生物荧光图像中自体荧光干扰的去除方法。

为实现所述目的，本发明提供的生物荧光图像中自体荧光干扰的去除方法的核心思想是利用不同波段的激发光获取的荧光图像包含有用荧光和自体荧光不同程度的信息，经过数值方法处理，最终筛选出有用荧光区域信息，从而达到去除自体荧光干扰的目的；该方法包括以下步骤：

步骤S1：获取两种不同波长的激发荧光图像一和激发荧光图像二；

步骤S2：激发荧光图像一和激发荧光图像二按照相同方式划分成多个尺寸相等的块，将激发荧光图像一和激发荧光图像二中对应位置的两个块构成一个测试小组；

步骤S3：将每个测试小组激发荧光图像一和激发荧光图像二中的像素值分别求和后做比值，得到每个测试小组的比值，求出所有测试小组的比值中的最大值，并乘上系数α作为阈值，筛选出所有比值大于阈值的测试小组作为种子小组；

步骤S4：求出每个种子小组像素值加权得到的质心坐标，对荧光小区的进行筛选，使用自适应的聚类分析方法，按照距离将各种子小组分为不同的荧光小区，在同一图像实现多个分散荧光区域的筛选；

步骤S5：以每个荧光小区的像素值最大的像素点作为种子点，在激发荧光图像一中采用种子漫水法搜索种子点周围区域，将大于激发荧光图像一平均像素值β倍以上的像素点做标记；将所有的标记点进行显示，其余点像素值置零，便得到去除自体荧光干扰后的荧光图像。

优选实施例，块的边长选取在8～64像素值之间。

优选实施例，系数α选取为0～1之间的实数。

优选实施例，系数β选取为大于1的实数。

优选实施例，激发荧光图像一中荧光染料的激发效率高于激发荧光图像二中荧光染料的激发效率，激发荧光图像一的激发光波长大于激发荧光图像二激发光波长。

优选实施例，在荧光小区的进行筛选时，采用自适应的聚类分析方法应用于一幅图像中有多个荧光目标区域的自体荧光去除。

本发明的有益效果：

本发明提出的方法在不用牺牲有用荧光信号的基础上，完成荧光图像中自体荧光干扰的去除。该发明通过自体荧光干扰的去除，大大提高了激发荧光成像的信噪比，特别是在字体荧光干扰最严重的400-700nm的波段。此外，本发明还应用了自适应的聚类分析方法，按照距离将各种子小组分为不同的荧光小区。这样就可以完成同一图像多个分散荧光区域的筛选，使得应用性大大加强。

附图说明

图1是本发明方法流程图。

图2是比值计算示意图。

图3GFP荧光植皮发光小鼠实验。

图4GFP标记肝肿瘤发光小鼠实验。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

生物的自体荧光分布一般是宽谱，而且随着波长增加，其强度有较缓慢的衰减；而一般的荧光探针信号则只在相对较窄的波段有较高的信号强度。基于之一事实，本发明在荧光探针信号较强的波段获得一幅激发效率较高荧光图像，同时在荧光探针信号较低(较小的波段)获得一幅波长较小的背景荧光图像。在激发效率较高荧光图像中大部分是有用荧光成分，而波长较小的背景荧光图像中绝大部分是自体荧光信号。因此，可以利用激发效率较高荧光图像和波长较小的背景荧光图像中有用荧光信号和自体荧光信号比例的差异筛选出有用荧光信号的同时去除自体荧光干扰，其理论推导如下：

若某一图像区域为有用荧光区域，则f₁，f₂分别表示激发效率较高荧光图像F和波长较小的背景荧光图像B中的有用荧光信号成分，a₁，a₂分别表示激发效率较高荧光图像F和波长较小的背景荧光图像B中的自体荧光信号成分，I₁是有用荧光信号成分f₁与自体荧光信号成分a₁之和，I₂是有用荧光信号成分f₂与自体荧光信号成分a₂之和；若某一图像区域为自体荧光区域，f_1m，f_2m分别表示激发效率较高荧光图像F和波长较小的背景荧光图像B中的有用荧光信号成分，a_1m，a_2m分别表示激发效率较高荧光图像F和波长较小的背景荧光图像B中的自体荧光信号成分，I_1m是有用荧光信号成分f_1m与自体荧光信号成分a_1m之和，I_2m是有用荧光信号成分f_2m与自体荧光信号成分a_2m之和。综上所述，有以下关系成立：

I₁＝f₁+a₁，I₂＝f₂+a₂，I_1m＝f_1m+a_1m，I_2m＝f_2m+a_2m，

在有用荧光区域，满足f₁＞f₂，a₁＜a₂；在自体荧光区域，满足f_1m＝f_2m＝0，a_1m＜a_2m。于是有以下推导：

\frac{I_{1}}{I_{2}} = \frac{f_{1} + a_{1}}{f_{2} + a_{2}} > \frac{f_{1 m} + a_{1 m}}{f_{2 m} + a_{2 m}} = \frac{I_{1 m}}{I_{2 m}},

从以上的推导可以看出，通过分析各区域中荧光图像像素值比例的差异来作为筛选出有用荧光区域和自体荧光区域的依据。需要补充的是，其中大部分区域可能既不是有用荧光信号区域，也不是自体荧光信号区域，而这部分所求出的比值一般在常数1附近，因此设置较高的阈值就可以很方便地将非有用荧光信号区域统一进行处理，并且不会影响处理效果。

下面结合附图1详细描述本发明的去除激发荧光图像中自体荧光干扰的方法。本发明的方法实施例，主要包括以下步骤：

步骤S1：利用卤素灯导出的光通过滤光片a后照射荧光染料GFP标记的小白鼠，产生的激发荧光通过滤光片c后由CCD相机接收获得激发荧光图像一；卤素灯导出的光通过滤光片b后照射荧光染料GFP标记的小白鼠，产生的激发荧光通过滤光片c后由CCD相机接收获得激发荧光图像二。滤光片a为带通滤光片，中心波长为488nm，半峰全宽为20nm，透过率大于90％；滤光片a为带通滤光片，中心波长为410nm，半峰全宽为20nm，透过率大于90％；滤光片c为带通滤光片，中心波长为525nm，半峰全宽为20nm，透过率大于90％。卤素灯为Schott KL 1500LCD，发射波长为400-800nm、功率为200w。CCD相机为半导体低温制冷CCD：PIXIS 1024BR，工作温度为-70℃，具有高灵敏度适合探测波长300-1100nm之间微弱信号，噪声低。

步骤S2：将激发荧光图像一和激发荧光图像二按照相同方式划分成多个尺寸大小相同的块，激发荧光图像一和激发荧光图像二中对应位置两个块构成一个测试小组。每个块的大小为8×8个像素值。

步骤S3：求出每个测试小组激发荧光图像一和激发荧光图像二中像素和的比值，求出所有测试小组的比值中的最大值，以最大比值的a倍作为阈值，筛选出所有比值大于阈值的测试小组作为种子小组。这里系数a取0.85。

其中，请参考附图2，比值的计算过程：

r (i, j) = \frac{S_{1} (i, j)}{S_{2} (i, j)},

i，j分别表示每个测试小组的横坐标和纵坐标编号。图2中(a)示出的S₁(i，j)是激发荧光图像一中该测试小组所有像素值之和，图2中(b)示出的S₂(i，j)是激发荧光图像二中该测试小组所有像素值之和，图2中(c)示出的r(i，j)则是S₁(i，j)与S₂(i，j)两者的比值ratio。

步骤S4：先计算出各种子小组像素值加权得到的质心坐标，对荧光小区的进行筛选；然后应用自适应的聚类分析方法，按质心坐标距离的远近将各种子小组组合为不同的荧光小区，在同一图像实现多个分散荧光区域的筛选。荧光小区的分类距离为128个像素单位，即小于该值的种子小组组成一个荧光小区。

其中，质心坐标x、y的计算方法如下：

x = \frac{Σ x_{k} \times r_{k}}{Σ x_{k}}, y = \frac{Σ y_{k} \times r_{k}}{Σ y_{k}}

(x_k，y_k)是该种子小组的第k各元素；r_k是第k个元素的像素值。

步骤S5：以每个荧光小区的最大像素值的像素坐标作为种子点，在激发荧光图像一中采用种子漫水法搜索种子点周围区域，将大于激发荧光图像一平均像素值β倍以上的像素点做标记；将所有的标记点进行显示，其余点像素值置零，便得到去除自体荧光干扰后的荧光图像。采用种子漫水法筛选出新的荧光图像。

首先搜索出每个荧光小区中在激发荧光图像一中的最大像素值的像素坐标，并以此为种子点开始分用漫水法标记并记录周围大于某一像素值阈值的所有点的坐标。激发荧光图像一中所有像素平均值的β倍作阈值，即漫水法结束的条件。这里β取值为1.4。每个荧光小区分别标记完成后，将激发荧光图像一中其他非标记区域的像素值设为0，则得到去除自体荧光干扰后的荧光图像。

图3显示了三组实验结果，图中a₁，a₂和a₃是通过激发效率较高荧光图像F分别获得的图像；b₁，b₂和b₃是通过滤波器波长较小的背景荧光图像B分别获得的图像；c₁，c₂和c₃分别是处理后的图像结果。从图中可知，未经处理的图像受到多处自体荧光信号的干扰，对有用形成严重信号。经过本发明方法处理后，分散各处的自体荧光被消除。

图4也显示了三组实验结果，a₁，a₂和a₃是通过滤波器激发效率较高荧光图像F分别获得的图像；b₁，b₂和b₃是通过滤波器波长较小的背景荧光图像B分别获得的图像；c₁，c₂和c₃分别是处理后的图像结果。d₁，d₂和d₃分别是生物发光验证的结果。从图中可知，未经处理的图像受到多处自体荧光信号的干扰，对有用形成严重信号。经过本发明方法处理后，分散各处的自体荧光被消除。值得一提的是，本实验还利用生物自发光(Bioluminescence)来验证有用荧光信号的真实性，见d₁、d₂、d₃。比较c组和d组相对应的图像可以看出，生物自发光和有用荧光信号的区域基本一致。

以上所述，仅为本发明中的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解想到的变换或替换，都应涵盖在本发明的权利要求书的保护范围之内。

Claims

1.一种生物荧光图像中自体荧光干扰的去除方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：获取两种不同波长的激发荧光图像一和激发荧光图像二，其中：激发荧光图像一中荧光染料的激发效率高于激发荧光图像二中荧光染料的激发效率，激发荧光图像一的激发光波长大于激发荧光图像二的激发光波长；

步骤S4：求出每个种子小组像素值加权得到的质心坐标，对荧光小区进行筛选；使用自适应的聚类分析方法，按照质心坐标距离的远近将各种子小组分为不同的荧光小区，在同一图像实现多个分散荧光区域的筛选；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，块的边长选取在8～64像素值之间。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，系数α选取为0～1之间的实数。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，系数β选取为大于1的实数。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对荧光小区进行筛选时，采用自适应的聚类分析方法应用于一幅图像中有多个荧光目标区域的自体荧光去除。